EA024246B1

EA024246B1 - Способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинской лимфомой высокой степени злокачественности

Info

Publication number: EA024246B1
Application number: EA201400153A
Authority: EA
Inventors: Елена Николаевна Воропаева; Татьяна Ивановна Поспелова; Михаил Иванович Воевода
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2016-08-31
Also published as: RU2013110587A; RU2533816C2; EA201400153A1

Abstract

Изобретение относится к области медицины, конкретнее к медицинской генетике, онкологии и онкогематологии. Сущность предлагаемого способа состоит в том, что исследуют полиморфизм G13494A 6-го интрона гена ТР53 пациента и при выявлении у пациента гомозиготного генотипа G/G в данном локусе прогнозируют низкую эффективность лечения, а именно малую вероятность 5-летнего выживания пациента и малую вероятность отсутствия рецидива, а при выявлении у пациента генотипа А/А или G/A в данном локусе прогнозируют высокую эффективность лечения, а именно высокую вероятность наступления ремиссии и 5-летнего выживания пациента. Предлагаемый способ эффективен в отношении различных вариантов агрессивных НХЗЛ, технически прост, дает возможность получить более полную картину прогноза эффективности лечения (вероятность достижения ремиссии, дожития больным 5-летнего срока от даты постановки диагноза, а также вероятность дожития больным данного срока без рецидива).

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретнее к медицинской генетике, онкологии и онкогематологии.

Неходжкинские злокачественные лимфомы (НХЗЛ) - это опухоли системы крови с первичным поражением периферических органов кроветворения, опухолевым субстратом которых являются подвергшиеся злокачественной трансформации Т-, В- или ΝΚ-лимфоциты различных фаз дифференцировки.

Согласно последней классификации ВОЗ (\УНО с1аззбтсайоп οί ГОтотз οί НастаЮроюОс апб 1утрйоШ йззиез ίη 2008: ап оусгу1с\у. §аЪЪайш Е., Васс1 Р., 8адгатозо С., РПеп §.А.//РаШо1одюа. 2010. 102. (3). Р. 83-87), известно более 60 вариантов лимфом, которые в зависимости от зрелости опухолевых клеток могут быть разделены на группы лимфом высокой или низкой степени злокачественности. К лимфомам высокой степени злокачественности относятся: диффузная крупноклеточная, беркиттоподобная, плеоморфная, лимфобластная лимфома/лейкемия, центробластная, иммунобластная, плазмобластная, анапластическая, фолликулярная 3-го цитологического типа, мантийноклеточная и др. К лимфомам низкой степени злокачественности относятся лимфома из малых лимфоцитов/хронический лимфолейкоз, пролимфоцитарная, центроцитарная, лимфоплазмоцитарная, фолликулярная 1-го цитологического типа, грибовидный микоз, маргинальноклеточная, МАЬТ-лимфома и др.

Пациенты с НХЗЛ составляют более 50% контингента гематологических клиник.

Результат лечения данных больных зависит как от применяемых терапевтических средств, которые могут быть менее и более интенсивными, так и от особенностей организма пациента, которые обусловливают большую или меньшую чувствительность к лечению. Обычно терапию начинают с менее интенсивных протоколов, предназначенных для данного вида НХЗЛ. В ряде случаев такой подход оказывается оправданным, лечение эффективным и приводит к ремиссии заболевания. Однако в ряде других случаев такой подход является ошибочным, лечение не приносит должного результата, а пациентом потеряно время на неэффективное лечение. Кроме того, применяющиеся в терапии больных НХЗЛ препараты оказывают токсический эффект на здоровые органы и ткани пациентов. А в случае неэффективности первого курса терапии, в опухолевой ткани возникает множественная лекарственная устойчивость (МЛУ). Общеизвестно, что для уничтожения опухолевых клеток применяются высокотоксичные препараты. Опухолевая клетка, при попадании в нее любого токсина, в том числе противоопухолевого препарата, испытывает состояние стресса. В ответ на это включается механизм защитной регуляции не только к применявшимся ранее препаратам, но и другим противоопухолевым средствам, отличающимся по структуре и механизму действия. МЛУ - это сохранение опухолевыми клетками жизнеспособности в ответ на воздействие различных лекарственных веществ (1Шр://\у\у\у.тадепстеб.ги/1об1катр.1ит1).

Таким образом, при неадекватном выборе самой первой программы лечения, оказавшейся недостаточно действенной, эффективность последующей программы терапии будет значительно снижаться.

Важным этапом решения проблем эффективности терапии, возникновения вторичной МЛУ является оценка некоторых особенностей организма пациента, с которыми связаны указанные проблемы, до начала специфической терапии. Такая оценка позволяет прогнозировать большую или меньшую эффективность лечения и делать вывод о целесообразности первоначального лечения менее сильными или сразу более сильно действующими противоопухолевыми средствами.

На совместной конференции Национального института рака США (ΝΟ) и Американского общества клинической онкологии (А8СО) в 1996 году эффекты противоопухолевой терапии, в том числе и терапии НХЗЛ, были разделены на 4 группы по мере убывания значимости: 1 - 5-летняя общая выживаемость, 2 - качество жизни, 3 - достижение ремиссии, 4 - 5-летняя безрецидивная выживаемость (А8СО. АЩсотез οί сапсег 1теа1теп1 οί 1есйпо1оду аззеззтей апб сапсег 1теа1теп1 дшбейпез // ί. С1ш.Опсо1оду. 1996. - Уо1. 14, № 3. - Р. 671-679).

Для НХЗЛ был разработан и до последнего времени с успехом применялся во врачебной практике ряд клинических и лабораторных прогностических моделей эффективности терапии НХЗЛ.

К клиническим моделям относятся следующие:

- РЫР1 (§о1а1-Сейдпу е1 а1. РоШси1ат 1утр1ота ш1егпайопа1 ргодпозйс шбех. В1ооб 2004; 104(5):1258-1265),

- М1Р1 (Ноз1ет е1 а1. А пе\у ргодпозйс шбех (М1Р1) Гог райейз уйй абуапсеб-з1аде тапйе се11 1утрйота. В1ооб 2008; 111(2):558-565),

- 1Р1 (А ргебюйуе тобе1 Гог аддгезз!уе поп-Нобдкт'з 1утр1юта. Тйе 1п1егпайопа1 №п-Нобдкт'з Ьутрйота Ргодпозйс Райотз Рто.)еск N Епд1 ί. Меб. 1993; 329(14):987-94).

РЫР1 является прогностическим индексом только для фолликулярной лимфомы и не применим к другим вариантам НХЗЛ. В качестве неблагоприятных прогностических факторов учитываются возраст более 60 лет, III и IV стадия заболевания, более 4 пораженных зон лимфатических узлов, уровень гемоглобина менее 120 г/л и повышенный уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови пациента. Каждый неблагоприятный прогностический фактор соответствует 1 баллу.

Сумма баллов дает возможность отнести пациента к одной из следующих групп риска неудачного лечения:

низкий риск (0-1 баллов), средний риск (2 балла),

- 1 024246 высокий риск (3-5 баллов).

ΜΙΡΙ является прогностическим индексом только для мантийноклеточных лимфом и не применим к другим вариантам НХЗЛ. Выделяют четыре неблагоприятных прогностических фактора: возраст, общее состояние (ЕСОО функциональный статус), уровень ЛДГ и лейкоцитов крови. Эти факторы оцениваются следующим образом:

баллов: возраст менее 50 лет, ЕСОО функциональный статус 0-1, ЛДГ не более 0,67 от верхней границы нормы или лейкоцитоз менее 6700 клеток/мкл;

балл: возраст 50-59 лет, ЛДГ в 0,67-0,99 раза больше верхней границы нормы или лейкоцитоз от 6700 до 9999 клеток/мкл;

балла: возраст 60-69 лет, ЕСОО функциональный статус 2-4, ЛДГ в 1-1,49 раза выше верхней границы нормы или лейкоцитоз 10,000-14,000 клеток/мкл;

балла: возраст 70 лет или больше, ЛДГ в 1,5 раза и более выше верхней границы нормы, лейкоцитоз от 15000 клеток/мкл и более.

низкий риск (0-3 балла), средний риск (4-5 баллов), высокий риск (6-11 баллов).

Для больных с агрессивными вариантами неходжкинских лимфом во всем мире используется способ прогнозирования тяжести течения заболевания, эффективности терапии с помощью суммы независимых факторов риска, которые были положены в основу Международного прогностического индекса (1п!егиайоиа1 ргодиокйс шйех, ΙΡΙ) (8Ырр Μ.Α., Наггт§1ои Ό.Ρ., Аийегкеи 1. е1 а1. 1п!егиайоиа1 ΝοηНойдкт'к 1ушрЬоша ргодиокйс ГасГОп, рго)есГ А ргейюйуе тойе1 Гог аддгеккще иои-Нойдкш'к 1утр1юта/И Еи§1. 1. Мей. 1993; 329:987-94; Поддубная И.В. Клиническая онкогематология/Под ред. М.А. Волковой. М.: Медицина, 2007г., с. 344-345). Наиболее значимыми из этих факторов являются: возраст старше 60 лет, повышение уровня сывороточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ), общее состояние больного, соответствующее 2-4 степени по шкале ЕСОО, ΙΙΙ-ΐν стадии болезни, наличие более одного экстранодального очага поражения, размер опухоли более 5 см (табл. 1).

Таблица 1. Международный прогностический индекс (ΙΡΙ)

Факторы	Градация фактора	Про ГН ОСТИ ческая оценка (в баллах)
Возраст	Менее 60 лет	0
Более 60 лет	1
Стадия лимфомы	1\П	0
πι\ιν	1
Число экстранодальных поражений	0 или 1	0
2 и более	1
Общесоматический статус по ВОЗ	0 или 1	0
2 и более	!
Уровень общей ЛДГ	Нормальный	0
Повышен	1
Максимальный размер опухоли	Менее 5 см	0
5 см и более	1

На основании количества имеющихся неблагоприятных факторов делают прогноз о степени тяжести течения заболевания, эффективности терапии отсутствие неблагоприятных факторов или присутствие лишь одного из них позволяет прогнозировать низкую степень тяжести заболевания, хороший эффект от терапии (1-ая группа по ΙΡΙ);

наличие 2-х факторов позволяет прогнозировать низкую/промежуточную степень тяжести заболевания, хороший/промежуточный эффект от терапии (2-я группа по ΙΡΙ);

наличие 3-х факторов позволяет прогнозировать промежуточную/высокую степень тяжести заболевания, промежуточный/низкий эффект от терапии (3-я группа по ΙΡΙ);

наличие 4-х факторов позволяет прогнозировать высокую степень тяжести заболевания, неэффективность терапии (4-я группа по ΙΡΙ).

Наличие двух и более факторов отчетливо отрицательно сказывается на прогнозе тяжести течения заболевания, эффективности лечения независимо от морфологического варианта опухоли. При ΙΡΙ=0-1 частота полных ремиссий после 1-й линии полихимиотерапии (ПХТ) составляет 80%, а 5-летняя выживаемость - 73%. При ΙΡΙ=4-5 полные ремиссии достигаются у 40% больных, 5-летняя выживаемость составляет всего 25% (И.В. Поддубная. Клиническая онкогематология/под ред. М.А. Волковой. - М.: Медицина, 2007 г., с. 345)

К лабораторным маркерам неблагоприятного прогноза эффективности лечения относятся следующие:

- 2 024246 уровень экспрессии опухолевыми клетками антигена Κί-67, который определяется иммуногистохимической окраской (Ко1е аиб ртодпокйс ыдшйсапсе оГ 1Нс Κί-67 шбех ίη поп-НобдОп'к 1утрйота. Вгоубе А., Воусоу О., 8йепоу Υ., Окоп Е., 8йркЬегд О., Ваиеу О. Ат ί Нета1о1. 2009 кт; 84(6):338-43). Повышение его уровня при диффузной В-крупноклеточной лимфоме позволяет разграничить пациентов с благоприятным и неблагоприятным прогнозом. В группе лиц с уровнем экспрессии лимфомными клетками антигена Κί-67 более 70% выживаемость статистически значимо ниже, чем у лиц с уровнем экспрессии Κί-67 менее 70%. Точных критериев применения его при других вариантах НХЗЛ не описано;

концентрация сывороточного бета2-микроглобулина, лактатдегидрогеназы и тимидинкиназы (Кткк с1акк1йсайоп Гот 1агде се11 1утркота икшд 1ас1а1е бекубгодепаке, Ье1а-2 тюгод1оЬи1т, апб [купибте ктаке. 8ик1 8., 8теап Ρ. ίτ., Тискег 8., Ртйкске Н.А., Кебтап кК., Кобпдие/ М.А., МсЬаидЫш Р., Котадиега ί., НадетеМег Р.В., Уек-жсцю/ ^.8., е1 а1. Ьеик Ьутркота. 1995 кт; 18(1-2):87-92). Нормальный уровень всех показателей соответствует низкому риску (трехлетняя выживаемость 91%), повышение концентрации одного или двух показателей - среднему риску (трехлетняя выживаемость 36%), а повышение концентрации трех показателей - высокому риску (трехлетняя выживаемость 0%).

Определение бета2-микроглобулина проводится дорогостоящим методом иммунопреципитации. Также следует учесть, что повышение его концентрации может происходить при различных аутоиммунных заболеваниях;

об ухудшении прогноза заболевания свидетельствует обнаружение в опухоли хромосомных перестроек. Хромосомные аномалии специфичны для вариантов НХЗЛ. Так, например, ΐ(8;22) (транслокация генетического материала между 8 и 22 хромосомами) встречается при лимфоме Беркитта (ВгеакроиНк оГ Виткйкк 1утркота ΐ(8;22) кагМосаОопк тар тейЫп а бШапсе оГ 300 кЬ ботепкйеат оГ ΜΥΟ 2е1б1ег К., 1оок 8., Пе1ес1ике Н.к, ЫоЬеск О., УиШаите М., кепок О.М., Вогпкатт О.^., Ырр М. Оепек СЬготокотек Сапсег. 1994 Арг; 9(4):282-7). Способ предполагает цитогенетическое исследование, до получения результата которого требуется несколько недель. Этого времени нет, когда речь идет о необходимости выбора терапии у больного с быстро прогрессирующей, агрессивной опухолью.

Кроме того, в уровне техники авторами обнаружены следующие способы прогнозирования эффективности лечения пациентов НХЗЛ высокой степени злокачественности.

1. Способ ультразвукового прогнозирования лечения неходжкинских лимфом (патент РФ на изобретение № 2211665). Способ основан на том, что на различных этапах противоопухолевого лечения проводится ультразвуковой мониторинг типа кровотока в пораженных лимфоузлах брюшной полости больных лимфобластными лимфомами, на основании которого и устанавливаются клинические критерии неблагоприятного прогноза эффективности терапии.

Помимо того, что данный способ не применим к другим вариантам НХЗЛ высокой степени злокачественности, он не дает возможности установить прогноз до начала специфического лечения с целью профилактики вторичной плейотропной лекарственной устойчивости опухоли к терапии.

2. Способ прогнозирования эффективности терапии лимфом (патент РФ на изобретение № 2349263). Способ основан на определении в сыворотке крови пациента до начала лечения активности цистеиновых протеаз лизосом катепсинов В и Ь. При превышении их активности более установленного уровня делают прогноз о низкой эффективности лечения.

Данный способ дает возможность прогнозировать вероятность достижения ремиссии, но не дает возможность прогнозировать отсроченные результаты лечения, такие как 5-летние общая и безрецидивная выживаемость.

3. Способ прогнозирования тяжести течения и эффективности лечения лимфом (патент РФ на изобретение № 2345367). Способ основан на том, что до лечения в сыворотке крови пациента определяют концентрации провоспалительных цитокинов интерлейкинов 1Ь-1 и 1Ь-6, а в мазках костного мозга определяют относительную долю лимфоидных опухолевых клеток, несущих на своей поверхности рецепторы к цитокинам 1Ь-1 и 1Ь-6. В зависимости от концентрации 1Ь-1 и относительной доли лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокинам 1Ь-1 и 1Ь-6, прогноз является благоприятным или нет.

Данный способ, как и предыдущий, не дает возможности прогнозировать отсроченные результаты лечения (5-летние общую и безрецидивную выживаемость). Кроме того, уровень цитокинов и их рецепторов, которые являются средствами межклеточного взаимодействия элементов иммунной системы, может меняться на фоне различной сопутствующей патологии или осложнений НХЗЛ, например, инфекционных заболеваний. Поэтому требуется широкий спектр дообследования пациентов с целью исключения влияния сопутствующей патологии на уровень измеряемых показателей.

4. МеШобк Гог 1бепШушд, б1адпоктд, апб ртебюйпд кшу1уа1 оГ 1утркотак (\УО 03/021229). Способ основан на использовании микрочипа Ьутрк Όχ для анализа экспрессии совокупности генов. По картине экспрессии генов прогнозируют выживаемость и возможность индивидуализации терапевтического подхода.

Осуществление данного способа требует приобретения дорогостоящих микрочипов, специализированного компьютерного оборудования и программного обеспечения.

5. ийпд р1акта рто1еотю райетп Гог б1адпок1к, с1аккШсайоп, ртебюйоп оГ гекропке 1о Шетару апб сйп- 3 024246

1са1 Ъсйауюг, 81габйса11оп оГ (Нсгару. апб топйоппд бНсакс ίη Нста1о1од1с тайдиапсюк (\УО 2004/029575). Способ основан на анализе протеинового профиля больных и обнаружении в нем белковмаркеров, используемых для диагностики и прогнозирования течения и эффективности лечения лимфобластных лимфом.

Данный способ не применим к другим вариантам агрессивных НХЗЛ.

6. АпОЬобюк адапъ! АРРбЬ ак Ъютагксгк Гог саг1у ргодпо818 оГ 1утрйота райсйк (\УО 2007039489). Способ основан на использовании антител против мембранного рецептора АРМЬ для диагностики резистентности к терапии и прогнозирования клинического течения диффузной Вкрупноклеточной лимфомы у пациентов из группы высокого риска (возраст старше 60 лет и имеющих более 2 баллов, согласно ΙΡΙ).

Как указано выше, данный способ не применим к другим вариантам агрессивных НХЗЛ.

7. МсШоб апб Κίΐ Гог 1йс Ргодпо818 оГ Мапбс Сс11 Ьутрйота (\УО 2011012763). Данный способ основан на определении уровня экспрессии опухолевыми клетками по крайней мере одного из следующих генов: ΚΝΟΤΤ, ΗΌΟΡΚΡ3, РАКР1, НМОВ3, РОАЬ§3ВР, ΡΟΝ2, СИК2АР1, ΌΒΝ1, СЯК1, СЯЯ3, §0X11, 8ЕТМАК. и С§ЯК1Е, и применяется для отнесения пациента с диагнозом мантийноклеточной лимфомы в категорию медленно прогрессирующего течения и хорошего ответа на лечение или обычного течения заболевания и более плохого ответа на лечение. Как и предыдущие способы, он не применим к другим вариантам агрессивных НХЗЛ.

8. РсШпо 1 ак а тагксг Гог 1йс б1адпо818 ог ргодпо818 оГ 1утрйота (ΚΚ 20120004286). Способ основан на измерении уровня мРНК РсШпо 1 в биологическом образце пациента с лимфоидной опухолью и сравнении уровня мРНК в ней с контролем и прогнозировании на основании полученных данных эффективности лечения.

Следует отметить нестабильность молекул РНК, что значительно затрудняет проведение методики и оценку результатов.

9. Турск оГ 1утрйота апб тсШоб Гог ргодпо818 ШсгеоР' (И§ 20080068434, 20080206). Способ определения прогноза для пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой основан на исследовании хромосомных перестроек и экспрессии маркера СИ5. При обнаружении 13ц21.1-ц31.3 или 1р36.21-р36.13 в сочетании с СИ5+ делают вывод о плохом прогнозе и вероятной неэффективности лечения, а при обнаружении 5р 15.33-р14.2 в сочетании с СИ5- - о благоприятном прогнозе и хорошем ответе на терапию. Использование данного способа также ограничивается лишь одним вариантом НХЗЛ, метод крайне трудоемок, требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

10. Мо1сси1с тагк Гог бШикс 1агдс Ъ-сс11 1утрйота йсайпд дшбс апб ргодпомк )ибдтсп1 (СЯ 20071173601). Данный способ основан на исследовании маркеров р-Ак! и / или ΥΒ-1 на поверхности опухолевых клеток больного диффузной В-крупноклеточной лимфомой с целью определения прогноза эффективности терапии и выбора адекватной схемы лечения.

Использование данного способа, как и нескольких предыдущих, ограничивается лишь одним вариантом НХЗЛ.

11. МсШобк Гог И1адпо818 апб Ргодпомк оГ Майдпап! Ьутрйота (И§ 2008004208). Способ основан на том, что при обнаружении в процессе массивной геномной сравнительной гибридизации перестроек в хромосомах 1 от р36.23 до р36.32, хромосоме 1 от д42.2 до д43, хромосоме 2 р 11.2, хромосоме 2 ц 13, хромосоме 17 от р 11.2 до р 13.3 и хромосоме 19 от р 13.2 до р13.3 делают вывод о неудовлетворительном прогнозе ответа на лечение больных НХЗЛ.

Для осуществления данного способа требуется приобретение дорогостоящих специализированного оборудования и программного компьютерного обеспечения.

12. МсШоб оГ б1адпо818 рптагу тсб1а8Йпа1 В-сс11 1утрйота ог с1а88юа1 Нобдкш 1утрйота Ъу бс!сс1шд Гипс1юпа1 ти1абоп а! С11ТА 1осик (^0/2012/113064). Способ основан на выявлении мутаций в гене, которые могут применяться для диагностики, прогнозирования течения и мониторирования первичной В-крупноклеточной лимфомы средостения в процессе терапии, а также прогнозирования эффективности лечения.

Использование данного способа ограничивается лишь данным вариантом НХЗЛ с локализацией в средостении.

13. Нста1о1одюа1 сапссг ргоГШпд куЧст (ЕР 1805197А1). Способ основан на использовании набора полинуклеотидных зондов для целого ряда генов для диагностики, классификации, лечения, мониторинга прогрессирования заболевания, предсказывания исхода заболевания или осложнения лимфом и лейкозов.

Данный способ трудоемок и сложен технически, а также дорогостоящ.

14. С'отрокШопк апб тсбюбк гс1аОпд !о СЯ§ 1утрйота (^0/2006/091861). Способ предназначен для диагностики, прогнозирования эффективности лечения лимфом центральной нервной системы.

Использование данного способа ограничивается НХЗЛ с локализацией в центральной нервной системы.

Кроме вышеуказанных ограничений способов, известных из уровня техники, следует сказать еще о том, что все они разработаны на больных, которых лечили без применения препаратов моноклональных

- 4 024246 антител (иммунотерапии). Как оказалось, при использовании препаратов моноклональных антител методы прогнозирования эффективности лечения у больных НХЗЛ, разработанные на больных, в отношении которых применяли только химиотерапию, не работают или работают недостаточно эффективно. Подробнее об этом сказано ниже.

До недавнего времени основным методом терапии НХЗЛ являлась программная полихимиотерапия (ПХТ), которая неспецифична в отношении опухоли и оказывает токсическое действие на здоровые ткани организма, что делает невозможным увеличение дозировок химиопрепаратов с целью преодоления МЛУ.

В последние годы появились высокоактивные лекарственные препараты моноклональных антител, способных воздействовать исключительно на лимфоидные клетки и уничтожать их, не повреждая другие ткани.

За рубежом в рамках иммунохимиотерапии уже более десятка лет применяются препараты моноклональных антител, связывающихся с фосфопротеином В-лимфоцитов С.П20 и запускающих апоптоз (комплемент зависимая, прямая и иммунологическая цитотоксичность) (В1ооД. 1997 8ер 15; 90(6):218895. ГОЕС-С2В8 (КйихшаЬ) апО-СО20 топос1опа1 аиНЬоДу (Негару ίη раПеШк \\'ПН ге1ар8еД 1о^-дгаДе попНоДдкт'8 1утрНота. Ма1опеу Ό.Ο., СпИо-Боре/ Ά.Ι., \У1Ше С.А., ВоДкт Ό., ЗсНЛДег КП., №1ДНаг( ТА., ктакиатап Ν., Рооп К.А., Ы1е8 Т.М., Оа11аие В.К., \Уеу К., Коу8(оп I., Эау18 Т., Ьеуу К.). СЭ20 экспрессируется В-клетками, начиная с ранних пре-В-клеток и далее на всех этапах дифференцировки, исключая плазмоциты, и является прекрасной мишенью для лечения В-клеточных лимфом.

В России в 2005 году была введена программа Дополнительного лекарственного обеспечения и в 2008 году - программа 7 нозологий, что позволило включить препарат С.П20 антитело (ритуксимаб) в протоколы лечения большинства больных В-клеточными СП20-позитивными лимфомами в России.

Применяемый с этого момента комплексный терапевтический подход, предусматривающий применение традиционных химиотерапевтических воздействий вместе с описанной иммунотерапией, безусловно, улучшает результаты терапии данной категории пациентов. Так, например, при диффузной Вкрупноклеточной лимфоме, являющейся одной из наиболее распространенных вариантов НХЗЛ, в настоящее время 5-летняя выживаемость составляет 58% против 45% до применения препаратов моноклональных антител (ТНе геу18еД 1п!егпайопа1 Ргодпо8Йс 1пДех (К-1Р1) ίδ а Ье((ег ргеДюЮг оГ оШсоте (Нап Не 81апДагД ΙΡΙ Гог раПеШк \\'ПН ДДГше 1агде В-се11 1утрНота 1геа1еП \\'ПН К-СНОР. ЗеНп Ь.Н., Веггу В., СННапаЫкн М., РЮдега1Д С., Ст11 К., Но8кт8 Р., К1а8а К., Зауаде К.1. ЗНепЫег Т., 8и1Нег1апД 1., Са8соупе Κ.Ό., Соппог8 РМ. В1ооД. 2007 Маг 1; 109(5):1857-61. ЕриЬ 2006 Μν 14). Одним из основных препятствий для дальнейшего прогресса в лечении НХЗЛ по-прежнему является приобретение клетками опухоли резистентности, но уже не только к цитостатической и лучевой, но и иммунной терапии, т.е. плейотропной резистентности.

Одновременно с началом клинического применения иммунохимиотерапии стали появляться сообщения о том, что хорошо зарекомендовавшие себя ранее методы прогнозирования эффективности химиотерапевтического лечения у больных НХЗЛ при использовании иммунохимиотерапии утратили свое значение (Ргодпо811с тоДе18 Гог Д1ГГи8е 1агде В-се11 1утрНота ш (Не гйихшаЬ ега: а пеуег-епДтд 81огу. Вап А., МагсНе8еШ Ь., 8ассЫ 8., МагсНе8еШ К., Ро/ζί δ., Рет Р., Ва11еап Е., Ми8(о Р., №τί δ., А1ое ЗршД М.А., Сох М.С. Апп Опсо1. 2010 1и1; 21(7):1486-91).

Был переработан индекс 1Р1 для оценки тяжести заболевания и эффективности терапии у пациентов с агрессивными лимфомами, которые получали препарат моноклональных антител ритуксимаб. Пересмотренный К-1Р1 использует те же факторы, но делит пациентов только на 3 группы риска:

очень хороший прогноз (без неблагоприятных прогностических факторов), хороший прогноз (1 или 2 неблагоприятных прогностических факторов), плохой прогноз (3 и более неблагоприятных прогностических факторов).

В исследовании, на основании которого был разработан К-1Р1, около 95% больных из группы очень хорошего прогноза жили не менее 4 лет, в то время как только около 55% больных из группы плохого прогноза жили не менее 4 лет (ТНе ге\л8еД 1п!егпайопа1 Ргодпо80с 1пДех (К-1Р1) 18 а Ъе((ег ргеДю(ог оГ оШсоте (Нап (Не 8(апДагД 1Р1 Гог раОеп(8 \уПН ДДГи8е 1агде В-се11 1утрНота (геа(еД \уПН К-СНОР. 8еНп Ь.Н., Веггу В., СННапаЬНа1 М., Р1Пдега1Д С., Ст11 К., Но8кш8 Р., К1а8а К., Зауаде К.1, ЗНепОег Т., 8и1Нег1апД 1., Са8соупе ΚΌ., Соппог8 1М. В1ооД. 2007 Маг 1; 109(5):1857-61. ЕриЬ 2006 Му 14.; Ке1еуапсе оГ (Не 1п(егпа(юпа1 Ргодпо8Йс 1пДех ш (Не гйихшаЬ ега. Тау К., Та1 Ό., Тао М., Онек К., На Т.С., Вт 8.Т. 1 С1ш Опсо1. 2011 1ап I; 29(1):е14).

Кроме переработанного индекса 1Р1, лишь два способа (они приведены ниже) из обнаруженных в результате патентно-информационного поиска дают возможность прогнозировать выживаемость пациентов с агрессивными НХЗЛ в случае применения как схем полихимиотерапии с включением антрациклинов, так и в случае схем иммунохимиотерапии, сочетающих антрациклины и анти-С.П20 антитела:

1. АГОаДеН А.А. е( а1. изучали ассоциацию уровня экспрессии ЬМО2 и ТОТК8Р9 с прогнозом выживаемости больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой (РгеДюДоп оГ 8игу1уа1 ш ДДГи8е 1агде В-се11 1утрНота Ьа8еД оп (Не ехрге88юп оГ 2 депе8 геГ1ес(тд (итог апД тюгоепуиоптепк А1^ζаДеΗ А.А., Сеп(1е8 АД., А1епсаг АД., Пи С.Ь., КоНг( Н.Е., Ноио( К., Со1Д8(еш МД., 2Нао δ., №Пкипат Υ., АДуат К.Н., Са8- 5 024246 соупе Κ.Ό., Впопек 1., ТФкНпаш К.1., МуЫеЪик! ΙΗ., ΡΚνπΙίκ 8.К., Ьоккок Ι.8., Ьеуу К. В1ооб. 2011 Аид 4;13 8(5):1350-8). На основании полученных данных авторами разработан способ МеОюбк о! Ргодпок15 Юг Ыоп-Нобдкш Ьутрйота (И8 2012134986), основанный на измерении уровня экспрессии опухолевыми клетками маркера ЬМО2 и уровня экспрессии клетками микроокружения маркера ΤΝΡΚ8Ρ9. В работе показано, что повышение уровня ЬМО2 и ΤΝΡΡ8Ρ9 коррелирует с хорошим ответом на терапию, состоящую из схем с антрациклинами, как включающую так и не включающую препараты анти-СО20 антител, и увеличением 10-летней общей выживаемости.

Данный способ пригоден только для пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой и не дает возможность прогнозировать вероятность достижения ремиссии, а также безрецидивную выживаемость пациентов.

2. Сообщение Ваггапк 8. е! а1. свидетельствует о том, что у пациентов с диффузной Вкрупноклеточной лимфомой, получающих терапию К-СНОР (т.е. лечение с применением ритуксимаба), перестройки гена МУС являются неблагоприятным прогностическим фактором (Кеаггапдетеп! о! МУС ίδ аккос1а!еД νίΐΐι роог ргодпок1к ш райейк νίΐΐι ДГГике 1агде В-се11 1утрйота 1геа1еб ш !йе ега о! гйихшаЪ., Сгоисй 8., 8тйй А., Тигпег К., О\\еп К., Ра!тоге К., Котап Е., 1аск А.1. Сйп Опсо1. 2010 1и1 10; 28(20):3360-5. ЕриЪ 2010 Мау 24) (прототип). Трехлетняя выживаемость пациентов составила 35% против 61% без перестройки гена МУС.

Данный способ пригоден, как уже указано выше, только для пациентов с диффузной Вкрупноклеточной лимфомой и требует одновременного применения двух методов: иммуногистохимического метода для определения экспрессии гена МУС и Р18Н-метода (йиогексей ш кйи НуЪпШ/аОоп флюоресценция в месте гибридизации) для непосредственного выявления перестройки данного гена. Р18Н-метод требует дорогостоящего оборудования, компьютерной базы с программным обеспечением.

Способ позволяет прогнозировать только 3-летнюю общую выживаемость, тогда как в онкологии общепринятым периодом наблюдения является 5-летний. Данный способ не дает возможность прогнозировать безрецидивную выживаемость, а также вероятность достижения ремиссии.

В качестве прототипа указан последний способ (сообщение Ваггапк 8. е! а1.). Он основан, как и предлагаемый способ, на генетическом признаке пациента, разработан на больных, получавших лечение ритуксимабом, и прогнозирует выживаемость. Однако, данный способ предназначен только для больных с диффузной В-крупноклеточной лимфомой.

Близким к предлагаемому является также переработанный ΙΡΙ - К-ΙΡΙ. Данный способ не использует генетический признак, но разработан на больных, получавших лечение ритуксимабом, позволяет прогнозировать выживаемость и, как и предлагаемый способ, предназначен для больных с различными формами агрессивных НХЗЛ.

На основе анализа уровня техники можно резюмировать, что существующие способы имеют те или иные ограничения:

1) предназначены для отдельных гистологических вариантов агрессивных НХЗЛ (только лимфобластные, только мантийноклеточная, только диффузная В-крупноклеточная) или даже для лимфом определенной локализации (средостение, центральная нервная система);

2) в то время как в онкологии и онкогематологии одними из важнейших показателей эффективности терапии являются достижение ремиссии, время жизни больного (5-летняя выживаемость), качество этой жизни, которое напрямую зависит от рецидивирования опухолевого процесса, прогностичность вышерассмотренных способов основана на анализе только частоты достижения ремиссии, либо только общей выживаемости пациентов, без возможности прогнозирования рецидивов;

3) способы, основанные на сравнительной геномной гибридизации, изучении хромосомных перестроек и использовании микрочипов трудоемки, требуют приобретения дорогостоящих материалов, специализированного компьютерного оборудования и программного обеспечения;

4) осуществление способов, основанных на манипуляциях с молекулами РНК, затруднено нестабильностью данных молекул;

5) ряд способов не дают возможности прогнозирования эффективности лечения заболевания до начала специфической терапии;

6) применение способа, основанного на исследовании уровня цитокинов и их рецепторов на поверхности лимфоцитов, ограничено необходимостью широкого спектра дообследования пациента с целью исключения влияния сопутствующей патологии на уровень измеряемых показателей. В случае наличия у пациента осложнений инфекционных НХЗЛ влияние на уровень измеряемых показателей инфекционного и опухолевого процесса разграничить практически невозможно;

7) наконец, все описанные выше способы, кроме последних двух и переработанного ΙΡΙ, не дают возможности прогнозировать эффективность терапии в случае применения иммунохимиотерапии, включающей препараты моноклональных анти-СЭ20 антител (ритуксимаб), в то время как иммунохимиотерапия сейчас является золотым стандартом лечения всех В-клеточных НХЗЛ.

Предлагаемое изобретение основано на исследовании связи между наличием у человека однонуклеотидной замены С13494А в 6 интроне антионкогена ТР53 и прогнозом эффективности лечения пациентов с неходжкинскими лимфомами высокой степени злокачественности.

- 6 024246

Ген ТР53 - ключевой регулятор постоянства генома клетки. Дефицит его функции способен вызывать МЛУ опухолевых клеток по меньшей мере тремя способами: отменяя апоптоз, учащая мутационный процесс и повышая активность генов, определяющих те или иные механизмы лекарственной устойчивости (Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опухольсупрессирующих и онкогенных активностей. Б.П. Копнин, П.Б. Копнин, Н.В. Хромова, Л.С. Агапова // Гематология. Т1, № 1, 2008).

В последовательности гена ТР53 были обнаружены 19 олигонуклеотидных полиморфизмов, один из которых находится в 13494 позиции 6 интрона антионкогена ТР53 и состоит в замене гуанина на аденин С13494А) (А поус1 ро1утогрН18т ίη ίηίτοη 6 о£ 1Нс Нитап р53 депе: а ро881Ь1е а88ОС1айоп \\ЙН сапсег ρτβάίδροδίΐίοη апй 8И8серйЬййу/8. Ре11ег [е4 η1.|//ΟΝΛ Се11 Βίο1.- 1995, Иес. - Уо1. 14, № 12. - Р. 983-90). Замена С на А в 61 паре нуклеотидов 6 интрона (основание номер 13494) гена ТР53 определяется по рестрикции ферментом М8р1. Этот фермент способен распознавать и разрезать нить ДНК при нахождении в 61 паре нуклеотидов 6 интрона гена ТР53 гуанина (С). В случае замены С на аденин (А) рестрикция данным ферментом становится невозможной.

Относительно полиморфизма С13494А 6 интрона гена ТР53 в уровне техники имеются следующие сведения:

1. Показана ассоциация комбинации гетерозиготного генотипа С/А полиморфного локуса С13494А 6 интрона гена ТР53 в сочетании с гетерозиготностью по двум другим полиморфным локусам йир16Ьр 3 интрона (те/йир16) и Агд72Рго 4 экзона (Агд/Рго) гена ТР53 с более высокими показателями общей выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого по сравнению с комбинацией гомозиготных генотипов по частым аллелям 3 интрона, 4 экзона и 6 интрона (\у/\\-Агд/Агд-С/С) (р<0,04) (Гервас П.А. Генетический полиморфизм гена-онкосупрессора р53 и функционально связанных с ним генов ССК5 и ХК.СС1 при раке легкого. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Томск - 2007, с. 22).

2. При хроническом лимфолейкозе/лимфоме из малых лимфоцитов, который относится к НХЗЛ низкой степени злокачественности, А/А генотип полиморфизма С13494А 6 интрона гена ТР53 ассоциирован с начальными стадиями заболевания, СЭ38 негативным статусом и более длительным периодом до необходимости начала специфического лечения, что свидетельствует о благоприятном течении заболевания. Однако влияния данного полиморфизма на общую выживаемость не отмечено (Геик Ке8. 2006 8ер; 30(9):1113-8.Т^о дегт Ние ро1утотрНт8т8 οί Пте Щтоиг 8иррге88ог деве р53 тау тПиенсе 1Не Ью1оду οί сНгошс 1утрНосуйс 1еикает1а. КосНеБш С., Ие1дайо ί., Реррег С., ЗЩгс/ушЮ ί., Ноорег Б., КШНиаи 8., Ρедаη С., Ртай С.).

Наличие по меньшей мере 9 разных изоформ белка ТР53, имеющих тканеспецифический характер, несомненно, не позволяет экстраполировать результаты, полученные на других видах опухолевых заболеваний, на пациентов с агрессивными НХЗЛ.

Данные о роли полиморфизма С13494А гена ТР53 при агрессивных неходжкинских лимфомах, в уровне техники отсутствуют.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинскими злокачественными лимфомами высокой степени злокачественности, а именно вероятности достижения ремиссии, 5-летнего общего и безрецидивного выживания, состоит в следующем. Исследуют полиморфизм С13494А 6-го интрона гена ТР53 пациента и при выявлении у пациента гомозиготного генотипа С/С в данном локусе прогнозируют низкую эффективность лечения, а именно малую вероятность 5-летнего выживания пациента и малую вероятность отсутствия рецидива, а при выявлении у пациента генотипа А/А или С/А в данном локусе прогнозируют высокую эффективность лечения, а именно высокую вероятность наступления ремиссии и 5-летнего выживания пациента.

По сравнению с аналогами предлагаемый способ эффективен в отношении различных вариантов агрессивных НХЗЛ;

дает возможность получить более полную картину прогноза эффективности лечения пациентов с агрессивными НХЗЛ, включающую вероятность достижения ремиссии, общую и безрецидивную 5летнюю выживаемость, от которой зависит качество жизни пациента, осуществление предлагаемого способа предполагает манипуляции с молекулами ДНК, которые значительно более стабильны во внешней среде, в сравнении с молекулами РНК, что не требует строгого соблюдения очень коротких (несколько десятков минут) временных интервалов от момента забора материала для исследования до выделения ДНК и выполнения анализа, предлагаемый способ дает возможность прогнозирования эффективности лечения заболевания до начала специфической терапии, в отличие от уровня цитокинов в крови и их рецепторов на поверхности лейкоцитов генотип полиморфизма С13494А в 6 интроне гена ТР53, на определении которого основан предлагаемый способ, является постоянной, не изменяющейся в течение всей жизни человека характеристикой, предлагаемый способ дает возможность прогнозировать эффективность терапии агрессивных НХЗЛ в случае применения иммунохимиотерапии, включающей препараты моноклональных анти-СИ20 антител (ритуксимаб).

- 7 024246

По сравнению с прототипом предлагаемый способ эффективен в отношении различных вариантов агрессивных НХЗЛ;

технически существенно проще и малозатратнее по времени и средствам, т.к. использует ПЦРПДРФ анализ (ПЦР - полимеразная цепная реакция; ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), дает возможность получить более полную картину прогноза эффективности лечения. Как выше уже было указано, выделяют 4 показателя эффективности противоопухолевой терапии. В прототипе используется только один - 3-летняя выживаемость, хотя в онкологии общепринятым периодом наблюдения является 5-летний период (А8СО. АШсотех о£ сапсег 1гса1тсп1 о£ 1есЬпо1о§у а55С55тсп1 апй сапсег 1геа1теп1 §шйе1ше8//1. С1ш.Опсо1о§у. - 1996. - Уо1. 14, № 3. - Р. 671-679). В предлагаемом способе используют 3 показателя эффективности терапии - прогнозируется вероятность достижения ремиссии, вероятность дожития больным 5-летнего срока от даты постановки диагноза, а также вероятность безрецидивного дожития больным данного срока, от чего зависит и 4-й показатель - качество жизни пациента.

При осуществлении предлагаемого способа на первом этапе в ПЦР реакции получают фрагмент гена ТР53 обследуемого пациента длиной 404 пары нуклеотидов (п.н.). Этот фрагмент может содержать в позиции 13494 С (гуанин) (частый аллель), либо А (аденин) (редкий аллель). Затем проводят рестрикцию полученного на первом этапе ампликона с использованием эндонуклеазы рестрикции ΜδρΙ, которая расщепляет только частый вариант аллеля (содержащий С в позиции 13494) и разрезает его на два фрагмента длиной 336 и 68 п.н. Далее проводят электрофорез продуктов гидролиза. Могут получиться три варианта картин электрофореза. Наличие на электрофорезе одной полосы длиной 404 п.н. свидетельствует об отсутствии гидролиза ампликона и гомозиготном минорном генотипе А/А у пациента; одной полосы длиной 336 п.н. - о гидролизе всего ампликона и гомозиготном частом генотипе С/С; наличие двух полос длиной 404 и 336 п.н. - о частичном гидролизе ампликона и гетерозиготном генотипе С/А у пациента.

Перечень фигур иллюстративного материала

Фиг. 1. Электрофоретический анализ результатов ПЦР фрагмента ДНК, содержащего полиморфизм С13494А в 6 интроне гена ТР53. М - ДНК-маркер молекулярного веса (100 п.н.).

Фиг. 2. Результаты электрофоретического анализа продуктов ΜδρΙ-гидролиза ампликонов, полученных на предыдущем этапе. 1 - 404 п.н. (АА); 2 - 404+336+68 п.н. (С/А); 3 - 336+68 п.н. (С/С); М ДНК маркер по 100 п.н.

Фиг. 3. Частота ремиссии в группе больных агрессивными НХЗЛ в зависимости от генотипа локуса 134946 интрона гена ТР53 и ΙΡΙ. Первые два столбца относятся ко всей обследованной группе больных; вторые - к подгруппе больных с С/С-генотипом; третьи - к подгруппе больных с генотипами С/А или А/А; четвертые - к подгруппе больных с величиной индекса К-ΙΡΙ или ΙΡΙ, равной 3 и более; пятые - с величиной индекса К-ΙΡΙ или ΙΡΙ, равной 2 и менее.

Примечание: * уровень значимости отличия р < 0,005 группы больных с С/С генотипом в сравнении с больными с С/А и А/А генотипами; ** уровень значимости отличия р<0,05 группы больных с 3 и более и 2 и менее неблагоприятными факторами прогноза, согласно К-ΙΡΙ (ΙΡΙ).

Фиг. 4. Безрецидивная выживаемость в группе больных агрессивными НХЗЛ в зависимости от генотипа полиморфизма С13494А в 6 интроне гена ТР53.

Фиг. 5. Общая выживаемость в группе больных агрессивными НХЗЛ в зависимости от генотипа полиморфизма С13494А в 6 интроне гена ТР53.

Обоснование способа и его осуществление

Клиническая характеристика больных

Группу обследованных составили 41 пациент с агрессивными вариантами В-клеточных НХЗЛ, диагностированными в Г ородском гематологическом центре г. Новосибирска с 2004 по 2007 г. Исследовали генотип больных в 13494 позиции 6 интрона гена ТР53.

Средний возраст больных составил 43,8±14,1 года (16-72 лет). По полу больные распределялись следующим образом: мужчины - 22 (54%), женщины - 19 (46%). Подавляющее большинство больных имели продвинутые стадии заболевания: 25 человек (61%) - Ιν стадию, 8 человек (20%) - ΙΙΙ стадию, 8 человек (19%) - ΙΙ стадию лимфомы.

В обследованной группе у пациентов, согласно классификации ВОЗ, были верифицированы следующие гистологические варианты лимфом: диффузная крупноклеточная, плеоморфная, лимфобластная, центробластная, иммунобластная, плазмобластная, анапластическая, фолликулярная 3-го цитологического типа, мантийноклеточная. Диагноз неходжкинской лимфомы был установлен на основании гистологического исследования биоптатов лимфоузлов с иммуногистохимической верификацией варианта опухоли с использованием широкой панели моноклональных антител к кластерам дифференцировки гемопоэтических клеток.

У 3-х больных было выявлено, согласно критериям ΙΡΙ, наличие 1 неблагоприятного прогностического фактора, у 9-ти - 2-х факторов, у 16-ти - 3-х факторов, у 8-и - 4-х факторов и у 5-и больных - 5-и неблагоприятных прогностических факторов. Пациенты без неблагоприятных факторов прогноза по ΙΡΙ, К- ΙΡΙ в нашем исследовании не встречались.

Больные с нелимфобластными вариантами заболевания в зависимости от стадии заболевания в качестве терапии первой линии получили от 4-х (при Ι-ΙΙ стадии) до 6-8 (при ΙΙΙ-Ιν стадии) курсов иммуно- 8 024246 полихимиотерапии, включающей препарат ритуксимаб. В терапии использовались стандартные и высокодозные протоколы - К-СНОР (ритуксимаб, циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон), КСНОЕР (ритуксимаб, циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон), К-Е8НАР (этопозид, дексаметазон, цитарабин, цисплатина).

При лимфобластных вариантах пациенты в качестве терапии первой линии получали лечение по протоколу Хельцера (рассчитана на 3 года), курсы СОАР (в течение 2-х лет), протоколы ОЛЛ-2005 и МВ-2002 (в течение 2-2,5 лет). Эффект полихимиотерапии оценивался по состоянию лимфоузлов, внутренних органов, анализам периферической крови и костного мозга, биохимическому исследованию крови, инструментальным методам обследования, общему состоянию больного и выраженности симптомов опухолевой интоксикации (лихорадка более 38°С, проливные ночные поты и снижение массы тела на 10% за последние 6 месяцев).

Выделение ДНК из лейкоцитов цельной венозной крови больных лимфомами

Кровь для исследования генотипа пациента забирали из вены в объеме 5 мл. Полученный материал хранили до выделения ДНК при температуре -20°С.

Процедура выделения ДНК

1- й день. Перед выделением ДНК пробу крови размораживали, гомогенизировали и добавляли в нее 5 мл свежеприготовленного буфера А (в его состав входят: 10 мМ трис-НС1 с рН 7,5, 10 мМ ЫаС1, 3 мМ М§С1₂). После тщательного встряхивания и центрифугирования пробы в течение 5 мин при 4 тыс. оборотов сливали надосадочную жидкость.

К осадку вновь добавляли 5 мл буфера А. Содержимое пробирки встряхивали, центрифугировали и сливали надосадочную жидкость. Такую последовательность действий повторяли еще 2-3 раза.

К отмытому осадку добавляли 1,9 мл буфера В (в его состав входят: 10 мМ ЕЭТА, 100 мМ ЫаС1, 50 мМ трис-НС1, рН 8,0). После тщательного встряхивания осадка с буфером добавляли 20% δΌδ (додецилсульфат натрия) в количестве 50 мкл и протеиназу К (Медиген, г. Новосибирск) в разведении 20 мг/мл в количестве 160 мкл. Содержимое пробирки перемешивали и оставляли для обработки белков протеиназой К на ночь в термостате при 37°С.

2- й день. В пробирку с пробой, в которой прошла обработка белков протеиназой К, добавляли 400 мкл 5М ЫаС1, 3 мл фенола, насыщенного буфером 0,1 М трис-НС1, рН 8,0, содержащим 0,2% 2меркаптоэтанола. Содержимое пробирки встряхивали и центрифугировали при 4 тыс. оборотов в течение 5 мин. После разделения фаз на водную и фенольную аккуратно пипеткой собирали верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку, добавляли в нее 3 мл смеси фенола с хлороформом в соотношении 1:1 (хлороформ содержал изоамиловый спирт в соотношении 24:1), встряхивали и вновь центрифугировали.

После разделения фаз на водную и хлороформ-фенольную аккуратно пипеткой собирали верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку, добавляли в нее 3 мл хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1, содержимое пробирки встряхивали и вновь центрифугировали.

После разделения фаз на водную и хлороформную аккуратно пипеткой собирали верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку, добавляли в нее 3 мл изопропилового спирта, аккуратно перемешивали содержимое пробирки до появления клубочка нитей ДНК.

Пробирки с пробой ДНК в изопропиловом спирте закрывали и оставляли на ночь при -20°С для оседания небольших фрагментов ДНК.

день. Пробирки с ДНК и изопропиловым спиртом центрифугировали при 4 тыс. оборотов в течение 5 мин для осаждения ДНК, спирт аккуратно сливали.

К осадку аккуратно добавляли 3 мл 75% этилового спирта, центрифугировали при 5 тыс. оборотов в течение 10 мин, спирт аккуратно сливали.

К осадку добавляли 3 мл 96% этилового спирта и вновь центрифугировали, спирт аккуратно сливали, остатки удаляли фильтровальной бумагой и подсушивали ДНК при 37°С до полного удаления спирта.

Растворяли осадок в би-дистиллированной воде до концентрации ДНК около 1 мг/мл и хранили до проведения ПЦР при -20°С.

Генотипирование полиморфизма С13494А 6 интрона гена ТР53

Анализ генотипа пациента по полиморфизму С13494А 6 интрона гена ТР53 включал несколько описанных ниже этапов.

1) Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР). Состав реакционной смеси на 1 пробу ДНК для проведения ПЦР указан в табл. 2.

- 9 024246

Таблица 2. Состав реакционной смеси на 1 пробу для ПЦР

Реактив	Объем, мкл
Буфер х 10 (100 тМ трис-НС1, рН 8,3, 500 тМ КС1, 25 тМ М_ёС1₂)	1,5
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (сПЧТРз) (концентрация каждого в смеси равна 2 мМ)	1,5
Праймер прямой (Р, 1)* (в разведении до 0,25 мкМ)	1,5
Праймер обратный (К, 11)** (в разведении до 0,25 мкМ)	1,5
Тац-полимераза (в реакцию 1 ЕА) «Сибэнзим», г. Новосибирск	1,0
Вода	7,0
ДНК-проба в разведении 1 мг/мл	1,0

* Прямой праймер: 5'-ССССАТСТАСААССАСТСА.

** Обратный праймер: 5'-ТТССАСАТСТСАТССССТТА.

В примечании к табл. 2 указаны использовавшиеся праймеры. Данные праймеры обеспечивают амплификацию фрагмента гена ТР53 размером 404 п.н., содержащего замену С на А в позиции 13494.

Программа температурно-временных циклов ПЦР (автоматический термоциклер ЕррепбогТ) предварительная денатурация - 94°С, 3 мин;

далее 30 циклов: денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров -57°С, 60 с; элонгация - 72°С, 60 с; постэлонгация - 72°С 3 мин.

2) Электрофоретический анализ результатов ПЦР в 1,5% агарозном геле. На гель наносится по 5 мкл амплификата проб нескольких пациентов. Используется ДНК-маркер молекулярных весов 100 п.н. в количестве 0,8 мкл. Маркер представляет собой смесь фрагментов ДНК последовательно возрастающей длины, отличающихся друг от друга на 100 п.н. Как видно из фиг. 1, в результате ПЦР получили фрагменты гена ТР53 размером 404 п.н.

3) Постановка гидролиза полученных ампликонов с использованием эндонуклеазы рестрикции ΜδρΙ. Состав реакционной смеси на 1 пробу ДНК для гидролиза приведен в табл. 3. Гидролиз проводился в течение 3 ч при 37°С.

Таблица 3. Состав реакционной смеси на 1 пробу ДНК для гидролиза

Реактив	Объем, мкл
I	2	3
Буфер для эндонуклеазы рестрикции М$р1 В*	2,0	2,0	2,0
Эндонуклеаза рестрикции Мзр1** (в реакцию 2 ЕА)	0,1	0,1	0,1
Вода	15,9	12,9	7,9
Ампликон	2,0	5,0	10,0

* в состав входят 10 мМ трис-НС1 рН 7.6 при 25°С, 10 мМ МдС1, 1 мМ БТТ.

** Сибэнзим, г. Новосибирск.

4) Электрофоретический анализ результатов ΜδρΙ-гидролиза в 6% полиакриламидном геле. На гель наносится по 10 мкл рестрикта каждого пациента и ДНК-маркер молекулярных весов 100 п.н. (в количестве 1,5 мкл). Варианты распределения полос на электрофореграмме приведены на фиг. 2. Отсутствие гидролиза (наличие одной полосы размером 404 п.н. на дорожке под номером 1) свидетельствует о гомозиготном минорном генотипе (А/А) данных пациентов. Полной гидролиз (наличие полосы размером 336 п.н. на дорожке под номером 3) свидетельствует о гомозиготном генотипе С/С у данного пациента (полоса, соответствующая 68 п.н., не визуализируется). Частичный гидролиз (наличие двух полос размером 404 и 336 п.н. на дорожках под номером 2) свидетельствует о гетерозиготном генотипе С/А у данных пациентов по полиморфизму С13494А 6 интрона гена ТР53.

Статистические методы исследования

Анализ генетических полиморфизмов начинался с выявления частоты встречаемости каждого из аллелей и генотипов. Для изученного полиморфизма в выборке пациентов с агрессивными лимфомами распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга, которое можно записать в виде формулы: р²АА+2рцАа+ц²аа=1.

При сравнении наблюдаемых и ожидаемых частот событий использовался стандартный критерий χ²Пирсона и точный критерий Фишера.

5-летнюю выживаемость пациентов исследовали с помощью метода анализа цензурированных данных с использованием функции вероятности выживания Каплана - Майера. Для сравнения кривых выживаемости использовали непараметрический 1од-гапк-критерий. При расчете общей выживаемости началом мониторинга считался момент постановки диагноза, событием - смерть от любой причины. При расчете безрецидивной выживаемости началом мониторинга считался момент постановки диагноза, событием - рецидив. Время наблюдения составило от 2 до 60 месяцев.

Для прогнозирования риска наступления события для пациентов с НХЗЛ и оценки влияния независимых предикторов на этот риск применялась модель пропорциональных рисков регрессии Кокса.

При оценке информативности предлагаемого метода и прототипа были рассчитаны прогностическая чувствительность и специфичность.

- 10 024246

Чувствительность метода определяли как долю пациентов с неблагоприятным прогнозом, которые до начала лечения были точно идентифицированы предлагаемым способом (т.е. по генотипу были отнесены к группе неблагоприятного прогноза).

Специфичность метода определяли как долю пациентов с благоприятным прогнозом, которые до начала лечения были точно идентифицированы предлагаемым способом (т.е. по генотипу были отнесены к группе благоприятного прогноза).

Статистические вычисления были выполнены с помощью программ (ЧаШЬса 6.0 и 8Ρ88 11.5. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования

Как указывалось выше, полиморфизм гена ТР53 был исследован у 41 пациентов с агрессивными НХЗЛ. Из 82 генов ТР53, принадлежащих 41 обследованным пациентам, 67 генов (82%) несли О-аллель и 15 (18%) - А-аллель.

Гомозиготный генотип О/О был обнаружен у 68% больных НХЗЛ (у 28 человек из 41), гомозиготный генотип А/А - у 5% больных (2/41) и гетерозиготный генотип О/А - у 27% больных НХЗЛ (11/41) (табл. 4).

Таблица 4. Распределение частот аллелей и генотипов О13494А 6 интрона гена ТР53 в обследованной группе больных агрессивными НХЗЛ

Аллели и генотипы С13494А 6-го интрона гена р53	Больные агрессивными НХЗЛ
	Абс.	%
О-аллель	67/82	82
А-аллель	15/82	' 18
Генотип О/О	28/41	68
Генотип О/А	11/41	27
Генотип А/А	2/41	5

Частота ремиссий во всей группе больных агрессивными НХЗЛ составила 58,5% (24/41) (фиг. 3). В подгруппе больных с О/О генотипом ремиссия получена у 42,9% (12/28) человек, что было статистически значимо (р=0,003) ниже, чем в подгруппе больных с О/А и А/А генотипами - 92,3% (12/13).

В обследованной группе получали ритуксимаб 33 человека с нелимфобластными НХЗЛ. Восемь больных с лимфобластными НХЗЛ ритуксимаб не принимали, т.к. опухолевые клетки при данных вариантах НХЗЛ не имеют на своей поверхности мишени для действия ритуксимаба - СЭ20-рецептора. Поскольку больных, в состав лечения которых входил ритуксимаб, было 80,5%, то результаты лечения этих больных были близки к результатам лечения всей группы больных.

У авторов не было возможности определить у обследованных больных наличие перестройки гена МУС согласно способу-прототипу. К тому же способ-прототип предназначен только для больных с Вкрупноклеточной лимфомой, а в обследованной группе были больные и с другими вариантами агрессивных НХЗЛ. Но авторы использовали международный прогностический индекс (К-ΙΡΙ или ΙΡΙ) для оценки степени тяжести заболевания и эффективности лечения обследованных больных, что позволяет сравнить предлагаемый способ с международным прогностическим индексом.

При анализе частоты ремиссий на основе описанного выше международного прогностического индекса получены следующие результаты: в подгруппе больных с 3-я и более неблагоприятными факторами прогноза ремиссия получена у 48,2% больных (14/29), что было статистически значимо ниже (р=0,039), чем в группе с 2-мя и менее неблагоприятными факторами прогноза - 83,3% (10/12).

При анализе показателей 5-летней выживаемости в обследованной группе больных НХЗЛ были получены следующие результаты (табл. 5): общая выживаемость составила 36,6% (15/41), безрецидивная 24,4% (10/41).

Таблица 5. Показатели 5-летней выживаемости больных агрессивными НХЗЛ

5-летняя выживаемость
Общая	Безрецидивная
Абс.	%	Абс.	%
15/41	36,6	10/41	24,4

Проведенный сравнительный анализ ассоциации генотипа полиморфного локуса О13494А 6 интрона гена ТР53 у больных агрессивными НХЗЛ с 5-летней выживаемостью выявил наличие ассоциации О/О генотипа со статистически значимым ухудшением показателей общей 21,4% (6/28) и безрецидивной 10,7% (3/28) выживаемости против 69,2% (9/13, р=0,004) и 53,9% (7/13, р=0,0006) при О/А и А/А генотипах соответственно (табл. 6, фиг. 4, 5).

- 11 024246

Таблица 6. Показатели 5-летней выживаемости больных НХЗЛ в зависимости от генотипа О13494А 6 интрона гена ТР53

5-летняя выживаемость
Общая	Безрецидивная
Генотип	уровень значимости отличия, Р	Генотип уровень \| значимости
О/О	О/А и А/А	О/О	О/А и отличия, А/А \| р
Абс, ί %	Абс.	%	Абс. 1 %	Абс.	% 1
6/28 ! 21,4 1	9/13	69,2	0,004	3/28 10,7	7/13	53,91 0,0006

При анализе 5-летней выживаемости пациентов с агрессивными НХЗЛ в зависимости от К-ΙΡΙ (ΙΡΙ) была показана ассоциация наличия 3-х и более факторов риска со статистически значимым ухудшением показателей общей выживаемости: 24,1% (7/29) против 66,7% (8/12) (р=0,013) при наличии 2-х и менее факторов риска. Ассоциации К-ΙΡΙ (ΙΡΙ) с показателями безрецидивной выживаемостью не выявлено (20,7% (6/29) против 33,3% (4/12) (р=0,095) (табл. 7).

Таблица 7. Показатели 5-летней выживаемости больных НХЗЛ в зависимости от К-ΙΡΙ (ΙΡΙ)

5-летняя выживаемость

Общая	Безрецидивная
Количество неблагоприятных прогностических факторов	уровень значимости отличия, р	Количество неблагоприятных п рогностических факторов	уровень значимости отличия, р
> 3	<2		>3	<2
Абс.	%	Абс.	%		Абс.	%	Абс.	%
7/29	24,1	8/12	66,7	0,013	6/29	20,7	4/12	33,3	0,095

Была проведена оценка влияния генотипа О13494А 6 интрона гена ТР53 и К-ΙΡΙ (ΙΡΙ) на 5-летнюю выживаемость в модели пропорциональных рисков регрессии Кокса (табл. 8).

Таблица 8. Оценка влияния генотипа О13494А 6 интрона гена р53 и К-ΙΡΙ (ΙΡΙ) в качестве независимых предикторов на 5-летнюю выживаемость в модели пропорциональных рисков регрессии Кокса

5-летняя выживаемость

Ковариаты	Общая	Безрецидивная
δί§.	Ехр.	δΐ₈.	Ехр. ]
1^г	Генотип 013494А 6 интрона гена р53	0,016	3,348	0,006	3,621
1	К-1Р1 (ΙΡΙ)	0,037	2,835	0,221	1,655

Анализ показал, что генотип локуса 13494 может служить независимым предиктором как общей, так и безрецидивной 5-летней выживаемости. При О/О генотипе в сравнении с О/А и А/А генотипами показано достоверное повышение риска ухудшения в 3,3 раза (р=0,016) общей, в 3,6 раза безрецидивной (р=0,006) выживаемости.

В то же время, международный прогностический индекс может служить независимым предиктором только общей выживаемости. При наличии 3-х и более неблагоприятных прогностических факторов КΙΡΙ (ΙΡΙ) в сравнении с наличием 2-х и менее прогностических факторов К-ΙΡΙ (ΙΡΙ) показано достоверное повышение риска ухудшения общей выживаемости лишь в 2,8 раза (р=0,037).

Чувствительность метода определяли по формуле а/(а+Ь), а специфичность по формуле ά/(ο+ά), (табл. 9).

Таблица 9. Таблица для расчета чувствительности и специфичности предлагаемого способа

Событие по факту:	Прогноз наступления события согласно предлагаемому способу
Наступит	не наступит	Всего
наступило	(а)	(Ь)	(а+Ь)
не наступило	(с)	(4)	(с+б)
Всего пациентов:	(а+с)	(Ь+ά)	(а+Ь+с+ά)

При расчете чувствительности/специфичности по прогнозированию общей выживаемости в качестве события принимали смерть больного до истечения 5 лет с даты постановки диагноза.

Чувствительность предлагаемого способа по прогнозированию общей выживаемости определяли по формуле а/(а+Ь) х 100%, где а - количество не выживших 5 лет больных с генотипом О/О; (а+Ь) - общее количество больных, не выживших 5 лет.

Специфичность предлагаемого способа по прогнозированию общей выживаемости определяли по

- 12 024246 формуле а/(с+а)хюо%, где ά - количество выживших 5 лет больных с генотипами С/Л и А/А; (с+ά) - общее количество больных, выживших 5 лет.

При расчете чувствительности/специфичности предлагаемого способа по прогнозированию безрецидивной выживаемости в качестве события принимали смерть больного до истечения 5-ти лет с даты постановки диагноза, отсутствие ремиссии у проживших 5 лет больных, а также наступление рецидива у проживших 5 лет и вошедших в ремиссию больных.

Чувствительность предлагаемого способа по прогнозированию безрецидивной выживаемости определяли по формуле а/(а+Ъ)х100%, где а - количество больных с генотипом С/С, не проживших 5 лет без рецидива (т.е. сумма несущих генотип С/С количеств больных: умерших + выживших без ремиссии + выживших и вошедших в ремиссию, у которых возник рецидив), (а+Ъ) - общее количество больных, не проживших 5 лет без рецидива (т.е. сумма количеств больных: умерших + выживших без ремиссии + выживших и вошедших в ремиссию, у которых был рецидив).

Специфичность предлагаемого способа по прогнозированию безрецидивной выживаемости определяли по формуле а/(с+а)х1оо%, где ά - количество проживших 5 лет без рецидива больных с генотипами С/А и А/А; (с+ά) - общее количество проживших 5 лет без рецидива больных.

При расчете чувствительности/специфичности способа по прогнозированию ремиссии в качестве события принимали отсутствие ремиссии у больного.

Чувствительность предлагаемого способа по прогнозированию ремиссии у больного определяли по формуле а/(а+Ъ)х100%, где а - количество больных с генотипом С/С, у которых не наступила ремиссия, (а+Ъ) - общее количество больных, не достигших ремиссии.

Специфичность предлагаемого способа по прогнозированию ремиссии определяли по формуле а/(с+а)х 100%, где ά - количество больных с генотипами С/А и А/А, у которых наступила ремиссия; (с+ά) - общее количество больных, у которых наступила ремиссия.

Чувствительность Κ.-ΙΡΙ (ΙΡΙ) по прогнозированию общей выживаемости определяли по формуле а/(а+Ъ)х100%, где а - количество не выживших 5 лет больных с количеством баллов 3 и более; (а+Ъ) - общее количество больных, не выживших 5 лет.

Специфичность Κ.-ΙΡΙ (ΙΡΙ) по прогнозированию общей выживаемости определяли по формуле а/(с+а)х 100%, где ά - количество выживших 5 лет больных с количеством баллов 2 и менее; (с+ά) - общее количество больных, выживших 5 лет.

Чувствительность Κ.-ΙΡΙ (ΙΡΙ) по прогнозированию безрецидивной выживаемости определяли по формуле а/(а+Ъ)х100%, где а - количество больных с количеством баллов 3 и более, не проживших 5 лет без рецидива (т.е. сумма количеств больных, набравших 3 и более баллов: умерших + выживших без ремиссии + выживших и вошедших в ремиссию, у которых возник рецидив), (а+Ъ) - общее количество больных, не проживших 5 лет без рецидива (т.е. сумма количеств больных: умерших + выживших без ремиссии + выживших и вошедших в ремиссию, у которых был рецидив).

Специфичность Κ.-ΙΡΙ (ΙΡΙ) по прогнозированию безрецидивной выживаемости определяли по формуле ά /(с+фх100%, где ά - количество проживших 5 лет без рецидива больных набравших 2 балла и менее; (с+ά) - общее количество проживших 5 лет без рецидива больных.

Чувствительность Κ.-ΙΡΙ (ΙΡΙ) по прогнозированию ремиссии у больного определяли по формуле а/(а+Ъ)х100%, где а - количество больных, набравших 3 балла, у которых не наступила ремиссия, (а+Ъ) - общее количество больных, не достигших ремиссии.

Специфичность Κ.-ΙΡΙ (ΙΡΙ) по прогнозированию ремиссии определяли по формуле а/(с+а)х 100%, где ά - количество больных, набравших 2 и менее баллов, у которых наступила ремиссия; (с+ά) общее количество больных, у которых наступила ремиссия.

- 13 024246

Полученные данные по чувствительности и специфичности предлагаемого способа и РЬ-ΙΡΙ (ΙΡΙ), представленные в табл. 10, показывают, что Κ-ΙΡΙ (ΙΡΙ) уступает предлагаемому способу по чувствительности прогнозирования 5-летней безрецидивной выживаемости и достижения ремиссии, а также по специфичности прогнозирования 5-летней общей, безрецидивной выживаемости и достижения ремиссии у пациентов с агрессивными НХЗЛ.

Таблица 10. Сравнение чувствительности и специфичности прогнозирования достижения ремиссии, 5летней общей и безрецидивной выживаемости пациентов с агрессивными НХЗЛ с помощью Κ-ΙΡΙ (ΙΡΙ) и предлагаемого способа (Ο13494Ά 6 интрона гена ТР53)

Показатель	Общая выживаемость, %	Безрецидивная выживаемость,%	Достижение ремиссии,⁰/»
Ρ-ΙΡΪ (1ΡΙ)	О13494А 6-го интрона гена ТР53	Ρ-ΙΡΙ (1ΡΙ)	О13494А 6-го интрона гена ТР53	Ρ-ΙΡΙ (ΙΡΙ)	О13494А 6-го интрона гена ТР53
Чувствительность	85	85 (22/26)	74	81(25/31)	88	94
Специфичность	53	60(9/15)	40	70 (7/10)	42	50

Учитывая полученные данные о низкой частоте 5-летней общей и безрецидивной выживаемости больных агрессивными НХЗЛ, имеющих С/С-генотип, возможно, следует изменить подход к лечению больных данной группы и применять сразу более интенсивное лечение, с целью повышения его эффективности и профилактики возникновения вторичной МЛУ, снижающей эффективность дальнейшего лечения.

Клинические примеры

1) Больная Ч., 76 лет.

Диагноз: диффузная В-крупноклеточная СИ20(+) лимфома Ιν стадии с поражением всех групп периферических лимфатических узлов, лимфатических узлов средостения, забрюшинного пространства, мягких тканей, костного мозга.

Жалобы: слабость, повышенная утомляемость, профузная потливость, головные боли, потеря массы тела 10 кг за 2 месяца, увеличение лимфоузлов.

Высокая степень злокачественности, большой объем опухолевой массы, выраженная пролиферативная активность, наличие Б-симптомов интоксикации.

Лечение: 8 курсов Ρ-ί',ΉΟΡ (ритуксимаб, циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон).

Эффект лечения положительный (достигнута ремиссия, общая и безрецидивная выживаемость - 5 лет).

После 6 курсов достигнута полная клинико-гематологическая ремиссия (уменьшение лимфатических узлов до нормальных размеров, исчезновение очага поражения мягких тканей и Б-симптомов, улучшение самочувствия, нормализация показателей периферической крови и костного мозга). Ремиссия сохраняется в течение 5 лет.

Международный прогностический индекс:

возраст - старше 60 лет - 1 балл, стадия - Ιν - 1 балл, число экстранодальных поражений - 2 (костный мозг, мягкие ткани) - 1 балл, общесоматический статус - 1-0 баллов, уровень ЛДГ - 400,5 ЕД - 0 балл, максимальный размер опухоли - более 5 см - 1 балл.

Итого: 4 балла, группа плохого прогноза Κ-ΙΡΙ, прогнозирование низкой эффективности терапии.

Прогноз по предлагаемому способу:

Генотип полиморфизма полиморфизм С13494А в 6-м интроне гена ТР53 - С/А.

По предлагаемому способу в данном случае следует прогнозировать высокую эффективность терапии.

2) Больной Г., 28 лет.

Диагноз: диффузная В-крупноклеточная СИ20(+) лимфома Ιν стадии с поражением подчелюстных лимфатических узлов, лимфатических узлов средостения, плевры, костного мозга.

Жалобы: слабость, утомляемость, повышенная ночная потливость, боли в грудной клетке, потеря массы тела 5 кг за 3 месяца, повышение температуры тела до 38°С, увеличение периферических лимфатических узлов.

Высокая степень злокачественности, высокая пролиферативная активность, наличие Б-симптомов интоксикации.

Лечение: 8 курсов Κ-ΠΗΟΕΡ (ритуксимаб, циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон), 2 курса ТГТ (телегамматерапия) на средостение.

Эффект лечения отрицательный (ремиссия достигнута, безрецидивная выживаемость 20 месяцев, общая выживаемость - 44 месяца).

После 6 курсов достигнута полная клинико-гематологическая ремиссия (уменьшение лимфатических узлов до нормальных размеров, исчезновение поражения плевры и Б-симптомов, улучшение самочувствия, нормализация показателей периферической крови и костного мозга). Через 3 месяца возник ранний рецидив (отмечен рост шейных лимфатических узлов, нарастание признаков интоксикации,

- 14 024246 ухудшение самочувствия и показателей периферической крови). Пациент на дальнейшую высокодозную терапию курсами К-Е8НАР не ответил. Причина смерти - прогрессирование основного заболевания.

Международный прогностический индекс:

возраст - менее 60 лет - 0 баллов, стадия - IV - 1 балл, число экстранодальных поражений - 1 (плевра) - 0 баллов, общесоматический статус - 1 - 0 баллов, уровень ЛДГ - 435 ЕД - 0 баллов, максимальный размер опухоли - менее 5 см - 0 баллов.

Итого: 1 балл, группа хорошего прогноза Κ.-ΙΡΙ, прогнозирование высокой эффективности терапии.

Прогноз по предлагаемому способу:

Генотип полиморфизма полиморфизм С13494Л в 6-м интроне гена ТР53 - С/С.

По предлагаемому способу в данном случае следует прогнозировать низкий эффект от терапии.

Claims

Способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинскими злокачественными лимфомами высокой степени злокачественности, а именно вероятности достижения ремиссии, 5-летнего общего и безрецидивного выживания, отличающийся тем, что исследуют полиморфизм С13494А 6-го интрона гена ТР53 пациента и при выявлении у пациента гомозиготного генотипа С/С в данном локусе прогнозируют низкую эффективность лечения, а именно малую вероятность 5-летнего выживания пациента и малую вероятность отсутствия рецидива, а при выявлении у пациента генотипа А/А или С/А в данном локусе прогнозируют высокую эффективность лечения, а именно высокую вероятность наступления ремиссии и 5-летнего выживания пациента.