ES2325807T3 - Adn genomicos que participan en la artritis reumatoide, procedimiento para su diagnostico, procedimiento de estimacion de su aparicion y kit diagnostico para su deteccion. - Google Patents
Adn genomicos que participan en la artritis reumatoide, procedimiento para su diagnostico, procedimiento de estimacion de su aparicion y kit diagnostico para su deteccion. Download PDFInfo
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Abstract
Un ADN genómico implicado en la artritis reumatoide, que comprende al menos una de las siguientes mutaciones en el ADN genómico que consta de la secuencia de bases de la SEC ID Nº 1: 1) sustitución de timina (t) por citosina (c) en la posición 1.987; 2) sustitución de guanina (g) por timina (t) en la posición 3.664; y 3) sustitución de citosina (c) por adenina (a) en la posición 3.769.
Description
ADN genómicos que participan en la artritis
reumatoide, procedimiento para su diagnóstico, procedimiento de
estimación de su aparición y kit diagnóstico para su detección.
La presente invención se refiere a ADN genómicos
con mutaciones, un procedimiento de diagnóstico de la artritis
reumatoide humana usando las mutaciones, un procedimiento para
estimar su aparición y un kit de diagnóstico de la misma.
La artritis reumatoide (AR) tiene un síntoma
fundamental de osteoartritis erosiva múltiple y también es una
enfermedad inflamatoria sistémica con una etiología desconocida que
afecta, simultáneamente, a múltiples órganos. La AR progresa de
forma crónica con periodos de remisión y exacerbación repetidos. La
AR no tratada causa la destrucción y deformación de las
articulaciones, presentándose posteriormente trastornos funcionales
del aparato motor. En algunas ocasiones supone un peligro para la
vida de los pacientes. En consecuencia, los pacientes con AR tienen
que soportar grandes cargas físicas y mentales de por vida.
La AR da lugar a una gran variedad de síntomas y
se utilizan ampliamente los criterios de diagnóstico del Colegio
Americano de Reumatología para su diagnóstico. Sin embargo, el
desarrollo de un estado de aparición de la AR generalmente es muy
lento, requiriendo un periodo de varias semanas a varios meses.
Según se estima mediante la existencia del factor reumatoide, que
es un índice objetivo en los criterios diagnósticos del Colegio
Americano de Reumatología, la tasa positiva es del 33% a los 3 meses
y aproximadamente del 88% incluso después de 12 meses o más
[Chiryo, 73(3): 23-27, 1991]. Esto indica
que, en la actualidad, la AR no puede diagnosticarse de forma
definitiva. Se ha llevado a cabo un intento por diagnosticar la
artritis reumatoide mediante la detección de un antígeno IgM sérico
asociado con la artritis reumatoide en el paciente a través de la
reacción con un antígeno recombinante (documento
JP-A-10-513257).
En el tratamiento de la AR, el procedimiento
terapéutico seleccionado varía generalmente dependiendo del estadio
de progresión de los síntomas en el estado de enfermedad.
Generalmente, en un estadio inicial durante el cual no puede
realizarse un diagnóstico definitivo, se administra un fármaco
antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y, en el caso de que pueda
realizarse un diagnóstico definitivo, se administra además del AINE
un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FARME). En
especial, en un estadio inicial de la aparición de la AR, puesto
que es difícil realizar un diagnóstico definitivo en ese momento,
se administra el AINE y, al mismo tiempo, se realiza un esfuerzo
para identificar esta enfermedad entre otras enfermedades
reumatoides, como la enfermedad del colágeno, observando
cuidadosamente los síntomas y la progresión. En el caso de que los
síntomas sigan progresando pueden administrarse esteroides, y se
realiza una farmacoterapia para el dolor junto con fisioterapia y
tratamiento ortopédico para mantener y mejorar las funciones de las
articulaciones. Además, en el caso de que aparezcan molestias en la
vida cotidiana debido a trastornos en las articulaciones, puede
realizar un tratamiento quirúrgico.
Aunque los aspectos de la artritis y los
trastornos en las articulaciones, que son las causas de la AR, en
especial sus procesos patológicos, se han elucidado gradualmente
mediante diversos estudios, se sigue pensando en la AR como en una
enfermedad que se desarrolla y progresa tras su aparición causada
por la cooperación entre un gran número de factores etiológicos que
incluyen el entorno en que se vive. Por esta razón, para realizar
una dilucidación más exacta de la enfermedad y un tratamiento
adecuado de la misma, tiene que establecerse una parte esencial de
las interacciones de los múltiples factores implicados. Puesto que
la AR es una enfermedad con una tasa de incidencia del 1% o
inferior a nivel mundial (N. Engl. J. Med., 322:
1277-1289, 1990), aunque los hermanos de pacientes
desarrollan la enfermedad con una frecuencia del 8% o superior
(Cell, 85: 311-318, 1996), se sospecha que uno de
los factores etiológicos es un factor genético determinado. Además,
puesto que se piensa que el entorno es uno de los factores
etiológicos, la aparición puede retrasarse o prevenirse si se presta
atención al estilo de vida diario, como a la dieta, infecciones
víricas y estrés, si puede conocerse de antemano el riesgo de
aparición. Además, si se realiza un diagnóstico precoz y se
proporciona un tratamiento apropiado en un estadio inicial, puede
retrasarse la progresión de la AR y puede esperarse una mejora del
pronóstico.
En la publicación internacional WO98/51794 y en
Shiozawa y col., 2000, los inventores de la presente invención
realizaron análisis de ligamiento de pacientes con AR y sus
hermanos usando un marcado microsatélite, e identificaron tres loci
génicos implicados donde se ubican los genes etiológicos de la
artritis reumatoide. Se han identificado los siguientes genes
etiológicos:
- 1)
- un gen etiológico de la artritis reumatoide localizado a no más de \pm 1 centimorgan de una secuencia de ADN hidrolizable con los marcadores de microsatélites D1S214 y/o D1S253 en el cromosoma 1 humano.
- 2)
- un gen etiológico de la artritis reumatoide localizado a no más de \pm 1 centimorgan de una secuencia de ADN hidrolizable con el marcador de microsatélite D8S556 en el cromosoma 8 humano.
\newpage
- 3)
- un gen etiológico de la artritis reumatoide localizado a no más de \pm 1 centimorgan de una secuencia de ADN hidrolizable con los marcadores de microsatélites DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 y/o DXS1232 en el cromosoma X humano.
Los presentes inventores adicionalmente
extendieron el estudio del gen etiológico 3) descrito anteriormente
y encontraron que una mutación específica (mutación eliminada en el
exón 2) del protooncogén Db1 del cromosoma X [EMBO J. 7(8):
2465-2473, 1988] se relacionaba con el estado de
aparición de la AR. A continuación presentaron la solicitud de
patente (PCT/JP00/01679).
Un objeto de la presente invención es esclarecer
mutaciones adicionales en el gen Db1 humano y sus relaciones con la
aparición o riesgo de aparición de AR; y proporcionar un
procedimiento para el diagnóstico preciso de la aparición o riesgo
de aparición de AR utilizando estas mutaciones. Otro objeto de la
presente invención es proporcionar un kit de diagnóstico útil para
la detección de un ADN genómico que es un gen Db1 mutado asociado
con la AR.
En estas circunstancias, los presentes
inventores han continuado realizando estudios exhaustivos y han
encontrado las mutaciones siguientes en el ADN genómico
representado en la SEC ID Nº 1, que muestra una secuencia de bases
del intrón 24 -exón 24 -intrón 23 del gen Db1 en células obtenidas
de los sujetos examinados:
- 1)
- sustitución de timina (t) por citosina (c) en la posición 1.987;
- 2)
- sustitución de guanina (g) por timina (t) en la posición 3.664 y
- 3)
- sustitución de citosina (c) por adenina (a) en la posición 3.769.
Más específicamente, la base (c) de la posición
1.987 se localiza en el intrón 24 y las bases (t) y (a) de la
posición 3.664 y la posición 3.769 se localizan en el intrón 23.
Previamente, se ha sabido que existen varios genes del genoma
implicados en la aparición de la AR y, ahora, se conoce que el ADN
genómico mutado de la presente invención es parcialmente la causa de
la aparición de la AR. Esta relación entre una mutación de
sustitución de una única base y las enfermedades es conocida en
otros casos, como el gen etiológico de la diabetes mellitus de tipo
II (Nature Genetics, 26: 163-175, 2000).
Los presentes inventores han encontrado a partir
de estos estudios que son útiles un procedimiento de diagnóstico de
la AR, un procedimiento para estimar el riesgo de aparición de la
AR y un kit de diagnóstico para detectar estas mutaciones, usando
las mutaciones del gen Db1 en las células obtenidos de las personas
examinadas como índice y se consiguen en la presente invención.
Además, la presente invención es útil para el desarrollo de
procedimientos y fármacos preventivos o terapéuticos novedosos para
el tratamiento de la artritis reumatoide.
En la presente memoria descriptiva, siempre que
no se especifique otra cosa, a, c, g y t significa las bases
adenina, citosina, guanina y timina, respectivamente.
Adicionalmente, la SEC ID Nº 1 se corresponde
con la secuencia de posición 55.823 a la posición 59.696 de la
secuencia registrada en el GenBank como el genoma humana del
cromosoma X, región q25-26.3 que contiene el ADN
genómico del gen Db1 (Nº de acceso a GenBank AL033403). En esta
conexión, la secuencia registrada en el GenBank tiene las siguientes
propiedades: la cadena complementaria de la misma es una cadena +;
se traduce desde la posición 115.837 en dirección 5' y se
transcribe al ARNm con número de acceso a GenBank X12556.
El procedimiento de diagnóstico de la AR, el
procedimiento para estimar su riesgo de aparición y el kit de
diagnóstico para su detección en la presente invención, detecta al
menos una de las mutaciones en el ADN genómico descrito
previamente.
La fig. 1 es una representación esquemática que
muestra la relación entre los cebadores utilizados para la
determinación de la secuencia de gen etiológico de la AR y el ADN
genómico.
la fig. 2 muestra los patrones electroforéticos
tras el tratamiento con Hinf-I de los productos
amplificados por PCR usando los cebadores que constan de las
secuencias de bases de SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 3. El carril 1
indica un producto de PCR derivado de una variante homóloga del gen
Db1, el carril 2 indica productos de PCR derivados de un gen Db1
normal (tipo silvestre) y la línea 3 indica los productos de PCR
derivados de una variante heteróloga del gen Db1.
La identificación de un ADN genómico mutante y
el diagnóstico de la AR o la estimación del riesgo de aparición de
AR puede hacerse, por ejemplo, como se describe a continuación.
Puede obtenerse el ADN genómico de un sujeto
examinado mediante el procedimiento convencional a partir de
cualquier células humana, por ejemplo, pelo, diversos órganos,
linfocitos periféricos o células sinoviales. También puede
obtenerse de células cultivadas y en proliferación. Además, el ADN
genómico obtenido de este modo puede usarse después de su
amplificación utilizando los procedimientos de amplificación génica
convencionales, como PCR (reacción en cadena de la polimerasa),
NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos),
TMA (amplificación mediada por transcripción) y SDA (amplificación
por desplazamiento de cadena).
Los procedimientos de detección para variantes
genómicas no se limitan especialmente. Se incluyen, por ejemplo, un
procedimiento de sonda oligonucleotídica específica de alelo, el
procedimiento de ensayo de ligamiento de oligonucleótidos, el
procedimiento PCR-SSCP, el procedimiento
PCR-CFLP, el procedimiento PCR-PHFA,
el procedimiento de sondas oligonucleotídicas invasivas, el
procedimiento RCA (amplificación por círculo rodante) y el
procedimiento de extensión de base con cebador
oligonucleotídico.
En el caso de la detección de mutaciones usando
el procedimiento de PCR, se sintetiza un cebador de PCR, que puede
amplificar la región que contiene las posiciones mutadas en la SEC
ID Nº 1; y a continuación, se lleva a cabo la secuenciación directa
del producto de PCR amplificado a partir del ADN genómico del
sujeto examinado para determinar la mutación. Detectando al menos
una de las mutaciones descritas anteriormente en el ADN genómico de
la SEC ID Nº 1, puede estimarse con precisión a continuación el
diagnóstico del AR del sujeto examinado o el riesgo de aparición de
la misma.
El cebador utilizado en la presente invención
puede prepararse de forma convencional usando un sintetizador de
ADN o similar.
Adicionalmente, las mutaciones descritas
anteriormente también pueden detectarse usando una micromatriz
equipada con oligonucleótidos consistentes en una secuencia normal
y una secuencia mutada en la mutación en el sitio en penumbra.
Además, la mutación (t \rightarrow g) en la
posición 3.664 también puede detectarse, como se muestra en los
Ejemplos, amplificando la cadena+ del ADN genómico usando un
oligonucleótido sintético que contiene el sitio de mutación de la
misma (SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 3) como cebador en la PCR,
escindiendo el producto de PCR con la enzima Hinf-I
y examinando si el producto de PCR se divide en dos fragmentos o no
(análisis de RFLP). En concreto, la secuencia en penumbra normal en
la posición 3.664 de la cadena complementaria de la SEC ID Nº 1 es
5'-gaatc-3' y se escinde con
Hinf-I (secuencia de reconocimiento:
5'-g\downarrowantc-3'). Por otro
lado, la secuencia en penumbra mutada en la posición 3.664 de la
cadena complementaria de la SEC ID Nº 1 es
5'-gcatc-3' y no se escinde con
Hinf-I.
El kit de diagnóstico de la presente invención
no está especialmente limitado, siempre que contenga un reactivo,
como un cebador y una sonda, con el que pueda detectarse al menos
una mutación del ADN genómico descrito anteriormente y puede
obtenerse mediante la combinación adicional de otros reactivos.
Entre los ejemplos del kit se incluye una
combinación de un cebador que está diseñado para amplificar la
región genómica que contiene al menos una mutación descrita
anteriormente y, además, al menos un reactivo necesario para
detectar la mutación, incluyendo una sonda que está diseñada para
detectar la región genómica que contiene al menos una mutación
descrita anteriormente, una enzima de restricción y un reactivo
utilizado para los procedimientos de determinación de la secuencia
de bases como el procedimiento Maxam-Gilbert y el
procedimiento de terminación de la cadena. Preferiblemente, se
incluye adicionalmente un kit que comprende un dideoxinucleótido
marcado con fluorescencia.
El diagnóstico de la AR o del riesgo de
aparición puede realizarse con precisión usando el kit
diagnóstico.
El kit de diagnóstico de la presente invención
puede constar, por ejemplo, en el caso de un kit para análisis por
RFLP de la mutación en la posición 3.664, de un conjunto de
cebadores compuesto por las secuencias de bases SEC ID Nº 2 y SEC
ID Nº 3, la enzima de restricción Hinf-I, ADN
sintetasa y similares. Además pueden añadirse un tampón adecuado,
solución de lavado y similares, que no alteran la detección de la
mutación.
La presente invención se explicará
adicionalmente en detalle y específicamente con ejemplos
ilustrativos, aunque no debe interpretarse que se limita a los
ejemplos siguientes.
Se seleccionaron para análisis 90 sujetos de 30
genealogías, constando cada genealogía de 2 pacientes con AR y un
paciente sano. Se extrajo ADN genómico de sangre periférica. Después
de la amplificación de la región con aproximadamente 5,3 kpb de la
zona de penumbra de los exones 23 y 24, que se corresponden con la
región deficiente de 223 pb del ADNc del gen Db1 mediante PCR, se
determinó la secuencia de bases mediante el procedimiento de
terminación con colorante usando un cebador de secuencia (fig. 1)
que se diseñó en función de la secuencia genómica previamente
conocida (Nº de acceso AL033403.1). En el análisis estadístico se
usó la prueba de la chi cuadrado (prueba \chi^{2}) para la
prueba de significancia. A continuación, la secuencia de bases de
cada grupo de cebadores utilizado para la PCR:
Según los resultados, se confirmaron 15
posiciones de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la región
del intrón. En la Tabla 1, se muestran todas las frecuencias. Según
los resultados de la prueba chi cuadrado, se reconoció una
diferencia significativa en la frecuencia entre el paciente con AR
y el sujeto sano (p<0,05) en tres posiciones, es decir,
nt2.632+106(t \rightarrow g), nt2.632+211(a
\rightarrow c) y nt2.745+576 (g \rightarrow a). La denominación,
por ejemplo, nt2.632+106(t \rightarrow g), indica que la
base t del intrón en la posición 106 de la base genómica (base
terminal del exón) que se corresponde con la base de la posición
2.632 en la cadena sentido del ADNc muta a g. Esto se corresponde
con una mutación a \rightarrow c en la posición 3.769 en la SEC ID
Nº 1. De forma similar, nt2.632+211 (a \rightarrow c) se
corresponde con una mutación t \rightarrow g en la posición 3.664
en la SEC ID Nº 1 y nt2.745+576(g \rightarrow a) se
corresponden con una mutación c \rightarrow t en la posición
1.987 de la SEC ID Nº 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se aisló un ADN genómico que constaba de 371 pb
mediante PCR usando cebadores de ADN representados por las
secuencias siguientes:
Db1 F15:
5'-ttggaaatctacccacttgg-3' (SEC ID
Nº 2)
Db1 R11:
5'-aaaccaacggtaagtgaaatg-3' (SEC ID
Nº 3)
que se sintetizaron según las
secuencias conocidas, así como usando la composición de reacción y
las condiciones
siguientes.
La mezcla de reacción del ADN amplificado
obtenido de este modo se hizo reacciona a 37ºC durante 1 hora con
la enzima de restricción Hinf-I (New England
Biolabs, Inc., secuencia reconocida:
5'-G\downarrowANTC-3') usando la
composición de reacción descrita a continuación para una digestión
completa y se analizó de forma convencional usando electroforesis
en gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio.
Los resultados se muestran en la Fig. 2. El
carril 2 es un patrón electroforético del producto de PCR después
del tratamiento con Hinf-I obtenido usando el gen
DB1 normal como molde, en el que la secuencia se escinde en 227 pb
y 144 pb mediante la secuencia reconocida por Hinf-I
(5'-gaatc-3') en la posición 3.664
(nt2.632+211) penumbra. El carril 1 es un patrón electroforético
del producto de PCR derivado de la variante homóloga del gen DB1 en
el que no se observa escisión debido a la desaparición de la
secuencia de reconocimiento de Hinf-I mediante la
mutación t \rightarrow g en la posición 3.664 (mutación a
\rightarrow c de nt2.632+211). El carril 3 es un patrón
electroforético del producto de PCR derivado de la variante
heteróloga del gen Db1. Puesto que se amplificó un fragmento que
tiene la secuencia de reconocimiento Hinf-I y otro
fragmento que no tiene la secuencia de reconocimiento de
Hinf-I, se detectaron simultáneamente 3 fragmentos
que constaba de un fragmento no escindido de 377 pb y 2 fragmentos
escindidos adicionales de 227 pb y 144 pb.
La presente invención se refiere a ADN genómicos
con mutaciones asociadas con la artritis reumatoide humana, un
procedimiento de diagnóstico de la artritis reumatoide humana
usando estas mutaciones, un procedimiento para estimar su aparición
y un kit de diagnóstico de la misma. La presente invención es útil
para la detección de la aparición de la artritis reumatoide o del
riesgo de aparición de la misma, de forma precisa, simple y exacta.
Adicionalmente, la presente invención es útil para el desarrollo de
procedimientos preventivos y terapéuticos y fármacos terapéuticos
novedosos para la artritis reumatoide.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte
del documento de patente europea. Aunque se ha tomado especial
cuidado en la compilación de las referencias, no se pueden excluir
errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este
respecto.
\bullet JP 10513257 A [0003]
\bullet WO 9851794 A [0006]
\bullet JP 0001697 W[0007]
\bullet JP 2001102006 A [0034]
\bulletChiryo, 1991, vol. 73
(3), 23-27 [0003]
\bulletN. Engl. J. Med., 1990,
vol. 322, 1277-1289 [0005]
\bulletCell, 1996, vol. 85,
311-318 [0005]
\bulletEMBO J., 1988, vol. 7
(8), 2465-2473 [0007]
\bulletNature Genetics, 2000,
vol. 26, 163-175 [0010].
<110> Shiozawa, Shunichi
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<120> ADN genómicos implicados en la
artritis reumatoide, un procedimiento de diagnóstico o estimación
del riesgo de aparición de esta enfermedad y kit diagnóstico para la
detección de la misma.
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<130>
02-F-021PCT
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<140>
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<141>
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<150> JP2001-102006
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-03-2001
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<160> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2. 1
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<210> 1
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<211> 3.874
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<300>
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<308> Gen Bank/AL033403.1
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<309>
23-11-1999
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipttggaaatct acccacttgg
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 3
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\hfill21
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<210> 4
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<211>18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskiptaacagaacg ggataagt
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 6
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<400> 7
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgcaaggtcaa cctacatt
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 12
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\hfill26
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<211>17
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgctacttgcc atttgac
\hfill17
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Claims (7)
1. Un ADN genómico implicado en la artritis
reumatoide, que comprende al menos una de las siguientes mutaciones
en el ADN genómico que consta de la secuencia de bases de la SEC ID
Nº 1:
1) sustitución de timina (t) por citosina (c) en
la posición 1.987;
2) sustitución de guanina (g) por timina (t) en
la posición 3.664; y
3) sustitución de citosina (c) por adenina (a)
en la posición 3.769.
2. El ADN genómico de la reivindicación 1
aislado de células humanas.
3. Un procedimiento in vitro de
diagnóstico de la artritis reumatoide o un procedimiento para
estimar el riesgo de aparición de artritis reumatoide, que
comprende la detección de al menos una de las mutaciones definidas
en la reivindicación 1.
4. El procedimiento in vitro de la
reivindicación 3, en el que la detección se realiza mediante un
procedimiento de sonda oligonucleotídica específica de alelo, un
procedimiento de ensayo de ligamiento de oligonucleótidos,
procedimiento de PCR, el procedimiento de sondas oligonucleotídicas
invasivas, el procedimiento de ampliación por círculo rodante y
procedimiento de extensión de base con cebador
oligonucleotídico.
5. El procedimiento in vitro de las
reivindicaciones 3 ó 4 en el que la sustitución de guanina (g) por
timina (t) en la posición 3.664 en el ADN genómico se detecta
usando cebadores de la SEC ID Nº 2 y 3 en PCR y la escisión del
producto con HinfI.
6. Un kit de diagnóstico para diagnosticar la
artritis reumatoide o estimar el riesgo de aparición de la artritis
reumatoide según el procedimiento de la reivindicación 5, que
comprende un conjunto de cebadores que consta de las secuencias de
bases de SEC ID Nº 2 y 3 y una enzima de restricción HinfI.
7. Uso in vitro del kit de la
reivindicación 6 en el diagnóstico de la artritis reumatoide y del
riesgo de aparición de la misma.
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