ES2788652T3

ES2788652T3 - Método de diagnóstico de hemopatías malignas y kit asociado

Info

Publication number: ES2788652T3
Application number: ES14781927T
Authority: ES
Inventors: Philippe Ruminy; Vinciane Marchand; Fabrice Jardin
Original assignee: Universite de Rouen; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Henri Becquerel
Current assignee: Universite de Rouen; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Henri Becquerel
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2020-10-22
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: FR3010530B1; US20160319362A1; DK3044331T3; FR3010530A1; HRP20200747T1; PL3044331T3; WO2015036705A1; EP3044331B1; HUE048794T2; CA2923116C; EP3044331A1; PT3044331T; CA2923116A1

Abstract

Método de diagnóstico de un cáncer asociado con la formación de genes de fusión en un sujeto, elegido entre una leucemia, un sarcoma o un carcinoma, comprendiendo dicho método una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando al menos pares de sondas elegidos entre: - las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para el diagnóstico de una leucemia, y/o - las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 para el diagnóstico de un sarcoma, y/o - las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma, estando cada una de las sondas fusionadas, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora; estando compuesto dicho par de sondas por dos sondas que se hibridan una al lado de la otra durante la etapa de RT-MLPA.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de diagnóstico de hemopatías malignas y kit asociado

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método para diagnosticar un cáncer asociado con la formación de genes de fusión en un sujeto, elegido entre una leucemia, un sarcoma o un carcinoma, comprendiendo dicho método una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando al menos pares de sondas elegidas entre:

- las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para el diagnóstico de una leucemia, y/o,

- las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 para el diagnóstico de sarcoma, y/o

- las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma,

estando cada una de las sondas fusionadas, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora; estando compuesto dicho par de sondas por dos sondas que se hibridan una al lado de la otra durante la etapa de RT-MLPA. Preferiblemente, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto, que comprende una etapa de RT-MLPA llevada a cabo en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, en particular con el fin de buscar transcritos de fusión, usando las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o usando las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y/o usando al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando fusionada cada una de las sondas, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. La presente invención también se refiere a un kit que comprende al menos las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o al menos las sondas de SEQ I^dNO: 374 a 405, y/o al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando fusionada cada una de las sondas, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

Estado de la técnica

Los cánceres se deben a una acumulación de anomalías genéticas por las células tumorales. Entre estas anomalías se encuentran numerosos reordenamientos cromosómicos (translocaciones, deleciones e inversiones) que conducen a la formación de genes de fusión. Estos genes de fusión a menudo se asocian con formas particulares de tumor, y ponerlos de manifiesto puede contribuir de forma significativa al diagnóstico (The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Mitelman F, Johansson B, Mertens F., Nat Rev Cáncer. 2007 Apr;7(4):233-45). También se usan a menudo como marcadores moleculares para controlar la eficacia de los tratamientos y seguir la evolución de la enfermedad, como por ejemplo en las leucemias agudas (Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMEd-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, Dotti G, Griesinger F, Parreira A, Gameiro P, Diaz MG, Malec M, Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A. Leukemia. 1999 Dec;13(12):1901-28). Hoy en día, las dos técnicas principales que permiten buscar estos genes de fusión son la citogenética y la RT-PCR. La citogenética consiste en establecer el cariotipo de las células cancerosas para buscar posibles anomalías en el número y/o estructura de los cromosomas. Tiene la ventaja de proporcionar una visión global de todo el conjunto del genoma. Sin embargo, es relativamente poco sensible, su eficacia depende en gran medida del porcentaje de células tumorales en la muestra a analizar y de la posibilidad de obtener cultivos celulares viables. Otro de sus inconvenientes es su baja resolución, que no permite detectar ciertas reorganizaciones (en particular, inversiones y eliminaciones de pequeño tamaño). Finalmente, algunos tumores están asociados con una inestabilidad genómica importante que enmascara anomalías genéticas patognomónicas. Por lo tanto, el análisis de cariotipos a menudo es difícil y solo puede ser realizado por personal con excelente experiencia.

La segunda técnica, la RT-PCR, se lleva a cabo a partir del ARN extraído de células tumorales. Tiene una excelente sensibilidad, muy superior a la citogenética. Esta sensibilidad la convierte en la técnica de referencia para analizar muestras biológicas donde el porcentaje de células tumorales es bajo, lo que permite controlar la eficacia de los tratamientos o anticipar muy pronto las posibles recaídas. Sin embargo, su principal limitación está relacionada con el hecho de que es extremadamente difícil multiplexar este tipo de análisis. En general cada traslocación se debe buscar mediante una prueba específica, solo algunas fusiones recurrentes entre las muy numerosas que se conocen hoy en día se buscan en laboratorios de análisis de rutina.

La solicitud internacional WO03/044486 también describe un método de diagnóstico de un cáncer que comprende la detección de una translocación cromosómica y que necesita la amplificación antes de la translocación a detectar. Por lo tanto, hoy en día existe la necesidad de un prueba ensayo y sensible, que también sea simple y rápido de implementar, que permita diagnosticar con precisión un cáncer, en particular un tumor sólido (sarcoma o carcinoma) o una leucemia.

Objeto de la invención

De forma sorprendente, los autores de la invención han logrado implementar un ensayo que permite diagnosticar un cáncer específico, en particular un tumor sólido (por ejemplo, sarcoma o carcinoma) o una leucemia. Este ensayo permite buscar simultáneamente un gran número de reordenamientos cromosómicos en numerosas formas de cáncer, y esto de manera económica y rápida (la prueba se puede realizar en un día). Además, su simplicidad de implementación permite que una persona que domine las técnicas clásicas de biología molecular lleve a cabo todos las etapas sin formación específica, usando equipos que ya están disponibles en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico de rutina.

Por lo tanto, la invención se refiere a un ensayo molecular que comprende en particular una etapa de RT-MLPA (Amplificación de sonda dependiente de ligadura de transcriptasa inversa), realizado en modo multiplexado. El modo multiplexado permite ahorrar tiempo, ya que es más rápido que varios monoplexados y es económicamente ventajoso. También permite buscar simultáneamente un número mucho mayor de anomalías que las técnicas disponibles actualmente.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de un cáncer asociado con la formación de genes de fusión en un sujeto, elegido entre una leucemia, un sarcoma o un carcinoma, comprendiendo dicho método una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, usando al menos pares de sondas elegidas entre:

- las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para el diagnóstico de una leucemia, y/o, - las sondas de SEQ

374 a 405 para el diagnóstico de un sarcoma, y/o

- las sondas de SEQ

524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma,

estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Dicho par de sondas está compuesto de dos sondas que se hibridan una al lado de la otra durante la etapa de RT-MLPA.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de un cáncer asociado con la formación de genes de fusión en un sujeto, que comprende una etapa de RT-MLPA realizada en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o usando las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y/o al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando fusionada cada una de las sondas, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

La presente invención se refiere también a un kit que comprende al menos las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y/o al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, que comprende preferiblemente además las sondas de SEQ ID NO: 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219, y/o las sondas de SEQ ID N^o: 438 a 480, y/o las sondas de SEQ ID NO: 616 a 674, y/o las sondas de SEQ ID NO: 734 a 741, y/o las sondas de SEQ ID NO: 750 a 774, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Preferiblemente, el kit comprende al menos las sondas de SEQ ID NO: 35 a 59, 64, 65 y de 267 a 274, y/o las sondas de SEQ ID NO: 406 a 437, y/o las sondas de SEQ ID NO: 560 a 595, preferiblemente comprende además las sondas de SEQ ID NO: 60 a 63, de 220 a 266 y de 275 a 373, y/o las sondas de SEQ ID NO: 675 a 733, y/o las sondas de SEQ ID NO: 775 a 799, y/o las s ondas de SEQ ID NO: 742 a 749.

Por "MLPA" se entiende la amplificación multiplexada de sonda dependiente de ligadura, que permite la amplificación simultánea de varios objetivos de interés contiguos entre sí, usando una o varias sondas específicas. Esta técnica es muy ventajosa, en el marco de la presente invención, para determinar la presencia de translocaciones, que son frecuentes en los tumores malignos.

Por "RT-MLPA" se entiende la amplificación multiplexada de sonda dependiente de ligadura precedida de una transcripción inversa (RT), que permite, en el marco de la presente invención, partir del ARN de un sujeto para amplificar y caracterizar los genes de fusión de interés .

Por "sujeto" se entiende un individuo sano o susceptible de padecer un cáncer o en el que se busca detección, diagnóstico o seguimiento.

Por " muestra biológica" se entiende una muestra que contiene material biológico. Más preferiblemente, se entiende cualquier muestra que contenga ARN. Esta muestra puede provenir de una toma de muestra biológica realizada en un ser vivo (paciente humano, animal, vegetal). Preferiblemente, las muestras biológicas según la invención se eligen entre sangre completa, médula ósea y una biopsia obtenida de un sujeto, en particular ser humano.

Por "sensibilidad" se entiende la proporción de pruebas positivas en sujetos que padecen cáncer y portadores de las anomalías buscadas.

Por "especificidad" se entiende la proporción de pruebas negativas en sujetos que no padecen cáncer y no son portadores de las anomalías buscadas.

Por "cáncer" se entiende una enfermedad caracterizada por una proliferación celular anormalmente grande en un tejido normal del organismo, de modo que la supervivencia de este último está amenazada. Según la invención, el cáncer se elige preferiblemente entre leucemias, sarcomas y carcinomas. Las leucemias son cánceres de las células de la médula ósea, de sistemas linfoides y mieloides. Los sarcomas son tumores malignos desarrollados a expensas del tejido conjuntivo común extraesquelético, como el tejido adiposo, tejido muscular, vasos y sistema nervioso periférico. Los carcinomas son tumores malignos desarrollados a expensas de un tejido epitelial.

Por "sonda" se entiende una secuencia de ácido nucleico de longitud comprendida entre 15 y 40 nucleótidos, preferiblemente entre 20 y 25 nucleótidos, y complementaria de una secuencia de ADNc derivada de un ARN del sujeto (endógeno). Por lo tanto, es capaz de hibridarse con dicha secuencia de ADNc derivada de un ARN del sujeto.

Por "secuencia cebadora" se entiende una secuencia de ácido nucleico de longitud comprendida entre 15 y 30 nucleótidos, preferiblemente entre 20 y 25 nucleótidos, y no complementaria de secuencias de ADNc derivadas de ARN del sujeto. Por lo tanto, no es complementario del ADNc que corresponde al ARN endógeno. Por lo tanto, no puede hibridarse con dichas secuencias de ADNc. Preferiblemente, la secuencia cebadora se elige entre las secuencias de SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

Los autores de la invención han identificado sondas específicas para cada tipo de translocación observada en ciertos tipos de cáncer. Esta identificación se basa en el análisis de la estructura intrón-exón de los genes implicados en las translocaciones, como se muestra en la figura 1. En particular, se buscan los puntos de rotura que pueden conducir a la expresión de proteínas quiméricas funcionales (figura 1B). A partir de estos resultados, se definen secuencias de a Dn de 25 a 40 pares de bases, que corresponden precisamente a los extremos 5' y 3' de los exones de los dos genes yuxtapuestos después de corte y empalme de los transcritos híbridos (figura 1C). Después se define un conjunto de sondas de la siguiente manera: se añade una secuencia cebadora (S^aen la figura 1) de una veintena de pares de bases en 5' de todas las sondas complementarias de los exones de los genes que forman la parte 5' de los transcritos de fusión. Se añade una segunda secuencia cebadora (S^ben la figura 1), también de una veintena de pares de bases, pero diferente de S^a, en los extremos 3' de todas las sondas complementarias de los exones de los genes que forman la parte 3' de los transcritos de fusión (figura 1D). Después estas sondas se agrupan en una mezcla y contienen todos los elementos necesarios para la detección de uno o más transcritos de fusión, producidos por una o más translocaciones.

Por lo tanto, las sondas usadas en la invención son capaces de hibridarse bien con los últimos nucleótidos del último exón en 5' de la translocación, o con los primeros nucleótidos del primer exón en 3' de la translocación. Preferiblemente, las sondas usadas en la invención, capaces de hibridarse con los primeros nucleótidos del primer exón en 3' de la translocación, se fosforilan en 5' antes de su uso.

Las diferentes translocaciones identificadas según la presente invención se ilustran en el figuras 10 a 12.

Las sondas según la invención son las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, opcionalmente combinadas con las sondas de SEQ ID NO: 26 a 29, 66 a 112 y 121 a 219 y/o con sondas de SEQ ID NO: 616 a 674.

Las sondas según la invención son las secuencias de SEQ ID NO: 374 a 405, opcionalmente combinadas con las sondas de SEQ ID NO: 438 a 480 y/o al menos con las sondas de SEQ ID NO: 750 a 774.

Las sondas según la invención son las secuencias de SEQ ID NO: 524 a 559, opcionalmente combinadas con las sondas de SEQ ID NO: 438 a 480 y/o al menos con las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 y/o con las sondas de SEQ ID NO: 734 a 741.

Las figuras 4, 5 y de 7 a 9 detallan el nombre de cada sonda, su posición (es decir, si están en 5' (I) o en 3' (D) de la unión anómala), su estructura (presencia o no de una secuencia cebadora y las características de esta secuencia), así como el gen y el exón con el que se hibrida cada sonda.

Preferiblemente, cada una de las sondas de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 8; de SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 30 se fusionan en 5' con una secuencia cebadora, y

cada una de las sondas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, de SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, de SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 31 se fusiona en 3' con una secuencia cebadora diferente.

Preferiblemente, las sondas fusionadas con secuencias cebadoras que se pueden usar según la invención son las secuencias de SEQ ID NO: 35 a 59, 64, 65 y de 267 a 274, opcionalmente combinadas con las sondas de SEQ ID NO: 60 a 63, de 220 a 266 y de 275 a 373 y/o con las sondas de SEQ ID NO: 675 a 733.

Preferiblemente, las sondas fusionadas con secuencias cebadoras que se pueden usar según la invención son las secuencias de SEQ ID NO: 406 a 437, opcionalmente combinadas con las sondas de SEQ ID NO: 481 a 523 y/o las sondas de SEQ ID NO: 775 a 799.

Preferiblemente, las sondas fusionadas con secuencias cebadoras que se pueden usar según la invención son las secuencias de SEQ ID NO: 560 a 595, opcionalmente combinadas con las sondas de SEQ ID NO: 481 a 523 y/o las sondas de SEQ ID NO: 742 a 749.

El método de diagnóstico según la invención se lleva a cabo con al menos los pares de sondas elegidos entre: - las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para el diagnóstico de una leucemia,

- las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 para el diagnóstico de un sarcoma, y

- las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma,

estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

El par de sondas se puede elegir entre las sondas de secuencia específica descritas antes y como se explica en las figuras 4, 7 y 9. Por "par de sondas" se entiende un conjunto de dos sondas, una está situada en 5' ("I" en el figuras 4-5 y de 7 a 9) de la translocación o mutación genética, la otra está situada en 3' ("D" en el figuras 4-5 y 7 a 9) de la translocación o mutación genética.

El método de diagnóstico según la invención se refiere al diagnóstico de leucemias y comprende una etapa de RT-MLPA realizada en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Las leucemias se eligen preferiblemente entre leucemias linfoblásticas agudas B, leucemias linfoblásticas agudas T, leucemias mieloblásticas agudas, leucemias mieloides crónicas, linfomas y mielomas.

Preferiblemente, en este caso, el método de diagnóstico según la invención también usa las sondas de SEQ ID NO: 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219, y/o las sondas de SEQ ID NO: 616 a 674, para la etapa de RT-MLPA, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Así, en este caso, se usa una mezcla de las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y SEQ ID NO: 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219 y/o SEQ ID NO: 616 a 674, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

Preferiblemente, la invención se refiere a un kit de diagnóstico de leucemia que comprende las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y de 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219, y/o SEQ ID NO: 616 a 674, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Preferiblemente, dicho kit comprende las sondas de SEQ ID NO: 35 a 59, 64, 65 y de 267 a 274, y preferiblemente también las sondas de SEQ ID NO: 60 a 63, de 220 a 266 y de 275 a 373, y/o preferiblemente también las sondas de SEQ ID NO: 675 a 733.

El método de diagnóstico según la invención se refiere al diagnóstico de sarcomas, y comprende una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando las sondas de s Eq ID NO: 374 a 405, estando cada una de las sondas fusionada, al menos un extremo, con una secuencia cebadora.

Los sarcomas se eligen preferiblemente entre los sarcomas de Ewing, rabdomiosarcomas, tumores desmoplásicos de células redondas, sarcomas sinoviales y liposarcomas mixoides.

Preferiblemente, en este caso, el método de diagnóstico según la invención también usa las sondas de SEQ ID NO: 438 a 480 y/o las sondas de SEQ ID NO: 750 a 774, para la etapa de RT-MLPA, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Por lo tanto, en este caso, se usa una mezcla de las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y de 438 a 480 y/o de 750 a 774, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

Preferiblemente, la invención se refiere a un kit de diagnóstico de sarcomas que comprende las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Preferiblemente, dicho kit comprende las sondas de SEQ ID NO: 406 a 437, y preferiblemente también las sondas de SEQ ID NO: 481 a 523, y/o preferiblemente también las sondas de SEQ ID NO: 775 a 799.

El método de diagnóstico según la invención se refiere al diagnóstico de carcinomas y comprende una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando las sondas de ^sE^qID NO: 524 a 559, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

Los carcinomas se eligen preferiblemente entre carcinomas broncopulmonares de células no pequeñas, adenocarcinomas prostéticos, carcinomas de riñón, tiroides y mama.

Preferiblemente, en este caso, el método de diagnóstico según la invención también usa las sondas de SEQ ID NO: 438 a 480 y/o las sondas de SEQ ID NO: 734 a 741, para la etapa de RT-MLPA, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Por lo tanto, en este caso, se usa una mezcla de las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 y de 438 a 480 y/o de 734 a 741, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

Preferiblemente, la invención se refiere a un kit de diagnóstico de carcinomas que comprende las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Preferiblemente, dicho kit comprende las sondas de SEQ ID NO: 560 a 595, y preferiblemente también las sondas de SEQ ID NO: 481 a 523, y/o preferiblemente también las sondas de SEQ ID NO: 742 a 749.

Preferiblemente, el método de la invención usa una muestra biológica elegida de sangre completa, médula ósea y una biopsia obtenida del sujeto.

La etapa de RT-MLPA deriva de la MLPA (Amplificación multiplexada de sonda dependiente de ligadura), descrita en particular en la patente US 6.955.901. Permite la detección y determinación simultánea de un gran número de secuencias de oligonucleótidos diferentes. El principio es el siguiente (véase la figura 2): el ARN extraído del tejido tumoral se convierte primero en ADN complementario (ADNc) por transcripción inversa. Después este ADNc se incuba con la mezcla de sondas adecuadas, cada una de las cuales puede hibridarse entonces con las secuencias de exones a las que corresponden. Si uno de los transcritos de fusión buscado esté presente en la muestra, vienen a fijarse dos sondas una al lado de la otra en el ADNc correspondiente. Se lleva a cabo entonces una reacción de ligadura usando una enzima con actividad de ADN ligasa, que establece un enlace covalente entre las dos sondas contiguas. Después se lleva a cabo una reacción de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), usando cebadores que corresponden a las secuencias cebadoras (S^ay S^ben el figura 2), que permite amplificar específicamente las dos sondas ligadas. La obtención de un producto de amplificación después de la etapa de RT-MLPa indica que una de las translocaciones buscadas esté presente en la muestra analizada.

Preferiblemente, la etapa de RT-MLPA usada en el método según la invención comprende al menos las siguientes etapas:

a) extracción del ARN de la muestra biológica del sujeto;

b) conversión del ARN extraído en a) en ADNc por transcripción inversa;

c) incubación del ADNc obtenido en b) con al menos un par de sondas elegidas entre:

- las sondas de SEQ ID NO

1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para el diagnóstico de una leucemia, y/o

- las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 para el diagnóstico de un sarcoma, y/o

- las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma,

estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Preferiblemente, en esta etapa c), se usan mezclas de sondas como las descritas previamente.

Preferiblemente, en esta etapa c), el ADNc obtenido en b) se incuba con al menos las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o con al menos las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y/o con al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora;

d) adición de una ADN ligasa a la mezcla obtenida en c), con el fin de establecer un enlace covalente entre dos sondas contiguas;

e) Amplificación por PCR de las sondas contiguas unidas de forma covalente obtenidas en d).

Típicamente, la extracción de ARN de la muestra biológica según la etapa a) se lleva a cabo según las técnicas convencionales, bien conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, esta extracción se puede llevar a cabo por lisis celular de células obtenidas de la muestra biológica. Esta lisis puede ser de naturaleza química, física o térmica. A esta lisis celular en general le sigue una etapa de purificación que permite separar y concentrar los ácidos nucleicos de otros residuos celulares. Para la implementación de la etapa a), se pueden usar los kits comerciales de tipo QIAGEN y Zymo Research, o también los comercializados por Invitrogen. Por supuesto, las técnicas relevantes difieren en función de la naturaleza de la muestra biológica analizada. El conocimiento del experto en la técnica le permite adaptar fácilmente estas etapas de lisis y purificación a dicha muestra biológica analizada.

Preferiblemente, el ARN extraído en la etapa a) se convierte entonces por transcripción inversa en ADNc; esta es la etapa b) (véase la figura 2B). Esta etapa b) se puede llevar a cabo usando cualquier técnica de transcripción inversa conocida de la técnica anterior. En particular, se puede hacer usando la transcriptasa inversa comercializada por Qiagen, Promega o Ambion, según las condiciones convencionales de uso, o también usando la transcriptasa inversa M-MLV de Invitrogen.

Preferiblemente, el ADNc obtenido en la etapa b) después se incuba con al menos las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o con al menos las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y/o con al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora. Esta es la etapa c) de hibridación de sondas (véase la figura 2C). En efecto, las sondas, que son complementarias de una parte de ADNc, van a venir a hibridarse con esta parte, si está presente en el ADNc. Como se muestra en el figura 2C, debido a su secuencia, las sondas por lo tanto se van a hibridar:

- ya sea con la parte de ADNc que corresponde a los últimos nucleótidos del último exón en 5' de la translocación. Estas son entonces las sondas "F" o "Directa (Forward)", también llamadas "I" o "Izquierda";

- ya sea con la porción de ADNc que corresponde a los primeros nucleótidos del primer exón en 3' de la translocación. Estas son entonces las sondas "R" o "Inversa (Reverse)", también llamadas "D" o "Derecha".

Al final de la etapa c), las sondas hibridadas con el ADNc son contiguas, si y solo si ha tenido lugar la translocación. Esta etapa c) se lleva a cabo típicamente incubando el ADNc y la mezcla de sondas a una temperatura comprendida entre 90°C y 100°C, durante un período de 1 a 5 minutos, y después se deja incubar durante un período de al menos 1 h, preferiblemente 16 h, a una temperatura de aproximadamente 60°C. Se puede llevar a cabo usando el kit comercial, vendido por la empresa MRC-Holland (SALSA MLPA Buffer).

Al final de la etapa c), típicamente se añade una ADN ligasa para unir de forma covalente solo las sondas contiguas; este es la etapa d) (véase la figura 2D). La ADN ligasa es en particular la ligasa 65, vendida por MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos (SALSA Ligase-65). Esta etapa d) se lleva a cabo típicamente usando los kits Lig-5a, Lig-10 o Lig-50 de MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos. Normalmente se lleva a cabo incubando la ADN ligasa y la mezcla obtenida en la etapa c) a una temperatura comprendida entre 50°C y 60°C, durante un período de 10 a 20 minutos, después durante un período de 2 a 10 minutos a una temperatura comprendida entre 95°C y 100°C. Al final de la etapa d), cada par de sondas contiguas I y D está unida de forma covalente, y la secuencia cebadora de cada sonda está siempre presente en 5' y en 3'.

Preferiblemente, el método también comprende una etapa e) de amplificación por PCR de las sondas contiguas unidas de forma covalente obtenidas en d) (véase la figura 2E). Esta etapa de PCR se lleva a cabo usando un par de cebadores, siendo uno de los cuales idéntico a la secuencia cebadora en 5', y siendo el otro cebador complementario a la secuencia cebadora en 3'. Preferiblemente, la amplificación por PCR de la etapa e) se lleva a cabo usando los cebadores de SEQ ID NO: 32 y 33, preferiblemente estando uno marcado en su extremo 5' con una biotina, con el fin de permitir la etapa (f). La PCR se realiza típicamente usando kits comerciales, tales como los kits listos para usar vendidos por Eurogentec (Red'y'Star Mix). Típicamente, la PCR se desarrolla en una primera fase de desnaturalización inicial a una temperatura comprendida entre 90°C y 100°C, típicamente aproximadamente de 94°C, durante un tiempo de 5 a 8 minutos; después una segunda fase de amplificación que comprende varios ciclos, típicamente 35 ciclos, comprendiendo cada ciclo 30 segundos a 94°C, después 30 segundos a 58°C, después 30 segundos a 72°C; y una última fase final de retorno a 72°C durante aproximadamente 4 minutos. Al final de la PCR, los amplicones se conservan preferiblemente a 4°C.

Típicamente, los cebadores que se pueden usar en la etapa e) de la PCR son los siguientes:

SEQ ID NO: Cebador

596 CMV Directo: CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG

597 CMV Inverso: CGC CAT CCA CGC TGT TTT G

598 pcADN3 Directo: GGC TAA CTA GAG AAC CCA CTG

599 pcADN3 Inverso: GGC AAC TAG AAG GCA CAG TC

600 pCEP Directo: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG

601 pCEP Inverso: GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC

602 pEGFPC 1 Directo: GAT CAC TCT CGG CAT GGA C

603 pEGFPC 1 Inverso: CAT TTT ATG TTT CAG GTT CAG GG

604 pEGFPN 1 Directo: GTC GTA ACA ACT CCG CCC

605 pEGFPN 1 Inverso: GTC CAG CTC GAC CAG GAT G

606 pGex Directo: ATA GCA TGG CCT TTG CAG G

607 pGex Inverso: GAG CTG CAT GTG TCA GAG G

608 pGL Directo: GTA TCT TAT GGT ACT GTA ACT G

609 pGL Inverso: CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC C

610 pShuttleCMV Directo: GGT CTA TAT AAG CAG AGC TG

611 pShuttleCMV Inverso: GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG

32 Inverso: GGGTTCCCTAAGGGTTGGA (complementario de la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 34) 33 Directo: GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA

Preferiblemente, el método según la invención comprende una etapa f) de análisis de los resultados de la PCR de la etapa e), preferiblemente por pirosecuenciación. Para este fin, se puede usar un pirosecuenciador, tal como el pirosecuenciador pyroMark Q24 vendido por la compañía Qiagen, usando el kit comercial Pyromark Gold Q24 Reagent y uno de los oligonucleótidos cebadores.

Esta etapa de análisis permite una lectura inmediata del resultado e indica directamente si la muestra del sujeto lleva una translocación específica identificada o no. Esto se demuestra en particular en el figura 3.

En efecto, en la etapa f), si, para una muestra biológica de un sujeto, se obtiene una amplificación por PCR en la etapa e) después de la hibridación con un par de sondas, entonces el sujeto es portador del cáncer asociado al reordenamiento cromosómico que corresponde al par de sondas identificadas.

Las diferentes secuencias citadas en la presente invención se resumen en la siguiente tabla:

Descripción de las figuras

Figura 1: Esquema de definición de las sondas.

Figura 2: Esquema de RT-MLPA.

A) Ejemplo de translocación en el intrón situado entre el exón 2 del gen 1 y el exón 2 del gen 2, que conduce a un ARNm de fusión.

B) Etapa 1: transcripción inversa de este ARNm de fusión, para obtener un ADNc.

C) Etapa 2: incubación con las sondas e hibridación de estas con las partes complementarias de ADNc. La sonda S1 está compuesta de una secuencia complementaria de los últimos nucleótidos del exón 2 del gen 1 de ADNc, y la sonda S2 está compuesta de una secuencia complementaria de los primeros nucleótidos del exón 2 del gen 2 de ADNc. La sonda S1 está fusionada en 5' con una secuencia cebadora SA.

La sonda S2 está fusionada en 3' con una secuencia cebadora SB.

Debido a la contigüidad entre los exones 2 del gen 1 y del gen 2, las sondas S1 y S2 se encuentran lado a lado. D) Etapa 3: ligadura por una ADN ligasa. Las sondas una al lado de la otra se encuentran entonces unidas. S1 y S2 forman así una secuencia continua, con SA y SB.

E) Etapa 4: PCR: usando cebadores adecuados, las sondas unidas se amplifican. En este caso, los cebadores usados son la secuencia SA y la secuencia complementaria de SB (llamada B').

F: análisis de los resultados obtenidos. La figura muestra un ejemplo de resultados obtenidos con las sondas que se unen a las translocaciones que implican el gen MLL (característico de leucemias) en muestras procedentes de 15 pacientes (bandas 1 a 15). Las bandas 16 y 17 son testigos negativos.

Parece que 11 de los 15 tumores son portadores de un reordenamiento del gen MLL.

Figura 3: Identificación de translocaciones en los casos de leucemias. Identificación de las parejas del gen MLL de las muestras n° 14 (A) y 15 (B) de la figura 2. Los productos de amplificación por PCR se analizaron por pirosecuenciación.

La secuencia A corresponde a una unión entre el 9° exón del gen MLL y el 2° exón del gen AF6, lo que indica que el tumor portaba una translocación t(6;11)(q27;q23).

La secuencia B corresponde a una unión entre el 10° exón del gen MLL y el 2° exón del gen AF1Q, lo que indica que el tumor portaba la translocación t(1;11)(q21;q23).

Estas dos translocaciones confirman el diagnóstico de leucemia aguda y están asociadas con formas de pronóstico muy malo.

Figura 4 : Tabla de las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 35 a 59, 64, 65 y de 267 a 274).

La tabla indica el gen y el exón con los que la sonda se hibrida. La columna "SEQ ID NO:" indica el número de secuencia de la sonda como tal, y entre paréntesis el número de secuencia de la sonda fusionada con la secuencia cebadora.

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de leucemias en particular.

Figura 5 : Tabla de las sondas de SEQ ID NO: 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO 60 a 63, de 220 a 266 y de 275 a 373).

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de leucemias en particular.

Figura 6 : Identificación de translocaciones en los casos de leucemias (A) y tumores sólidos (B).

Los productos de amplificación por PCR se analizaron por pirosecuenciación.

A) Las translocaciones identificadas corresponden a:

"AML1 exon5 - ETO exon2": LMA2 (leucemia mieloblástica aguda tipo 2)

"MLL exon9 - AF10 exon9": LLA (leucemia linfocítica aguda)

"BCR exonl3 - ABL exon2": leucemia mieloide crónica

"PML exon3 - RARa exon3": LMA3 (leucemia mieloblástica aguda tipo 3)

"BCR exonl - ABL exon2": LLA (leucemia linfocítica aguda); y

"CBFB exon5 -MYH11 exon12": LMA4 (leucemia mieloblástica aguda tipo 4).

B) Las translocaciones identificadas corresponden a un sarcoma sinovial (SYT-SSX), a un rabdomiosarcoma (PAX-FKHR) y a un linfoma anaplásico (NPM-AlK).

El término "Tneg" significa una muestra de control, que proviene de un tumor conocido que no presenta los reordenamientos genéticos ensayados.

Figura 7: Tabla de sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 406 a 437).

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de sarcomas en particular.

Figura 8: Tabla de sondas de SEQ ID NO: 438 a 480 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 481 a 523).

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de sarcomas en particular.

Figura 9: Tabla de sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 560 a 595).

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de carcinomas en particular.

Figura 10: Identificación de genes de fusión.

A) Genes de fusión en casos de leucemias. Los transcritos de fusión se hibridan con las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120.

B) Genes de fusión en el caso de sarcomas. Los transcritos de fusión se hibridan con las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405.

C) Genes de fusión en el caso de carcinomas. Los transcritos de fusión se hibridan con las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559.

Figura 11: Identificación de genes de fusión en el caso de leucemias.

El uso, en un solo kit, de las sondas de SEQ ID NO: 1 a 31, de 66 a 219, 438, 467, 534, 559, de 616 a 639, de 641 a 670, 737 y 759, permitiría buscar simultáneamente más de 110 reordenamientos genéticos diferentes en leucemias. Figura 12: Identificación de genes de fusión en el caso de sarcomas y carcinomas. Los transcritos de fusión se hibridan con las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, 524 a 559 y 438 a 480.

Figura 13: Tabla de sondas de SEQ ID NO: 616-674 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 675-733).

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de leucemias en particular.

Figura 14: Tabla de sondas de SEQ ID NO: 734-741 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 742-749).

La tabla indica el gen y el exón con los que la sonda se híbrida. La columna "SEQ ID NO:" indica el número de secuencia de la sonda como tal, y entre paréntesis el número de secuencia de la sonda fusionada con la secuencia cebadora.

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de carcinomas en particular.

Figura 15: Tabla de sondas de SEQ ID NO: 750-774 (que corresponden a las sondas fusionadas con la secuencia cebadora de SEQ ID NO: 775-799).

Estas sondas se pueden usar para el diagnóstico de carcinomas en particular.

Figura 16: Identificación de los genes de fusión que son objetivo en el ejemplo 2.

Los transcritos de fusión se hibridan con las sondas de SEQ ID NO: 1 a 31, de 66 a 167, de 169 a 182, 628, de 657 a 659 y 662.

Descripción detallada de la invención

EJEMPLO 1

Materiales y métodos

Etapa a): extracción de ARN:

Las células obtenidas de sangre o médula ósea o fragmentos de biopsia se conservan a -80°C en 1 ml de trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.).

Se añaden 200 pl de cloroformo (Merck, Darmstadt, Alemania) a cada muestra previamente descongelada.

La mezcla se homogeneiza antes de ser incubada aproximadamente 5 minutos en hielo y después se centrifuga durante 15 min a 12.000 rpm y a 4°C.

Se añaden 500 pl de isopropanol al 100% (Sigma Aldrich, St Quentin Fallavier, Francia) a la fase acuosa previamente aislada.

La mezcla se homogeneiza antes de ser incubada aproximadamente 10 minutos en hielo y se centrifuga durante 10 minutos a 12.000 rpm y a 4°C.

Después de decantación, los sedimentos se lavan con aproximadamente 1 ml de etanol al 70% y se centrifugan 5 min a 7500 rpm y a 4°C.

Después de otros 2 lavados, los sedimentos se decantan y se secan antes de recogerlos en aproximadamente 100 |jl de agua.

Los ARN se incuban después en un baño de agua a aproximadamente 55°C durante 5 a 10 min.

La concentración de los ARN obtenidos se ajusta entre 50 y 250 ng/pl

Etapa b): transcripción inversa:

Se incuban 4 pl de ARN (200-1000 ng) con 2,5 pl de tampón 5x (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), 1 pl de DTT 100 mM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Ee .UU.) 2 pl de los dNTP 10 mM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y 2 pl de hexámeros 100 pmol/pl (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), durante 2 minutos a 80°C, después 5 minutos a 37°C, después las muestras se conservan a 4°C.

Después se añade la transcriptasa inversa (RT) (1 pl de RT (30 u) (M-MLV, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.)), y la mezcla resultante se incuba durante 15 minutos a 37°C, después 2 minutos a 98°C, después se conserva a 4°C.

Etapa c): incubación e hibridación del ADNc con las sondas (MLPA):

Se incuban 5 |jl de la mezcla anterior (~ la mitad de la reacción inicial) obtenida en la etapa b) con 1,5 |jl de tampón de MLPA (tampón Old Salsa MLPA. MRC Holland, Amsterdam, Países Bajos) y 1,5 j l de la mezcla de sondas descrita a continuación, durante 2 minutos a 95°C, después al menos 1 hora a 60°C.

Mezcla de sondas para MLPA (3 fmol/1,5 j l final):

Primer etapa: Recogida de cada sonda a 100 jM (H2O)

Segundo etapa: Dilución de cada sonda a 10 jM (H2O)

Tercer etapa: Mezcla de sondas: 2 j l de cada sonda 10 jM

Volumen final: mismo volumen de TE20: 2 para Mix en TE10:1 final

Cuarto etapa: Dilución final: (0,2 j l de mezcla de sondas F y R de la etapa 3 x n sondas) TE10:1 cs para 1ml (ejemplo: mezcla de sondas F con 10 sondas diferentes: 0.2x10 = 2 j l de mezcla F; mezcla R con 10 sondas: 0.x10 = 4 j l de mezcla R; Mezcla final = 2 j l de mezcla F 4 j l de mezcla R 994 j l de TE10:1)

Etapa d): ligadura:

La ligasa 65 (n tubos 10%) (Salsa Ligase-65. MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos) se prepara con la siguiente mezcla:

3 j l de tampón de ligasa A (Ligase Buffer A, MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos), 3 j l de tampón de ligasa B (Ligase Buffer B, MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos), 25 j l de H2O Mezcla vorticial

1 jL de mezcla ligasa 65 (Salsa Ligase-65. MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos)

Mezcla vorticial.

La mezcla de sondas de la etapa c) se mezcla a 54°C con 32 j l de esta mezcla de ligasa, después se incuba 15 minutos a 54°C y 5 minutos a 98°C, y después se conserva a 4°C.

Etapa e): PCR:

La PCR (n tubos 10%) se lleva a cabo en la siguiente mezcla:

20 j l de mezcla Eurogentec Red'y'Start Mix (Eurogentec, Angers, Francia)

1 j l de cebador de SEQ ID NO: 32 (Biot)

1 j l de cebador de SEQ ID NO: 33

13 j l de H2O

Se mezclan 5 j l de la mezcla de la etapa d) con 35 j l de la mezcla de PCR anterior, y después se someten al siguiente programa de PCR:

94°C 6 min

94°C 30 s

35x 58°C 30 s

72°C 30 s

72°C 4 min

4°C

Etapa f): Pirosecuenciación:

Control (opcional): gel de acrilamida al 8% (Acrykrrride/Bis-Acrylamide 29:1, 40%, Biosolve B.V., Valkenswaard, Países Bajos)

Se analizan 20 j l del producto amplificado por PCR mediante pirosecuenciador.

Resultados

Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 2, 3 y 6A para los casos de leucemias, y en la figura 6B para tumores sólidos

Tras la PCR, si se detecta la translocación buscada, entonces la muestra es positiva y el diagnóstico de la enfermedad es inmediato.

Ejemplo 2

En la leucemia aguda, las translocaciones cromosómicas recurrentes que conducen a la fusión de dos genes son frecuentes. Algunos de estos marcadores tienen un impacto en el pronóstico y terapéutico bien establecido y se verifican sistemáticamente en el momento del diagnóstico por citogenética y RT-PCR. Sin embargo, debido a las limitaciones de estos métodos, solo se analizan sistemáticamente algunos reordenamientos conocidos de entre todos los existentes. Por lo tanto, se ignoran muchas anomalías que podrían proporcionar información clínica importante, principalmente debido a la imposibilidad de realizar una detección de múltiples objetivos rentable, rápida y fiable. El ensayo que se propone aquí es simple y permite una detección fiable de docenas de genes de fusión en solo unas pocas horas.

El ensayo se ha diseñado para detectar simultáneamente más de 50 translocaciones que implican 70 genes recurrentes en las leucemias mieloblásticas agudas (LMA), leucemias linfocíticas agudas (lLa ) y leucemias mieloides crónicas (LMC).

Las muestras de ADNc obtenidas de las células leucémicas se incuban primero con una mezcla de sondas de oligonucleótidos que son complementarias de los extremos de los exones, en las uniones anómalas en los ARNm de fusión. Estas sondas corresponden a los transcritos de fusión dados en la figura 16, y tienen la secuencia de SEQ ID NO: 1 a 31, de 66 a 167, de 169 a 182, 628, de 657 a 659 y 662. Para la mayoría de los genes, se han diseñado diferentes sondas para detectar diferentes transcritos resultantes de recombinaciones genómicas alternativas (por ejemplo en los exones 1, 13, 14 y 19 para el gen BCR, y en los exones 2 y 3 para el gen ABL). La mezcla reúne así más de 150 sondas y se dirige a más de 400 transcritos de fusión diferentes. Todas las sondas de la izquierda tienen una cola común (S^a) en su extremo 5', todas las sondas de la derecha tienen una cola común (S^b) en su extremo 3' (véanse las figuras 2A a E) También se han incluido sondas adicionales para detectar las mutaciones más frecuentes del gen NPM1 (A, B, D). Si hay una translocación presente en la muestra, las dos sondas se hibridan una al lado de la otra en el ADNc de fusión. Después se usa una ADN ligasa para crear una unión covalente entre estas sondas, lo que permite su amplificación por PCR con los cebadores S^ay S^b. Si un producto de PCR se amplifica, las dos parejas se identifican por análisis de secuencia.

Este método se ha aplicado a una serie retrospectiva de 430 pacientes (252 con LMA y 178 niños con LLA). En las LLA-B (147 casos), se detectaron los 33 reordenamientos ETV6-RUNX1, los 6 reordenamientos BCR-ABL y los 5 reordenamientos TCF3-PBX1, así como los 6 reordenamientos MLL (3 AF4; 1 ENL, 1 AF9 y 1 AFF4) identificados en el momento del diagnóstico por métodos convencionales, así como 5 uniones P2RY8-CRLF2 previamente desconocidas.

En las LLA-T (31 casos), se detectaron 6 reordenamientos conocidos (4 SIL-TAL, 2 CALM-AF710) y 5 fusiones no detectadas previamente (2 NUP214-ABL, 1 MLL-ENL, 1 ETV6-ABL y una nueva unión PLZF-ABL).

En las LMA, se detectaron 86 fusiones: 23 PML-RARA, 2 PLZF-RARA, 18 CBFB-MYH11, 12 RUNX1-RUNX1T1, 4 NUP98-NSD1, 2 BCR-ABL, 1 DEK-NUP214, 1 CALM-AF10, 1 MOZ-CBP, 22 reordenamientos MLL (13 PTD, 3 AF9, 2 AF6, 1 AF10, 1 ENL, 1 AF1Q y 1 MAPRE) y 44 mutaciones de NPM1. Sobre todo, 20 translocaciones de esta serie, de las cuales 14 fusiones del gen MLL y una anomalía citogenética críptica t(8, 21) no se habían identificado durante el diagnóstico.

Además, todas estas nuevas anomalías (en las LMA y LLA) se pudieron confirmar por RT-PCR convencional y secuenciación, demostrando la especificidad del método.

En toda la cohorte de 430 pacientes, los tres métodos detectaron 157 fusiones. Se detectaron 85 fusiones (54,1%) y 112 fusiones (71,3%) respectivamente en el momento del diagnóstico por citogenética o por RT-PCR, y 152 fusiones (96,8%) se detectaron por el presente método.

En conclusión, el método según la invención es un ensayo multiplexado simple que puede poner de manifiesto una gran cantidad de fusiones genéticas recurrentes en la leucemia. Su corto tiempo de rotación (se pueden analizar hasta 40 pacientes en paralelo y los resultados se pueden obtener en menos de un día) y su bajo coste (solo son necesarios un dispositivo de PCR, un pirosecuenciador y reactivos básicos de biología molecular) lo hacen particularmente adecuado para la práctica diaria. Su capacidad para detectar numerosas anomalías que casi nunca se analizan en la práctica diaria podría proporcionar muchos diagnósticos y pronósticos, y permitir la estratificación Ċ

de los pacientes en ensayos clínicos prospectivos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de diagnóstico de un cáncer asociado con la formación de genes de fusión en un sujeto, elegido entre una leucemia, un sarcoma o un carcinoma, comprendiendo dicho método una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto usando al menos pares de sondas elegidos entre:

- las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para el diagnóstico de una leucemia, y/o - las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 para el diagnóstico de un sarcoma, y/o

- las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma,

estando cada una de las sondas fusionadas, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora; estando compuesto dicho par de sondas por dos sondas que se hibridan una al lado de la otra durante la etapa de RT-MLPA.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la secuencia cebadora se elige entre las secuencias de SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que dicha muestra biológica se elige entre sangre completa, médula ósea y una biopsia de dicho sujeto.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las sondas de SEQ ID NO: 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219 y/o las sondas de SEQ ID NO: 616 a 674 también se usan para la etapa de RT-MLPA, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las sondas de SEQ ID NO: 750 a 774 también se usan para la etapa de RT-MLPA, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las sondas de SEQ ID NO: 734 a 741 también se usan para la etapa de RT-MLPA, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la etapa de RT-MLPA comprende al menos las siguientes etapas:

a) extracción del ARN de la muestra biológica del sujeto;

b) conversión del ARN extraído en a) en ADNc por transcripción inversa;

c) incubación del ADNc obtenido en b) con pares de sondas elegidos entre:

- las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120 para diagnosticar una leucemia, y/o

- las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405 para el diagnóstico de un sarcoma, y/o,

- las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559 para el diagnóstico de un carcinoma,

estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora;

d) adición de una ligasa de ADN a la mezcla obtenida en c), para establecer un enlace covalente entre dos sondas contiguas;

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado por que comprende una etapa f) de análisis de los resultados de la PCR de la etapa e), preferiblemente por pirosecuenciación.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado por que, en la etapa f), si, para una muestra biológica de un sujeto, se obtiene una amplificación por PCR en la etapa e) tras la hibridación con un par de sondas, entonces el sujeto es un portador de cáncer asociado al reordenamiento cromosómico que corresponde al par de sondas identificado.

10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado por que la amplificación por PCR de la etapa e) se hace usando los cebadores de SEQ ID NO: 32 y 33.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que es un método de diagnóstico de una leucemia en un sujeto, que comprende una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora, correspondiendo dichas sondas a las sondas de SEQ ID NO: 35 a 59, 64, 65 y 267 a 274.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado por que la etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida del sujeto se lleva a cabo además con al menos las sondas de SEQ ID NO: 60 a 63, de 220 a 266 y de 275 a 373, y/o las sondas de SEQ ID NO: 675 a 733.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que es un método de diagnóstico de un sarcoma en un sujeto, que comprende una etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora, correspondiendo dichas sondas a las sondas de SEQ ID NO: 406 a 437.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado por que la etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida del sujeto se lleva a cabo además con al menos las sondas de SEQ ID NO: 481 a 523, y/o las sondas de SEQ ID NO: 775 a 799.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que es un método de diagnóstico de un carcinoma en un sujeto, que comprende un etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora, correspondiendo dichas sondas a las sondas de SEQ ID NO: 560 a 595.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado por que la etapa de RT-MLPA en una muestra biológica obtenida del sujeto se lleva a cabo además con al menos las sondas de SEQ ID NO: 481 a 523, y/o las sondas de SEQ ID NO: 742 a 749.

17. Kit que comprende al menos las sondas de SEQ ID NO: 1 a 25, 30, 31 y de 113 a 120, y/o las sondas de SEQ ID NO: 374 a 405, y/o las sondas de SEQ ID NO: 524 a 559, que comprende preferiblemente además las sondas de SEQ ID NO: 26 a 29, de 66 a 112 y de 121 a 219, y/o las sondas de SEQ ID NO: 616 a 674, y/o las sondas de SEQ ID NO: 438 a 480, y/o las sondas de SEQ ID NO: 750 a 774, y/o las sondas de SEQ ID NO: 734 a 741, estando cada una de las sondas fusionada, al menos en un extremo, con una secuencia cebadora.

18. Kit que comprende al menos las sondas de SEQ ID NO: 35 a 59, 64, 65 y 267 a 274, y/o las sondas de SEQ ID NO: 406 a 437, y/o las sondas de SEQ ID NO: 560 a 595, que comprende preferiblemente además las sondas de SEQ ID NO: 60 a 63, de 220 a 266 y de 275 a 373, y/o las sondas de SEQ ID NO: 675 a 733, y/o las sondas de SEQ ID NO: 775 a 799, y/o las sondas de SEQ ID NO: 742 a 749.