KR20030093291A - 만성관절류머티즘에 관여하는 게놈ｄｎａ, 그 진단방법,그 발증가능성의 판정방법, 및 이들의 검출용 진단키트 - Google Patents

만성관절류머티즘에 관여하는 게놈ｄｎａ, 그 진단방법,그 발증가능성의 판정방법, 및 이들의 검출용 진단키트 Download PDF

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Abstract

배열번호1의 게놈DNA에 있어서, 하기 (1)이상의 변이를 갖는 게놈DNA, 그 변이를 이용한 인간만성관절류머티즘의 진단방법, 그 발증가능성의 판정방법 및 이들의 검출용 진단키트에 관한 것이다.
(1) 위치 1987의 염기가 시토신(c)으로부터 티민(t)으로 치환.
(2) 위치 3664의 염기가 티민(t)으로부터 구아닌(g)으로의 치환.
(3) 위치 3769의 염기가 아데닌(a)으로부터 시토신(C)으로의 치환.

Description

만성관절류머티즘에 관여하는 게놈ＤＮＡ, 그 진단방법, 그 발증가능성의 판정방법, 및 이들의 검출용 진단키트{Genomic DNAS Participating in Rheumatoid Arthritis, Method of Diagnosing the Same, Method of Judging Onset Riks Thereof and Diagnostic Kit for Detecting the Same}
만성관절류머티즘(rheumatoid arthritis, RA)은 다발하는 미란성 관절염을 주 징상으로 하는 바, 동시에 많은 장기에 장해를 주는 원인불명의 전신성 염증질환이다. RA는 완화와 악화를 반복하면서 만성적으로 진행하며, 치료하지 않고 방치하면 관절의 파괴와 변형을 초래하여, 결국 운동기관의 기능장애가 나타나게 된다. 때로는 생명도 위협한다. 따라서, RA환자는 신체적으로나 정신적으로도 헤아릴 수 없을 정도의 큰 고통을 일생동안 짊어지게 된다.
RA는 그 발증(發症)의 양상도 다종다양하여, 그 진단에는 미국류머티즘학회의 진단기준이 널리 사용되고 있다. 그러나, RA의 발증은, 보통 서서히 수주간에서부터 수개월에 걸치며, 미국류머티즘학회의 진단기준에 있어서의 객관적인 지표로서의 류마토이드인자의 존재는, 그 양성율(陽性率)이 3개월이내에서 33%, 12개월이상에 있어서도 88%정도(치료, 제 73권, 제 3호, 제 23-27쪽, 1991년)이며, RA라고 확실하게 진단하는데는 이르지 못하고 있다. 그래서 재조합(再組合)항원과 반응하는 환자혈청중의 류마티스성 관절염 관련항체 IgM항체를 검출하여, 류마티스성 관절염을 진단하려고 하는 시도 등이 행해지고 있다(일본국 특개평 10-513257호).
또, RA의 치료는 통상적으로, RA병태의 병상(病狀)의 진행과정에 따라서 선택해야 할 치료수단이 다르다. 일반적으로 확정진단을 내릴 수 없는 초기에 있어서는, 비스테로이드 항염증약(NSAID)을 투여하고, 확정진단이 내려진 경우는, NSAID에 첨가하여 질환수식성 항류머티즘약(DMARD)을 투여한다. 특히 RA발증의 초기에는, 확정진단을 내리는 것이 곤란하며, 현상태에서는 NSAID를 투여하고, 경과를 신중히 관찰하면서, 교원병(膠原病)을 포함하는 다른 류머티즘질환과의 감별을 동시에 실시하고 있다. 또한 증상이 진행된 경우에는, 스테로이드약의 투여를 실시하는 경우도 있으며, 동통완화를 위한 약물치료요법과 함께 관절기능의 유지·회복에 대한 이학적치료법·장구요법(裝具療法)을 실시한다. 또 관절파괴로 인해 일상생활이 부자유스럽게 된 경우에는, 수술요법을 시행하는 경우도 있다.
RA의 원인인 관점염과 관절파괴의 양상, 특히 이들의 병리과정은 다양한 연구를 통하여 점차 명확해지고 있는 바, RA는 생활환경을 포함한 많은 원인인자가 중합되어 비로서 질환으로 발전·악화하는 질환이다. 이 때문에, 질환의 바른 해명과 적절한 치료를 실시하는데는 다인자상호작용의 본체 그 자체가 밝혀지지 않으면 안된다. 만성 관절류머티즘(RA)은 세계적으로 볼 때, 이환율이 1% 이하의 질환이지만(N. Engl. J. Med. 322:1277-1289, 1990), 환자의 혈연관계에 있어서는 약 8% 이상이 발증(Cell, 85: 311-318, 1996)한다는 점으로 보아, 그 원인인자로서 어떤 유전적 요인이 상정되고 있다. 또, 환경이 원인인자의 하나로 생각되고 있기 때문에, 사전에 발증가능성을 알게 됨으로써, 일상생활에 있어서, 예를 들면, 식이, 바이러스감염 및 스트레스 등에 주의하는 것으로써 발증을 지연시키거나 방지하는 것이 가능하다. 또한, 진단을 빨리해서 초기에 적절한 치료를 실시함으로서 RA의 진행을 늦출수가 있고, 예후의 개선이 기대된다.
국제공개 WO98/51791호에는 본출원의 발명자들이 마이크로위성마아커(mirco satellite marker)를 사용한 연쇄해석을 RA환자 및 그 혈연자에 대하여 실시함으로써, 만성관절류머티즘의 질환유전자가 위치하는 3개소의 유전자 자리를 특정하여, 이하의 질환유전자를 동정(同定)하고 있다.
(1) 사람의 제1염색체의 마이크로위성마아커 D1S214 및/또는 D1S253이 혼성화(hybridize)하는 DNA배열로부터 ±1센티모오갠 이내에 위치하는 만성관절류머티즘의 질환유전자.
(2) 사람의 제8염색체의 마이크로위성마아커 D8S556이 혼성화하는 DNA배열로부터 ±1센치모오갠 이내에 위치하는 만성관절류머티즘의 질환유전자.
(3) 사람의 X염색체의 마이크로위성마아커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 혼성화하는 DNA배열로부터 ±1센치모오갠 이내에 위치하는 만성관절류머티즘의 질환유전자.
또, 본 발명자들은 상기 (3)의 질환유전자에 대하여 더욱 연구를 진행하여,X염색체의 Dbl 프로토온코진(EMBO J. (78) : 2454-2473, 1988 ; GenBank accession No. X12556)의 변이(2엑손결실형변이)가 RA의 발증에 관계하고 있다는 것을 발견하여, 특허출원하고 있다(PCT/JP00/01697).
본 발명은 인간Dbl유전자의 거듭되는 변이와 RA의 발증 또는 그 발증가능성을 해명하고, 그 변이를 이용하여 RA의 발증 또는 그 발증가능성을 고정밀도로 진단할 수가 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다. 또한, 본 발명은 RA에 관한 Dbl이 변이한 게놈DNA를 검출하기 위한 유용한 진단키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
본출원 발명은 변이를 갖는 게놈DNA, 그 변이를 이용한 인체의 만성 관절류머티즘의 진단방법, 그 발증가능성의 판정방법 및 이들의 검출용 진단키트에 관한 것이다.
도 1은 RA질환유전자의 배열결정에 사용한 프라이머와 게놈DNA와의 관계를 나타낸 모식도.
도 2는 배열번호 2 및 3의 염기배열로 이루어지는 프라이머를 사용하여 증폭한 PCR산물의 Hinf-1처리후의 전기영동상이다. 레인1은 호모변이형 Dbl유전자유래의 PCR산물, 레인2는 정상(야생형)Dbl유래의 PCR산물, 레인3은 헤테로변이형 Dbl유래의 PCR산물의 결과이다.
이와 같은 상황하에 있어서, 본 발명자들은 예의연구를 진행한 결과, 피검자들로부터 얻어진 세포에 있어서 Dbl유전자의 인트론24-엑손24-인트론23의 염기배열을 나타낸 배열번호1의 게놈DNA에 있어서 다음과 같은 변이를 발견하였다.
(1) 위치 1987의 염기가 시토신(c)으로부터 티민(t)으로 치환.
(2) 위치 3664의 염기가 티민(t)으로부터 구아닌(g)으로의 치환.
(3) 위치 3769의 염기가 아데닌(a)으로부터 시토신(C)으로의 치환.
즉, 위치 1987의 염기(c)는 인트론24에 존재하고, 위치 3664 및 3789의 염기(t) 및 아데닌(a)은 인트론23에 존재한다. RA의 발증에 관여하는 게놈유전자는 종래부터 복수개 존재하는 것이 알려지고 있으나, 본 발명의 변이한 게놈DNA는 이들의 RA발증원인의 일부를 구성하는 것이다. 또한, 인트론영역에 있어서의 1염기치환과 질환과의 관계에 관해서는 예를 들면, 2형당뇨병의 질환유전자(NatureGenetics 26 : 163-175, 2000)등이 알려지고 있다.
이들의 지견으로부터 피검자로부터 얻어진 세포에 있어서의 Dbl유전자의 변이를 지표로 하여, RA의 진단방법 또는 그 발증가능성의 판정방법 및 이들의 변이를 검출하는 진단키트가 유용하다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하는데 이르렀다. 또한, 본 발명은 만성질환류머티즘의 새로운 예방·치료법 및 치료약제의 개발에도 유용하다.
본 명세서에 있어서, 특별히 규정되지 않는 한, a, c, g 및 t는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민의 각 염기를 나타낸다.
또, 배열번호 1은 Dbl유전자의 게놈DNA를 포함하는 X염색체 q25-26.3영역의 인간게놈으로서 진뱅크에 등록되어 있는 배열(GenBank accession No. AL033403)의 위치 55,823∼59,696의 배열에 상당한다. 또한, 이 진뱅크에 등록되어 있는 배열은 그 상보쇄가 +스트랜드이며, 위치115, 837로부터 5'방향으로 번역되며, GenBank accession No. X12556의 mRNA를 전사한다.
본 발명의 RA진단방법, 그 발증가능성의 판정방법 및 이들의 검출용 진단키트에 있어서는 게놈DNA의 상기 변이 중 적어도 하나를 검출한다.
변이게놈DNA의 동정 및 RA의 진단 또는 그 발증가능성의 판정은 예를 들면, 다음과 같이 하여 실시할 수 있다.
피검자의 게놈DNA는, 통상의 방법에 의해 인체의 모든 세포로부터 얻을 수 있는 바, 예를 들면, 모발, 각 장기, 말초임파구, 활막세포 등으로부터 얻을 수가 있다. 또, 얻어진 세포를 배양, 증식한 것으로부터 얻을 수도 있다. 또한, 얻어진 게놈DNA는 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법 및 SDA(Strand Displacement Amplification)법 등의 통상적으로 행해지는 유전자증폭법에 의해 증폭하여 사용할 수가 있다.
게놈변이의 검출방법으로서는 예를 들면, 특별히 한정되지 않으나, 알릴특이적 올리고뉴클레오티드프로브법, 올리고뉴클레오티드라이게이션 어세이(Oligonucleotide Ligation Assay)법, PCR-SSCP법, PCR-CFLP법, PCR-PHFA법, 인베더법, RCA(Rolling Circle Amplfication)법, 프라이머올리고베이스익스텐션(Primer Oligo Base Extension)법 등을 들 수 있다.
PCR법을 사용하여 변이를 검출하는 경우에는, 배열번호1의 변이위치를 포함하는 영역을 PCR증폭할 수가 있는 PCR프라이머를 합성하고, 피검자의 게놈DNA로부터 증폭되는 PCR산물의 다이렉트시퀀스에 의해 결정할 수 있다. 배열번호1의 게놈의 하나이상의 상기 변이를 검출하는 것에 의해, 피검자의 RA의 진단 또는 그 발증가능성의 판정을 고정밀도로 실시할 수가 있다.
본 발명에서 사용되는 프라이머는 통상의 방법에 의해 DNA신시사이져(synthesizer) 등에 의해 제작할 수가 있다.
또, 상기의 변이는 예를 들면, 변이부위치주변의 정상배열 및 변이배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 구비한 마이크로어레이장치 등에 의해서도 검출할 수가 있다.
또한, 위치 3664의 변이(t→g)는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 그 변이부위를 포함하는 합성올리고뉴클레오티드(배열번호 2, 3)를 프라이머로하여 DNA의 +스트랜드를 PCR증폭하고, PCR산물을 제한효소 Hinf-Ⅰ로 절단하여, 2단편화되는가의 여부를 조사하는 것에 의해서도 검출할 수 있다(RFLP분석). 즉, 배열번호1의 상보쇄에 있어서의 위치 3664주변의 정상배열은 5'-gaatc-3'이며 Hinf-Ⅰ(인식배열 5'-g↓antc-3')에 의해 절단된다. 한편, 배열번호1의 상보쇄에서의 위치 3664주변의 변이배열은 5'-gcatc-3'가 되기 때문에, Hin-Ⅰ에 의해서도 절단되지 않는다.
본 명세서에 있어서의 진단키트는 상기 게놈DNA의 1이상의 변이를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 프라이머, 프로브 등을 포함하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 또한 이 외에 시약을 조합하는 것에 의해 얻을 수가 있다.
예를 들면, 상기 변이를 1이상 포함하는 게놈영역을 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머를 포함하고, 다시, 상기 변이를 하나이상 포함하는 게놈영역을 검출할 수 있도록 설계된 프로브, 제한효소, 맥섬 길버트법, 체인터미네이터법 등의 염기배열결정법에 이용되는 시약 등, 변이를 검출하기 위하여 필요한 시약을 하나이상, 조합한 키트를 들 수가 있다. 또, 바람직하게는 형광표지된 다이디옥시뉴클레오티드를 포함하는 키트를 들 수가 있다.
이들의 진단키트를 사용하는 것에 의해, RA진단 또는 그 발증가능성의 판정을 고정밀도로 실시할 수가 있다.
본 발명의 진단키트는 예를 들면, 위치 3664의 변이에 대한 RFLP분석을 위한 키트의 경우에는, 배열번호 2 및 3의 염기배열로 이루어지는 프라이머세트, 제한효소 Hinf-Ⅰ, DNA합성효소등에 의해 구성할 수가 있다. 또, 변이의 검출에 지장이 없는 적당한 완충액 및 세정액 등이 포함되어 있어도 좋다
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하고 구체적으로 설명하는 바, 본 발명은 이하의 예로 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
유전자변이의 특정
RA환자 2명, 건강한 사람 1명을 가계(家系)로 한 30가계 90명을 대상으로 하였다. 말초혈로부터 게놈DNA를 추출하여, Dbl유전자 cDNA의 223bp결손영역에 대응하는 엑손23, 24의 근방 약 5.3kbp의 영역을 PCR법에 의해 증폭후, 기존 공보의 게놈배열(Acc. No. AL033403.1)에 의거하여 설계한 시퀀스프라이머(도 1)를 사용한 Dye Terminater법에 의해 염기배열을 결정하였다. 통계처리로서 백분율에 의한 X2검정에 의해 유의차 검정을 실시하였다. PCR에 사용한 각 프라이머세트의 염기배열은다음과 같다.
F5/RE1 : 5'-taacagaacgggataagt-3'(배열번호 4)
5'-ccaagtgggtagatttccaa-3'(베열번호 5)
FE1/RE2 : 5'-caaaagctcacttagtt-3'(배열번호 6)
5'-ggcttactcctaatggc-3'(배열번호 7)
FE2/S5 : 5'-cttctcaccttgtggtaaat-3'(배열번호 8)
5'-catttgggaaacggtaaagt-3'(배열번호 9)
S6AS/S2 : 5'-gtggcgcatgcctgtaat'-3'(배열번호 10)
5'-gcaaggtcaacctacatt-3'(배열번호 11)
S3AS/R1 : 5'-tggtatataggttacatctattgata-3'(배열번호 12)
5'-gctacttgccatttgac-3'(배열번호 13)
그 결과, 인트론영역에 15개소의 SNPs를 확인하였다. 각각의 빈도를 표 1에 나타낸다. X2검정을 실시한 결과, nt2632 +106(t→g), nt2632 +211(a→c), 및 nt2745 +576(g→a)의 3개소에 대하여 RA환자와 건강한 사람과의 사이에서 빈도에 의미있는 차이를 확인하였다(p<0.05). 또한, 예를 들면, nt2632 +106(t→g)라는 표기는 cDNA센스고리의 2632번째의 염기에 대응하는 게놈염기(엑손의 최종염기)로부터 106번째의 인트론염기t가 g로 변이하고 있는 것을 나타내며, 배열번호 1에서는 위치 3769의 a→c변이에 상당한다. 동일하게 nt2632 +211(a→c)는 배열번호 1의 위치 3664의 t→g변이, nt2745 +576(g→a)는 배열번호 1의 위치 1987의 c→t변이에각각 상당한다.
nt2522 +136(A→G) nt2522 +235(A→G) nt2522 +394(C→T) nt2522 +556(A→G) nt2522 +764(G→A)
RA환자 변이보유자수 14 15 1 15 15
n 33 43 42 46 45
빈도(%) 42.42 34.88 2.38 32.61 33.33
건강한 사람 변이보유자수 5 5 0 4 4
n 15 18 19 18 18
빈도(%) 33.33 27.78 0 22.22 22.22
nt2632 +106(T→G) nt2632 +191(T→A) nt2632 +211(A→C) nt2745 +375(A→G) nt2745 +576(G→A)
RA환자 변이보유자수 19 0 19 0 20
n 45 32 39 54 54
빈도(%) 42.32 0 48.72 0 37.04
건강한 사람 변이보유자수 4 1 2 0 6
n 17 12 14 24 24
빈도(%) 23.53 8.33 14.29 0 25
nt2745 +655(A→G) nt2745 +1368(T→C) nt2745 +1435(T→C) nt2745 +1527(C→T) nt2745 +1921(A→G)
RA환자 변이보유자수 2 14 10 14 13
n 54 31 28 32 46
빈도(%) 3.7 45.16 35.71 43.75 28.26
건강한 사람 변이보유자수 1 4 2 4 4
n 26 10 8 11 23
빈도(%) 3.85 40 25 36.36 17.39
(실시예 2)
배열번호1에 있어서의 위치 3664의 t→g변이의 RFLP분석
기존공보의 배열에 따라서 합성한 DNA프라이머 :
DblF15 : 5'-ttggaaatctacccacttgg-3'(배열번호 2)
DblR11 : 5'-aaaccaacggtaagtgaaatg-3'(배열번호 3)에 의해서 다음과 같은 반응조성 및 조건으로 PCR법에 의해 371bp의 게놈DNA을 단리하였다.
게놈DNA1㎕
PCR Bufferll(아프라이드바이오시스템즈사 제품)2.5
25mM MgCl21.5
2mM dNPT2.5
10pmol/㎕ 센스프라이머0.5
10pmol/㎕안티센스프라이머0.5
Gold Taq폴리메라아제0.25
멸균수16.25
반응조건 : (95℃/12분) x 1
(94℃/30초, 50℃/30초, 72℃/1분) x 30
얻어진 DNA증폭반응액을 이하의 반응조성에 의해 제한효소 Hinf-Ⅰ(New England biolab사, 인식배열 5'-G↓ ANTC-3')에 의해 37℃에서 1시간 반응시켜서 완전히 소화하고, 통상의 방법에 의해 2.0%아가로스전기영동 및 에티듐브로마이드염색에 의해 분석하였다.
PCR반응액10㎕
Hinf Ⅰ 2㎕
반응완충액(NE Bufferll)1.5㎕
멸균수1.5㎕
결과는 도 2에 도시한 바와 같다. 제2레인은 정상 Dbl유전자를 주형(鑄型)으로 하여 얻어진 PCR산물의 Hinf-Ⅰ처리후의 전기영동상이며, 위치 3664(nt2632 +211)주변의 Hinf-Ⅰ인식배열(5'-gaatc-3')에 의해 절단되어 227bp와 144bp로 분할된다. 제1레인은 변이형 Dbl유전자유래의 PCR산물의 전기영동상이며, 위치 3664의 t→g변이(nt2632 + 211의 a→c변이)에 의해 Hinf-Ⅰ인식배열이 소실하기 때문에, 분할되는 일이 없다. 또한 제3레인은 헤테로변이형 Dbl유전자유래의 PCR산물의 전기영동상이다. Hinf-Ⅰ인식배열을 갖는 단편과 인식배열을 갖지 않는 단편이 증폭되기 때문에, 분할되지 않는 377bp단편과, 그것이 227bp 및 144bp로 분할된 2단편의 합계 3단편이 동시에 검출되었다.
본출원 발명은 인간만성관절류머티즘에 관련한 변이를 갖는 게놈DNA와, 이 변이를 이용한 인간만성관절류머티즘의 진단방법, 그 발증가능성의 판정방법 및 이들의 검출용 진단키트에 관한 것이다. 이들 발명은, 만성관절류머티즘의 발병 또는 그 발증가능성을 고정밀도로 간편하고 확실하게 실시할 수가 있어서 유용하다. 또한 본 발명은 만성관절류머티즘의 새로운 예방·치료법 및 치료약제의 개발에도 유용하다.

Claims (3)

  1. 배열번호 1의 염기배열로 이루어지는 게놈DNA에 있어서, 하기의 변이,
    (1) 위치 1987의 염기가 시토신(c)으로부터 티민(t)으로 치환,
    (2) 위치 3664의 염기가 티민(t)으로부터 구아닌(g)으로의 치환, 및
    (3) 위치 3769의 염기가 아데닌(a)으로부터 시토신(C)으로의 치환
    의 1이상을 갖는 것을 특징으로 하는 만성관절류머티즘에 관여하는 게놈DNA.
  2. 제1항에 기재된 게놈DNA를 검출하는 것을 특징으로 하는 만성관절류머티즘의 진단방법 또는 그 발증가능성의 판정방법.
  3. 제1항에 기재된 게놈DNA의 변이를 검출하는 방법을 이용한 만성관절류머티즘의 진단 또는 그 발증가능성의 판정키트.
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