ES2329543T3 - Procedimiento para la deteccion de enfermedades. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la detección selectiva en un paciente de cáncer o pre-cáncer, en el que el procedimiento comprende: determinar la integridad de los ácidos nucleicos en una muestra de heces de un paciente, que comprende células desprendidas o residuo celular; e identificar una detección selectiva positiva como una muestra en la que la integridad de los ácidos nucleicos supera un umbral pre-determinado, o identificar en dicho paciente como que tiene cáncer o pre-cáncer si están presentes ácidos nucleicos en dicha muestra en una cantidad superior a un umbral pre-determinado.
Description
Procedimientos para la detección de
enfermedades.
Muchas enfermedades se asocian con inestabilidad
genómica. Es decir, una alteración de la estabilidad genómica, tal
como una mutación, se ha vinculado con el inicio o la progresión de
ciertas enfermedades. En consecuencia se han propuestos varios
aspectos de inestabilidad genómica como marcadores fiables de
enfermedad. Por ejemplo, se han propuesto mutaciones en los genes
BRCA como marcadores de cáncer de mama y mutaciones en el gen
regulador del ciclo celular p53 se han asociado con numerosos
cánceres, especialmente con el cáncer colorrectal. Se ha sugerido
que mutaciones específicas podrían ser una base de los ensayos de
detección selectiva molecular para las etapas tempranas de ciertos
tipos de cáncer. Véase, por ejemplo, Sidransky y col., Science, 256:
102-105 (1992).
La búsqueda de marcadores genómicos de
enfermedad ha sido especialmente intensa en el área de la detección
del cáncer. El cáncer se caracteriza por un crecimiento celular
incontrolado, que se puede asociar con una o más mutaciones
genéticas. Dichas mutaciones pueden hacer que las células afectadas
eviten la muerte celular. Por ejemplo, una mutación en un gen
supresor tumoral puede hacer que las células eviten la apoptosis, un
tipo de muerte celular que se piensa que está bajo control genético
directo. Durante la apoptosis, las células pierden sus membranas,
el citoplasma se condensa y la cromatina nuclear se divide en
fragmentos de oligonucleótidos de una longitud característicamente
corta. De hecho, dichos patrones características de escisión de ADN
se han propuesto como ensayo para apoptosis.
Se han realizado intentos para identificar y
usar marcadores de ácido nucleico que son indicativos de cáncer. No
obstante, incluso cuando se encuentran dichos marcadores, se ha
probado que su uso para la detección en muestras de pacientes,
especialmente muestras heterogéneas, no tiene éxito debido a una
incapacidad para obtener suficiente material de muestra o debido a
la baja sensibilidad resultado de medir sólo un único marcador. Se
ha probado que obtener simplemente una cantidad adecuada de ADN
humano de un tipo de muestra heterogénea, heces, es difícil Véase
Villa, y col., Gastroenterol., 110: 1346-1353 (1996)
(en el que se notifica que solo el 44,7% de todas las muestras de
heces y solo el 32,6% de las heces de individuos sanos produce
suficiente ADN para el análisis de mutaciones). Otros informes en
los que se ha obtenido ADN adecuado han comunicado una sensibilidad
baja en la identificación del estado patológico de un paciente sobre
la base de una única mutación asociada con el cáncer. Véase Eguchi,
et al., Cancer, 77: 1707-1710 (1996) (usando
una mutación en p53 como mercado para el cáncer).
Los investigadores han intentado analizar
mutaciones en el ADN de células tumorales en áreas luminales, tales
como el colon, conductos biliares, vasos sanguíneos y similares.
Estos intentos sólo han tenido éxito cuando hay una mutación
conocida y se ha encontrado una concentración relativamente alta de
material celular. Véase, p. ej., Mulcahy, y col., Ann. Oncol. 10
Suppl 4: 114-117 (1999). No se han realizado
intentos para correlacionar el estado de la enfermedad con la
integridad del ADN en el material celular desprendido.
Giacona Mary Beth y col. (1998), Páncreas, vol
17(1), páginas 89 a 97 desvelan el análisis de AND sin célula
en plasma sanguíneo humano.
El documento US 3.413.464 desvela procedimientos
para medir ácido nucleico en muestras biológicas tras potenciación
en una solución ácida.
El documento WO 99/07895 desvela procedimientos
para cuantificar moléculas de ácido nucleico.
El documento WO 96/23895 desvela la detección y
cuantificación del daño de ADN en animales y en cultivos
celulares.
Allen R. Todd y col. (1997), Journal of
Pharmacological and Toxicological Methods, vol 37(4), páginas
215-228 desvela la caracterización morfológica y
bioquímica y el análisis de la apoptosis.
Schmitt Estelle y col. (1998), Cell Death and
Differentiation, vol. 5 (6), Junio 1998, páginas
506-516 desvela que Bax-\alpha
estimula la apoptosis inducida por quimioterapia para el cáncer y
acelera la activación de cisteína proteasas similares a la caspasa
3 en células Namalwa de linfoma B con mutación doble en p53.
La presente invención proporciona que la
integridad de los ácidos nucleicos en muestras biológicas que
comprenden material celular desprendido es un indicador del estado
de enfermedad del paciente del que se obtuvo la muestra. De acuerdo
con la invención, ciertas muestras de tejido o de líquido corporal,
especialmente las que se describen más adelante, contienen residuos
de células que se han desprendido de órganos o tejidos adyacentes.
En pacientes sanos, tales residuos son el resultado de la apoptosis
como parte del ciclo celular normal. La apoptosis reduce la
integridad del ácido nucleico, de modo que en residuos celulares de
individuos sanos sólo existen ácidos nucleicos de fragmento
pequeño. Por el contrario, en enfermedades como el cáncer en las que
los mecanismos del ciclo celular se han destruido o alterado, el
residuo celular comprende ácidos nucleicos de alta integridad (es
decir, ácidos nucleicos que no han sido degradados mediante
apoptosis). Por tanto, los procedimientos de la invención comprende
el uso de la integridad del ácido nucleico como medida del estado de
enfermedad del paciente. La integridad se puede medir por cualquier
medio conveniente. Entre los medios preferidos se incluyen la
cantidad de ácido nucleico en una muestra, la longitud de los ácidos
nucleicos en una muestra, o el peso molecular de los ácidos
nucleicos en una muestra.
La invención proporciona procedimientos para
detectar cáncer o pre-cáncer en un paciente sobre la
base de la integridad de los ácidos nucleicos del paciente
presentes en un espécimen o muestra obtenidos del paciente. De
acuerdo con los procedimientos de la invención, un espécimen de
tejido o de fluido corporal que contiene residuo celular
desprendido obtenido de un paciente con una enfermedad contiene una
cantidad de ácido nucleico intacto que es mayor a lo que cabría
esperar en tal espécimen obtenido de un paciente sano. Por tanto,
una medida de ácido nucleico intacto en una muestra de paciente es
indicativa del estado de enfermedad global del paciente. Como se
usa en la presente memoria descriptiva, "intacto" se refiere a
ácidos nucleicos que son más largos que los que cabría esperar que
estuvieran presentes como resultado de la apoptosis. La invención
es igualmente aplicable para usos humanos y veterinarios. De acuerdo
con esto, "paciente", como se define en la presente memoria
descriptiva, significa seres humanos u otros animales.
Un paciente sano generalmente produce residuos
celulares mediante degradación apoptótica normal, lo que tiene como
resultado fragmentos relativamente cortos de ácido nucleico en
muestras derivadas de tejido y fluidos luminales. Pacientes que
tienen una enfermedad generalmente producen células y residuos
celulares, una proporción de las cuales ha evitado una regulación
normal del ciclo celular, lo que tiene como resultado fragmentos de
ácido nucleico intactos y relativamente largos. Sin pretender ligado
a la teoría, la presente invención aprovecha esta y otras ideas
concernientes al modo en que las células responden a enfermedades,
especialmente enfermedades asociadas con anomalías genéticas
(inducidas o heredadas). Como resultado, se ha descubierto que el
estado de enfermedad de un paciente se determina mediante análisis
de los ácidos nucleicos del paciente producidos en especimenes
obtenidos del paciente. Más preferentemente, dichos especimenes son
aquéllos que con mayor probabilidad contienen residuos celulares
desprendidos. Tales especímenes incluyen, entre otros, heces, suero
sanguíneo o plasma, esputo, pus, calostro y otros. En enfermedades
como el cáncer, en el que las inestabilidades o anomalías genómicas
han interferido con la regulación normal del ciclo celular, los
especimenes tales como los identificados en lo que antecede
contienen fragmentos de ácido nucleico relativamente intactos. La
presencia de dichos fragmentos es una detección selectiva
diagnóstica general de la enfermedad.
De acuerdo con esto, los procedimientos de la
invención comprenden la detección selectiva de un paciente para
cáncer o pre-cáncer mediante análisis de la
integridad de los ácidos nucleicos en un espécimen de tejido o de
fluido corporal obtenido del paciente. Entre los especimenes
preferidos se incluyen los que comprenden células desprendidas o
residuos celulares. Por tanto, especimenes altamente preferidos son
aquéllos que no contienen abundancia de células intactas (no
exfoliadas). Dichos especimenes preferidos comprenden heces,
esputo, orina, bilis, jugo pancreático y suero sanguíneo o plasma,
todas ellas contienen células desprendidas o residuos celulares.
Los procedimientos de la invención son especialmente útiles como
detecciones selectivas de cáncer. El cáncer es una enfermedad que
se piensa que está asociada con inestabilidades genómicas y,
específicamente, con la pérdida de control sobre el ciclo celular
normal. Por tanto, las células tumorales normalmente están intactas
y generalmente se desprenden en, por ejemplo, heces, esputo, orina,
bilis, jugo pancreático y sangre. Tales células desprendidas y
residuo celular contienen ácidos nucleicos de mayor integridad en
comparación con las que se encuentran en especimenes obtenidos de
un paciente sano. Hay numerosos modos por los que la integridad de
los ácidos nucleicos en un espécimen de un paciente se mide como
detección selectiva de cáncer o pre-cáncer.
En una forma de realización preferida, la
integridad del ácido nucleico se mide por la capacidad de amplificar
los ácidos nucleicos en una muestra. Por tanto, un procedimiento
preferido comprende realizar en una muestra de tejido o de fluido
corporal una reacción de amplificación usando como molde un locus de
ácido nucleico que se sospecha que está en la muestra. Si la
cantidad del producto de la amplificación (amplicón) es mayor a la
cantidad de amplicón que se prevé que esté presente en una muestra
normal (p. ej., una que no tiene la enfermedad que se está
buscando), se determina que la muestra es positiva. En algunos
casos, la presencia de algún producto de amplificación es
suficiente para justificar una detección positiva de la enfermedad.
Es preferible que, en el caso del ADN, la reacción de amplificación
sea una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o, en el caso del
ARN, que la reacción de amplificación sea una PCR con transcriptasa
inversa. Se han diseñado cebadores para amplificar el locus o los
loci escogidos para el análisis. Para los fines de la invención, un
"locus genómico" es cualquier elemento genético, incluidos,
entre otros, una región de codificación de un gen, una región de
ácido nucleico no codificadora, un elemento regulador de un gen, un
intrón o ARN. No es necesario que los loci genómicos diana estén
asociados con ningún cáncer o pre-cáncer específico
porque un incremento en el ácido nucleico amplificable es, en sí
mismo, diagnóstico.
En una forma de realización preferida, la
presencia de un único amplicón de alto peso molecular es una
detección positiva. Preferentemente, un fragmento de
aproximadamente 1,3 Kb o mayor se mide como indicador de ácidos
nucleicos de alta integridad en la muestra del paciente.
En una forma de realización altamente preferida,
se produce un perfil de productos de amplificación a través de una
gama de fragmentos de ácido nucleico de diferentes longitudes. En
una forma de realización preferida, se realiza una serie de
reacción de amplificación en un único locus genómico, estando cada
reacción diseñada para amplificar un fragmento de longitud única.
Si se produce un amplicón detectable en cada reacción, o en una
serie de reacciones, superior al previsto en una muestra obtenida de
un paciente sano, se determina que la muestra es positiva. Por
ejemplo, se han realizado intentos para amplificar fragmentos de 200
pb, 400 pb, 800 pb, 1,3 Kb, 1,8 Kb y 2,4 Kb en el mismo locus
genómico. En una muestra obtenida de un individuo sano (una muestra
"normal"), cabría esperar que se observa poco o ningún producto
de amplificación, especialmente cuando como molde se usan las
porciones más largas del locus. Por el contrario, al menos alguna
proporción de células y residuo celular en una muestra obtenida de
un paciente enfermo contendrá fragmentos intactos.
En otra forma de realización se produce un
perfil de productos de amplificación a través de una gama de
fragmentos de ácido nucleico de diferentes longitudes mediante una
serie de reacciones de amplificación realizadas en una serie de
loci genómicos diferentes, estando cada reacción diseñada para
amplificar un fragmento de longitud única. Si se produce un
amplicón detectable en cada reacción, o en una serie de reacciones,
superior al previsto en una muestra obtenida de un paciente que no
tiene la enfermedad que se busca, se determina que la muestra es
positiva.
De acuerdo con los procedimientos de la
invención, las muestras normales no producen cantidades
significativas de amplicón detectable a ninguna longitud
significativamente mayor que el fragmento apoptótico típico
(aproximadamente 175 pb). De acuerdo con esto, si los cebadores
están espaciados para amplificar fragmentos de sólo una longitud en
un locus genómico dado o si se realiza una serie de amplificaciones
en el locus, fácilmente se pueden observar diferencias entre las
muestras normales y de enfermos.
Como se detalla más adelante, los procedimientos
de la invención son útiles para detectar cáncer o
pre-cáncer en muestras biológicas, que comprende
células desprendidas o residuo celular. Por ejemplo, la presencia en
una muestra de heces de un paciente de cantidades de ácido
nucleico, preferentemente ADN, por encima de un umbral
pre-determinado para pacientes sanos es indicativa
de que el paciente tiene cáncer. El análisis de seguimiento se usa
para determinar si está la enfermedad. No obstante, la detección
selectiva de la enfermedad general es eficaz con independencia del
locus de la enfermedad y del espécimen tomado para analizar. Por
tanto, mientras que el análisis de ácidos nucleicos en heces
generalmente es predictivo de la enfermedad, no necesariamente
indica que la enfermedad es de origen gastrointestinal. No obstante,
la detección selectiva de seguimiento basada en, por ejemplo,
análisis mutacional, es adecuada para identificar el locus de la
enfermedad. En la técnica se conocen numerosos análisis
mutacionales e incluyen, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº
5.670.325.
En una forma de realización alternativa, la
detección selectiva de muestras de pacientes mediante la detección
de cantidades de ácido nucleico en la muestra se combina con un
ensayo de actividad celular apoptótica. Tales ensayos se pueden
combinar con la detección de cantidades de ácido nucleico en una
muestra de paciente como detección selectiva de un estado de
enfermedad. Una detección selectiva positiva es una que produce: (1)
una cantidad de ácido nucleico que es superior a la cantidad que se
prevé que esté presente en una muestra normal (p. ej., una que no
tiene la enfermedad que se está buscando) y (2) una cantidad de
actividad celular apoptótica que es inferior a la que se prevé que
esté presente en una muestra normal. En una forma de realización
altamente preferida, los procedimientos de la invención comprenden
analizar una pluralidad de loci genómico para determinar una
cantidad de ácido nucleico amplificable presente en cada locus. El
análisis de múltiples loci usando procedimientos de la invención
puede incrementar la sensibilidad del ensayo de detección
selectiva.
Como se pone como ejemplo con detalle más
adelante, los procedimientos de la invención comprenden la detección
selectiva de una muestra biológica para una anomalía en un ácido
nucleico mediante la realización de una reacción de amplificación
usando como molde un ácido nucleico que se sospecha, o se prevé, que
esté en la muestra; la determinación de una cantidad del producto
de amplificación obtenido; la comparación de la cantidad de
amplicón obtenido con una cantidad estándar de producto de
amplificación; y la identificación de una muestra que tiene una
anomalía en un ácido nucleico si la cantidad de producto de
amplificación difiere de la cantidad estándar. En una forma de
realización preferida, una cantidad estándar de producto de
amplificación se determina mediante la amplificación de un locus,
una porción del mismo, que se está buscando (p. ej., un ácido
nucleico salvaje intacto) en una muestra normal conocida (una
obtenida de un individuo del que se sabe que no tiene la enfermedad
que se está buscando). También en formas de realización preferidas,
una cantidad estándar se determina por referencia a la técnica. En
ciertas formas de realización de la invención, la cantidad estándar
es esencialmente amplicón no detectable debido a la ausencia en la
muestra de ácidos nucleicos de alta integridad. En consecuencia,
cualquier amplicón en la muestra de un paciente es indicativo de una
detección selectiva positiva. Especialmente este es el caso cuando
se está buscando un fragmento largo (p. ej. de 1,8 Kb o 2,4 Kb).
Por último, la cantidad estándar puede ser un marcador de peso
molecular en, por ejemplo, un gel electroforético.
En una forma de realización preferida de la
invención, la muestra se prepara a partir de un espécimen
seleccionado del grupo constituido por heces, esputo, sangre,
orina, líquido cefalorraquídeo, líquido seminal, saliva, aspirado
de pezón de mama y tejido de biopsia. No obstante se puede usar
cualquier espécimen de tejido o fluido corporal de acuerdo con los
procedimientos de la invención. Especialmente preferidas son las
muestras de fluido luminal porque dichas muestras están,
generalmente, libre de células sanas intactas. Dichas muestras
incluyen sangre, orina bilis, jugo pancreático, heces, esputo, pus
y similares.
También en una forma de realización preferida,
el ácido nucleico o ácidos nucleicos que se está buscando es ADN.
En una forma de realización más concreta, el ácido nucleico que se
está analizando se selecciona a partir de una región codificadora
de un gen, o una porción de la misma, una región de ácido nucleico
no codificadora, o una porción de la misma, un elemento regulador
de un gen o una porción del mismo, y un fragmento no identificado
de ADN genómico. También en una forma de realización preferida, el
ácido nucleico que se está buscando es ARN. Como el experto en la
técnica aprecia, cualquier locus genómico es susceptible de
someterse a detección selectiva de acuerdo con la invención. El
locus o loci concretos escogidos para el análisis depende, en parte,
de la enfermedad que se esté buscando y de la comodidad del
investigador. No es necesario que el locus o loci escogidos para el
análisis se correlacione con alguna enfermedad específica porque los
procedimientos de la invención contemplar medir el ácido nucleico
total en una muestra o ácido nucleico amplificable en una muestra
como indicador del estado de enfermedad global o de la presencia y/o
extensión de la apoptosis en la muestra. No obstante, se pueden
usar loci asociados con enfermedad (aquéllos en los que una mutación
es indicativa, causal o, de otro modo, evidencia de enfermedad).
Entre los loci asociados con enfermedad preferidos se incluyen p53,
apc, MSH-2, dcc, scr, c-myc,
B-catenina, mlh-1,
pms-1, pms-2,
pol-delta y bax.
La cantidad de producto de amplificación se
puede determinar mediante cualquier medio adecuado o cómodo.
Preferentemente, la cantidad de producto de amplificación se
determina mediante electroforesis en gel. Se pueden usar
indicadores, tales como indicadores fluorescentes o radiactivos.
Las cantidades de producto de amplificación producido se pueden
comparar con cantidades estándar mediante cualquier medio adecuado o
cómodo, incluidos, entre otros, comparación visual, comparación
óptica con máquina, densitometría, espectroscopia de masas, captura
de híbridos y otros medios conocidos. La reacción de amplificación,
en sí misma, puede ser cualquier medio para amplificar ácido
nucleico, incluidos, entre otros, PCR, RT-PCR, OLA,
círculo rodante, extensión de una base, y otros conocidos en la
técnica. El producto de amplificación también se puede medir
mediante técnicas de amplificación de señal, tales como
amplificación de cadena ramificada (Chiron). Los procedimientos de
la invención son útiles con cualquier plataforma para la
identificación, amplificación, secuenciación u otro tipo de
manipulación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, se pueden aplicar
procedimientos de la invención a la reacción en cadena de la
ligasa, el desplazamiento de hebra
(Becton-Dickinson) y otros.
También en una forma de realización preferida de
la invención se lleva a cabo una serie de reacciones de
amplificación en un locus genómico sencillo. Cada reacción de
amplificación en la serie se diseña para amplificar un fragmento de
una longitud diferente. En una forma de realización preferida, las
longitudes diana del fragmento son 200 pb, 400 pb, 800 pb, 1,3 Kb,
1,8 Kb y 2,4 Kb. Los cebadores para la amplificación se han diseñado
de acuerdo con los conocimientos de la técnica con el fin de
amplificar el molde, si está presente, de la longitud deseada en el
locus deseado. Una detección positiva selectiva es una que produce
amplicón en al menos una, y preferentemente al menos dos de las 4
series de reacciones de amplificación. Como se ha indicado antes,
una muestra normal que ha sufrido o que está sufriendo apoptosis,
normalmente contiene pocos o ningún fragmento de longitud
significativa. Por tanto, una serie de reacciones de amplificación
dirigida a fragmentos de aproximadamente 200 pb a aproximadamente
2,4 Kb y más largos revela muestras que pueden contener ácidos
nucleicos que han evitado la apoptosis, como pone de manifiesto la
amplificación de fragmentos largos.
Procedimientos preferidos de la invención
también comprenden realizar reacciones de amplificación con una
serie de diferentes loci genómicos. Preferentemente se usan de
aproximadamente 2 a aproximadamente 7 loci. No obstante, el
investigador individual determina el número preciso de loci
analizados sobre la base de la enfermedad que se ha de detectar o
sobre la base de la comodidad. De acuerdo con los procedimientos de
la invención, se diseñan cebadores para amplificar el ácido
nucleico (preferentemente ADN) en cada uno de los loci escogidos.
Una muestra en la que al menos un locus, preferentemente al menos
dos loci, y más preferentemente al menos tres loci, producen un
producto de amplificación detectable se considera una muestra
positiva. Las longitudes de los fragmentos que se han de amplificar
en este ensayo se pueden variar, pero tienen una longitud de,
preferentemente, al menos aproximadamente 180 pb cada uno. No es
necesario que se amplifiquen en cada uno de los loci escogidos los
fragmentos de la misma longitud.
Los procedimientos de la invención también
comprenden realizar una serie de reacciones de amplificación en una
serie de loci genómicos diferentes. Cada reacción de amplificación
en la serie se diseña para amplificar un fragmento de una longitud
diferente. Preferentemente se usan de aproximadamente 2 a
aproximadamente 7 reacciones de amplificación con aproximadamente 2
a aproximadamente 7 loci. No obstante, el investigador individual
determina el número preciso de loci analizados sobre la base de la
enfermedad que se ha de detectar o sobre la base de la comodidad. En
una forma de realización preferida, las longitudes diana del
fragmento son 200 pb, 400 pb, 800 pb, 1,3 Kb, 1,8 Kb y 2,4 Kb. Los
cebadores para amplificación se diseñan de acuerdo con los
conocimientos de la técnica con el fin de amplificar el molde, si
hay. Se prefiere, aunque no es necesario, que se amplifiquen en
cada uno de los loci escogidos los fragmentos de la misma longitud.
Una detección selectiva positiva es una que produce amplicón en al
menos una, y preferentemente al menos dos, de las series de
reacciones de amplificación y en la que al menos un locus,
preferentemente al menos dos loci, y más preferentemente al menos
tres loci, producen producto de amplificación detectable. Como se
ha indicado antes, una muestra normal que ha sufrido o que está
sufriendo apoptosis, normalmente contiene pocos o ningún fragmento
de longitud significativa. Por tanto, una serie de reacciones de
amplificación dirigida a fragmentos de aproximadamente 200 pb a
aproximadamente 2,4 Kb y más largos revela muestras que pueden
contener ácidos nucleicos que han evitado la apoptosis, como pone
de manifiesto la amplificación de fragmentos largos.
Los procedimientos de la invención también
pueden usarse para valorar la integridad de ADN en una muestra
biológica. Dichos procedimientos comprenden realizar una reacción de
amplificación usando como molde al menos dos loci de los que se
sospecha que están en la muestra;
determinar qué loci producen amplicón
detectable; y valorar la integridad del ADN en la muestra como
función del número de loci que producen amplicón. La integridad del
ADN en la muestra es elevada cuando el amplicón se produce en una o
más de las reacciones de amplificación. Este procedimiento es
especialmente útil para determinar si una muestra heterogénea tiene
suficiente ácido nucleico para medir. De acuerdo con esto, dichos
procedimientos se usan para la detección selectiva o
"cualificar" muestras para su posterior análisis (p. ej.,
análisis genético, bioquímico, citológico o de otro tipo).
Los procedimientos de la invención también se
pueden usar para valorar las anomalías fetales realizando reacciones
de amplificación con ácidos nucleicos en la sangre materna.
Exactamente como se ha descrito en lo que antecede, la capacidad
para amplificar cantidades significativas de ácido nucleico es un
indicador de inestabilidad genómica. Un valor basal para la
comparación de la extensión de la amplificación del ácido nucleico
puede ser las cantidades de ácidos nucleicos de muestras normales
conocidas. La cantidad de amplificación obtenida de muestras
fetales se introduce en un continuo y el investigador debe analizar
cualquier muestra dada en términos de la cantidad de ácido nucleico
fetal producido en varios estados de enfermedad y en muestras
normales.
Los procedimientos de la invención son útiles
como procedimientos de detección selectiva diagnósticos. A menudo
es deseable realizar pruebas de seguimiento en un paciente con el
fin de confirmar un estado de enfermedad que se sospecha. Dichos
procedimientos de seguimiento se determinan sobre la base del estado
de enfermedad que se está analizando. Por ejemplo, se puede sugerir
la realización de una colonoscopia en un caso en el que una muestra
de heces sea positiva en la detección selectiva de acuerdo con los
procedimientos de la invención. Dichos procedimientos de
seguimiento se contemplan en la presente memoria descriptiva como
parte de la invención.
Los procedimientos de la invención son útiles
como detección selectiva de una amplia gama de cánceres o
pre-cánceres. Además de los cánceres y adenomas de
colon, los procedimientos de la invención son útiles para la
detección selectiva de otras enfermedades, por ejemplo para la
detección selectiva de linfomas, o cánceres o adenomas de estómago,
pulmón, hígado, páncreas, próstata, riñón, testículos, vejiga
urinaria, útero u ovario. Los procedimientos de la invención son
especialmente útiles para la detección selectiva de cualquier
enfermedad que altere la función adecuada del sistema
gastrointestinal; más especialmente enfermedades del colon. Los
procedimientos de la invención también son útiles para la detección
selectiva de apoptosis en una muestra celular. El perfil de ADN
amplificable en una muestra se correlaciona con proteínas que se han
asociado con enfermedad. Por ejemplo, la regulación por aumento de
la proteína de la apoptosis, survivina, se correlaciona con mayores
cantidades de ADN amplificable, como el del encogen Ras, además de
otros oncogenes y sus productos génicos.
Los procedimientos de la invención son también
útiles como ensayos de apoptosis. La presencia de fragmentos de
alta integridad o de grandes cantidades de ácidos nucleicos en una
muestra indica que la muestra derivaba de células que no habían
pasado por la apoptosis. La ausencia de dichos fragmentos o
cantidades indica que las células que contribuyeron a la muestra sí
habían sufrido apoptosis. De acuerdo con esto, un ensayo de
actividad apoptótica de la invención, bien solo o en combinación con
otros ensayos de la inestabilidad genómica, es útil como detección
selectiva de enfermedad.
Por último, los procedimientos de la invención
se pueden llevar a cabo mediante captura híbrida. Por ejemplo, se
puede usar la captura híbrida y el posterior análisis de los
fragmentos capturados para determinar la integridad del ácido
nucleico de una muestra.
La invención también proporciona un perfil de
fragmentos de ácido nucleico indicativo de enfermedad. Un perfil
preferido se obtiene mediante los procedimientos descritos en lo que
antecede. Los perfiles preferidos comprenden ácidos nucleicos que
tienen entre aproximadamente 200 pb y aproximadamente 2m6 Kb
obtenidos en una muestra de pacientes, que comprende residuo
celular de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente
memoria descriptiva. Un perfil altamente preferido contiene al
menos un ácido nucleico de al menos 1,3 Kb.
Otros objetos y ventajas de la invención son
evidentes tras la consideración de las figuras siguientes y
descripción detallada de las mismas.
La figura 1 es una fotografía de gel, que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de
K-ras (exón 1) aislado de heces usando cebadores
directos e inversos separados por aproximadamente 200 pb. La
intensidad de la banda se refiere a la cantidad de producto de 200
pb o más en la muestra. Las calles 1-4 son los
resultados de pacientes con cáncer o adenoma, la calle 5 es un
control positivo, las calles 6-10 son de pacientes
que no tenían cáncer o adenoma, las calles 11-12
son controles negativos y las calles 13-18 son
patrones en el peso molecular aproximado indicado en la figura.
Las amplificaciones se graduaron de A a C, siendo A la banda más
intensa y c la menos intensa.
Las figuras 2-4 son fotografías
de geles, que muestra los resultados de la amplificación del ADN de
apc (exón 15) aislado de heces usando cebadores directos e inversos
separados por aproximadamente 200 pb. La intensidad de la banda se
refiere a la cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra. Las
calles 1-4 son los resultados de pacientes con
cáncer o adenoma, la calle 5 es un control positivo, las calles
6-10 son de pacientes que no tenían cáncer o
adenoma, las calles 11-12 son controles negativos y
las calles 13-18 son patrones en el peso molecular
aproximado indicado en la figura. Las amplificaciones se graduaron
de A a C, siendo A la banda más intensa y c la menos intensa.
La figura 5 es una fotografía de gel, que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de p53 (exón 5)
aislado de heces usando cebadores directos e inversos separados por
aproximadamente 200 pb. La intensidad de la banda se refiere a la
cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra. Las calles
1-4 son los resultados de pacientes con cáncer o
adenoma, la calle 5 es un control positivo, las calles
6-10 son de pacientes que no tenían cáncer o
adenoma, las calles 11-12 son controles negativos y
las calles 13-18 son patrones en el peso molecular
aproximado indicado en la figura. Las amplificaciones se graduaron
de A a C, siendo A la banda más intensa y c la menos intensa.
La figura 6 es una fotografía de gel, que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de p53 (exón 7)
aislado de heces usando cebadores directos e inversos separados por
aproximadamente 200 pb. La intensidad de la banda se refiere a la
cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra. Las calles
1-4 son los resultados de pacientes con cáncer o
adenoma, la calle 5 es un control positivo, las calles
6-10 son de pacientes que no tenían cáncer o
adenoma, las calles 11-12 son controles negativos y
las calles 13-18 son patrones en el peso molecular
aproximado indicado en la figura. Las amplificaciones se graduaron
de A a C, siendo A la banda más intensa y c la menos intensa.
La figura 7 es una fotografía de gel, que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de p53 (exón 8)
aislado de heces usando cebadores directos e inversos separados por
aproximadamente 200 pb. La intensidad de la banda se refiere a la
cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra. Las calles
1-4 son los resultados de pacientes con cáncer o
adenoma, la calle 5 es un control positivo, las calles
6-10 son de pacientes que no tenían cáncer o
adenoma, las calles 11-12 son controles negativos y
las calles 13-18 son patrones en el peso molecular
aproximado indicado en la figura. Las amplificaciones se graduaron
de A a C, siendo A la banda más intensa y c la menos intensa.
La figura 9-10 son fotografías
de geles de los resultados de la amplificación del ADN de muestras
de heces usando cebadores directos e inversos separados por
aproximadamente 1,8 Kb. La intensidad de la banda muestra la
cantidad de producto de 1,8 Kb o mayor. Las calles 1, 8 y 9 son
controles negativos, las calles 2, 3 y 5 son los resultados de
pacientes con cáncer o adenoma, las calles 4, 6 y 7 son los
resultados de pacientes que no tenían cáncer o adenoma y las calles
10-14 son los patrones del peso molecular.
Las Figuras 11A y B son fotografías de geles de
los resultados de la amplificación de ADN en heces de un total de
30 pacientes y controles. La intensidad de la banda se refiere a la
cantidad de ADN amplificable en la muestra. Las calles N son
controles negativos, las calles 1, 3, 11 y 18 son los resultados de
pacientes que son indicativos de la presencia de cáncer o adenoma,
las calles 2, 4, 5-10, 12-17 y
19-30 son los resultados de pacientes que son
indicativos de la ausencia de cáncer o adenoma. Las calles restantes
son marcadores o patrones.
La Figura 12 muestra una representación
esquemática de la colocación de los cebadores para amplificar en un
procedimiento de la presente invención. En este procedimiento, un
único dejador directo, F_{1}, se usa junto con una serie de
dejadores inversos, R_{1} a R_{6}, escogidos para amplificar
porciones de la diana progresivamente más largos.
La Figura 13 muestra una representación
esquemática de la colocación de los cebadores para amplificar en un
procedimiento de la presente invención. En este procedimiento se
escoge una serie de pares de dejadores directos e inversos
(F_{1}, R_{1}) a (F_{3}, R_{3}), para amplificar porciones
de la diana separadas por intervalos a lo largo de la diana.
La invención proporciona procedimientos para el
análisis de muestras biológicas. Los procedimientos de la invención
proporcionan información diagnósticamente relevante para la
integridad de los ácidos nucleicos en una muestra biológica. Las
muestras biológicas normales (aquéllas que no presentan indicios del
cáncer o pre-cáncer que se está buscando),
especialmente aquéllas que comprenden tejido y/o fluido luminal,
normalmente comprenden una mayoría de ácidos nucleicos
(especialmente ADN) de fragmento corto y baja integridad, que son el
resultado de la degradación mediante apoptosis. Cuando una
mutación ha producido inestabilidad genómica se puede alterar el
ciclo celular normal y puede que no se produzca la degradación
apoptótica a la velocidad esperada en una muestra normal. Los
procedimientos de la invención buscan dichas alteraciones.
Como consecuencia, los procedimientos preferidos
de la invención comprenden determinar una cantidad de ácido
nucleico amplificable en una muestra biológica y determinar si la
cantidad es consistente con una cantidad esperada en una muestra
normal.
En muchas muestras biológicas, especialmente
muestras heterogéneas, puede no haber producto de amplificación
detectable. Esto es especialmente cierto cuando se usan fragmentos
más largos como moldes para amplificación. Generalmente, la
probabilidad de que cualquier conjunto dado de cebadores para PCR
amplifique un fragmento de ADN que tenga una longitud superior a la
distancia del cebador se expresa como
% de Fragmentos
amplificados =
(LF-DC)/(LF+DC)
en la que LF es la longitud del
fragmento (en pares de bases) y DC es la distancia al cebador (en
pares de bases). Esta ecuación supone que las longitudes del
fragmento de ADN de la muestra se distribuyen de forma uniforme (es
decir, no hay un locus preferido en el que se produce la
rotura).
En una forma de realización preferida, los
procedimientos de la invención comprenden amplificar secuencias de
diferente longitud en una muestra, si están presentes, con el fin de
generar un perfil de productos de amplificación indicativo de
enfermedad o de la propensión sufrir la enfermedad. En un
procedimiento preferido, una muestra se expone a un conjunto de
cebadores para PCR que comprende un único cebador directo, que puede
ser una sonda de captura usada para capturar fragmentos diana, y
una pluralidad de cebadores inversos en 3' que hibridan con
porciones de una secuencia contigua (si está presente) en la
muestra. Las amplificaciones que usan estos cebadores tendrán como
resultado una serie de productos de amplificación, cada uno con una
longitud diferente, su la secuencia diana contigua está presente en
la muestra. La longitud de los productos de amplificación se
determina mediante los espacios entre el cebador directo y cada uno
de los cebadores inversos en 3'. Un ejemplo se muestra en la Figura
12, que es una representación esquemática que muestra la colocación
de los cebadores para amplificación.
Si la secuencia diana, o una porción de ella,
está presente en la muestra, la amplificación tendrá como resultado
una serie de fragmentos cuya longitud viene dictada por la
espaciación de los cebadores. De acuerdo con los principios
aducidos en lo que antecede, una muestra de un paciente enfermo
producirá un perfil de productos de amplificación en el ensayo
descrito en lo que antecede que difiere del perfil obtenido de una
muestra que contiene los fragmentos más pequeños que se espera que
se produzcan como resultado de la apoptosis normal. En una forma de
realización preferida, el cebador directo está diseñado pata
hibridar aproximadamente 200 pb en 5' del primer cebador inverso y
aproximadamente 2,3 Kb en 5' del último cebador inverso. Otros
cebadores inversos están diseñados para hibridar en varias
localizaciones entre el primer y último cebadores inversos.
Intervalos preferidos entre el cebador directo y los diversos
cebadores inversos son 200 pb (F_{1}-R_{1}), 400
pb (F_{1}-R_{2}), 800 pb
(F_{1}-R_{3}), 1,3 Kb,
(F_{1}-R_{4}), 1,8 Kb
(F_{1}-R_{5}) y 2,3 Kb
(F_{1}-R_{6}). El número y espaciación de los
cebadores inversos se escoge a la conveniencia del experto en
la
técnica.
técnica.
También en una forma de realización preferida se
usa una sonda de captura de híbridos para anclar una secuencia
diana, preferentemente sobre u soporte sólido (p. ej., esferas).
Después, una pluralidad de sondas se colocan a varias distancias en
3' de la sonda de captura. Dichas sondas pueden ser pares de
cebadores directos e inversos como se ha tratado en lo que
antecede, o pueden ser sondas de amplificación de señal, como las
usadas en la reacción en cadena de la ligasa (LCR), y otras usadas
en la identificación de secuencias. La pluralidad de sondas
hibridan a lo largo de la longitud de un fragmento diana si la diana
está presente en la muestra. Por tanto, analizando las muestras la
presencia de las sondas, se puede determinar la integridad de las
secuencias presentes en la muestra. Esto se puede realizar de
numerosas formas, incluidas, entre otras, captura de híbridos, PCR,
LCR, desplazamiento de hebras, cadena ramificada u otros ensayos
conocidos en la técnica que incorporan sondas o cebadores híbridos
con el fin de identificar o cuantificar la secuencia. Una muestra
que contiene ácidos nucleicos intactos (de integridad elevada)
representa una detección selectiva positiva de acuerdo con la
invención. En una forma de realización, la muestra se introduce en
pocillos (p. ej., en una placa de 96 pocillos) que contiene sonda
de captura unida al soporte. La sonda de captura inmoviliza una
secuencia diana, si está presente en la muestra. Las sondas que
hibridan con la secuencia en 3' de la sonda de captura (sondas en
3') se colocan en cada pocillo, de modo que cada sonda en 3' se
espacia una distancia única de la sonda de captura común y cada
pocillo sólo contiene un tipo de sonda en 3'. A continuación se
genera una señal mediante, por ejemplo, amplificación, o mediante
procedimiento ELISA estándar, seguido por amplificación, o por LCR,
y otros procedimientos mencionados en lo que antecede. La presencia
de señal en cada pocillo indica la presencia de secuencia de al
menos la longitud entre la sonda de captura y la sonda en 3'. En una
forma de realización alternativa, cada pocillo recibe múltiples
sondas en 3' diferentes, que pueden estar marcadas claramente, y la
presencia del indicador(es) se correlaciona con la longitud
de la secuencia presente en la muestra.
Una muestra de un paciente que tiene, por
ejemplo, cáncer producirá amplicón entre la mayoría o todos los
pares de cebadores (en función de, entre otras cosas, la longitud de
los fragmentos diana, de la espaciación de los cebadores y de donde
en la diana se espacian los cebadores). Tal perfil representa una
detección selectiva positiva de la enfermedad o de la propensión a
sufrir la enfermedad. Una muestra de un paciente que no tiene
indicios de enfermedad tiene como resultado poco o ningún producto
de amplificación en el ensayo descrito en lo que antecede. En una
detección selectiva negativa, puede haber amplificación de
fragmentos pequeños (p. ej., 200 pb), pero no debería haber
amplificación de fragmentos más grandes (es decir, fragmentos
resultantes de amplificación entre el cebador directo y los
cebadores inversos separados). En los diagnósticos de cáncer, el
fragmento diana puede ser, opcionalmente, un encogen, un supresor
tumoral o cualquier otro marcador asociado con cáncer. No obstante,
no es necesario usar marcadores asociados con cáncer en los
procedimientos de la invención, dado que dichos procedimientos se
basan en al reconocimiento general de que las muestras indicativas
de enfermedad contienen una mayor cantidad de ácidos nucleicos
intactos y una mayor cantidad de ácidos nucleicos de fragmento
largo. De acuerdo con esto, en los procedimientos de la invención se
puede usar cualquier locus de ácido nucleico diana conveniente.
Las reacciones de amplificación descritas en lo
que antecede se pueden realizar de acuerdo con cualquier protocolo
adecuado o conveniente y el tamaño de fragmento de los productos de
amplificación resultantes (si existen) puede determinarse mediante
cualquier medio adecuado o conveniente.
En una forma de realización alternativa, los
procedimientos de la invención comprenden realizar una serie de
reacciones de amplificación con un fragmento diana de ácido nucleico
contiguo, en el que cada reacción de aplicación comprende un
cebador directo y un cebador inverso, de modo que los cebadores
directos e inversos están separados a intervalos en un fragmento
contiguo que se sospecha que está en la muestra. Un ejemplo de esta
disposición se muestra en la figura 13. Preferentemente, los
espacios entre cada par de cebadores directo e inverso son
equivalentes. En una detección selectiva positiva, el ensayo
descrito en lo que antecede tendrá como resultado una serie de
fragmentos del mismo tamaño para la mayoría, si no todos, los pares
de cebadores. Tal disposición de los productos de amplificación
pone de manifiesto una secuencia diana contigua indicativa de
enfermedad (véase en lo que antecede). Una muestra de un paciente
libre de enfermedad debería producir pocos o ningún producto de
amplificación, pero en ningún caso producirá la disposición contigua
de los productos de amplificación que se espera de una muestra que
contiene una secuencia diana diagnóstica relativamente intacta,
Cada uno de los procedimientos descritos en lo
que antecede se basa en el principio de que un ácido nucleico
intacto, o un segmento de un ácido nucleico intacto, en una muestra
es diagnóstico. Por tanto se contemplan variaciones de los
procedimientos descritos en lo que antecede.
Dichas variaciones incluyen la introducción de
cebadores, el número de cebadores usado, la secuencia diana, el
procedimiento para identificar secuencias, y otras. Por ejemplo, en
el procedimiento representado en la figura 13 y descrito en lo que
antecede, no es necesario que el número de cebadores directos e
inversos sea igual. Por ejemplo, un cebador directo puede usarse
para amplificar fragmentos entre dos cebadores inversos. Otras
variaciones en la introducción del par de cebadores se encuentran
dentro de la técnica, como también los detalles de las reacciones
de amplificación que se van a realizar. Por último, como se
representa en las Figuras 12 y 13, en los procedimientos de la
invención se pueden usar sondas de captura con el fin de aislar una
secuencia diana escogida.
Los ejemplos siguientes proporcionan detalles
adicionales de los procedimientos de acuerdo con la invención. Con
el fin de proporcionar ejemplos, los siguientes ejemplos
proporcionan detalles del uso del procedimiento de la presente
invención en la detección del cáncer de colon. De acuerdo con esto,
aunque se proporcionan ejemplos de la siguiente manera, la
invención no está tan limitada y el experto en la técnica apreciará
su amplia gama de aplicación tras consideración de la misma.
El ejemplo siguiente se refiere a la detección
selectiva del cáncer de colon en muestras de heces expulsadas.
Sobre la base de los principios sobre los que se basa la invención
(véase lo que antecede), se puede realizar el mismo análisis con
otras muestras, como las mencionadas en lo que antecede, con los
mismos resultados que se muestran en la presente memoria
descriptiva.
Para el análisis de las muestras de heces, los
procedimientos preferidos de la invención comprenden obtener al
menos una porción transversal o circunferencial de heces expulsadas
como se indica en la patente de EE.UU. nº 5.741.650, y de la
solicitud de patente pendiente de tramitación y de
co-propiedad de EE.UU. número 09/059.718. Aunque es
deseable una porción transversal o circunferencial de heces, los
procedimientos que se proporciona en la presente memoria
descriptiva se realizan con muestras aleatorias obtenidas de heces
expulsadas, que incluye frotis o raspados. Una vez obtenida, el
espécimen de heces se homogeneiza. Un tampón preferible para
homogeneización es uno que contiene al menos ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 16 mM. No obstante, como se
instruye en la solicitud de patente pendiente de tramitación,
co-propiedad de EE.UU. nº de serie 60/122.177, se
ha descubierto que el uso de EDTA de al menos 150 mM mejora
considerablemente el rendimiento de ácido nucleico en las heces.
Por tanto, un tampón preferido para la homogeneización de heces
comprende solución salina tamponada con fosfato, NaCl o KCl
20-100 mM,
EDTA al menos 150 mM, y, opcionalmente, un detergente (tal como SDS) y una proteinasa (p. ej., proteinasa K).
EDTA al menos 150 mM, y, opcionalmente, un detergente (tal como SDS) y una proteinasa (p. ej., proteinasa K).
Tras la homogeneización, preferentemente el
ácido nucleico se aísla de la muestra de heces. El aislamiento o
extracción de ácido nucleico no se requiere en todos los
procedimientos de la invención, ya que ciertas técnicas de
detección pueden realizarse de forma adecuada en heces
homogeneizadas sin aislamiento de ácidos nucleicos. No obstante, en
una forma de realización preferida, las heces homogeneizadas se
agitan para crear un sobrenadante que contiene ácidos nucleicos,
proteínas, lípidos y otros residuos celulares. El sobrenadante se
trata con un detergente y con proteinasa para degradar las proteínas
y el ácido nucleico se extrae con fenol-cloroformo.
Los ácidos nucleicos extraídos se precipitan después con alcohol.
Otras técnicas se pueden usar para aislar ácido nucleico de la
muestra. Dichas técnicas incluyen captura de híbridos y
amplificación directamente desde las heces homogeneizadas. Los
ácidos nucleicos se pueden purificar y/o aislar en la medida
requerida por el ensayo de detección selectiva que se va a emplear.
El ADN total se aísla usando técnicas conocidas en la ciencia.
El tamaño de los fragmentos de ADN humano
obtenidos en lo que antecede se puede determinar por numerosos
medios. Por ejemplo, el ADN humano se puede separar usando
electroforesis en gel. Se prepara un gel de agarosa al 3% usando
técnicas conocidas en la ciencia. Véase Ausubel et. al.,
Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sones, 1195,
pág. 2-23-2-24. El
tamaño de los fragmentos de ADN humano se determina después mediante
comparación con patrones conocidos. Los fragmentos superiores a
aproximadamente 200 pb proporcionan una detección selectiva
positiva. Aunque se puede establecer un diagnóstico sobre la base de
la detección selectiva sola, a los pacientes que presentan una
detección selectiva positiva se les aconseja que busquen pruebas de
seguimiento para obtener un diagnóstico confirmado.
Un medio preferido para determinar la longitud
de los fragmentos de ADN humano usa la PCR. Los procedimientos para
implementar la PCR son bien conocidos. En la presente invención, los
fragmentos de ADN humano se amplifican usando cebadores específicos
humanos. El amplicón superior a aproximadamente 200 pb producido
mediante PCR representa una detección selectiva positiva. Otras
reacciones y modificaciones de amplificación de la PCR, tales como
la reacción en cadena de la ligasa, PCR de fase inversa,
Q-PCR y otras, se pueden usar para producir niveles
detectables de amplicón. El amplicón puede detectarse mediante
acoplamiento con un indicador (p. ej., fluorescencia,
radioisótopos, y similares), mediante secuenciación, mediante
electroforesis en gel, mediante espectrometría de masas o mediante
cualquier otro medio conocido en la técnica, con la condición de que
la longitud, peso u otra característica de los amplicones se
identifique por tamaño.
Se realizaron experimentos para determinar si
las características de ADN amplificable en heces eran predictivas
de cáncer o pre-cáncer en pacientes de los que se
obtuvieron las muestras de heces. En el primer experimento, la
cantidad de ADN amplificable se midió en cada una de las diversas
muestras de heces usando amplificación por PCR para detectar
fragmentos de ADN en la muestra de una longitud de al menos 200
pares de bases. El segundo experimento determinó la cantidad de
fragmentos largos (superiores a 200 pares de bases) en las mismas
muestras y después determinó las proporciones entre producto largo
y producto corto. El tercer experimento determinó un perfil de
productos de amplificación con longitudes de fragmento de ácido
nucleico de 200 pb, 400 pb, 800 pb, 1,3 Kb, 1,8 Kb y 2,4 Kb. Los
experimentos cuarto y quinto fueron estudios clínicos que
correlacionaron la integridad de los ácidos nucleicos en muestras
de heces de pacientes con el estado de enfermedad global del
paciente.
Se recogieron muestras de heces de 9 pacientes
que presentaron síntomas o una historia clínica que indicaba que se
debía realizar una colonoscopia. Cada muestra de heces se congeló.
Inmediatamente después de proporcionar una muestra de heces, a cada
paciente se le realizó una colonoscopia con el fin de determinar el
estado de enfermedad del paciente. Sobre la base de los resultados
de la colonoscopia, y los posteriores análisis histológicos de
muestras de biopsia tomadas durante la colonoscopia, los individuos
fueron asignados a uno de dos grupos: normal o anormal. EL grupo
anormal constaba de pacientes con cáncer o con un adenoma de al
menos 1 cm de diámetro. Sobre la base de estos resultados, 4 de los
9 pacientes se asignaron al grupo anormal.
Las muestras se sometieron a detección selectiva
mediante captura híbrida de ADN humano y determinación de la
cantidad de ADN amplificable que tiene al menos 200 pares de bases.
Cada espécimen de heces congeladas, de un peso de
7-33 gramos, se descongeló y homogeneizó en Tris 500
mM, EFTA 16 mM y NaCl 10 mM a pH 9,0 a una proporción
volumen-masa de 3:1. Después, las muestras se
volvieron a homogeneizar en el mismo tampón hasta una proporción
volumen final-masa de 20:1 y se agitaron en
macroesferas de cristal a 2356 g. El sobrenadante se recogió y
trató con SDS y proteinasa K. Después, el ADN se extrajo con
fenol-cloroformo y se precipitó con alcohol. El
precipitado se suspendió en Tris 10 mM y EDTA 1 mM (1 x TE) a pH
7,4. Por último, el ADN se trató con ARNasa.
El ADN humano se aisló en el precipitado
mediante captura de híbridos específica de secuencia. Se usaron
sondas biotiniladas frente a porciones de los genes p53,
K-ras, y apc.
La sonda de K-ras fue
| 5'GTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGAC 3' | (SEC ID Nº: 1). |
Existían dos sondas de apc:
apc-1309 fue
5'TTCCAGCTGTCACAGCACCCTAGAACCAAATCCAG3' (SEC ID
Nº 2) y apc-1378 fue
5'CAGATAGCCCT
GGACAAACAATGCCACGAAGCAGAAG3' (SEC ID Nº 3).
GGACAAACAATGCCACGAAGCAGAAG3' (SEC ID Nº 3).
Existían cuatro sondas contra p53, la primera
(hibrida con una porción del exón 5) fue
5'TACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGG3' (SEC
ID Nº 4), la segunda (que hibrida con una porción del exón 7) fue
5'ATTTCTTCCATACTACTACCCATCGACCTCTCATC3' (SEC ID Nº 5), la tercera,
que también hibrida con una porción del exón 7, fue
5'ATGAGGCCAGTGCGCCTTGGGGAGACCTGTGGCAAGC3' (SEC ID Nº 6); y, por
ultimo, una sonda frente al exón 8 tenía la secuencia
5'GAAAGGACAAGGGTGGTTGGGA
GTAGATGGAGCCTGG3' (SEC ID Nº 7).
GTAGATGGAGCCTGG3' (SEC ID Nº 7).
A una suspensión que contiene 300 \mul de ADN
se añadió una alícuota de 10 \mul de cada sonda (20 pmol/captura)
en presencia de 310 \mul de tampón GITC 6M durante 2 horas a
temperatura ambiente. Los complejos de híbrido se aislaron usando
esferas de estreptavidina (Dynal). Después de lavar, los complejos
sonda-esfera se suspendieron a 25ºC durante 1 hora
en 0,1 x tampón TE a pH 7,4. La suspensión se calentó después
durante 4 minutos a 85ºC y se retiraron las esferas.
A continuación, el ADN capturado se amplificó
usando PCR, esencialmente como se ha descrito en la patente de
EE.UU. Nº 4.683.202. Cada muestra se amplificó usando cebadores
directos e inversos a través de 7 loci (Kras, exón 1, APC exón 15
(3 loci distintos), p53, exón 5, p53, exón 7 y p53, exón 8) por
duplicado (para un total de 14 amplificaciones para cada locus). Se
realizaron siete PCR distintas (40 ciclos cada una) por duplicado
usando cebadores dirigidos a detectar fragmentos en la muestra que
tienen 200 pares de bases o más. En ADN amplificado se introdujo en
un gel al 40% Nusieve (FMC Biochemical) (3% Nusieve, 1% afarosa) y
se tiñó con bromuro de etidio (0,5 \mug/ml). En ADN amplificado
resultante se graduó sobre la base de la intensidad relativa de los
geles teñidos. Los resultados se muestran en las Figuras
1-7. Cada figura representa los resultados para los
9 pacientes (incluidos los patrones) para los siete loci diferentes
que se amplificaron. Como se muestra en las Figuras, cada muestra
de un paciente con cáncer o adenoma se detectó en forma de una banda
que tiene una intensidad significativamente mayor que las bandas
asociadas con las muestras de pacientes que no tenían cáncer ni
pre-cáncer. Los cuatro pacientes con cáncer/adenoma
identificados usando colonoscopia se identificaron correctamente
mediante la determinación de la cantidad de ADN amplificable de 200
pares de bases o de mayor longitud. Como se muestra en las figuras
1-7, los resultados fueron los mismos con
independencia de qué locus se amplificó. De acuerdo con esto, la
cantidad de ADN de 200 pb o más en una muestra fue predictiva del
estado de enfermedad del paciente.
Se realizó un experimento que fue esencialmente
idéntico al descrito en lo que antecede en el Ejemplo 1, pero se
introdujeron cebadores directos e inversos de modo que se
amplificaran los fragmentos de aproximadamente 1,8 Kb y
mayores.
El ADN se preparó como se ha descrito en lo que
antecede. Los cebadores directos e indirectos se espaciaron de modo
que hibridaran con una separación de aproximadamente 1,8 Kb en tres
loci diferentes (Kras, exón 1, APC, exón 15, and p53 exón 5). Se
realizaron treinta y tres rondas de amplificación y el ADN
resultante se colocó en un gel de agarosa al 3%. Los resultados se
muestran en las figuras 8-10. Como se muestra en las
figuras (que muestran los resultados de tres experimentos distintos
para amplificar y detectar producto "largo"), las muestras de
individuos que tienen cáncer o pre-cáncer produjeron
grandes cantidades de ADN de peso molecular alto (en este caso 1,8
Kb y mayores); mientras que las muestras de pacientes que no tenían
cáncer o pre-cáncer no produjeron ADN en el
intervalo de aproximadamente 1,8 Kb y mayores. Por tanto, la
presencia de ADN de alto peso molecular era indicativo del estado
de enfermedad del paciente.
Se realizó un experimento para determinar el
perfil de peso molecular de ADN de muestras recogidas y preparadas
como parte de un estudio ciego con 30 pacientes que acudieron a la
Clínica Mayo con sospecha de trastornos gastrointestinales. Se
obtuvieron muestras de heces y el ADN se aisló como se ha descrito
en lo que antecede.
Antes de la amplificación, el ADN se aisló de
las muestras mediante captura híbrida. Se usaron sondas biotiniladas
frente a porciones de los genes BRCA1, BRCA2, p53, APC.
La sonda BRCA1 fue
| 5'GATTCTGAAGAACCAACTTTGTCCTTAACTAGCTCTT3' | (SEQ ID NO: 8). |
La sonda BRCA2 fue
| 5'CTAAGTTTGAATCCATGCTTTGCTCTTCTTGATTATT3' | (SEC ID Nº 9). |
La sonda APC1 fue
| 5'CAGATAGCCCTGGACAAACCATGCCACCAAGCAGAAG3' | (SEC ID Nº 10). |
La sonda p53, que hibrida con una porción del
exón 5, fue
| 5'TACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGG3' | (SEC ID Nº 4). |
La sonda APC2 fue
| 5'GAAGTTCCTGGATTTTCTGTTGCTGGATGGTAGTTGC3' | (SEC ID Nº 11). |
Una alícuota de 300 \mul de la muestra se
introdujo en 300 \mul de tampón isotiocianato de guanidina 6M con
10 \mul de cada sonda de captura y se incubó durante la noche a
25ºC. El AND capturado se aisló usando 100 \mul de esferas de
captura durante una hora a temperatura ambiente.
El ADN eluyó de las esferas y se amplificó
mediante PCR en las condiciones convencionales de PCR.
De acuerdo con los procedimientos de la
invención, se realizaron reacciones de amplificación usando
cebadores directos e inversos a través de los 5 loci para cada
muestra. Los cebadores directos e inversos se espaciaron para
amplificar fragmentos de 200 pb, 400 pb, 800 pb, 1,3 Kb, 1,8 Kb y
2,4 Kb. Cada una de 30 reacciones de PCR se realizó durante 36
ciclos. El amplicón se pasó a un gel de Seakeam al 3% y se tiñó con
bromuro de etidio. Los resultados se muestran en las figuras 11A y
11B. Cada figura representa los resultados para 15 de los 30
pacientes.
Como se muestra en dichas figuras, los pacientes
con cáncer o adenoma tienen un mayor rendimiento de ADN
amplificable. Esto es especialmente cierto al nivel de 1,8 Kb y
mayores. Por tanto, los pacientes con cáncer o adenoma no sólo
producen más ADN amplificable en sus heces, sino que también
producen fragmentos de ADN más grandes que los producidos en las
heces de pacientes que no tienen cáncer. Por tanto, un mayor
rendimiento de ADN amplificable y la presencia de ADN de alto peso
molecular, especialmente de 1,8 Kb y mayor, fueron indicativos del
estado de enfermedad del paciente.
En este ejemplo, los procedimientos de la
invención se correlacionaron con el desenlace clínico en numerosos
pacientes que tenían un adenoma colorrectal o cáncer colorrectal
diagnosticado usando colonoscopia, y 79 pacientes a los que no se
les diagnosticó cáncer o adenoma colorrectal. Se obtuvo una muestra
de heces de cada uno de estos pacientes y se preparó tal como se ha
descrito en lo que antecede. Los fragmentos de los 5 loci diferentes
a los que se hace referencia en lo que antecede se amplificaron
usando cebadores separados por 200, 400, 800, 1300, 1800, y 2400
pares de bases usando el protocolo descrito en lo que antecede en el
Ejemplo 2. Cada amplificación se puntuó de modo que la
amplificación con éxito de un fragmento recibía una puntuación de 1
y la falta de amplificación recibía una puntuación de 0. El corte
para una detección selectiva positiva se estableció en 21. Los
resultados se muestran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en lo que antecede, los
procedimientos de la invención son eficaces en la detección
selectiva de la presencia de cáncer y adenoma colorrectal.
En este ejemplo, los procedimientos de la
invención se usaron para detectar cánceres no colónicos en 28
pacientes.
Se obtuvo una muestra de heces de cada uno de
los 28 pacientes. La muestra se preparó como se ha descrito en lo
que antecede. Los fragmentos de los 5 loci diferentes a los que se
ha hecho referencia en lo que antecede se amplificaron usando
cebadores separados por 200, 400, 800, 1300, 1800 y 2400 pares de
bases usando el protocolo descrito en lo que antecede en el Ejemplo
3. Cada amplificación se puntuó de modo que la amplificación con
éxito de un fragmento recibía una puntuación de 1 y la falta de
amplificación recibía una puntuación de 0.
Dado que cinco loci se analizaron usando 6 pares
de cebadores cada uno, la puntuación máxima obtenible fue 30
(amplificación con éxito de los 6 fragmentos en los cinco loci).
Como corte entre pacientes enfermos y no enfermos se usó una
puntuación de 21. Los resultados se muestran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como se ha mostrado en lo que antecede, los
procedimientos de la invención detectaron con éxito 18 de 27
pacientes que en realidad tenían cáncer no colónico. Sólo en un
paciente se produjo un diagnóstico erróneo como que tenía cáncer
cuando no tenía. Por tanto, los procedimientos de la invención son
útiles para diagnóstico no invasivo de un estado de enfermedad
cancerosa no especificada en un paciente.
El umbral de 21 para una detección positiva
selectiva se puede modificar para adecuarse a las sensibilidades y
especificidades deseadas. Por ejemplo, si 18 fueran los falsos
negativos, se evitarían los resultados que se muestran en la tabla
4. El experto en la técnica sabe cómo establecer los umbrales en
función del paciente (p. ej., un umbral menor para pacientes con
síntomas que para pacientes que no presentan síntomas), la
enfermedad que se está diagnosticando y el nivel deseado de
sensibilidad y especificidad. Con independencia del mural, el
principio de la invención sigue siendo que la integridad del ácido
nucleico es un marcador viable de enfermedad, y especialmente de
cáncer.
Además, la propensión a sufrir enfermedad puede
medirse usando procedimientos de la invención. Por ejemplo, se
puede usar el perfil periódico del peso molecular de acuerdo con los
procedimientos de la invención para monitorizar el estado de
enfermedad de un paciente que presenta síntomas mínimos o ninguno.
Tal monitorización longitudinal determinará si un paciente está
progresando con cantidades crecientes de ácidos nucleicos de
integridad elevada, lo que indica que es deseable una exploración de
seguimiento.
<110> Shuber, Anthony P
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para la detección de
enfermedades
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EXT034PC
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
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1999-09-08
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-7
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda K-ras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggagtatt tgatagtgta ttaaccttat gtgtgac
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda apc de apc-1309
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccagcagt gtcacagcac cctagaacca aatccag
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda apc de apc-1378
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatagccc tggacaaaca atgccacgaa gcagaag
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda p53 exón 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactcccctg ccctcaacaa gatgttttgc caactgg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda p53 exón 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcttcca tactactacc catcgacctc tcatc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda p53 exón 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaggccag tgcgccttgg ggagacctgt ggcaagc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda p53 exón 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaggacaa gggtggttgg gagtagatgg agcctgg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda BRCA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattctgaag aaccaacttt gtccttaact agctctt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda BRCA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaagtttga atccatgctt tgctcttctt gattatt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda APC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatagccc tggacaaacc atgccaccaa gcagaag
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda APC2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagttcctg gattttctgt tgctggatgg tagttgc
\hfill37
Claims (15)
1. Un procedimiento para la detección selectiva
en un paciente de cáncer o pre-cáncer, en el que el
procedimiento comprende:
determinar la integridad de los ácidos nucleicos
en una muestra de heces de un paciente, que comprende células
desprendidas o residuo celular; e identificar una detección
selectiva positiva como una muestra en la que la integridad de los
ácidos nucleicos supera un umbral pre-determinado, o
identificar en dicho paciente como que tiene cáncer o
pre-cáncer si están presentes ácidos nucleicos en
dicha muestra en una cantidad superior a un umbral
pre-determinado.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la integridad de los ácidos nucleicos se detecta mediante la
determinación de una cantidad de ácido nucleico del paciente en una
muestra de heces del paciente;
comparación de dicha cantidad con una cantidad
estándar de ácido nucleico que se prevé que esté presente en una
muestra negativa para la enfermedad; y detección de la enfermedad en
dicho paciente como una cantidad de ácido nucleico del paciente
superior a dicha cantidad convencional.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la integridad de los ácidos nucleicos se detecta
mediante:
(a) amplificación del ácido nucleico de un
paciente en una muestra de heces obtenida de un paciente;
(b) determinación de una cantidad de ácido
nucleico amplificado obtenido en la etapa (a); y
(c) identificación de una detección selectiva
positiva cuando dicha cantidad de ácido nucleico amplificado es
superior a una cantidad de ácido nucleico amplificado que se espera
en una muestra negativa para la enfermedad.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho cáncer se selecciona
del grupo constituido por cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer
de esófago, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de
páncreas, cáncer hepático y linfoma.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho ácido nucleico se
selecciona del grupo constituido por los genes
K-ras, p53, apc, dcc, de supresión tumoral y
oncogenes.
6. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
5, en el que dicho ácido nucleico tiene una longitud de al menos
200 pares de bases.
7. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
5, en el que dicho ácido nucleico tiene una longitud de al menos
400 pares de bases.
8. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
5, en el que dicho ácido nucleico tiene una longitud de al menos
800 pares de bases.
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ácido nucleico tiene una
longitud de al menos 1,3 Kb.
10. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
5, en el que dicho ácido nucleico tiene una longitud de al menos
1,8 Kb.
11. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
5, en el que dicho ácido nucleico tiene una longitud de al menos
2,4 Kb.
12. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho cáncer es cáncer de
colon.
13. Un procedimiento para la detección selectiva
de cáncer o pre-cáncer mediante determinación de la
integridad de ácidos nucleicos en una muestra de heces de un
paciente, en el que el procedimiento comprende las etapas tal y
como se indican en una cualquiera de las formas de realización (A) o
(B):
(A) seleccionar una pluralidad de loci
genómico;
- realizar una reacción de amplificación de cada uno de dichos loci;
- identificar una detección selectiva positiva como una muestra en la que el número de loci
- producir un producto de amplificación que supera un umbral pre-determinado;
\newpage
(B) seleccionar una pluralidad de loci
genómico;
- realizar una reacción de amplificación de cada uno de dichos loci;
- asignar una primera puntuación numérica a cada locus en el que tenga lugar amplificación; asignar una segunda puntuación numérica a cada locus en el que no tenga lugar amplificación;
- determinar si un total de dicha primera puntuación numérica supera un total de dicha segunda puntuación numérica en una cantidad umbral, de modo que se realiza la detección selectiva de dicha muestra de cáncer o pre-cáncer.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que dicho cáncer se selecciona del grupo constituido por cáncer
de colon, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de próstata,
cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer hepático y
linfoma.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que dicho cáncer es cáncer de colon.
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