ITMI20002240A1 - Mutazioni nel gene della ferroportina 1 associata ad emocromatosi ereditaria - Google Patents

Mutazioni nel gene della ferroportina 1 associata ad emocromatosi ereditaria Download PDF

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Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo :
"Mutazioni nel gene della ferroportina 1 associata ad emocromatosi ereditaria"
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda mutazioni nel gene codificante la Ferroportina 1 associate ad emocromatosi ereditaria e l’identificazione di tali mutazioni quale metodo diagnostico per l'emocromatosi ereditaria. STATO DELL'ARTE
L'emocromatosi è una patologia ereditaria caratterizzata da un accumulo eccessivo di ferro nell’organismo, il quale porta con il tempo a lesioni a livello di diversi organi e tessuti, in particolare di fegato, miocardio, pancreas, rene, milza, gonadi e cute. L’emocromatosi idiopatica è la malattia ereditaria più diffusa nella popolazione occidentale (incidenza 1:300) ed è caratterizzata da una trasmissione recessiva. Recentemente questo tipo di emocromatosi è stata associata a mutazioni del gene HFE, localizzato sul braccio corto del cromosoma 6. In uno studio condotto su pazienti affetti da questa patologia si è infatti osservato che l’83% dei soggetti analizzati presentavano una mutazione puntiforme a livello di questo gene (C282Y) (Federe altri, Nat Genet 1996, 13: 399-408).
Studi più recenti hanno tuttavia dimostrato che nella popolazione mediterranea solo il 64% pazienti affetti da emocromatosi ereditaria sono omozigoti per la mutazione C282Y. Questo ha portato ad ipotizzare che, nelle popolazione sud-europee in particolare, altri geni oltre al HFE possano essere responsabili dell’emocromatosi idiopatica (Pipemo e altri, Gastroenterology 1998, 114: 996-1002 e Borot e altri, Immunogentics 1997, 45:320-324).
L'identificazione delle modificazioni genetiche responsabili dell’emocromatosi ereditaria è di grande importanza sia diagnostica che terapeutica. A tutt’oggi la diagnosi dell'ematocromatosi awiene tardivamente ed è basata sulla sintomatologia clinica che si sviluppa in seguito a lesioni tessutali spesso irreversibili. Inoltre, la diagnosi di tale patologia è resa difficoltosa dal fatto che i suoi sintomi sono spesso simili a quelli di altre patologie caratterizzate da alterata omeostasi del ferro. Lo sviluppo di metodi di screening genetico per la diagnosi precoce, in fase presintomatica, deil'emocromatosi ereditaria permetterebbero di intervenire tempestivamente con la flebotomia prevenendo in tal modo danni ad organi e tessuti.
Inoltre, l'identificazione delle alterazioni genetiche associate all’emocromatosi ereditaria e la comprensione del ruolo che esse svolgono nello sviluppo della patologia sono di estrema importanza per la messa a punto di nuovi e migliori strategie terapeutiche.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
L’inventore ha in precedenza identificato e caratterizzato una famiglia affetta da una forma di emocromatosi non HFE-dipendente a trasmissione autosomica dominante (Pietrangelo e altri, New Eng J Med 1999, 341: 725-732).
L’inventore ha ora sorprendentemente trovato che il locus di questa patologia è sul braccio lungo del cromosoma 2 (2q32) e che nei soggetti affetti da questo tipo di emocromatosi è presente una mutazione a livello di un codone localizzato nell'esone 3 del gene codificante la ferroportina 1, che risiede nella stessa regione cromosomica, che non si osserva in soggetti non affetti dalla patologia. Tale mutazione porta alla sostituzione di un aminoacido nella molecola di ferroportina 1.
Pertanto la presente invenzione si riferisce ad un acido nucleico codificante una ferroportina 1 mutata caratterizzata dal fatto di comprendere una mutazione del codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ. ID. No. 2, ad una proteina ferroportina 1 mutata codificata da detto acido nucleico e a metodi per la diagnosi in vitro dell'emocromatosi ereditaria basati sulla identificazione di detto acido nucleico o di detta proteina.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: Schema della strategia per la identificazione della mutazione mediante digestione enzimatica con Mboll.
La Figura 1a rappresenta la sequenza di DNA genomico amplificata nel metodo diagnostico, in cui la sequenza GCC incorniciata è il codone codificante raminoacido alanina in posizione 77 della ferroportina wild type che è mutato nel codone GAC in individui affetti da emocromatosi ereditaria. La doppia barra (//) indica la separazione tra l’esone 3 e un segmento deH’introne 3. La Figura 1b rappresenta la coppia di oligonucleotidi utilizzati nella reazione di PCR del metodo diagnostico descritto neli’ Esempio 3b e la sequenza di DNA genomico bersaglio in cui N indica il nucleotide C o A. L'oligonucleotide senso presenta un nucleotide mismatched, sottolineato (A al posto di G). La Figura 1c rappresenta la sequenza amplificata da individui controllo, in assenza della mutazione. La Figura 1d raffigura invece la sequenza del DNA amplificato da individui affetti dalla patologia, in cui in uno degli alleli il codone GCC è mutato nel codone GAC e porta alla comparsa di un sito consenso per l'enzima Mbo II.
Figura 2: Risultato dell’analisi diagnostica dei membri della famiglia sani o affetti da emocromatosi.
In Figura 2a è rappresentata la relazione tra gli individui analizzati (pedigree). I soggetti affetti da emocromatosi sono indicati in nero, mentre quelli sani in bianco. I cerchi indicano i soggetti di sesso femminile mentre i quadrati quelli di sesso maschile. La Figura 2b rappresenta i profili di restrizione ottenuti in seguito a digestione con Mbo Il del DNA amplificato da ciascun individuo. Come indicato nella Figura 2c, nel caso di soggetti sani, che presentano solo la sequenza wild type, in seguito a digestione con Mbo II il DNA amplificato, di 131 paia di basi, non viene digerito. Poiché tutti i soggetti affetti dalla patologia sono eterozigoti per la mutazione, il DNA amplificato viene digerito in una banda di 131 paia di basi (allele normale) e due bande di 94 e 37 paia di basi (quest'ultima non visibile in Figura 2b).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Come verrà illustrato in dettaglio negli esempi che seguono, gli autori della presente invenzione hanno identificato che la mutazione di un particolare codone localizzato nell'esone 3 del gene della ferroportina 1 è associata ad una forma di emocromatosi ereditaria non dipendente dal gene HFE.
La mutazione identificata porta alla espressione di una ferroportina 1 mutata in cui l'amminoacido alanina in posizione corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID No: 2 (listato sequenze in allegato) è sostituito. L'inventore ha sorprendentemente trovato che tale mutazione è un'indicazione sufficiente della presenza di emocromatosi ereditaria non correlata al gene HFE e che pertanto la sua individuazione è utile per la diagnosi precoce di questa patologia. Inoltre, gli autori della presente invenzione hanno trovato che l’emocromatosi ereditaria è correlata con la compromissione della funzionalità della ferroportina 1 ( impairment funzionale).
Pertanto in primo aspetto la presente invenzione si riferisce ad un acido nucleico codificante una ferroportina 1 mutata caratterizzato dal fatto di comprendere una mutazione del codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO: 2.
Con il termine "acido nucleico codificante una ferroportina 1’’ si intende DNA genomico, cDNA, DNA, ad esempio ottenuto tramite PCR, o mRNA codificante per la sequenza aminoacidica di SEQ ID NO: 2 o per una sequenza aminoacidica che presenta almeno il 90% e preferibilmente almeno il 95% di omologia con detta sequenza aminoacidica. Qualora l'acido nucleico sia DNA esso può essere a singola o doppia elica.
L'invenzione comprende inoltre un acido nucleico avente una sequenza complementare a quella del sopradescritto acido nucleico. Ad esempio, tale sequenza può essere una sequenza antisenso utilizzata per bloccare l'espressione del gene o dell’mRNA nelle cellule.
La mutazione secondo l’invenzione porta alla sostituzione, nella molecola di ferroportina 1 wild-type (GenBank accession number: AF231121) dell’aminoacido corrispondente alla posizione 77.
Con il termine " ferroportina 1 wild-type” ci si riferisce ad una ferroportina 1 che svolge il suo ruolo normale e fisiologico, in particolare che non presenta mutazioni che ne alterino la funzionalità. Inoltre, la posizione numerica dell'aminoacido ha l’unico scopo di identificarlo e può variare a causa della presenza di variazioni nella sequenza aminoacidica della proteina, ad esempio al variare della specie presa in considerazione o a causa della presenza di mutazioni o delezioni nelle regioni a monte di detto aminoacido.
L’inventore ha trovato che la sostituzione dell'alanina in posizione 77 con una molecola di acido aspartico comporta un modifica strutturale nella ferroportina 1 evidenziabile, ad esempio, mediante programmi di predizione di struttura secondaria delle proteine quali ad es. “PHDsec’’ (Rost e altri, J Mol Biol 232: 584-599, 1993) e quello “JRED” (Cuff e altri, Proteins: Structure, Function and Genetics 34: 508-519). In particolare, detta sostituzione determina il passaggio della regione della proteina che va dall’aminoacido 58 all’aminoacido 81 (LLLTAVYGLWAGS VLVLGXIIGO, SEQ ID NO: 8) dalla configurazione ad alfa-elica a quella a foglietto beta.
L’importanza deH’amminoacido in posizione 77 nel determinare la struttura secondaria della ferroportina 1 è inoltre confermata dalla sua elevata conservazione in diverse specie animali.
La sostituzione dell’alanina, aminoacido piccolo e non carico, con una molecola carica e di maggiori dimensioni quale l’acido aspartico, risulta in interazioni steriche e di carica che destabilizzano legami ad idrogeno della alfa elica. Analogamente, sostituzioni dell’aianina con aminoacidi carichi quali, ad esempio, l'arginina, la lisina o l'acido glutammico o di maggior ingombro sterico, quali, ad esempio l'istidina, potrebbero portare ad una analoga distorsione della molecola.
La regione della ferroportina 1 corrispondente a SEQ ID NO 8 contiene inoltre un sito di modificazione post-trasduzionale della proteina, il sito di miristilazione GAIIGD, che viene modificato nella proteina mutata secondo l’invenzione. Come è noto, la miristilazione è importante nel favorire le interazioni dei polipeptidi con i fosfolipidi di membrana.
Pertanto, secondo un secondo aspetto, l'invenzione si riferisce ad una proteina ferroportina 1 mutata caratterizzata dalla sostituzione deH'aminoacido in posizione corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO:2 e codificata dall'acido nucleico di cui sopra.
Detta sostituzione consiste nella sostituzione deH'aminoacido alanina in posizione corrispondente alla posizione 77, con un aminoacido aventi proprietà steriche e/o di carica diverse da quelle dell’aianina. Preferibilmente, detto aminoacido è scelto dal gruppo comprendente arginina, lisina, acido glutammico o acido aspartico, tra i quali preferito è l'acido aspartico. Secondo un'applicazione particolarmente preferita la mutazione presente nell’acido nucleico deH’invenzioneconsiste quindi nella sostituzione del codone codificante per raminoacido in posizione corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO:2, preferibilmente GCC, con un codone scelto dal gruppo comprendente GAC e GALI, tra cui preferito è GAC.
In un suo ulteriore aspetto l'invenzione si riferisce a peptidi aventi una sequenza aminoacidica di almeno 6 aminoacidi comprendente raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO: 2 e gli aminoacidi immediatamente a valle e/o a monte di questo. La lunghezza e la sequenza di tali peptidi sono scelti in base a criteri noti da) tecnico del ramo a seconda dell’applicazione che se ne desidera fare, ad esempio, per stimolare la produzione di anticorpi specifici per la mutazione in animali ospiti o per ottenere peptidi e/o anticorpi che interagiscano in modo specifico con l’epitopo mutato.
Realizzazione preferita di tali peptidi è il peptide corrispondente a SEQ ID NO: 8, in cui preferibilmente Xaa è acido aspartico.
La presente invenzione si riferisce anche a frammenti nucleotidici dell’acido nucleico sopradescritto comprendenti il codone mutato e ad oligonucleotidi aventi una sequenza di almeno 9 nucleotidi e preferibilmente di almeno 15 nucleotidi dell’acido nucleico sopradescritto comprendente detto codone.
Detti frammenti e oligonucleotidi possono essere di RNA o DNA e ,in quest'ultimo caso, a singola o doppia elica. Preferìbilmente, gli oligonucleotidi dell’invenzione sono ad elica singola.
L’invenzione comprende inoltre frammenti nucleotidici e oligonucleotidi aventi sequenze complementari a quelle dei sopradescrìtti frammenti o oligonucleotidi.
Per “frammento nucleotidico" secondo la presente invenzione si intende un acido nucleico avente una sequenza corrispondente ad una sequenza parziale dell’acido nucleico dell’invenzione di lunghezza superiore a 100 paia di basi.
Per "olìgonucleotide" secondo la presente invenzione si intende un frammento dell’acido nucleico dell’invenzione avente una lunghezza massima di 100 paia di basi.
I frammenti nucleotidici e gli oligonucleotidi dell'invenzione vengono ottenuti, ad esempio, per digestione dell’acido nucleico dell'invenzione, attraverso amplificazione mediante PCR oppure sintetizzati tramite tecniche note nel ramo.
Gli oligonucleotidi e i frammenti di DNA dell’invenzione essere utilizzati a diversi scopi quali, ad esempio, la produzione di proteine chimeriche o di anticorpi, l'individuazione della mutazione dell'invenzione a scopo diagnostico oppure l’inattivazione del gene mutato a scopi terapeutici. L’esperto del ramo è in grado di scegliere di volta in volta frammenti e oligonucleotidi aventi sequenza e lunghezza adatte all'utilizzo che se ne desidera fare. Ad esempio, qualora detti frammenti o oligonucleotidi vengano utilizzati per l’individuazione della mutazione dell’invenzione tramite tecniche di ibridazione essi devono avere lunghezza e sequenza tale da essere in grado di ibridarsi in modo specifico, in condizioni stringenti, ad una sequenza dell'acido nucleico comprendente il codone mutato.
Secondo una realizzazione preferita, i frammenti e gli oligonucleotidi dell’invenzione sono marcati, ad esempio, con radioisotopi, enzimi, biotina-avidina o altre molecole adatte a renderli visualizzabili tramite specifici saggi.
L’invenzione si riferisce inoltre ai peptidi codificati da tali frammenti e oligonucleotidi.
L'acido nucleico, un suo frammento comprendente la mutazione o un acido nucleico comprendente tale frammento possono essere vantaggiosamente utilizzati per la produzione di una ferroportina 1 mutata ricombinante, di un suo frammento o di una proteina chimerica comprendente tale frammento, al fine, ad esempio, di studiare le caratteristiche funzionali della proteina mutata, ad esempio tramite studi di competizione, o di produrre anticorpi. A questo scopo detto acido nucleico o frammento viene inserito in un vettore d’espressione che, a sua volta, viene introdotto in una cellula procariota o eucariota utilizzando tecniche ben note nell'arte quali ad, esempio, trasfezione, trasformazione, infezione o iniezione intranucleare.
Vettori adatti a questo scopo includono, ad esempio, plasmidi, vettori di origine virale e cromosomi artificiali di lievito o di mammifero.
Secondo una ulteriore applicazione, l'invenzione si riferisce pertanto a un vettore ricombinante comprendente un acido nucleico o un frammento di DNA secondo l'invenzione così come a cellule eucariote o procariote comprendenti detto vettore.
L’acido nucleico secondo l'invenzione può essere inoltre utilizzato per la preparazione di cellule eucariote, tessuti o animali non umani comprendenti un transgene codificante la ferroportina 1 mutata dell’invenzione. Il trangene può essere integrato stabilmente nel genoma della cellula, tessuto o animale oppure essere presente in forma extracromosomiale.
Dette cellule, tessuti o animali non umani sono utili come modelli per lo studio della funzionalità del gene e della proteina comprendenti la mutazione secondo l'invenzione e del loro ruolo nell’insorgenza della emocromatosi ereditaria. Questo studio è di particolare importanza per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per la cura dell'emocromatosi ereditaria.
In un ulteriore aspetto l'invenzione si riferisce ad un metodo per la diagnosi in vitro dell'emocromatosi ereditaria in un mammifero, preferibilmente Homo Sapiens, comprendente i seguenti stadi:
a) isolamento di DNA genomico o RNA da un campione biologico ottenuto da detto mammifero;
b) verifica della presenza in detto DNA genomico o RNA della mutazione secondo l’invenzione,
in cui la presenza di detta mutazione è una indicazione che detto mammifero è affetto da emocromatosi ereditaria.
Preferibilmente detto campione biologico è un campione di plasma, saliva, urina, feci, liquido amniotico o tessuto.
Prima di deta verifica l’RNA viene preferibilmente trasformato in DNA complementare (cDNA) tramite una reazione di trascrizione inversa. Il DNA genomico o il cDNA sono analizzati diretamente oppure in seguito ad amplificazione in vitro tramite polymemse Chain reaction (PCR) (Saiki e altri, Science 239: 487-491, 1988) o altre tecniche quali, ad esempio, ligase chain reaction (LCR) (Wu e altri, Genomics 4: 560-569, 1989) strand dispiacement amplification (SDA) (Walker e altri, PNAS USA 89: 392-396) o self-sustained sequence replication (3SR) (Fahy e altri, PCR Methods Appi. 1 : 25-33, 1992).
Preferibilmente, il DNA genomico o il cDNA viene amplificato tramite PCR utilizzando una coppia di oligonucleotidi adatti ail'amplificazione di un segmento di detto DNA comprendente il codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO:2.
Ad esempio, coppie di oligonucleotidi che possono essere utilizzati per amplificare il cDNA sono quelli avente la sequenza nucleotidica di SEQ ID No:3 e SEQ ID No: 4 mentre oligonucleotidi idonei aH’amplificazione del DNA genomico sono quelli aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 6.
Numerose tecniche, ben note nell’arte, possono essere utilizzate per individuare nel DNA genomico o nel cDNA la presenza della mutazione secondo l’invenzione. Tecniche adatte sono, ad esempio, tecniche basate suH’utilizzo di enzimi di restrizione (Kan e altri, Lancet: 910-912, 1978), tecniche di ibridazione con sonde oligonucleotidiche allelespecifiche (Wallace ed altri, Nucl Acids Res 6: 3543-3557, 1978) tra cui, ad esempio, ibridazione con oligonucleotidi immobilizzati su filtri (Saiki e altri, PNAS USA 86: 6230-6234, 1989) o micro-chips (Chee e altri, Science 274:610-614, 1996) e o ligonucleotide arrays (Maskos e atri, Nucl Acids Res 21: 2269-2270, 1993), PCR allele-specifica (Newton e altri Nucl Acid Res 17:2503-2516, 1989), mismatch repair detection (MRD) (Faham e Cox Genome Res: 474-482, 1995), Singie-strand conformational polymorphism analysis (Ravnik-Glavac et al, Hum. Mol. Gen. 3: 801, 1994), gel elettroforesi in gradiente denaturante (Guldberg et al., Nucl. Acids Res. 22: 880, 1994), Hot Cleavage (Cotton et al. Proc.Natl. Acad Sci USA 85: 4397, 1988), DNAse (Youil e altri, PNAS USA 92: 87-91, 1995) e RNAse protection assay (Winter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 7575, 1985; Meyers et al., Science 230: 1242, 1985), allele spedile prìmer extension (Syvanen e altri, Genomics 8: 684-692, 1990 e Syvanen e altri, Hum Mutai 13:1-10, 1999), genetic bit analysis (GBA) (Nikiforov e altri Nucl Acid Res 22:4167-4175, 1994), prìmer-ligation assay (OLA) (Landergen e altri, Science 241: 1077, 1988), allele spedite ligation chain reaction (LCR) (Barrany PNAS USA 88:189-193, 1991), gap-LCR (Abravaya e altri Nucl Acids Res 23: 675-682, 1995) e tecniche di sequenziamento. Tecniche particolarmente preferite per l'individuazione della mutazione dell'invenzione sono tecniche basate sull'utilizzo di enzimi di restrizione, PCR allele specifica, tecniche di ibridazione o tecniche di sequenziamento.
Pertanto, secondo una prima applicazione preferita la verifica della presenza nel DNA analizzato della mutazione secondo l’invenzione avviene utilizzando tecniche basate sull’utilizzo di enzimi di restrizione e comprende i seguenti stadi:
a) amplificazione del DNA genomico o del cDNA con una coppia di oligonucleotidi adatta all’amplificazione selettiva di un segmento di detto DNA comprendente il codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO:2 e alla contemporanea introduzione nel DNA amplificato di una mutazione tale che, in combinazione con la mutazione dell’invenzione, crei la sequenza consenso per un sito di restrizione altrimenti non presente; b) incubazione del DNA amplificato con un enzima in grado di riconoscere detto sito di restrizione; e
c) analisi della dimensione dei prodotti della digestione;
in cui l’awenuta digestione è indice della presenza nel DNA genomico o complementare della mutazione dell'invenzione.
L'analisi della dimensione dei prodotti della digestione viene effettuata, ad esempio, tramite gel elettroforesi, utilizzando un marcatore di pesi molecolari, seguita da visualizzazione delle bande di DNA, tramite ad esempio utilizzo di etidio bromuro.
Nel caso si desideri, ad esempio, verificare la presenza della sostituzione del codone GCC, codificante per l'alanina in posizione 77, con il codone GAC, codificante una molecola di acido aspartico, possono essere utilizzati oligonucleotidi aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7. Come verrà illustrato negli esempi che seguono, questi oligonucleotidi danno origine, in presenza della sopradescritta sostituzione, ad un frammento di DNA amplificato avente la sequenza indicata in Figura 1d che contiene il sito consenso per l'enzima Mbo II, GAAGACATCATCGGT, non presente invece nel frammento di DNA amplificato dal DNA wild-type (Fig.lc). La successiva incubazione del prodotto della reazione di amplificazione con Mbo II risulta nella digestione del frammento solo se nella sequenza originale era presente la mutazione.
Secondo una ulteriore applicazione preferita l'individuazione della mutazione secondo l’invenzione viene eseguita tramite tecniche di ibridazione in cui sono utilizzati frammenti dell'acido nucleico dell’invenzione o oligonucleotidi specifici per la mutazione secondo l’invenzione. Detti frammenti o oligonucleotidi sono in grado di ibridare in modo specifico ad una sequenza dell’acido nucleico dell’invenzione comprendente il codone mutato anche quando detta sequenza è presente insieme a numerose altre sequenze.
L’esperto del ramo è in grado di selezionare di volta in volta le condizioni di ibridazione e la lunghezza e sequenza dei frammenti o degli oligonucleotidi più adatte alla particolare tecnica di ibridazione utilizzata e al tipo di DNA che si sta analizzando (DNA genomico o complementare, amplificato o clonato in vettori opportuni).
Secondo una ulteriore applicazione preferita, il metodo diagnostico prevede l’utilizzo di una PCR allele-specifica, in cui il DNA genomico o complementare viene sottoposto ad una reazione di PCR in cui sono utilizzati oligonucleotidi in grado di amplificare in modo selettivo un segmento di detto DNA comprendente il codone mutato e non il corrispondente segmento comprendente il codone non-mutato.
La presente invenzione si riferisce inoltre a frammenti di acido nucleico e ad oligonucleotidi secondo l’invenzione da utilizzarsi nei sopradescritti metodi. In particolare, si riferisce a oligonucleotidi aventi la sequenza nucleotidica corrispondente a SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 e 7.
Nell’ambito della presente invenzione sono compresi inoltre kit diagnostici per la individuazione in un individuo della mutazione secondo l’invenzione. Secondo una applicazione particolarmente preferita detti kit diagnostici comprendono oligonucleotidi aventi sequenza nucleotidica corrispondente a SEQ ID NO: 6 e 7 e l’enzima Mbo II.
La presente invenzione si riferisce inoltre ad un metodo per la diagnosi in vitro dell’emocromatosi ereditaria in un mammifero comprendente la verifica della presenza in una campione biologico da detto mammifero di una proteina ferroportina 1 mutata secondo l’invenzione, in cui l'identificazione di detta proteina è una indicazione che l’individuo è affetto da emocromatosi ereditaria.
Perferibilmente detta verifica viene eseguita attraverso saggi immunologici in cui sono utilizzati anticorpi monoclonali o policlonali in grado di discriminare tra una molecola di ferroportina mutata secondo l’invenzione e una molecola di ferroportina wild-type.
Pertanto la presente invenzione si riferisce anche ad anticorpi, monoclonali o policlonali, in grado di riconoscere in modo specifico una molecola di ferroportina 1 mutata secondo l’invenzione o un epitopo di essa comprendente la mutazione. Tali anticorpi sono ottenuti attraverso metodi ben noti nell’arte quali, ad esempio, quelli descrìtti da Harlow e Lane in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1988.
Gli anticorpi dell’invenzione presentano particolare utilità, oltre che come reagenti diagnostici, per studiare le caratteristiche della proteina o a scopi terapeutici. Ad esempio, detti anticorpi possono essere utilizzati per individuare la precisa localizzazione tessutale o cellulare della proteina mutata, studiarne le caratteristiche biochimiche o purificarla per immunoaffmità.
Inoltre, poiché la presenza in un individuo di un gene recante la mutazione dell'invenzione e della ferroportina 1 da esso codificata è correlata con l’insorgenza di emocromatosi ereditaria risulta molto importante disporre di mezzi per bloccare l’espressione del gene od inattivare la proteina.
L’invenzione si riferisce pertanto anche ad oligonucleotidi, ad esempio oligonucleotidi antisenso, adatti a bloccare l'espressione del gene codificante la ferroportina 1 mutata dell’invenzione, e ad anticorpi e polipeptidi in grado di alterare in modo specifico la funzionalità della ferroportina 1 mutata dell’invenzione.
L'invenzione si riferisce inoltre a composizioni farmaceutiche comprendenti detti oligonucleotidi, anticorpi o peptidi miscelati con eccipienti farmaceuticamente accettabili.
ESEMPI ESEMPIO 1
Identificazione del cromosoma e del locus cromosomico associati con l’emocromatosi ereditaria non HFE-dipendente
Un campione DNA è stato estratto dal sangue periferico del probando e dei membri delia sua famiglia affetti dalla patologia utilizzando il kit di estrazione del DNA da campione di sangue (Quiagen Blood Extraction Kit, Quiagen). Sul DNA estratto si è quindi condotto una ricerca automatizzata sull'intero genoma della localizzazione del gene associato alla malattia (“genome wide search") utilizzando dei set di marcatori per lo studio della segregazione ereditaria della malattia (ABI PRISM Linkage mapping set, Perkin Elmer, Stati Uniti). Per le reazioni di PCR sono stati utilizzati oligonucleotidi fluorescenti nelle condizioni indicate dal produttore. Un’aliquota di ciascuna reazione di PCR è stata poi sequenziata in un sequenziatore di DNA ABI PRISM 377 e i risultati ottenuti sono stati analizzati con software GENESCAN. L’assegnazione dell’allele è stata effettuata utilizzando il software Genotyper™. L’analisi statistica è stata condotta sulla base di una malattia autosomica dominante con penetranza completa. La frequenza gene-malattia è stata fissata a 0.012 e tutti gli allelì marker sono stati considerati egualmente frequenti. La Tabella 1 riporta il “lod score" cioè la massima probabilità di associazione di uno specifico marcatore con la malattia.
Tabella 1:
Quanto più alto è il punteggio, espresso in modo logaritmico, quanto meno l'associazione della malattia con i marcatori specifici utilizzati è dovuta al caso. Ad esempio, un lod score di 1.0 indica 1 possibilità su 10 che il risultato sia dovuto al caso; un lod score di 2, una possibilità su 100 e così via. Il fatto che siano stati trovati punteggi molto elevati per il marcatore D2S118 (5.99) e per D2S152 (5.88), indica che il gene associato alla malattia risiede nella regione delimitata da questi marcatori. In questa regione cromosomica risiede la ferroportina 1. Nessuna altra regione cromosomica ha dato simili risultati.
ESEMPIO 2
Identificazione della mutazione
Campioni di sangue sono stati raccolti dal probando, da 15 membri della famiglia affetti dalla patologia e da 25 membri della famiglia non affetti dalla patologia. L’RNA totale è stato isolato da macrofagi ottenuti da ciascun campione attraverso estrazione in guanidina-isotiocianato ed è stato quindi preparato il DNA complementare secondo un protocollo standard (400 ng di RNA totale, 1 μg di oligodT, 1 mM di dNT, 20 U di trascrittasi inversa AMV in 20 pi di tampone di reazione; Promega) La sequenza completa della ferroportina 1 è stata poi amplificata dal cDNA tramite una reazione di PCR utilizzando la seguente coppia di oligonucieotidi:
in dettaglio, 10 pi del prodotto della reazione di trascrizione inversa sono stati amplificati in 50 μΙ finali di tampone di reazione 1X contenente dNTP 200 μΜ, MgCI2 1.5 mM, 0.25 pg di ciascuno dei sopra descritti oligonucleotide, 2.6 unità di enzima. Per la reazione di amplificazione è stato utilizzato un programma di 30 cicli, ognuno dei quali era caratterizzato dal seguente profilo termico:
94°C per 1 minuto,
58°C per 40 secondi,
75°C per 5 minuti.
Dal cDNA della ferroportina amplificato 1 si sono poi ottenuti quattro frammenti di DNA parzialmente sovrapposti attraverso una nuova PCR, utilizzando le seguenti coppie di oligonucleotidi:
I quattro frammenti ottenuti dall'amplificazione sono stati poi separati elettroforeticamente su gel di agarosio, purificati utilizzando il kit Jet Sorb (Genenco) e sequenziati direttamente utilizzando il kit Rhodamine Sequence kit (Perkin Elmer, Stati Uniti). Il sequenziamento ha evidenziato la presenza nei soggetti affetti dalia patologia della sostituzione di una C con una A in posizione 230 di SEQ.ID No.1 (nucleotide in posizione 534 della sequenza avente GenBank accession number: AF231121), che non si è invece rilevata in nessuno dei soggetti controllo. Questa sostituzione è localizzata a livello dell’esone 3 del gene della ferroportina 1 e risulta nella sostituzione dell’alanina in posizione 77 della ferroportina 1 con acido aspartico.
ESEMPIO 3
Metodo diagnostico
a) DNA genomico del probando, di 15 suoi familiari affetti dalla patologia e 125 individui controllo, comprendenti 100 volontari sani e 25 membri della famiglia non affetti dalla patologia, è stato estratto da leucociti ottenuti da campioni di sangue dei soggetti da analizzare utilizzando un kit per l’estrazione di DNA dal sangue (Quiagen).
Il DNA ottenuto è stato quindi amplificato tramite PCR utilizzando una coppia di oligonucleotidi complementari alle regioni introniche ai lati dell’esone 3 ed aventi la seguente sequenza:
In dettaglio, 200 ng di DNA genomico sono stati amplificati in 50 μ{ di tampone di reazione 1X contenente dNTPs 200 μΜ, MgC(2 1.5 mM, 20 pmoli di ciascun oligonucleotide e 2.6 U di enzima.
Per la reazione di amplificazione è stato utilizzato un programma di 30 cicli, ognuno dei quali era caratterizzato dal seguente profilo termico: 94°C per 1 minuto,
60°C per 1 minuto,
72°C per 45 secondi.
Il DNA ottenuto è stato poi purificato utilizzando il kit PCR Wizard (Promega) e sequenziato in un sequenziatore automatico ABI Prism 377 (Perkin Elmer, Stati Uniti), con la stessa coppia di otigonucleotidi utilizzati per la reazione di PCR.
E’ stata rilevata la sostituzione di una C con una A nell’esone 3 nei soggetti affetti dalla patologia ma non nei soggetti controllo,
b) Si sono ottenuti campioni di sangue dalla probanda, da 15 suoi familiari affetti dalla patologia e dai 125 soggetti controllo descritti nell’Esempio 2 e il DNA genomico è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA da campioni di sangue (Biorad).
Poiché la mutazione osservata non dà origine alla comparsa o alla scomparsa di alcun sito di restrizione, la porzione dell’esone 3 contenente la mutazione è stata amplificata attraverso una reazione di PCR utilizzando una coppia di oligonucleotidi aventi le seguenti sequenze:
Come mostra la Figura 1 b, l’oligonucleotide senso presenta un nucleotide mismatched (A al posto di G, sottolineato). L'amplificazione con i sopradescritti oligonucleotidi dà origine, in presenza della mutazione, ad un frammento di DNA amplificato, avente la sequenza indicata in Figura 1d, che contiene il sito consenso per l'enzima Mbo II, GAAGACATCATCGGT. In assenza della mutazione, si ottiene invece un frammento di DNA, avente la sequenza indicata in Figura 1d e che non contiene tale sito di restrizione (Fig.lc).
Pertanto, la successiva incubazione del prodotto della reazione di amplificazione con l’enzima Mbo 11 risulta nella digestione del frammento solo se nella sequenza originale era presente la mutazione.
In dettaglio, 10 μΙ del DNA genomico estratto sono stati amplificati in 50 μl finali di tampone di reazione 1x contenente dNTPs 200 μΜ, MgCI2 1.5 mM, 20 p moli di ciascun oligonucleotide e 2.6 unità di enzima. Per la reazione di amplificazione è stato utilizzato un programma di 30 cicli, ognuno dei quali era caratterizzati dal seguente profilo termico:
94° C per 1 minuto,
58°C per 1 minuto,
72°C per 45 secondi.
10 μΙ del prodotto ottenuti dall’amplificazione sono stati poi digeriti con l’enzima Mbo II (Geneco) in tampone di reazione 1X per 3 ore a 37°C. I frammenti ottenuti dalla digestione sono stati quindi separati su gel di poliacrilamide al 12%. I campioni ottenuti da pazienti affetti dalla patologia davano origine a 3 bande di 131, 94 e 37 paia di basi. I campioni controllo presentavano invece tutti una sola banda di 131 paia di basi. La figura 2 illustra i risultati ottenuti dal probando, da 4 suoi familiari affetti dalla patologia e da 3 familiari normali. Come si può vedere dalla figura, solo nei soggetti affetti dalla patologia si osserva la digestione del frammento di 131 paia di basi in due frammenti di 94 e 37 paia di basi.
Risulta inoltre compreso nella presente invenzione qualsiasi intervento terapeutico di sostituzione del gene mutato con il gene wild type. Pertanto, la molecola di ferroportina 1 mutata è un bersaglio terapeutico per tutti gli interventi di terapia genica mirati alla sostituzione del gene mutato.

Claims (49)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Acido nucleico codificante una ferroportina 1 caratterizzato dal fatto di comprendere una mutazione del codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ. ID. No. 2.
  2. 2. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di essere cDNA.
  3. 3. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di essere mRNA.
  4. 4. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di essere DNA genomico.
  5. 5. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detto aminoacido è l’alanina.
  6. 6. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta mutazione porta alla sostituzione di detto aminoacido con un aminoacido avente caratteristiche sieriche e/o di carica diverse.
  7. 7. Acido nucleico secondo la rivendicazione 6 caratterizzata dal fatto che detto aminoacido avente caratteristiche sieriche e/o di carica diverse è scelto dal gruppo comprendente l'arginina, la lisina, l’acido glutammico o l’acido aspartico.
  8. 8. Acido nucleico secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che detto aminoacido è l’acido aspartico.
  9. 9. Acido nucleico secondo la rivendicazione 8 caratterizzato dal fatto che detta mutazione consiste nella sostituzione del codone GCC con il codone GAC o GAU.
  10. 10. Acido nucleico secondo la rivendicazione 9 caratterizzato dal fatto che detta mutazione consiste nella sostituzione del codone GCC con il codone GAC.
  11. 11. Acido nucleico avente sequenza complementare a quella dell’acido nucleico secondo la rivendicazione 1.
  12. 12. Ferroportina 1 mutata codificata dall’acido nucleico secondo la rivendicazione 1.
  13. 13. Peptide avente una sequenza di almeno 6 aminoacidi della ferroportina secondo la rivendicazione 12 comprendente l’aminoacido corrispondente all posizione 77 di SEQ ID NO: 2.
  14. 14. Frammento dell’acido nucleico secondo la rivendicazione 1 comprendente il codone codificante laminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ. ID. No. 2.
  15. 15. Frammento secondo la rivendicazione 14 caratterizzato dal fatto di essere marcato.
  16. 16. Oligonucleotide avente una sequenza di almeno 9 nucleotidi dell’acido nucleico secondo la rivendicazione 1 e comprendente il codone codificante laminoacido corrispondente alia posizione 77 di SEQ. ID. No. 2
  17. 17. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 16 caratterizzato dal fatto che detta sequenza è di almeno 15 nucleotidi.
  18. 18. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 16 caratterizzato dal fatto di essere marcato.
  19. 19. Frammento avente sequenza complementare a quella del frammento secondo la rivendicazione 14.
  20. 20. Oligonucleotide avente sequenza complementare a quella dell’oligonucleotide secondo la rivendicazione 16.
  21. 21. Peptide codificato da un frammento secondo la rivendicazione 14 o da un oligonucleotide secondo la rivendicazione 16.
  22. 22. Vettore ricombinante comprendente la sequenza nucleotidica dell'acido nucleico secondo la rivendicazione 1 o del frammento secondo la rivendicazione 14.
  23. 23. Cellula transfettata o trasformata con il vettore rcombinante secondo la rivendicazione 22.
  24. 24. Cellula eucariota, tessuto o animale non umano comprendente un transgene codificante una proteina secondo la rivendicazione 12.
  25. 25. Metodo per la diagnosi in vitro dell’emocromatosi ereditaria in un mammifero comprendente i seguenti stadi a) isolamento di DNA genomico o RNA da un campione biologico ottenuto da detto mammifero; b) verifica della presenza in detto DNA genomico o RNA della mutazione secondo la rivendicazione 1 , in cui la presenza di detta mutazione è una indicazione che detto mammifero è affetto da emocromatosi ereditaria.
  26. 26. Metodo secondo la rivendicazione 25 caratterizzato dal fatto che detto mammifero è un Homo sapiens.
  27. 27. Metodo secondo la rivendicazione 25 caratterizzato dal fatto che detto campione biologico è un campione di sangue, plasma, saliva, urina, feci, liquido amniotico o tessuto.
  28. 28. Metodo secondo la rivendicazione 25 caratterizzato dal fatto che prima di detta verifica il DNA genomico isolato viene amplificato.
  29. 29. Metodo secondo la rivendicazione 28 caratterizzato dal fatto che il DNA genomico viene amplificato tramite PCR utilizzando una coppia di oligonucleotidi adatti aH’amplificazione di un segmento di detto DNA comprendente il codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO: 2.
  30. 30. Metodo secondo la rivendicazione 29 caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi hanno la sequenza nucleotidica di SEQ.ID NO: 5 e SEQ.ID NO: 6.
  31. 31. Metodo secondo la rivendicazione 25 caratterizzato dal fatto che prima di detta verifica l’RNA viene trasformato in cDNA.
  32. 32. Metodo secondo la rivendicazione 31 caratterizzato inoltre dal fatto che prima di detta verifica il cDNA viene amplificato.
  33. 33. Metodo secondo la rivendicazione 32 caratterizzato dal fatto che il cDNA viene amplificato tramite PCR utilizzando una coppia di oligonucleotidi adatti aH’amplifìcazione di un segmento di detto DNA comprendente il codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO:2.
  34. 34. Metodo secondo la rivendicazione 33 caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi hanno la sequenza nucleotidica di SEQ.ID NO: 3 e SEQ.ID NO: 4.
  35. 35. Metodo secondo la rivendicazione 25 caratterizzato dal fatto che detta verifica viene eseguita utilizzando una tecnica scelta dal gruppo comprendente tecniche basate sull'utilizzo di enzimi di restrizione, tecniche di ibridazione con sonde oligonucleotidiche allele-specifiche, PCR allele-specifica, mismatch repair detection, single-strand conformational polymorphism analysis, gel elettroforesi in gradiente denaturante, Hot Cleavage, DNAse e RNAse protection assay, allele specific primer extension, genetic bit analysis o\igonucleotide-ligation assay, allele specific ligation chain reaction e tecniche di sequenziamento.
  36. 36. Metodo secondo la rivendicazione 35 caratterizzato dal fatto che detta verifica viene eseguita tramite tecniche basate sull’utilizzo di enzimi di restrizione, PCR allele specifica, tecniche di ibridazione o di sequenziamento.
  37. 37. Metodo secondo la rivendicazione 36 caratterizzato dal fatto che detta verifica comprende i seguenti stadi: a) amplificazione del DNA genomico o del cDNA con oligonucleotidi adatti all'amplificazione selettiva di un segmento di detto DNA comprendente il codone codificante raminoacido corrispondente alla posizione 77 di SEQ ID NO: 2 e alla contemporanea introduzione nel DNA amplificato di una mutazione tale che, in combinazione con la mutazione dell’invenzione, crei la sequenza consenso per un sito di restrizione altrimenti non presente: b) incubazione del DNA amplificato con un enzima in grado di riconoscere detto sito di restrizione; e c) analisi dei prodotti della digestione; in cui l’avvenuta digestione è indice della presenza nel DNA genomico o nel cDNA della mutazione secondo la rivendicazione 1.
  38. 38. Metodo secondo la rivendicazione 37 caratterizzato dal fatto che detti oligonucleotidi hanno la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 e detto enzima è Mbo 11.
  39. 39. Oligonucleotide avente la sequenze nucleotidica di SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 o 7.
  40. 40. Kit diagnostico per la individuzione della mutazione in un individuo comprendente oligonucleotidi aventi sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 e l’enzima Mbo II.
  41. 41. Metodo per la diagnosi in vitro dellemocromatosi ereditaria in un mammifero comprendente la verifica della presenza in un campione biologico ottenuto da detto mammifero di una proteina ferroportina 1 secondo la rivendicazione 12, in cui la presenza di detta proteina è una indicazione che detto mammifero è affetto da emocromatosi ereditaria.
  42. 42. Metodo secondo la rivendicazione 41 in cui detta identificazione viene eseguita utilizzando anticorpi in grado di riconoscere in modo specifico detta ferroportina 1 mutata.
  43. 43. Anticorpi monoclonali o policlonali in grado di riconoscere in modo specifico una proteina ferroportina 1 mutata secondo la rivendicazione 12.
  44. 44. Anticorpi per l'inattivazione specifica di una proteina ferroportina 1 mutata secondo la rivendicazione 12.
  45. 45. Composizione farmaceutica comprendente anticorpi secondo la rivendicazione 44.
  46. 46. Polipeptidi per l’inattivazione specifica di una ferroportina 1 mutata secondo la rivendicazione 12.
  47. 47. Composizione farmaceutica comprendente polipeptidi secondo la rivendicazione 46.
  48. 48. Oligonucleotidi adatti a bloccare dell’espressione del gene codificante una ferroportina 1 mutata secondo la rivendicazione 12.
  49. 49. Composizione farmaceutica comprendente oligonucleotidi secondo la rivendicazione 48.
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