KR20010012591A - 만성관절 류우머티스의 질환유전자, 만성관절류우머티스의 진단방법 및 만성관절 류우머티스원인인자의 결정방법 - Google Patents

만성관절 류우머티스의 질환유전자, 만성관절류우머티스의 진단방법 및 만성관절 류우머티스원인인자의 결정방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 마이크로세터라이트 마커 D1S214, D1S253, D8S556, DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 하이브리다이즈하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자와, 상기 적어도 하나를 프라이머로 하여 피험자의 게놈 DNA를 PCR 증폭하고, 이들 PCR 산물을 대상 건강한 자의 동일 PCR 산물과 비교하는 것을 특징으로 하는 만성관절 류우머티스의 진단방법 및 만성관절 류우머티스의 원인인자의 결정방법을 제공한다.

Description

만성관절 류우머티스의 질환유전자, 만성관절 류우머티스의 진단방법 및 만성관절 류우머티스 원인인자의 결정방법{A Gene Causative of Rheumatoid Arthritis, Method for Diagnosing Rheumatoid Arthritis, and Method for Identifying Causative Factors of Rheumatoid Arthritis}
만성관절 류우머티스의 원인인 관절염과 관절파괴의 양상, 특히 이들의 병리과정은 각종 연구를 통하여 점진적으로 명확하게 밝혀져 왔지만, 만성관절 류우머티스를 포함하는 많은 자가면역질환은 다수의 원인인자가 중합되어 질환으로 발전·증악되기 때문에 이들 질환의 정확한 해명과 적절한 치료를 위해 다양한 인자 상호작용의 본체 그 자체가 규명되어져야 한다.
만성관절 류우머티스는 세계적으로 이환율 1% 이하의 질환이지만(N. Engl. J. Med. 322: 1277-1289, 1990), 질환의 동포(同胞)에는 약 8% 이상의 증상이 발현된다(Cell 85: 311-318, 1996)는 것으로부터 그 원인인자의 하나로 어떤 유전적 요인이 작용한다고 예상된다. 그렇지만, 질환의 유전적 인자를 특정하기 위해 통상 사용되고 있는 분자유전학적 수법과 유전자 공학적 수법은 자가면역질환에 대하여는 유효하게 기능하지 못한다. 무엇때문인가, 자가면역질환은 암과 같은 돌연변이를 일으키는 하나의 유전자의 이상증식이라는 생물학적으로 단순한 기구에 의해 병발하는 것은 아니기 때문이다. 또한, 질환의 유전적 기반을 구하는 종래의 고전적 유전학의 수법은 자가면역질환이 다인자 유전에 의한 것을 명확히 한 것이지만, 그 내부 혹은 본체에 진입한 것은 될 수 없었다. 이렇게, 만성관절 류우머티스에 관련하는 유전자에 대해서는 그 실체는 원래 염색체 위의 유전자 좌위(座位)조차도 완전히 탐지되지 않은 것이 실상이었다.
한편, 다형성 마커를 이용한 연쇄해석법 및 포지셔널크로닝(positional cloning)은 근년에 유전성 질환의 연구에 혁명적 진보를 가져왔다. 이들 방법을 이용함에 의해 종래는 손을 쓸 수 없었던 질환 유전자의 염색체 국재(局在)가 명확해졌을 뿐만아니라, 다수의 질환에 대하여 원인유전자가 단리·해석되고 있다(실험의학 vol.12 No.6: 80∼85, 1994). 또, 최근에는 다형성 마커로써 마이크로세터라이트 마커(Micro satellite marker)(Nature, 359: 794∼801, 1992; Nature Genet., 7: 246∼339)를 이용한 연쇄해석과 고전적 유전학의 수법인 환자 가계의 해석을 조합한 동포대(同胞對)해석법에 의해 I형 당뇨병의 원인유전자가 단리되어(Nature, 171: 130∼136, 1994) 자가면역질환을 비롯하여 난치병에 대해서도 원인유전자의 특정이 가능한 것이 시준되고 있다.
본 출원은 이상의 사정을 감안하여 최신의 연구동향을 밟아서 된 것이고, 사람 염색체 위의 그 존재위치를 새로이 특정한 만성관절 류우머티스의 질환유전자 및 이들 유전자의 변이를 지표로 하는 만성관절 류우머티스의 진단방법 및 원인인자의 결정방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 출원의 발명은 만성관절 류우머티스 질환유전자 및 이들 유전자의 변이를 지표로 하는 만성관절 류우머티스의 진단방법 및 원인인자의 결정방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명 유전자 좌위의 특정에 사용한 마이크로세터라이트 마커의 제1∼제5 염색체 지도이다.
도 2는 본 발명 유전자 좌위의 특정에 사용한 마이크로세터라이트 마커의 제6∼제15 염색체 지도이다.
도 3은 본 발명 유전자 좌위의 특정에 사용한 마이크로세터라이트 마커의 제16∼제22 염색체 지도 및 성염색체 지도이다.
도 4는 PCR 산물의 겔 전기영동의 일례이다.
도 5는 PCR 산물의 제노타이퍼(Genotyper)에 의한 해석의 일례이다.
도 6은 해석한 마이크로세터라이트 마커에 대한 MLS 값을 염색체 1∼6에 플롯트한 결과이다.
도 7은 해석한 마이크로세터라이트 마커에 대한 MLS 값을 염색체 7∼12에 플롯트한 결과이다.
도 8은 도 6은 해석한 마이크로세터라이트 마커에 대한 MLS 값을 염색체 13∼18에 플롯트한 결과이다.
도 9는 해석한 마이크로세터라이트 마커에 대한 MLS 값을 염색체 19∼X에 플롯트한 결과이다.
도 10은 본 발명의 질환유전자를 지시하는 마커부위를 함유한 복수의 마커부위에 대하여 제1 염색체(상단), 제8 염색체(중단) 및 X염색체(하단)것에 각 마이크로세터라이트 마커의 MLS 값과 목표유전자의 유전적 거리(단위: ㎝모간)의 관계를 나타낸 그래프도이다.
본 출원은 상기 과제를 해결하는 발명으로써 이하의 각 유전자를 제공한다.
(1)사람 제1 염색체의 마이크로세터라이트 마커 D1S214 및/또는 D1S253이 하이브리다이즈(Hybridize)하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자.
(2)사람 제8 염색체의 마이크로세터라이트 마커 D8S556이 하이브리다이즈하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자.
(3)사람 X염색체의 마이크로세터라이트 마커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 하이브리다이즈하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자.
또한, 본 출원은 마이크로세터라이트 마커 D1S214, D1S253, D8S556, DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232의 적어도 하나를 프라이머로 하여 피험자의 게놈 DNA를 PCR 증폭하고, 이들 PCR 산물을 대상 건강한 자의 동일 PCR 산물과 비교하는 것을 특징으로 하는 만성관절 류우머티스의 진단방법을 제공한다.
게다가, 본 출원은 마이크로세터라이트 마커 D1S214, D1S253, D8S556, DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232의 적어도 하나를 프라이머로 하여 피험자의 게놈 DNA를 PCR 증폭하고, 이들 PCR 산물을 대상 건강한 자의 동일 PCR 산물과 비교하는 것을 특징으로 하는 만성관절 류우머티스의 원인인자의 결정방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 유전자에 대하여 그 특정방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 유전자는 마이크로세터라이트 마커를 이용한 연쇄해석을 만성 류우머티스 환자 및 그 혈연자에 대하여 실시함에 의해 염색체 좌위를 특정한 복수의 유전자이다. 즉, 본 발명자는 사람 염색체의 전장에 걸쳐 마이크로세터라이트 마커 유전자의 DNA 위의 다형성(CA의 반복배열에 의한 길이의 다형)을 이용하여 만성관절 류우머티스의 질환감수성에 관계하는 전유전자 좌위를 결정했다. 구체적인 방법은 아래와 같다.
(1)게놈 DNA의 추출
미국 류우머티스학회의 진단기준에 합치하고, 관절파괴의 정도가 스테이지 2 이상인 만성관절 류우머티스 환자(A), 다른 류우머티스 환자(B)와 그 건강한 동포(C)를 일조로 하고, 합계 35조를 대상으로 하여 해석했다. 각 사람에서 EDTA를 사용하여 미쇄혈(10㎖)을 채혈하고, 이를 20㎖의 버퍼-Ⅰ[0.32M sucrose, 5% v/v Triton X-100, 5mM MgCl2, 12mM Tris HCl(pH 7.6)]와 완만하게 혼합하여 세포막을 용해했다. 원심분리하던 중, 침전한 핵을 버퍼-Ⅱ[4M guanidine thiocyanate, 12mM EDTA, 375mM NaCl, 0.5% sodium N-lauroyl sarcosinate, 0.1M β-mercaptoethanol, 12mM Tris HCl(pH 7.6)]와 반응시켜 핵막을 용해하고, 이어서, 에탄올 침전에 의해 DNA를 추출했다.
(2)마이크로세터라이트 DNA의 PCR 증폭과 사이징(sizing)
추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 도 1에서 도 3에 도시한 염색체 좌위에 대응하는 마이크로세터라이트 마커 유전자를 형광표지 프라이머(퍼킨엘머社製)를 이용하여 PCR 증폭했다. 더구나, 마커 D1S502는 DNA 증폭이 기술적으로 곤란하므로 사용하지 않았다. 또한, HLA-D 영역을 상세히 분석하기 위해 D6D276 대신에 D6S299, D6S265, D6S273의 각 유전자를 증폭했다. 또한, 이상의 마이크로세터라이트 DNA의 증폭에 더하여 HLA-DRB1 영역 근방의 유전자에 대해서도 제한효소단편장 다형(RFLP)마커를 사용하여 PCR 증폭하고, 합계 359 마커부위에 대하여 검색했다.
게다가, 마이크로세터라이트 DNA의 증폭에서 PCR 반응용액(15㎕)의 조성은 DNA(30ng); 프라이머 혼합몰(0.2μM); dNTP(각 0.2mM); DNA폴리머라아제(1unit); MgCl2(2.5mM); 1×PCR 버퍼-Ⅱ이고, 증폭반응의 조건은 94℃에서 10분간, 변성(94℃, 30초간); 어닐링(55℃, 1분간); 신장(72℃, 2분간)을 27싸이클, 최후로 72℃에서 5분간으로 했다.
6-FAM, TET 또는 HEX로 표지한 각 PCR 산물은 TAMURA 표지된 사이즈 스탠다드와 함께 1판넬(panel)의 겔(4% acrylamide/6M ruea) 위에서 DNA 씨퀀서(ABI 377 : 어플라이드바이오시스템社製) 안에서 전기영동했다. 도 4는 이 전기영동의 일례이지만, 본 방법에서는 화상으로서 패턴인식된 사이즈 스탠다드를 참조하여 DNA 단편의 피크, 크기, 영역을 분석하기 때문에 전기영동에 의한 오차를 극히 낮게 할 수 있었다. 그후, 컴퓨터에 집어넣어 형광화상의 위치에서 각각의 마커 유전자의 사이징을 하고, 가계마다 친유래(親由來)의 유전자가 어떻게 전파했는가를 결정했다. 더구나, 전기영동의 결과는 진스캐닝(Gene scanning)의 해석을 통하여 제노타이퍼해석 소프트로 사이징되었다. 도 5는 이 제노타이퍼에 의한 해석결과의 일례이다.
(3)연쇄해석
마이크로세터라이트 마커에 의한 연쇄해석을 사용한 동포대해석법은 I형 당뇨병의 원인유전자의 동정에서 이미 공지이지만(Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 8560∼8565, 1995), 만성관절 류우머티스를 대상으로 하는 경우에는, 이 방법을 그대로 사용할 수는 없다. 왜냐하면, 통상의 동포대해석법은 환자와 그 양친사이에서 동조유전자(IBD : identical by decent)의 유전양식을 결정하지만, 노년성 질환인 만성관절 류우머티스의 경우 환자는 그 발병시에 이미 양친이 사망하고 있는 것이 대부분이고, IBD값을 일의적으로 결정하는 것이 불가능하기 때문이다.
그래서, 본 발명에서는 IBD값을 구함에 있어서, 환자(A), 환자(B), 건강한 동포(C) 3명의 조합을 1조로 하고, 35조에 대하여 해석을 했다. 즉, IBD값은 본래친이 보유하는 유전자 a가 양 이환 동포(兩罹患同胞)에 분여(分與)된 경우에 1로 되고, 이환 동포(罹患同胞)가 각각의 대립 유전자를 공유하고, 혹은 그 각각이 부모의 한편쪽에서 분여된 경우에는 IBD=2로 된다. 양친이 이미 사망하여 부모의 유전자가 타이핑할 수 없는 때는 IBD는 일의적으로 결정할 수는 없다. 그렇지만, 해석의 대상으로 하는 인종집단에서 인의의 유전자 마커의 분포가 결정되면 이 유전자의 알로타잎(allotype) 빈도를 사용하여 IBD값을 결정할 수 있다. 즉, 환자(A), 환자(B), 건강한 동포(C) 3명사이의 외모상의 IBD의 일치를
(A-B간의 IBD값, A-C간의 IBD값, B-C간의 IBD값)
로 하고, 임의의 유전자에 착안하여 이를 a로 하고, 기타를로 한 때 얻을 가능성은 표 1에 나타낸 바와 같이 27로 된다.
표 1
케이스 1 : (ａａ,ａａ,ａａ), (ａ,ａ,ａ), ( , , )
케이스 2 : (ａａ,ａａ, ), ( , ,ａａ)
케이스 3 : (ａａ, ,ａａ), ( ,ａａ,ａａ), (ａａ, , ), ( ,ａａ, )
케이스 4 : (ａａ,ａａ,ａ), (ａ,ａ,ａａ), (ａ,ａ, ), ( , ,ａ)
케이스 5 : (ａａ,ａ,ａａ), (ａ,ａａ,ａａ), (ａａ,ａ,ａ), (ａ,ａａ,ａ), (ａ, ,ａ), ( ,ａ,ａ), (ａ, , ), ( , , )
케이스 6 : (ａａ, , ａ), ( , ａａ, ａ)
케이스 7 : (ａａ, ａ, ), (ａ, ａａ, ), (ａ, , ａａ), ( , ａ, ａａ)
유전자 a의 알로타잎 빈도를 Pa로 하여 홀멘 앤드 클레이톤(Holmans ＆ Clayton ;Am. J. Hum. Genet. 57 : 1221∼1232, 1995)의 식 1에 의해 로드값(Lod값; L값)이 구해졌다.
식 1 :
예를들어, 표 1의 케이스 1의 3과 같이 L값을 각각 L11, L12, L13로 하여 산출하면 이들 값은 각각 식 2, 식 3 및 식 4로 구해진다.
식 2 : L11= Pa4z0+ 1/2Pa3(1+Pa)z1+ 1/4Pa3(1+Pa)2z2
식 3 : L13= Pa4z0+ 1/2Pa8(1+Pa)z1+ 1/4Pa2(1+Pa)3z2
식 4 : L13= 3Pa3Pa2z0+ 1/2PaPa(1+2PaPa)Z1+ PaPa(1+1/2PaPa)z3
동일하게 하여 L11에서 L72까지의 L값이 산출된다. 게다가, 모든 피험자에 대하여 동일하게 계산함에 의해 모집단에서 유전자 a의 L값이 식 5에 의해 구해진다.
식 5 :
이어서, 이 L값은 변수 Z0, Z1, Z2를 Z0≤1/2, Z0≤1/2Z1, Z0+Z1+Z2=1의 조건하에서 전체범위를 변동시켜 최대 L값(Lmax)을 구한다. 한편, 마커와 실제 유전자의 관련이 없는 경우의 L값(Lnull)은 Z0=0.25, Z1=0.50, Z2=0.25로 고정하고 다음 식 6에서 얻어진다.
식 6 :
최종적으로 최대 로드값(Maximal Load Score : MLS)이 식 7로써 구해진다.
식 7 :
도 6에서 도 9는 해석한 전 359개의 마이크로세터라이트 마커에서의 MLS값을 염색체마다 플롯트한 결과이다. 여기서, 1개는 MLS값이 3.0 전후를 나타낸 마커부위를 원인유전자와도 대응관계가 유의하다고 보여질 수 있다. 즉, MLS값은 마커와 원인유전자의 대응관계가 우연히 일어날 수 있는 경우와 비교한 확률이고, 대수값 log10으로 표시되고 있으므로 MLS=3.0의 경우에는 우연히 대응관계가 생기는 것보다도 1000배 높은 확률로 대응관계가 존재한다고 볼 수 있다. 즉, 마이크로세터라이트 마커 D1S214, D1S253, D8S556 및 DXS1232는 MLS값이 3.0 전후로 극히 높고, 원인유전자의 아주 가까운 위치를 지시함이 이해되었다.
또, 도 10은 상기 4개의 마커부위를 포함한 복수의 마커부위에 대하여, 제1 염색체(상단), 제8 염색체(중단) 및 X염색체(하단)의 것에 각 마이크로세터라이트 마커의 MLS 값과 질환유전자의 유전적 거리(단위: ㎝모간)의 관계를 나타낸 그래프도이다. 이 도 10에 도시한 바와 같이, 사람 제1 염색체에 대해서는 마이크로세터라이트 마커 D1S214 및/또는 D1S253의 마크부위의 아주 가까운 위치에 목표로 되는 만성관절 류우머티스의 질환유전자가 존재하는 것이 이해된다. 동일하게, 사람 제8 염색체에 있어서는 마이크로세터라이트 마커 D8S556의 마크부위, X염색체에 있어서는 마이크로세터라이트 마커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232의 마크부위의 아주 가까운 위치에 질환유전자가 존재하는 것이 이해된다.
본 발명의 만성관절 류우머티스 질환유전자는 이상과 같은 특정의 염색체 좌위에 존재하는 유전자(상기한 마이크로세터라이트 마커의 8 마크부위 ±1㎝모간 이내의 적어도 1개소 이상에 존재하는 유전자)이고, 예컨대, 포지셔널크로닝등의 공지의 방법에 의해 그 코드영역을 특정하고, 더욱이나 염기배열을 결정함에 의해 유효한 치료법의 확립에 크게 공헌할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 사용된 마이크로세터라이트 유전자의 PCR 증폭과 그 해석은 만성관절 류우머티스의 진단 및 원인인자의 결정에도 응용할 수 있다. 즉, 이환의 가능성이 있는 피험자의 게놈 DNA를 상기 염색체 좌위에 대응하는 마커를 프라이머로 하여 PCR 증폭하고, 도 5에 도시한 바와 같은 제노타이퍼에 의해 해석함에 의해 건강자의 그것과 비교하는 것에 의해 이후의 발병을 높은 정밀도로 판정할 수 있다.
본 발명에 의해 사람 만성관절 류우머티스의 질환유전자와 이들의 질환유전자의 변이를 지표로 하는 만성관절 류우머티스의 진단방법 및 원인인자의 결정방법이 제공된다. 이들의 발명은 의약품 개발 및 의료기술의 개발등에 이용가능하다.

Claims (5)

  1. 사람 제1 염색체의 마이크로세터라이트 마커 D1S214 및/또는 D1S253이 하이브리다이즈하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자.
  2. 사람 제8 염색체의 마이크로세터라이트 마커 D8S556이 하이브리다이즈하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자.
  3. 사람 X염색체의 마이크로세터라이트 마커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 하이브리다이즈하는 DNA 배열에서 ±1㎝모간 이내에 위치하는 만성관절 류우머티스의 질환유전자.
  4. 마이크로세터라이트 마커 D1S214, D1S253, D8S556, DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및 DXS1232의 적어도 하나를 프라이머로 하여 피험자의 게놈 DNA를 PCR 증폭하고, 이들 PCR 산물을 대상 건강한 자의 동일 PCR 산물과 비교하는 것을 특징으로 하는 만성관절 류우머티스의 진단방법.
  5. 마이크로세터라이트 마커 D1S214, D1S253, D8S556, DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및 DXS1232의 적어도 하나를 프라이머로 하여 피험자의 게놈 DNA를 PCR 증폭하고, 이들 PCR 산물을 대상 건강한 자의 동일 PCR 산물과 비교하는 것을 특징으로 하는 만성관절 류우머티스의 원인인자의 결정방법.
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