JP4317376B2 - 糖尿病性腎症遺伝子の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病性腎症遺伝子の検出方法に関する。さらに詳しくは、糖尿病性腎症に対する罹病性を与える糖尿病性腎症遺伝子の検出方法、該検出方法に用いるためのキット、及び糖尿病患者における腎症の発症の予防又は該腎症の治療の薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病性腎症は、西洋諸国及び日本における末期腎不全の主な原因である（非特許文献１−３）。前記糖尿病性腎症は、虚血性心臓疾患、脳卒中等の動脈硬化症等の疾患を引き起こし、糖尿病患者における平均余命の低下をもたらす。
【０００３】
糖尿病性腎症の病因は、多要因的であると考えられており、いくつかのカスケードが、糖尿病性腎症の発生及び進行に寄与するのであろうと考えられているが、正確な機構等について、不明な点が多いのが現状である。
【０００４】
【非特許文献１】
アクマール（Ａｋｍａｌ Ｍ）、Ａｍ．Ｊ．ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．、３８、Ｓｕｐｐｌ．１、２００１
【非特許文献２】
「米国腎臓データシステム２００１年報データレポート：米国における末期腎臓病のアトラス」“Ｅｘｃｅｒｐｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ ２００１ Ａｎｎｕａｌ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ：Ａｔｌａｓ ｏｆ ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．” Ａｍ．Ｊ．ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．、３８、Ｓｕｐｐｌ．３、２００１
【非特許文献３】
「患者登録委員会 日本透析医学会：日本における長期透析療法の現状」 “Ｐａｔｉｅｎｔ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｊｐｎ Ｓｏｃ ＤｉａｌＴｈｅｒ ３５（７）: １１５５−１１８４，２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定すること、迅速に判定すること、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出すること、迅速に検出すること等を可能にする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定すること、迅速に判定すること、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出すること、迅速に検出すること等を可能にする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、糖尿病患者において、糖尿病性腎症を併発する可能性を低減させること等を可能にする、糖尿病患者、特に網膜症を伴う糖尿病患者の腎症の発症の予防又は該腎症の治療のための薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕 ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子を指標として用いることを特徴とする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法であって、糖尿病患者の核酸試料について、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基を同定するステップを含み、
（Ｉ’ ）該＋７８位に対応する塩基が、Ｇである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ＩＩ’ ）該＋７８位に対応する塩基が、Ａである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる、
糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法、
〔２〕 ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子の発現産物を指標として用いることを特徴とする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法であって、糖尿病患者のタンパク質試料について、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位に対応するアミノ酸残基を同定するステップを含み、
（ｉ）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ｉｉ）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる、
糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法、
〔３〕下記核酸：
（１’）ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖
を含有してなる、前記〔１〕記載の検出方法を行なうための、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット、並びに
〔４〕下記核酸：
（１’）ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖
が固定化された核酸アレイを含有してなる、前記〔１〕記載の検出方法を行なうための、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット、
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法は、ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子〔ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１〕又はその発現産物を指標として用いることに１つの大きな特徴がある。
【０００８】
本明細書において、「罹病性決定要因」は、易罹病性の決定要因と、難罹病性の決定要因とに大別される。前記「易罹病性の決定要因」としては、（１）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖；（１’）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。
【０００９】
また、前記「難罹病性の決定要因」としては、（２）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖；（２’）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。
【００１０】
本発明の検出方法においては、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子又はその発現産物における特定の変異の有無を指標として用いるため、糖尿病患者の被験試料中における糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因を容易に、迅速に検出することができ、糖尿病患者の糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を容易に、迅速に検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００１１】
前記ＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子は、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ- 共輸送体をコードする遺伝子である。前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子は、低カリウム血症、代謝性アルカローシス等の病態が見られるＧｉｔｅｌｍａｎ症候群の一部の患者において、第２３エキソンの＋７８位の塩基が、Ｇ（グアニン）からＡ（アデニン）に変異していることが知られている遺伝子である〔レミンク（Ｌｅｍｍｉｎｋ ＨＨ）ら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、５４、７２０−７３０、１９９８〕。また、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子に対するノックアウトマウスにおいても、Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群と類似の症状が観察されている〔シュルセシス（Ｓｃｈｕｌｔｈｅｓｉｓ ＰＪ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２９１５０−２９１５５、１９９８〕。
【００１２】
一方、本発明は、糖尿病患者においては、予想外にも、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物の９１３位が、アルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異している場合、例えば、第２３エキソンの＋７８位の塩基が、ＧからＡに変異している場合、糖尿病性腎症に対して、難罹病性を示し、一方、該９１３位が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、例えば、第２３エキソンの＋７８位の塩基が、Ｇである場合、糖尿病性腎症に対して易罹病性を示すという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１３】
本発明の検出方法は、具体的には、
▲１▼ ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを同定すること、又は
▲２▼ ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子発現産物中の９１３位のアミノ酸残基を同定することにより行なわれうる。
【００１４】
本発明の検出方法に用いられる試料としては、具体的には、糖尿病患者の試料、好ましくは、網膜症を伴う糖尿病患者の試料が挙げられる。前記試料としては、より具体的には、核酸を含有する試料（「核酸試料」という）、タンパク質を含有する試料（「タンパク質試料」という）が挙げられる。前記試料は、糖尿病患者の生検試料、例えば、血液、皮膚、粘膜、爪、腎臓等が挙げられる。前記核酸試料又はタンパク質試料は、慣用の方法で前記生検試料を処理することにより得られる。前記核酸試料は、例えば、
− 末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血清を除去し、
− 得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で２０分間インキュベートし、
− 得られた混合物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去し、
− 得られた沈殿に、プロテイナーゼＫを添加氏、３７℃４時間以上処理し、
− 得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、
− 得られた上層に、イソプロパノールを添加して、ＤＮＡの沈殿を生じさせ、
− 遠心分離により、ＤＮＡを回収し、７０％ エタノールで処理し、
− 得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）〕に溶解する
ことにより得られうる。
【００１５】
また、前記タンパク質試料は、例えば、
− 腎組織又は腎培養細胞をホモゲナイゼーション緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、８０ｍＭ シュークロース、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍｇ／ｌ ロイペプチン、５ｍｇ／ｌ ペプスタチン）中でホモゲナイズし、
− 得られた産物について、３０００×gで１０分間の遠心分離を２回行ない、
− 得られた上清について、さらに１４０００×ｇで３０分間遠心分離する
ことにより、沈澱として得られうる。なお、タンパク質試料の調製の際の操作は、４℃で行なわれうる。
【００１６】
前記▲１▼の検出方法としては、具体的には、糖尿病患者の核酸試料について、
ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを同定するステップを含む方法が挙げられる。前記ステップは、例えば、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列における該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを含む領域を検出又は配列解析することにより行なわれうる。
【００１７】
前記コドンを含む領域の検出には、例えば、インベーダー法、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅＡミスマッチ切断法、ヘテロデュプレックス法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、タックマン法、ダイレクトシークエンス法、ローリングサークル増幅法等が行なわれうる。なかでも、操作の迅速性、操作に要するコストの低減、ハイスループットでの実施等の観点から、好ましくは、インベーダー法が望ましい。
【００１８】
前記インベーダー法は、鋳型ＤＮＡとアレルプローブ（３’側にＳＮＰ部位からはじまる鋳型と相補的な配列と、５’側に鋳型と無関係なフラップ配列を有するオリゴヌクレオチド）と、インベーダープローブ（５’側にＳＮＰ部位直前まで、鋳型と相補的な配列を有し、ＳＮＰ位置の任意の塩基で終わるオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションを行なう方法である。ここで、前記インベーダー法においては、
− ＳＮＰ部位では、相補的にアニーリングした二本鎖中にインベーダープローブの３’末端塩基が侵入した構造が形成され、
− エンドヌクレアーゼ（ｃｌｅｖａｓｅ）が前記構造を認識してフラップを切断し、
− 前記フラップと、該フラップに相補的にアニーリングして第２のｃｌｅｖａｓｅ認識部位を生じるように設計されたＦＲＥＴプローブとがアニーリングし、
− ｃｌｅｖａｓｅにより切断され、生じた蛍光標識ＦＲＥＴプローブの断片量を蛍光に基づき測定する
ことにより遺伝子型を判定される。
【００１９】
また、電気泳動時における移動度の違いを指標として一塩基置換を検出する場合（例えば、前記一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法等）、例えば、（１） ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖
との移動度の違いを指標とすればよい。
【００２０】
なお、本明細書において、「核酸の相補鎖」とは、例えば、センス鎖に対するアンチセンス鎖であることを意味し、実質的に完全な相補を意味する。
【００２１】
前記▲１▼の検出方法においては、
（Ｉ）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（II) 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである場合、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる。
【００２２】
前記▲１▼の検出方法としては、より具体的には、糖尿病患者の核酸試料について、ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基を同定するステップを含み、
（Ｉ' ）該＋７８位に対応する塩基が、Ｇである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（II' ）該＋７８位に対応する塩基が、Ａである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる
方法が挙げられる。
【００２３】
前記▲１▼の検出方法において、配列解析を行なう場合、例えば、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列における該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを含む領域について、慣用のＰＣＲ等によりダイレクトシークエンスすること等により行なわれうる。
【００２４】
なお、前記▲１▼の検出方法において、用いられるプローブ又はプライマーは、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１）の塩基配列に基づき、前記コドンを含む領域の検出に適したプローブ又は該領域の増幅に適したプライマーとしてデザインすればよい。なお、プローブ又はプライマーの特異性を向上させる観点から、前記プローブ又はプライマーは、好ましくは、反復配列等の非特異的検出又は非特異的増幅をもたらしうる配列を含まない配列であることが望ましい。また、前記プローブ又はプライマーは、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子に特徴的な部分配列からなる核酸であることが望ましい。なお、本明細書において、「ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子に特徴的な部分配列」とは、例えば、データベースに登録された配列のうち、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子を除く塩基配列には、見出されない部分配列をいい、例えば、データベースに登録された配列との配列同一性が、２０％以下、好ましくは、１０％以下、より好ましくは、５％以下、特に好ましくは０％である配列をいう。
【００２５】
なお、本明細書において、前記配列同一性は、比較対象の配列を適切なアルゴリズムに基づきアライメントし、同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。前記アルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム〔Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．，２，４８２（１９８１）〕、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３（１９７０）〕、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）らの相同性検索法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４（１９８８）〕等が挙げられ、より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ＢＬＡＳＴアルゴリズム等が挙げられる。なお、本明細書においては、前記配列同一性の数値は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づき、配列を解析して算出されたものを基準としたときに上記範囲であればよく、アルゴリズムにより見かけの数値が若干異なっていてもよい。
【００２６】
前記プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、具体的には、１５ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、２０ヌクレオチド長以上であり、５０ヌクレオチド長以下であり、好ましくは、３５ヌクレオチド長以下であることが望ましい。
【００２７】
前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、好ましくは１８ヌクレオチド長以上であることが望ましい。なお、プローブの場合、ストリンジェントな条件、好ましくは、中ストリンジェンシー、より好ましくは、高ストリンジェンシーの条件下に前記コドンを含む領域に特異的にハイブリダイズするものであればよい。
【００２８】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス刊、１９８９〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、
▲１▼ ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温するステップ、
▲２▼ 非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、を行ない、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうこと等が挙げられる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝81.5−16.6 (log10[Na+])＋0.41 (%G＋C)−(600/N)
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる値である。
【００２９】
かかるプローブ又はプライマーのデザインは、慣用のソフトウェアを用いることにより、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１に基づき行なわれうる。
【００３０】
プライマーは、例えば、Ｇ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合が、約５０％であることが望ましく、プライマー同士又は単独で２量体を形成しないようにプライマー同士又は同一プライマー内で相補的な配列がないことが望ましい。
【００３１】
本発明に用いられうるプローブ又はプライマーの具体例としては、例えば、インベーダー法に用いる場合、
アレルプローブＧ（nnnnnnnnnnnnnnngggctgagcagtaagttctgt；配列番号：１）、
アレルプローブＡ（nnnnnnnnnnnnnnnaggctgagcagtaagttctgt；配列番号：２）、
インベーダープローブ（tgacatcaaccagaaccctcn；配列番号：３）、
プライマーＦ（tccatgtgtcctccaggatcatttc；配列番号：４）及び
プライマーＲ（gatgctagatggggtctgtatgttgc；配列番号：５）
の組み合わせ
等が挙げられる。なお、前記アレルプローブＧ及びアレルプローブＡにおいて、フラップに相当するｎ（任意の塩基）が連続している部分は、例えば、ＦＡＭ・ＶＩＣの組み合わせによる独立した検出が可能なように互いに異なる配列に設計すればよい。また、いうまでもないが、ｎの個数は必ずしも例示のものに限定されるものではなく、例えば、１〜数個ｎを付加あるいは欠失させたものであってもよい。具体的には、前記アレルプローブＧ及びアレルプローブＡの組み合わせとしては、特に限定されないが、アレルプローブＧとして、配列番号：６（atgacgtggcagacgggctgagcagtaagttctgt）と、アレルプローブＡとして、配列番号：７（cgcgccgaggaggctgagcagtaagttctgt）との組み合わせ等が挙げられる。
【００３２】
また、前記▲１▼の検出方法においては、支持体に前記（１）の核酸若しくはその相補鎖、及び／又は前記（２）の核酸若しくはその相補鎖を固定化した核酸アレイを用いることもできる。具体的には、前記核酸アレイと、糖尿病患者の核酸試料由来の標識核酸試料と、任意に対照試料由来の標識された核酸とを接触させ、ハイブリダイゼーションを行なう。
【００３３】
前記核酸アレイは、例えば、前記（１）の核酸若しくはその相補鎖、及び／又は前記（２）の核酸若しくはその相補鎖に、支持体表面への固定化を容易にしうる修飾基を導入し、ついで、得られた修飾核酸を、慣用のＤＮＡアレイ作製装置を用いて、予め定められた部位に整列、固定化すればよい。前記核酸の固定化量、固定化密度は、核酸アレイによるハイブリダーゼションを行ないうる範囲で適宜選択されうる。
【００３４】
前記支持体としては、ガラス（例えば、スライドグラス）、シリコンチップ等が挙げられる。
【００３５】
前記標識物質としては、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等が挙げられる。例えば、前記蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。核酸試料の標識は、試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を標識することによって実施される。前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いた場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出されうる。
【００３６】
なお、核酸アレイを用いて、コドンの違いを検出する場合、ハイブリダイゼーションにおける条件は、好ましくは、高ストリンジェンシーであることが望ましい。かかる条件としては、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭ ２−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で４２℃で１時間インキュベートし、その後、洗浄液１（２×ＳＳＣ及び０．１％）により４２℃で５分洗浄し、洗浄液２（１×ＳＳＣ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）により４２℃で５分洗浄する条件が挙げられる。
【００３７】
前記▲２▼の検出方法としては、具体的には、糖尿病患者のタンパク質試料について、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位に対応するアミノ酸残基を同定するステップを含む方法が挙げられる。前記ステップは、例えば、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基を含む領域を検出又は配列解析することにより行なわれうる。
【００３８】
前記アミノ酸残基を含む領域の検出には、例えば、抗体を用いたイムノアッセイ、ウエスタンブロット等により行なわれうる。
【００３９】
前記抗体としては、１） 前記（１’）のポリペプチドとは反応し、前記（２’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
２） 前記（２’）のポリペプチドとは反応し、前記前記（１’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
が挙げられる。
【００４０】
前記抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｅｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、１９９２年〕に記載の方法により、（１’）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（２’）発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。前記抗体は、前記（１’）又は前記（２’）のポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、前記（１’）又は（２’）いずれかにおける９１３位を含む特定の部分断片に特異的に結合しうる抗体であってもよい。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、ビオチン、アビジン等で標識されていてもよい。なお、前記（１’）のポリペプチド又は前記（２’）のポリペプチドに対する前記抗体の特異性は、例えば、前記（１’）のポリペプチド及び前記（２’）のポリペプチドを用い、オクタロニー法、ＥＬＩＳＡ等により評価されうる。例えば、前記オクタロニー法の場合、前記１）の抗体は、前記（１’）のポリペプチドとは反応して、沈降線を示し、前記（２’）のポリペプチドとは反応せず、沈降線を示さない抗体として評価され、前記２）の抗体は、前記（２’）のポリペプチドとは反応して、沈降線を示し、前記前記（１’）のポリペプチドとは反応せず、沈降線を示さない抗体として評価されうる。
【００４１】
前記▲２▼の検出方法においては、
（ｉ）９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ii）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる。
【００４２】
また、本発明には、前記検出方法に用いられる核酸若しくはその相補鎖、又は抗体を含有したキットも含まれる。
【００４３】
前記▲１▼の検出方法を行なうためのキットとしては、具体的には、下記核酸：
（１） ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖
を含有した、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット、
が挙げられる。
【００４４】
前記（１）の核酸若しくはその相補鎖としては、より具体的には、（１’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖が挙げられる。また、前記（２）の核酸若しくはその相補鎖としては、より具体的には、（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖が挙げられる。
【００４５】
また、前記▲１▼の検出方法を行なうためのキットは、前記（１）の核酸若しくはその相補鎖、及び／又は前記（２）の核酸若しくはその相補鎖が固定化された核酸アレイを含有したキットであってもよい。
【００４６】
また、前記▲２▼の検出方法を行なうためのキットとしては、
１） 前記（１’）のポリペプチドとは反応し、前記（２’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
２） 前記（２’）のポリペプチドとは反応し、前記前記（１’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
を含有した、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キットが挙げられる。
【００４７】
本発明の検出用キットには、検出に用いられうる標識物質、発色試薬、緩衝液（例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液、抗体保存用緩衝液、核酸保存用緩衝液、洗浄用緩衝液等）、対照試料等をさらに含有してもよい。
【００４８】
また、本発明者らの知見によれば、糖尿病患者の腎症の発症の予防又は該腎症の治療のための薬剤が提供される。
【００４９】
本発明の薬剤は、糖尿病患者に投与するものであり、かつヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸を含有することに１つの特徴がある。
【００５０】
本発明の薬剤は、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸が用いられているため、糖尿病患者に投与することにより、該糖尿病患者に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を産生させることができ、糖尿病性腎症の発症の予防又は該腎症の治療を行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【００５１】
本発明の薬剤は、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸を、治療上有効量含有する。
【００５２】
ここで、「治療上有効量」は、糖尿病性腎症の発症を予防すること又は該腎症を治療することに十分な量であればよく、糖尿病患者の体重、疾患状態、年齢等に応じて適宜選択されうる。かかる「治療上有効量」は、後述の薬理評価法に基づき定められた量であってもよい。
【００５３】
本発明の薬剤の製剤形態は、投与形態に適した製剤形態であればよい。例えば、注射剤の場合、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、滅菌水等の溶液を、フィルター等で濾過滅菌し、得られた溶液に、前記核酸を溶解させることにより調製されうる。前記溶液は、好ましくは、核酸分解酵素を含有していない溶液であることが望ましい。また、本発明の薬剤は、必要に応じて慣用の担体等を含有してもよい。また、本発明の薬剤は、リポソーム製剤として、懸濁剤、凍結剤等の製剤形態であってもよい。
【００５４】
糖尿病患者への本発明の薬剤の導入法としては、本発明の薬剤を直接糖尿病患者の体内、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に導入する方法、糖尿病患者の細胞を取り出して体外で本発明の薬剤を当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す方法等が挙げられる。
【００５５】
本発明の薬剤を投与する場合、その投与形態としては、非ウイルスベクターに基づく投与形態と、ウイルスベクターに基づく投与形態とに大別される。
【００５６】
非ウイルスベクターの場合、慣用の遺伝子発現ベクターに前記核酸を組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて、リン酸−カルシウム共沈法、微小ガラス管を用いた核酸の直接注入法、パーティクルガン銃で金粒子等の担体とともに核酸分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、リポソーム、正電荷ポリマーによる導入法等を行なうことにより、細胞や組織に本発明の薬剤を投与することができる。
【００５７】
前記遺伝子発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＩ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＳＧ、ｐＣＤＮＡ，ｐＣＲ，ｐＬＰ等が挙げられる。
【００５８】
ウイルスベクターの場合、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、前記核酸を導入し、得られた組換えウイルスを細胞に感染させることによって、細胞内に核酸を導入することが可能である。
【００５９】
前記薬剤中の前記核酸の含有量は、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、有効成分の前記核酸の量として０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇであることが望ましい。かかる投与用量を数日ないし数ヶ月に１回投与することが望ましい。
【００６０】
本発明の薬剤の薬理評価は、例えば、尿中ナトリウム排泄率、尿中カリウム排泄率、クレアチニンクリアランス、尿中アルブミン排泄率、血清ナトリウム値、血清カリウム値、血清クレアチニン値、血中尿素窒素等を指標として行なわれうる。また、薬理評価として、モデル動物等を用いて、腎組織検査を行なってもよく、ヒトにおける腎生検を評価してもよい。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明を実施例などにより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例などにより限定されるものではない。
【００６２】
実施例１
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、岩手医科大学又は千葉西総合病院の外来患者向け診療所に定期的に来診する２型糖尿病患者を対象として実験を行なった。
【００６３】
なお、前記糖尿病患者について、下記診断基準：
１）腎症症例（ＤＮ）：糖尿病性網膜症を伴う患者及び明らかな糖尿病性腎症（アルブミン排出速度（ＡＥＲ）＞若しくは＝２５０μｇ／分、又はアルブミンクレアチニン比（ＡＣＲ）＞若しくは＝３００ｍｇ／ｇＣｒ）を伴う患者又は透析療法下の患者
２）対照（Ｃ）：糖尿病性網膜症を伴うが、腎症発症のいかなる兆候もない患者（ＡＥＲ＜２０μｇ／分、又はＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇＣｒ）
に従って、２つのグループに分類した。
【００６４】
前記糖尿病患者から、末梢血液を得、末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血清を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で２０分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロテイナーゼＫを添加し、３７℃４時間以上インキュベートした。
【００６５】
得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層（水層）に、イソプロパノールを添加して、ＤＮＡの沈殿を生じさせた。ついで、遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）を行ない、ＤＮＡを回収し、１ｍｌ ７０％ エタノールを添加し、得られたＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）〕に溶解し、ＤＮＡ試料を得た。
【００６６】
前記ＤＮＡ試料について、ＳＮＰによりジェノタイピングした。用いたＳＮＰは、ＳＮＰデータベース（ＩＭＳ−ＪＳＴ ＳＮＰｓ データベース:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）からランダムに選択されたものである。各ＳＮＰ遺伝子座の遺伝子型を、オオニシ（Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ．）ら〔Ｊ．Ｈｕｍａｎ．Ｇｅｎｅｔ．、４６、４７１−４７７、２００１〕のインベーダー法により解析した。
【００６７】
前記インベーダー法において、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲにより標的部位を増幅した。ＰＣＲ条件は、１６．６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６．７μＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０×Ｔａｑ ｍｉｘ（２．５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、３１．２５Ｕ／μｌ Ｔａｑａｎｔｉｂｏｄｙ）、０又は１０％ ＤＭＳＯ、各０．２５μＭ プライマー中、変性：９５℃、１５秒とアニーリング：６０℃、４５秒と伸長：７２℃、３分とを１サイクルとする４０サイクルである。
【００６８】
前記Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲにより増幅された産物をｄＨ2Ｏで、１：１１に希釈し、３８４プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾させ、プレート上の各ウェルに、３μｌ インベーダー反応液（組成：１０×緩衝液、１０×ＦＲＥＴプローブ、１０×ｃｌｅｖａｓｅ、アレルプローブ）を添加した。その後、６３℃で２０分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、ＦＡＭ及びＶＩＣに由来する蛍光（５２０ｎｍ、５４６ｎｍ）を測定した。
【００６９】
まず、糖尿病性腎症症例の９４患者及び対照の９４個体のそれぞれをスクリーニングした（一次スクリーニング）。２×３又は２×２分割表を用いて、統計学的データを評価することにより、糖尿病性腎症患者と対照群の個体との間における遺伝子型又は対立遺伝子頻度における顕著な差異を示したＳＮＰを選択した。また、選択されたＳＮＰの統計的有意性を明らかにするために、他の３７８糖尿病性腎症患者及び対照の１５５個体で解析した。相関解析、ハプロタイプ頻度及びハーディ・ワインバーグ平衡の統計解析並びにＬＤ係数Ｄ’の算出は、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ Ｂ．）ら〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９、３１１−３２２、１９９５〕及びニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ ＤＭ．）ら〔Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６３、１５３１−１５４０、１９９８〕のように行なった。
【００７０】
糖尿病性腎症症例の９４患者及び対照の９４個体を用いて、５６，６４８個のＳＮＰ座をスクリーニングした。その結果、８９４個のＳＮＰ座の遺伝子型及び／又は対立遺伝子頻度は、腎症症例と対照との間で顕著に異なること（ｐ＜０．０１）が見出された。したがって、これらの８９４個のＳＮＰ座を、さらに多くの患者で解析した。結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
その結果、第１６染色体ｑ１３のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の２４番目のイントロンにおける１つのＳＮＰ座の遺伝子型の分布が、糖尿病性腎症と強く関連することがわかった（表１ χ2＝１５．８、ｐ＝０．００００９ オッズ比２．６２、９５％ＣＩ １．５８−４．３７）。
【００７３】
ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子（アクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１）を含むゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ配列情報に基づき、ＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲプライマーをデザインした。ＰＣＲプライマーのデザインに際し、ベッデル（Ｂｅｄｅｌｌ ＪＡ．）ら〔Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６、１０４０−１０４１、２０００〕に記載のように、ＲＥＰＥＡＴ ＭＡＳＫＥＲコンピュータープログラムを用い、反復配列エレメントを除外して行なった。ＰＣＲ反応及びＤＮＡ配列決定は、既報〔オオニシ（Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１０６、２８８−２９２、２０００〕に記載のように、ダイターミネーターを用いたサイクルシークエンシング法により行なった。各ＳＮＰの遺伝子型決定は、前記インベーダーアッセイ又は場合により、ダイレクトシークエンシングで行なった。
【００７４】
その結果、図１に示されるように、２５０ｂｐ上流又は下流内の３９個のＳＮＰを用いたＳＬＣ１２Ａ３遺伝子における目印ＳＮＰ周辺の連鎖不平衡マッピングにより、この領域の連鎖不平衡が、目印ＳＮＰの上流約１００ｋｂから、下流５０ｋｂまでの約１５０ｋｂのブロックに広がると考えられることが示された。
【００７５】
したがって、糖尿病性腎症に対する罹病性を決定するに重要な領域が、前記１５０ｋｂのブロック内にあると考えられた。前記ブロック内には、ＫＩＡＡ００９５；ホモシステイン誘導性、小胞体ストレス誘導性、ユビキチン様ドメインメンバー１（ＨＥＲＰＵＤ１）などのＳＬＣ１２Ａ３遺伝子以外の２遺伝子がある。
【００７６】
ついで、これらの遺伝子内の３１個のＳＮＰと、糖尿病性腎症の候補遺伝子であることが報告されているコレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子内の５個のＳＮＰとを解析した。しかしながら、これらのＳＮＰと糖尿病性腎症との有意な関連は見出されなかった（ｐ＞０．０１）。
【００７７】
これらの結果より、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子自体が、糖尿病性腎症に対する罹病性の最も有望なものであると推測された。
【００７８】
次に、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子における別の多型を調べ、別の６５個のＳＮＰ(全７８個のＳＮＰ)及び４個の挿入／欠失多型を同定した。これらのＳＮＰについて、インベーダー法又はダイレクトシークエンスにより、５５３腎症症例及び３２０対照でジェノタイピングした。なお、表２に示される多型を調べるために、下記プローブ及びプライマーの組み合わせ：
第２３エキソンの＋７８に関して、
アレルプローブG： 配列番号：１
アレルプローブA： 配列番号：２
インベーダープローブ： 配列番号：３
プライマーF： 配列番号：４
プライマーR： 配列番号：５
第２４イントロンの＋１８７０に関して、
アレルプローブG： 配列番号：８
アレルプローブA： 配列番号：９
インベーダープローブ： 配列番号：１０
プライマーF： 配列番号：１１
プライマーR： 配列番号：１２
第２５イントロンの＋１３に関して、
アレルプローブC： 配列番号：１３
アレルプローブT： 配列番号：１４
インベーダープローブ： 配列番号：１５
プライマーF： 配列番号：１６
プライマーR： 配列番号：１７
第２５イントロンの＋２５００に関して、
アレルプローブC： 配列番号：１８
アレルプローブT： 配列番号：１９
インベーダープローブ： 配列番号：２０
プライマーF： 配列番号：２１
プライマーR： 配列番号：２２、
を用いた。
【００７９】
表２に結果を示す。
【００８０】
【表２】
【００８１】
これらのＳＮＰのいくつかは、糖尿病性腎症と有意に関連することがわかった。特に、アミノ酸置換（第２３エキソンの＋７８位、Ａｒｇ９１３Ｇｌｎ）をもたらす第２３エキソンにおけるＳＮＰと糖尿病性腎症との関連性は、表２に示されるように、非常に高いことが示された（χ2＝１９．４、ｐ＝０．００００１、オッズ比２．６９[９５％ ＣＩ１．７１−４．２３]）
【００８２】
また、前記表１に示された４個のＳＮＰは、連鎖不平衡にあったが、表３〜表５に示されるように、Ａｒｇ９１３Ｇｌｎ単独と糖尿病性腎症との関連に比べ、いかなるハプロタイプも糖尿病性腎症との高い関連性を示さなかった。
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
【００８５】
【表５】
【００８６】
表に示されたＳＮＰ遺伝子型分布は、全てハーディ・ワインバーグ平衡にあった。
【００８７】
臨床的特徴とＡｒｇ９１３Ｇｌｎの遺伝子型との関連を、表６に示す。
【００８８】
【表６】
【００８９】
このＳＮＰの遺伝子型に関して、被験対象の２型糖尿病患者のうち、血清クレアチニン、血清電解質及び血圧などの臨床的パラメータには、いかなる差異も同定できなかった。
【００９０】
以上のように、ＳＮＰを遺伝子マーカーとして用いたゲノムワイド症例−対照関連研究により、糖尿病性腎症に対する易罹病性の指標となる候補となるものとして、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターをコードするＳＬＣ１２Ａ３遺伝子が同定された。また、コドン９１３でのＡｒｇのＧｌｎへのアミノ酸置換は、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの機能を低下させることにより、糖尿病性腎症に対する罹病性を与えることに直接寄与するであろうことを示唆した。
【００９１】
第１６染色体ｑ１３のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子は、腎臓遠位尿細管におけるＮａ+、Ｃｌ-再吸収のメディエイターであり、サイアザイド系利尿薬の標的であるサイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターをコードする。また、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子は、常染色体の劣性形質として遺伝し、低カリウム症、代謝性アルカローシス、低マグネシウム血（症）、低炭酸症及び容積枯渇（ｖｏｌｕｍｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により特徴付けられるＧｉｔｅｌｍａｎ症候群の原因遺伝子として知られている〔シモン（Ｓｉｍｏｎ ＤＢ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１２、２４−３０、１９９６〕。また、前記シモンらは、Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群の１２患者におけるＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の１６変異を報告している。Ｇｉｔｅｒｍａｎ症候群を引き起こす多くの変異は、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの機能の喪失を導き、これらの体液及び電解質異常をもたらすことを示唆している。Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群患者において、９１３位のＡｒｇのＧｌｎへのアミノ酸置換が同定されているため、この置換は、本トランスポーターの機能の喪失を導くと思われる。したがって、対照被験者におけるアミノ酸置換を伴う少数対立遺伝子の頻度の増加は、少数対立遺伝子を有する患者が、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの活性を減少させることにより腎症の進行を防ぐことを示唆する。
【００９２】
少数対立遺伝子（９１３Ｇｌｎ）を有する患者が、糖尿病性腎症に罹りにくくなる正確な機構は、未だ不明である。サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの機能の喪失が、ナトリウム制限状態で顕著な動脈圧低下を導くため、９１３位のＡｒｇのＧｌｎへの置換は、糖尿病等のある病的状態下での血圧に影響を与えうることが仮定されうる。さらに、サイアザイド利尿薬は、高血圧の患者の治療のために幅広く使用される。したがって、少数対立遺伝子の保持者における動脈圧が、２型糖尿病患者のうちの非保持者の動脈圧よりも低かったことが予想される。一方、血圧の上昇は、糖尿病性腎症の発生と進行の独立した危険因子であることが示され、それゆえ、この置換は、２型糖尿病における動脈圧に影響することにより、糖尿病性腎症に対する罹病性を付与することに寄与すると思われる。
【００９３】
しかしながら、２型糖尿病のうち、置換された対立遺伝子の保持者と非保持者との間の動脈圧等の臨床的パラメータのいかなる差異も同定できなかった。これは、この遺伝子多型が、糖尿病性腎症に対する罹病性にどのように寄与するのかについて正確な機構を明らかにするため、前向き無作為化臨床試験などのさらなる研究が必要であるが、このコトランスポーターにより調節される血圧以外の新規な因子が糖尿病性腎症の発症及び進行に寄与することが示唆される。
【００９４】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＧの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【００９５】
配列番号：２は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＡの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【００９６】
配列番号：３は、エキソン２３ ＋７８インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【００９７】
配列番号：４は、エキソン２３ ＋７８プライマーＦの配列である。
【００９８】
配列番号：５は、エキソン２３ ＋７８プライマーＲの配列である。
【００９９】
配列番号：６は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＧの配列である。
【０１００】
配列番号：７は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＡの配列である。
【０１０１】
配列番号：８は、イントロン２４ ＋１８７０アレルプローブＧの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０２】
配列番号：９は、イントロン２４ ＋１８７０アレルプローブＡの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０３】
配列番号：１０は、イントロン２４ ＋１８７０インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【０１０４】
配列番号：１１は、イントロン２４ ＋１８７０プライマーＦの配列である。
【０１０５】
配列番号：１２は、イントロン２４ ＋１８７０プライマーＲの配列である。
【０１０６】
配列番号：１３は、イントロン２５ ＋１３アレルプローブＣの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０７】
配列番号：１４は、イントロン２５ ＋１３アレルプローブＴの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０８】
配列番号：１５は、イントロン２５ ＋１３インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【０１０９】
配列番号：１６は、イントロン２５ ＋１３プライマーＦの配列である。
【０１１０】
配列番号：１７は、イントロン２５ ＋１３プライマーＲの配列である。
【０１１１】
配列番号：１８は、イントロン２５ ＋１３アレルプローブＣの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１１２】
配列番号：１９は、イントロン２５ ＋２５００アレルプローブＴの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１１３】
配列番号：２０は、イントロン２５ ＋２５００インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【０１１４】
配列番号：２１は、イントロン２５ ＋２５００プライマーＦの配列である。
【０１１５】
配列番号：２２は、イントロン２５ ＋２５００プライマーＲの配列である。
【０１１６】
【発明の効果】
本発明の糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法によれば、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定することができ、迅速に判定することができ、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出することができ、迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キットによれば、前記検出方法を行なうために用いることができ、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定することができ、迅速に判定することができ、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出することができ、迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の糖尿病患者の腎症の発症の予防又は該腎症の治療のための薬剤は、糖尿病患者、特に網膜症を伴う糖尿病患者において、糖尿病性腎症を併発する可能性を低減させることができるという優れた効果を奏する。
【０１１７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子周辺のＬＤマッピングを示す。ＬＤ係数は、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子におけるＳＮＰとＳＬＣ１２Ａ３中の目印ＳＮＰから２５０ｋｂ上流又は下流内のＳＮＰとの間で算出した。低い少数対立遺伝子頻度（＜０．１５）のＳＮＰは、計算には入れなかった。
【図２】図２は、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子における遺伝的多様性を示す図である。図中、シャープ記号は、目印ＳＮＰを示し、「*」は、挿入／欠失多型を示し、十字は、１次スクリーニングで解析されたＳＮＰを示し、無印は、最初の陽性結果の後のさらなるサーチで同定されたＳＮＰを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病性腎症遺伝子の検出方法に関する。さらに詳しくは、糖尿病性腎症に対する罹病性を与える糖尿病性腎症遺伝子の検出方法、該検出方法に用いるためのキット、及び糖尿病患者における腎症の発症の予防又は該腎症の治療の薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病性腎症は、西洋諸国及び日本における末期腎不全の主な原因である（非特許文献１−３）。前記糖尿病性腎症は、虚血性心臓疾患、脳卒中等の動脈硬化症等の疾患を引き起こし、糖尿病患者における平均余命の低下をもたらす。
【０００３】
糖尿病性腎症の病因は、多要因的であると考えられており、いくつかのカスケードが、糖尿病性腎症の発生及び進行に寄与するのであろうと考えられているが、正確な機構等について、不明な点が多いのが現状である。
【０００４】
【非特許文献１】
アクマール（Ａｋｍａｌ Ｍ）、Ａｍ．Ｊ．ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．、３８、Ｓｕｐｐｌ．１、２００１
【非特許文献２】
「米国腎臓データシステム２００１年報データレポート：米国における末期腎臓病のアトラス」“Ｅｘｃｅｒｐｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ ２００１ Ａｎｎｕａｌ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ：Ａｔｌａｓ ｏｆ ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．” Ａｍ．Ｊ．ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．、３８、Ｓｕｐｐｌ．３、２００１
【非特許文献３】
「患者登録委員会 日本透析医学会：日本における長期透析療法の現状」 “Ｐａｔｉｅｎｔ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｊａｐａｎｅｓｅ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｊｐｎ Ｓｏｃ ＤｉａｌＴｈｅｒ ３５（７）: １１５５−１１８４，２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定すること、迅速に判定すること、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出すること、迅速に検出すること等を可能にする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定すること、迅速に判定すること、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出すること、迅速に検出すること等を可能にする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、糖尿病患者において、糖尿病性腎症を併発する可能性を低減させること等を可能にする、糖尿病患者、特に網膜症を伴う糖尿病患者の腎症の発症の予防又は該腎症の治療のための薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕 ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子を指標として用いることを特徴とする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法であって、糖尿病患者の核酸試料について、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基を同定するステップを含み、
（Ｉ’ ）該＋７８位に対応する塩基が、Ｇである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ＩＩ’ ）該＋７８位に対応する塩基が、Ａである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる、
糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法、
〔２〕 ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子の発現産物を指標として用いることを特徴とする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法であって、糖尿病患者のタンパク質試料について、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位に対応するアミノ酸残基を同定するステップを含み、
（ｉ）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ｉｉ）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる、
糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法、
〔３〕下記核酸：
（１’）ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖
を含有してなる、前記〔１〕記載の検出方法を行なうための、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット、並びに
〔４〕下記核酸：
（１’）ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖
が固定化された核酸アレイを含有してなる、前記〔１〕記載の検出方法を行なうための、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット、
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法は、ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子〔ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１〕又はその発現産物を指標として用いることに１つの大きな特徴がある。
【０００８】
本明細書において、「罹病性決定要因」は、易罹病性の決定要因と、難罹病性の決定要因とに大別される。前記「易罹病性の決定要因」としては、（１）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖；（１’）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。
【０００９】
また、前記「難罹病性の決定要因」としては、（２）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖；（２’）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。
【００１０】
本発明の検出方法においては、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子又はその発現産物における特定の変異の有無を指標として用いるため、糖尿病患者の被験試料中における糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因を容易に、迅速に検出することができ、糖尿病患者の糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を容易に、迅速に検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００１１】
前記ＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子は、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ- 共輸送体をコードする遺伝子である。前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子は、低カリウム血症、代謝性アルカローシス等の病態が見られるＧｉｔｅｌｍａｎ症候群の一部の患者において、第２３エキソンの＋７８位の塩基が、Ｇ（グアニン）からＡ（アデニン）に変異していることが知られている遺伝子である〔レミンク（Ｌｅｍｍｉｎｋ ＨＨ）ら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、５４、７２０−７３０、１９９８〕。また、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子に対するノックアウトマウスにおいても、Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群と類似の症状が観察されている〔シュルセシス（Ｓｃｈｕｌｔｈｅｓｉｓ ＰＪ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２９１５０−２９１５５、１９９８〕。
【００１２】
一方、本発明は、糖尿病患者においては、予想外にも、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物の９１３位が、アルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異している場合、例えば、第２３エキソンの＋７８位の塩基が、ＧからＡに変異している場合、糖尿病性腎症に対して、難罹病性を示し、一方、該９１３位が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、例えば、第２３エキソンの＋７８位の塩基が、Ｇである場合、糖尿病性腎症に対して易罹病性を示すという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１３】
本発明の検出方法は、具体的には、
▲１▼ ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを同定すること、又は
▲２▼ ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子発現産物中の９１３位のアミノ酸残基を同定することにより行なわれうる。
【００１４】
本発明の検出方法に用いられる試料としては、具体的には、糖尿病患者の試料、好ましくは、網膜症を伴う糖尿病患者の試料が挙げられる。前記試料としては、より具体的には、核酸を含有する試料（「核酸試料」という）、タンパク質を含有する試料（「タンパク質試料」という）が挙げられる。前記試料は、糖尿病患者の生検試料、例えば、血液、皮膚、粘膜、爪、腎臓等が挙げられる。前記核酸試料又はタンパク質試料は、慣用の方法で前記生検試料を処理することにより得られる。前記核酸試料は、例えば、
− 末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血清を除去し、
− 得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で２０分間インキュベートし、
− 得られた混合物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去し、
− 得られた沈殿に、プロテイナーゼＫを添加氏、３７℃４時間以上処理し、
− 得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、
− 得られた上層に、イソプロパノールを添加して、ＤＮＡの沈殿を生じさせ、
− 遠心分離により、ＤＮＡを回収し、７０％ エタノールで処理し、
− 得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）〕に溶解する
ことにより得られうる。
【００１５】
また、前記タンパク質試料は、例えば、
− 腎組織又は腎培養細胞をホモゲナイゼーション緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、８０ｍＭ シュークロース、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍｇ／ｌ ロイペプチン、５ｍｇ／ｌ ペプスタチン）中でホモゲナイズし、
− 得られた産物について、３０００×gで１０分間の遠心分離を２回行ない、
− 得られた上清について、さらに１４０００×ｇで３０分間遠心分離する
ことにより、沈澱として得られうる。なお、タンパク質試料の調製の際の操作は、４℃で行なわれうる。
【００１６】
前記▲１▼の検出方法としては、具体的には、糖尿病患者の核酸試料について、
ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを同定するステップを含む方法が挙げられる。前記ステップは、例えば、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列における該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを含む領域を検出又は配列解析することにより行なわれうる。
【００１７】
前記コドンを含む領域の検出には、例えば、インベーダー法、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅＡミスマッチ切断法、ヘテロデュプレックス法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、タックマン法、ダイレクトシークエンス法、ローリングサークル増幅法等が行なわれうる。なかでも、操作の迅速性、操作に要するコストの低減、ハイスループットでの実施等の観点から、好ましくは、インベーダー法が望ましい。
【００１８】
前記インベーダー法は、鋳型ＤＮＡとアレルプローブ（３’側にＳＮＰ部位からはじまる鋳型と相補的な配列と、５’側に鋳型と無関係なフラップ配列を有するオリゴヌクレオチド）と、インベーダープローブ（５’側にＳＮＰ部位直前まで、鋳型と相補的な配列を有し、ＳＮＰ位置の任意の塩基で終わるオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションを行なう方法である。ここで、前記インベーダー法においては、
− ＳＮＰ部位では、相補的にアニーリングした二本鎖中にインベーダープローブの３’末端塩基が侵入した構造が形成され、
− エンドヌクレアーゼ（ｃｌｅｖａｓｅ）が前記構造を認識してフラップを切断し、
− 前記フラップと、該フラップに相補的にアニーリングして第２のｃｌｅｖａｓｅ認識部位を生じるように設計されたＦＲＥＴプローブとがアニーリングし、
− ｃｌｅｖａｓｅにより切断され、生じた蛍光標識ＦＲＥＴプローブの断片量を蛍光に基づき測定する
ことにより遺伝子型を判定される。
【００１９】
また、電気泳動時における移動度の違いを指標として一塩基置換を検出する場合（例えば、前記一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法等）、例えば、（１） ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖
との移動度の違いを指標とすればよい。
【００２０】
なお、本明細書において、「核酸の相補鎖」とは、例えば、センス鎖に対するアンチセンス鎖であることを意味し、実質的に完全な相補を意味する。
【００２１】
前記▲１▼の検出方法においては、
（Ｉ）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（II) 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである場合、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる。
【００２２】
前記▲１▼の検出方法としては、より具体的には、糖尿病患者の核酸試料について、ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基を同定するステップを含み、
（Ｉ' ）該＋７８位に対応する塩基が、Ｇである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（II' ）該＋７８位に対応する塩基が、Ａである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる
方法が挙げられる。
【００２３】
前記▲１▼の検出方法において、配列解析を行なう場合、例えば、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列における該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンを含む領域について、慣用のＰＣＲ等によりダイレクトシークエンスすること等により行なわれうる。
【００２４】
なお、前記▲１▼の検出方法において、用いられるプローブ又はプライマーは、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１）の塩基配列に基づき、前記コドンを含む領域の検出に適したプローブ又は該領域の増幅に適したプライマーとしてデザインすればよい。なお、プローブ又はプライマーの特異性を向上させる観点から、前記プローブ又はプライマーは、好ましくは、反復配列等の非特異的検出又は非特異的増幅をもたらしうる配列を含まない配列であることが望ましい。また、前記プローブ又はプライマーは、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子に特徴的な部分配列からなる核酸であることが望ましい。なお、本明細書において、「ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子に特徴的な部分配列」とは、例えば、データベースに登録された配列のうち、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子を除く塩基配列には、見出されない部分配列をいい、例えば、データベースに登録された配列との配列同一性が、２０％以下、好ましくは、１０％以下、より好ましくは、５％以下、特に好ましくは０％である配列をいう。
【００２５】
なお、本明細書において、前記配列同一性は、比較対象の配列を適切なアルゴリズムに基づきアライメントし、同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。前記アルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム〔Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．，２，４８２（１９８１）〕、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３（１９７０）〕、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）らの相同性検索法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４（１９８８）〕等が挙げられ、より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ＢＬＡＳＴアルゴリズム等が挙げられる。なお、本明細書においては、前記配列同一性の数値は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づき、配列を解析して算出されたものを基準としたときに上記範囲であればよく、アルゴリズムにより見かけの数値が若干異なっていてもよい。
【００２６】
前記プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、具体的には、１５ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、２０ヌクレオチド長以上であり、５０ヌクレオチド長以下であり、好ましくは、３５ヌクレオチド長以下であることが望ましい。
【００２７】
前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、好ましくは１８ヌクレオチド長以上であることが望ましい。なお、プローブの場合、ストリンジェントな条件、好ましくは、中ストリンジェンシー、より好ましくは、高ストリンジェンシーの条件下に前記コドンを含む領域に特異的にハイブリダイズするものであればよい。
【００２８】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス刊、１９８９〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、
▲１▼ ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温するステップ、
▲２▼ 非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、を行ない、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうこと等が挙げられる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝81.5−16.6 (log10[Na+])＋0.41 (%G＋C)−(600/N)
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる値である。
【００２９】
かかるプローブ又はプライマーのデザインは、慣用のソフトウェアを用いることにより、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１に基づき行なわれうる。
【００３０】
プライマーは、例えば、Ｇ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合が、約５０％であることが望ましく、プライマー同士又は単独で２量体を形成しないようにプライマー同士又は同一プライマー内で相補的な配列がないことが望ましい。
【００３１】
本発明に用いられうるプローブ又はプライマーの具体例としては、例えば、インベーダー法に用いる場合、
アレルプローブＧ（nnnnnnnnnnnnnnngggctgagcagtaagttctgt；配列番号：１）、
アレルプローブＡ（nnnnnnnnnnnnnnnaggctgagcagtaagttctgt；配列番号：２）、
インベーダープローブ（tgacatcaaccagaaccctcn；配列番号：３）、
プライマーＦ（tccatgtgtcctccaggatcatttc；配列番号：４）及び
プライマーＲ（gatgctagatggggtctgtatgttgc；配列番号：５）
の組み合わせ
等が挙げられる。なお、前記アレルプローブＧ及びアレルプローブＡにおいて、フラップに相当するｎ（任意の塩基）が連続している部分は、例えば、ＦＡＭ・ＶＩＣの組み合わせによる独立した検出が可能なように互いに異なる配列に設計すればよい。また、いうまでもないが、ｎの個数は必ずしも例示のものに限定されるものではなく、例えば、１〜数個ｎを付加あるいは欠失させたものであってもよい。具体的には、前記アレルプローブＧ及びアレルプローブＡの組み合わせとしては、特に限定されないが、アレルプローブＧとして、配列番号：６（atgacgtggcagacgggctgagcagtaagttctgt）と、アレルプローブＡとして、配列番号：７（cgcgccgaggaggctgagcagtaagttctgt）との組み合わせ等が挙げられる。
【００３２】
また、前記▲１▼の検出方法においては、支持体に前記（１）の核酸若しくはその相補鎖、及び／又は前記（２）の核酸若しくはその相補鎖を固定化した核酸アレイを用いることもできる。具体的には、前記核酸アレイと、糖尿病患者の核酸試料由来の標識核酸試料と、任意に対照試料由来の標識された核酸とを接触させ、ハイブリダイゼーションを行なう。
【００３３】
前記核酸アレイは、例えば、前記（１）の核酸若しくはその相補鎖、及び／又は前記（２）の核酸若しくはその相補鎖に、支持体表面への固定化を容易にしうる修飾基を導入し、ついで、得られた修飾核酸を、慣用のＤＮＡアレイ作製装置を用いて、予め定められた部位に整列、固定化すればよい。前記核酸の固定化量、固定化密度は、核酸アレイによるハイブリダーゼションを行ないうる範囲で適宜選択されうる。
【００３４】
前記支持体としては、ガラス（例えば、スライドグラス）、シリコンチップ等が挙げられる。
【００３５】
前記標識物質としては、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等が挙げられる。例えば、前記蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。核酸試料の標識は、試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を標識することによって実施される。前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いた場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出されうる。
【００３６】
なお、核酸アレイを用いて、コドンの違いを検出する場合、ハイブリダイゼーションにおける条件は、好ましくは、高ストリンジェンシーであることが望ましい。かかる条件としては、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭ ２−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で４２℃で１時間インキュベートし、その後、洗浄液１（２×ＳＳＣ及び０．１％）により４２℃で５分洗浄し、洗浄液２（１×ＳＳＣ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）により４２℃で５分洗浄する条件が挙げられる。
【００３７】
前記▲２▼の検出方法としては、具体的には、糖尿病患者のタンパク質試料について、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位に対応するアミノ酸残基を同定するステップを含む方法が挙げられる。前記ステップは、例えば、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基を含む領域を検出又は配列解析することにより行なわれうる。
【００３８】
前記アミノ酸残基を含む領域の検出には、例えば、抗体を用いたイムノアッセイ、ウエスタンブロット等により行なわれうる。
【００３９】
前記抗体としては、１） 前記（１’）のポリペプチドとは反応し、前記（２’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
２） 前記（２’）のポリペプチドとは反応し、前記前記（１’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
が挙げられる。
【００４０】
前記抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｅｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、１９９２年〕に記載の方法により、（１’）ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（２’）発現産物のアミノ酸配列において、９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。前記抗体は、前記（１’）又は前記（２’）のポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、前記（１’）又は（２’）いずれかにおける９１３位を含む特定の部分断片に特異的に結合しうる抗体であってもよい。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、ビオチン、アビジン等で標識されていてもよい。なお、前記（１’）のポリペプチド又は前記（２’）のポリペプチドに対する前記抗体の特異性は、例えば、前記（１’）のポリペプチド及び前記（２’）のポリペプチドを用い、オクタロニー法、ＥＬＩＳＡ等により評価されうる。例えば、前記オクタロニー法の場合、前記１）の抗体は、前記（１’）のポリペプチドとは反応して、沈降線を示し、前記（２’）のポリペプチドとは反応せず、沈降線を示さない抗体として評価され、前記２）の抗体は、前記（２’）のポリペプチドとは反応して、沈降線を示し、前記前記（１’）のポリペプチドとは反応せず、沈降線を示さない抗体として評価されうる。
【００４１】
前記▲２▼の検出方法においては、
（ｉ）９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ii）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる。
【００４２】
また、本発明には、前記検出方法に用いられる核酸若しくはその相補鎖、又は抗体を含有したキットも含まれる。
【００４３】
前記▲１▼の検出方法を行なうためのキットとしては、具体的には、下記核酸：
（１） ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、アルギニン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸若しくはその相補鎖
を含有した、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット、
が挙げられる。
【００４４】
前記（１）の核酸若しくはその相補鎖としては、より具体的には、（１’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖が挙げられる。また、前記（２）の核酸若しくはその相補鎖としては、より具体的には、（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖が挙げられる。
【００４５】
また、前記▲１▼の検出方法を行なうためのキットは、前記（１）の核酸若しくはその相補鎖、及び／又は前記（２）の核酸若しくはその相補鎖が固定化された核酸アレイを含有したキットであってもよい。
【００４６】
また、前記▲２▼の検出方法を行なうためのキットとしては、
１） 前記（１’）のポリペプチドとは反応し、前記（２’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
２） 前記（２’）のポリペプチドとは反応し、前記前記（１’）のポリペプチドとは反応しない抗体、
を含有した、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キットが挙げられる。
【００４７】
本発明の検出用キットには、検出に用いられうる標識物質、発色試薬、緩衝液（例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液、抗体保存用緩衝液、核酸保存用緩衝液、洗浄用緩衝液等）、対照試料等をさらに含有してもよい。
【００４８】
また、本発明者らの知見によれば、糖尿病患者の腎症の発症の予防又は該腎症の治療のための薬剤が提供される。
【００４９】
本発明の薬剤は、糖尿病患者に投与するものであり、かつヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸を含有することに１つの特徴がある。
【００５０】
本発明の薬剤は、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸が用いられているため、糖尿病患者に投与することにより、該糖尿病患者に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を産生させることができ、糖尿病性腎症の発症の予防又は該腎症の治療を行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【００５１】
本発明の薬剤は、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の塩基配列において、該遺伝子の発現産物中の９１３位のアミノ酸残基に対応するコドンが、グルタミン残基に対応するコドンである塩基配列を有する核酸を、治療上有効量含有する。
【００５２】
ここで、「治療上有効量」は、糖尿病性腎症の発症を予防すること又は該腎症を治療することに十分な量であればよく、糖尿病患者の体重、疾患状態、年齢等に応じて適宜選択されうる。かかる「治療上有効量」は、後述の薬理評価法に基づき定められた量であってもよい。
【００５３】
本発明の薬剤の製剤形態は、投与形態に適した製剤形態であればよい。例えば、注射剤の場合、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、滅菌水等の溶液を、フィルター等で濾過滅菌し、得られた溶液に、前記核酸を溶解させることにより調製されうる。前記溶液は、好ましくは、核酸分解酵素を含有していない溶液であることが望ましい。また、本発明の薬剤は、必要に応じて慣用の担体等を含有してもよい。また、本発明の薬剤は、リポソーム製剤として、懸濁剤、凍結剤等の製剤形態であってもよい。
【００５４】
糖尿病患者への本発明の薬剤の導入法としては、本発明の薬剤を直接糖尿病患者の体内、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に導入する方法、糖尿病患者の細胞を取り出して体外で本発明の薬剤を当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す方法等が挙げられる。
【００５５】
本発明の薬剤を投与する場合、その投与形態としては、非ウイルスベクターに基づく投与形態と、ウイルスベクターに基づく投与形態とに大別される。
【００５６】
非ウイルスベクターの場合、慣用の遺伝子発現ベクターに前記核酸を組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて、リン酸−カルシウム共沈法、微小ガラス管を用いた核酸の直接注入法、パーティクルガン銃で金粒子等の担体とともに核酸分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、リポソーム、正電荷ポリマーによる導入法等を行なうことにより、細胞や組織に本発明の薬剤を投与することができる。
【００５７】
前記遺伝子発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＩ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＳＧ、ｐＣＤＮＡ，ｐＣＲ，ｐＬＰ等が挙げられる。
【００５８】
ウイルスベクターの場合、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、前記核酸を導入し、得られた組換えウイルスを細胞に感染させることによって、細胞内に核酸を導入することが可能である。
【００５９】
前記薬剤中の前記核酸の含有量は、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、有効成分の前記核酸の量として０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇであることが望ましい。かかる投与用量を数日ないし数ヶ月に１回投与することが望ましい。
【００６０】
本発明の薬剤の薬理評価は、例えば、尿中ナトリウム排泄率、尿中カリウム排泄率、クレアチニンクリアランス、尿中アルブミン排泄率、血清ナトリウム値、血清カリウム値、血清クレアチニン値、血中尿素窒素等を指標として行なわれうる。また、薬理評価として、モデル動物等を用いて、腎組織検査を行なってもよく、ヒトにおける腎生検を評価してもよい。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明を実施例などにより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例などにより限定されるものではない。
【００６２】
実施例１
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、岩手医科大学又は千葉西総合病院の外来患者向け診療所に定期的に来診する２型糖尿病患者を対象として実験を行なった。
【００６３】
なお、前記糖尿病患者について、下記診断基準：
１）腎症症例（ＤＮ）：糖尿病性網膜症を伴う患者及び明らかな糖尿病性腎症（アルブミン排出速度（ＡＥＲ）＞若しくは＝２５０μｇ／分、又はアルブミンクレアチニン比（ＡＣＲ）＞若しくは＝３００ｍｇ／ｇＣｒ）を伴う患者又は透析療法下の患者
２）対照（Ｃ）：糖尿病性網膜症を伴うが、腎症発症のいかなる兆候もない患者（ＡＥＲ＜２０μｇ／分、又はＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇＣｒ）
に従って、２つのグループに分類した。
【００６４】
前記糖尿病患者から、末梢血液を得、末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血清を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で２０分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロテイナーゼＫを添加し、３７℃４時間以上インキュベートした。
【００６５】
得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層（水層）に、イソプロパノールを添加して、ＤＮＡの沈殿を生じさせた。ついで、遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）を行ない、ＤＮＡを回収し、１ｍｌ ７０％ エタノールを添加し、得られたＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）〕に溶解し、ＤＮＡ試料を得た。
【００６６】
前記ＤＮＡ試料について、ＳＮＰによりジェノタイピングした。用いたＳＮＰは、ＳＮＰデータベース（ＩＭＳ−ＪＳＴ ＳＮＰｓ データベース:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）からランダムに選択されたものである。各ＳＮＰ遺伝子座の遺伝子型を、オオニシ（Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ．）ら〔Ｊ．Ｈｕｍａｎ．Ｇｅｎｅｔ．、４６、４７１−４７７、２００１〕のインベーダー法により解析した。
【００６７】
前記インベーダー法において、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲにより標的部位を増幅した。ＰＣＲ条件は、１６．６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６．７μＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０×Ｔａｑ ｍｉｘ（２．５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、３１．２５Ｕ／μｌ Ｔａｑａｎｔｉｂｏｄｙ）、０又は１０％ ＤＭＳＯ、各０．２５μＭ プライマー中、変性：９５℃、１５秒とアニーリング：６０℃、４５秒と伸長：７２℃、３分とを１サイクルとする４０サイクルである。
【００６８】
前記Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲにより増幅された産物をｄＨ2Ｏで、１：１１に希釈し、３８４プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾させ、プレート上の各ウェルに、３μｌ インベーダー反応液（組成：１０×緩衝液、１０×ＦＲＥＴプローブ、１０×ｃｌｅｖａｓｅ、アレルプローブ）を添加した。その後、６３℃で２０分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、ＦＡＭ及びＶＩＣに由来する蛍光（５２０ｎｍ、５４６ｎｍ）を測定した。
【００６９】
まず、糖尿病性腎症症例の９４患者及び対照の９４個体のそれぞれをスクリーニングした（一次スクリーニング）。２×３又は２×２分割表を用いて、統計学的データを評価することにより、糖尿病性腎症患者と対照群の個体との間における遺伝子型又は対立遺伝子頻度における顕著な差異を示したＳＮＰを選択した。また、選択されたＳＮＰの統計的有意性を明らかにするために、他の３７８糖尿病性腎症患者及び対照の１５５個体で解析した。相関解析、ハプロタイプ頻度及びハーディ・ワインバーグ平衡の統計解析並びにＬＤ係数Ｄ’の算出は、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ Ｂ．）ら〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９、３１１−３２２、１９９５〕及びニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ ＤＭ．）ら〔Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６３、１５３１−１５４０、１９９８〕のように行なった。
【００７０】
糖尿病性腎症症例の９４患者及び対照の９４個体を用いて、５６，６４８個のＳＮＰ座をスクリーニングした。その結果、８９４個のＳＮＰ座の遺伝子型及び／又は対立遺伝子頻度は、腎症症例と対照との間で顕著に異なること（ｐ＜０．０１）が見出された。したがって、これらの８９４個のＳＮＰ座を、さらに多くの患者で解析した。結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
その結果、第１６染色体ｑ１３のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の２４番目のイントロンにおける１つのＳＮＰ座の遺伝子型の分布が、糖尿病性腎症と強く関連することがわかった（表１ χ2＝１５．８、ｐ＝０．００００９ オッズ比２．６２、９５％ＣＩ １．５８−４．３７）。
【００７３】
ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子（アクセッション番号：ＡＣ ０１２１８１）を含むゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ配列情報に基づき、ＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲプライマーをデザインした。ＰＣＲプライマーのデザインに際し、ベッデル（Ｂｅｄｅｌｌ ＪＡ．）ら〔Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６、１０４０−１０４１、２０００〕に記載のように、ＲＥＰＥＡＴ ＭＡＳＫＥＲコンピュータープログラムを用い、反復配列エレメントを除外して行なった。ＰＣＲ反応及びＤＮＡ配列決定は、既報〔オオニシ（Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１０６、２８８−２９２、２０００〕に記載のように、ダイターミネーターを用いたサイクルシークエンシング法により行なった。各ＳＮＰの遺伝子型決定は、前記インベーダーアッセイ又は場合により、ダイレクトシークエンシングで行なった。
【００７４】
その結果、図１に示されるように、２５０ｂｐ上流又は下流内の３９個のＳＮＰを用いたＳＬＣ１２Ａ３遺伝子における目印ＳＮＰ周辺の連鎖不平衡マッピングにより、この領域の連鎖不平衡が、目印ＳＮＰの上流約１００ｋｂから、下流５０ｋｂまでの約１５０ｋｂのブロックに広がると考えられることが示された。
【００７５】
したがって、糖尿病性腎症に対する罹病性を決定するに重要な領域が、前記１５０ｋｂのブロック内にあると考えられた。前記ブロック内には、ＫＩＡＡ００９５；ホモシステイン誘導性、小胞体ストレス誘導性、ユビキチン様ドメインメンバー１（ＨＥＲＰＵＤ１）などのＳＬＣ１２Ａ３遺伝子以外の２遺伝子がある。
【００７６】
ついで、これらの遺伝子内の３１個のＳＮＰと、糖尿病性腎症の候補遺伝子であることが報告されているコレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）遺伝子内の５個のＳＮＰとを解析した。しかしながら、これらのＳＮＰと糖尿病性腎症との有意な関連は見出されなかった（ｐ＞０．０１）。
【００７７】
これらの結果より、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子自体が、糖尿病性腎症に対する罹病性の最も有望なものであると推測された。
【００７８】
次に、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子における別の多型を調べ、別の６５個のＳＮＰ(全７８個のＳＮＰ)及び４個の挿入／欠失多型を同定した。これらのＳＮＰについて、インベーダー法又はダイレクトシークエンスにより、５５３腎症症例及び３２０対照でジェノタイピングした。なお、表２に示される多型を調べるために、下記プローブ及びプライマーの組み合わせ：
第２３エキソンの＋７８に関して、
アレルプローブG： 配列番号：１
アレルプローブA： 配列番号：２
インベーダープローブ： 配列番号：３
プライマーF： 配列番号：４
プライマーR： 配列番号：５
第２４イントロンの＋１８７０に関して、
アレルプローブG： 配列番号：８
アレルプローブA： 配列番号：９
インベーダープローブ： 配列番号：１０
プライマーF： 配列番号：１１
プライマーR： 配列番号：１２
第２５イントロンの＋１３に関して、
アレルプローブC： 配列番号：１３
アレルプローブT： 配列番号：１４
インベーダープローブ： 配列番号：１５
プライマーF： 配列番号：１６
プライマーR： 配列番号：１７
第２５イントロンの＋２５００に関して、
アレルプローブC： 配列番号：１８
アレルプローブT： 配列番号：１９
インベーダープローブ： 配列番号：２０
プライマーF： 配列番号：２１
プライマーR： 配列番号：２２、
を用いた。
【００７９】
表２に結果を示す。
【００８０】
【表２】
これらのＳＮＰのいくつかは、糖尿病性腎症と有意に関連することがわかった。特に、アミノ酸置換（第２３エキソンの＋７８位、Ａｒｇ９１３Ｇｌｎ）をもたらす第２３エキソンにおけるＳＮＰと糖尿病性腎症との関連性は、表２に示されるように、非常に高いことが示された（χ2＝１９．４、ｐ＝０．００００１、オッズ比２．６９[９５％ ＣＩ１．７１−４．２３]）
【００８２】
また、前記表１に示された４個のＳＮＰは、連鎖不平衡にあったが、表３〜表５に示されるように、Ａｒｇ９１３Ｇｌｎ単独と糖尿病性腎症との関連に比べ、いかなるハプロタイプも糖尿病性腎症との高い関連性を示さなかった。
【００８３】
【表３】
【表４】
【表５】
表に示されたＳＮＰ遺伝子型分布は、全てハーディ・ワインバーグ平衡にあった。
【００８７】
臨床的特徴とＡｒｇ９１３Ｇｌｎの遺伝子型との関連を、表６に示す。
【００８８】
【表６】
このＳＮＰの遺伝子型に関して、被験対象の２型糖尿病患者のうち、血清クレアチニン、血清電解質及び血圧などの臨床的パラメータには、いかなる差異も同定できなかった。
【００９０】
以上のように、ＳＮＰを遺伝子マーカーとして用いたゲノムワイド症例−対照関連研究により、糖尿病性腎症に対する易罹病性の指標となる候補となるものとして、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターをコードするＳＬＣ１２Ａ３遺伝子が同定された。また、コドン９１３でのＡｒｇのＧｌｎへのアミノ酸置換は、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの機能を低下させることにより、糖尿病性腎症に対する罹病性を与えることに直接寄与するであろうことを示唆した。
【００９１】
第１６染色体ｑ１３のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子は、腎臓遠位尿細管におけるＮａ+、Ｃｌ-再吸収のメディエイターであり、サイアザイド系利尿薬の標的であるサイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターをコードする。また、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子は、常染色体の劣性形質として遺伝し、低カリウム症、代謝性アルカローシス、低マグネシウム血（症）、低炭酸症及び容積枯渇（ｖｏｌｕｍｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により特徴付けられるＧｉｔｅｌｍａｎ症候群の原因遺伝子として知られている〔シモン（Ｓｉｍｏｎ ＤＢ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１２、２４−３０、１９９６〕。また、前記シモンらは、Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群の１２患者におけるＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の１６変異を報告している。Ｇｉｔｅｒｍａｎ症候群を引き起こす多くの変異は、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの機能の喪失を導き、これらの体液及び電解質異常をもたらすことを示唆している。Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群患者において、９１３位のＡｒｇのＧｌｎへのアミノ酸置換が同定されているため、この置換は、本トランスポーターの機能の喪失を導くと思われる。したがって、対照被験者におけるアミノ酸置換を伴う少数対立遺伝子の頻度の増加は、少数対立遺伝子を有する患者が、サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの活性を減少させることにより腎症の進行を防ぐことを示唆する。
【００９２】
少数対立遺伝子（９１３Ｇｌｎ）を有する患者が、糖尿病性腎症に罹りにくくなる正確な機構は、未だ不明である。サイアザイド感受性Ｎａ+−Ｃｌ-コトランスポーターの機能の喪失が、ナトリウム制限状態で顕著な動脈圧低下を導くため、９１３位のＡｒｇのＧｌｎへの置換は、糖尿病等のある病的状態下での血圧に影響を与えうることが仮定されうる。さらに、サイアザイド利尿薬は、高血圧の患者の治療のために幅広く使用される。したがって、少数対立遺伝子の保持者における動脈圧が、２型糖尿病患者のうちの非保持者の動脈圧よりも低かったことが予想される。一方、血圧の上昇は、糖尿病性腎症の発生と進行の独立した危険因子であることが示され、それゆえ、この置換は、２型糖尿病における動脈圧に影響することにより、糖尿病性腎症に対する罹病性を付与することに寄与すると思われる。
【００９３】
しかしながら、２型糖尿病のうち、置換された対立遺伝子の保持者と非保持者との間の動脈圧等の臨床的パラメータのいかなる差異も同定できなかった。これは、この遺伝子多型が、糖尿病性腎症に対する罹病性にどのように寄与するのかについて正確な機構を明らかにするため、前向き無作為化臨床試験などのさらなる研究が必要であるが、このコトランスポーターにより調節される血圧以外の新規な因子が糖尿病性腎症の発症及び進行に寄与することが示唆される。
【００９４】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＧの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【００９５】
配列番号：２は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＡの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【００９６】
配列番号：３は、エキソン２３ ＋７８インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【００９７】
配列番号：４は、エキソン２３ ＋７８プライマーＦの配列である。
【００９８】
配列番号：５は、エキソン２３ ＋７８プライマーＲの配列である。
【００９９】
配列番号：６は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＧの配列である。
【０１００】
配列番号：７は、エキソン２３ ＋７８アレルプローブＡの配列である。
【０１０１】
配列番号：８は、イントロン２４ ＋１８７０アレルプローブＧの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０２】
配列番号：９は、イントロン２４ ＋１８７０アレルプローブＡの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０３】
配列番号：１０は、イントロン２４ ＋１８７０インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【０１０４】
配列番号：１１は、イントロン２４ ＋１８７０プライマーＦの配列である。
【０１０５】
配列番号：１２は、イントロン２４ ＋１８７０プライマーＲの配列である。
【０１０６】
配列番号：１３は、イントロン２５ ＋１３アレルプローブＣの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０７】
配列番号：１４は、イントロン２５ ＋１３アレルプローブＴの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１０８】
配列番号：１５は、イントロン２５ ＋１３インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【０１０９】
配列番号：１６は、イントロン２５ ＋１３プライマーＦの配列である。
【０１１０】
配列番号：１７は、イントロン２５ ＋１３プライマーＲの配列である。
【０１１１】
配列番号：１８は、イントロン２５ ＋１３アレルプローブＣの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１１２】
配列番号：１９は、イントロン２５ ＋２５００アレルプローブＴの配列であり、１〜１５位におけるｎは、任意の数であってよく、任意の塩基である。
【０１１３】
配列番号：２０は、イントロン２５ ＋２５００インベーダープローブの配列であり、２１位におけるｎは、任意の塩基である。
【０１１４】
配列番号：２１は、イントロン２５ ＋２５００プライマーＦの配列である。
【０１１５】
配列番号：２２は、イントロン２５ ＋２５００プライマーＲの配列である。
【０１１６】
【発明の効果】
本発明の糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法によれば、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定することができ、迅速に判定することができ、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出することができ、迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キットによれば、前記検出方法を行なうために用いることができ、糖尿病患者における糖尿病性腎症の易罹病性又は難罹病性を容易に判定することができ、迅速に判定することができ、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症に対する易罹病性又は難罹病性を付与しうる罹病性決定要因を、容易に検出することができ、迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の糖尿病患者の腎症の発症の予防又は該腎症の治療のための薬剤は、糖尿病患者、特に網膜症を伴う糖尿病患者において、糖尿病性腎症を併発する可能性を低減させることができるという優れた効果を奏する。
【０１１７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子周辺のＬＤマッピングを示す。ＬＤ係数は、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子におけるＳＮＰとＳＬＣ１２Ａ３中の目印ＳＮＰから２５０ｋｂ上流又は下流内のＳＮＰとの間で算出した。低い少数対立遺伝子頻度（＜０．１５）のＳＮＰは、計算には入れなかった。
【図２】図２は、ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子における遺伝的多様性を示す図である。図中、シャープ記号は、目印ＳＮＰを示し、「*」は、挿入／欠失多型を示し、十字は、１次スクリーニングで解析されたＳＮＰを示し、無印は、最初の陽性結果の後のさらなるサーチで同定されたＳＮＰを示す。
Claims (4)
- ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子を指標として用いることを特徴とする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法であって、糖尿病患者の核酸試料について、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基を同定するステップを含み、
（Ｉ’ ）該＋７８位に対応する塩基が、Ｇである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ＩＩ’ ）該＋７８位に対応する塩基が、Ａである場合、該核酸試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる、
糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法。 - ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ ３）遺伝子の発現産物を指標として用いることを特徴とする、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法であって、糖尿病患者のタンパク質試料について、前記ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子の発現産物中の９１３位に対応するアミノ酸残基を同定するステップを含み、
（ｉ）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、アルギニン（Ａｒｇ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する易罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となり、
（ｉｉ）該９１３位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン（Ｇｌｎ）である場合、該タンパク質試料中に、糖尿病性腎症に対する難罹病性を付与しうる罹病性決定要因が含まれることの指標となる、
糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出方法。 - 下記核酸：
（１’）ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖
を含有してなる、請求項１記載の検出方法を行なうための、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット。 - 下記核酸：
（１’）ヒト第１６染色体上のＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ｇである塩基配列からなる核酸若しくはその相補鎖、及び／又は
（２’） 該ＳＬＣ１２Ａ３遺伝子において、第２３エキソンの＋７８位に対応する塩基が、Ａである塩基配列からなる若しくはその相補鎖
が固定化された核酸アレイを含有してなる、請求項１記載の検出方法を行なうための、糖尿病性腎症に対する罹病性決定要因の検出用キット。
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