ES2561316T3 - Detección de la predisposición genética a estados asociados con la osteoartritis - Google Patents

Abstract

Método de detección de la predisposición para el riesgo de progresión de enfermedad grave y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis en un sujeto que comprende detectar en el sujeto el genotipo en IL1RN rs9005 G>A; en el que la presencia de genotipo G/G indica que el sujeto tiene predisposición a la progresión de enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de este genotipo indica que el sujeto no tiene predisposición a los mismos; y en el que la presencia de genotipo A/A o G/A indica que el sujeto está protegido frente a la progresión a enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de estos genotipos indica que el sujeto no está protegido frente a los mismos.

Description

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DESCRIPCION

Deteccion de la predisposicion genetica a estados asociados con la osteoartritis Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a un metodo y a kits para detectar una predisposicion a, determinar el riesgo de, y guiar la terapia para: discapacidad y disminucion de la funcion ffsica asociada con gravedad de osteoartritis, progresion de osteoartritis y osteoartritis incidente.

Antecedentes

La osteoartritis (OA) es un trastorno cronico de las articulaciones caracterizado por la degeneracion del cartflago articular y el hueso adyacente. La OA se considera generalmente una enfermedad degenerativa del envejecimiento, y la incidencia aumenta con la edad. La etiologfa de la osteoartritis es multifactorial, implicando factores tanto mecanicos como bioqmmicos. La osteoartritis afecta comunmente a las manos, los pies, la columna vertebral y articulaciones grandes fuera de la columna vertebral que soportan peso, tales como las caderas y las rodillas. Las articulaciones predominantemente afectadas son las que soportan peso e incluyen las rodillas, caderas, columna vertebral cervical y lumbosacra, y pies. Otras articulaciones comunmente afectadas incluyen las articulaciones interfalangicas distales (DIP) e interfalangicas proximales (PIP) de las manos. La osteoartritis primaria se refiere de manera general a la osteoartritis sin causa conocida. La osteoartritis secundaria se refiere de manera general a la osteoartritis resultante de alguna lesion externa o interna o enfermedad (obesidad, traumatismo repetido o cirugfa en las estructuras de las articulaciones, articulaciones anomalas en el nacimiento (anomalfas congenitas), gota, diabetes y otros trastornos hormonales).

La progresion estructural de la OA se evalua actualmente con vistas radiograficas simples midiendo la anchura del espacio articular (JSW) y/o el estrechamiento del espacio articular (JSN) a lo largo de un periodo de tiempo. (Altman et al.: Osteoarthritis Cartilage 1996, 4:217-243). La progresion de OA esta asociada con una degradacion acelerada del cartflago que conduce a estrechamiento del espacio articular, alteracion dolorosa de la articulacion y afectacion funcional. La progresion de la enfermedad de OA se caracteriza por un patron de expresion genica proinflamatorio en el cartflago y en el sinovio articular, con un aumento reactivo en la densidad osea en el hueso subcondral.

La osteoartritis es la enfermedad articular en adultos mas comun, afectando al 5-20% de la poblacion mundial y aumentando en cuanto a frecuencia y gravedad en todas las poblaciones que estan envejeciendo. La prevalencia estimada en EE.UU. es de 15-60 millones de pacientes; 300-1200 millones en todo el mundo. La implicacion de OA de la mano, rodilla, cadera y columna vertebral es comun, representando las artroplastias totales de rodilla mas de 300.000/ano en los EE.UU. y 700.000 mas en todo el mundo. Se espera que estas cifras aumenten en un 525% para 2030. Ademas, las artroplastias totales de cadera representan mas de 150.000/ano solo en los EE.UU. La OA puede implicar una unica articulacion o multiples articulaciones en el mismo individuo, centrandose la terapia actual en el alivio del dolor ya que no hay ninguna terapia aprobada por la FDA que detenga o invierta el deterioro articular.

Dado el aumento previsto en la prevalencia de la osteoartritis, existe una necesidad de identificar factores de riesgo para discapacidad y disminucion de la funcion ffsica asociada con osteoartritis, progresion de osteoartritis y osteoartritis incidente. Varios estudios han implicado factores, incluyendo factores geneticos, envejecimiento, lesion y deformidad de las articulaciones, obesidad y deficiencias hormonales en la patogenesis de la osteoartritis. Para optimizar el tratamiento de la OA, es importante aumentar el conocimiento referente a los factores pronostico de la progresion de OA. Tales factores pronostico pueden usarse para identificar grupos de alto riesgo para el desarrollo (o la aparicion) de OA y/o grupos de alto riesgo para la progresion de enfermedad grave de OA. Tal informacion de pacientes sera clmicamente util para el tratamiento clmico de pacientes con OA. Por ejemplo, si se sabe que un individuo con OA tiene un riesgo aumentado de progresion de enfermedad grave, el medico puede iniciar un tratamiento temprano con agentes modificadores de la enfermedad cuando esten disponibles. Tal informacion de pronostico tambien puede ser clmicamente util para orientar decisiones sobre el momento de cirugfa de artroplastia. El conocimiento sobre factores pronostico y la predisposicion de un individuo para la aparicion y la progresion grave de la enfermedad tambien es relevante para la investigacion clmica, tal como para evaluar y desarrollar intervenciones terapeuticas incluyendo terapias modificadoras de la enfermedad. Por ejemplo, dado que generalmente un pequeno porcentaje de pacientes con OA muestran evidencias radiograficas de progresion de la enfermedad en el plazo de un periodo de uno a tres anos, los ensayos clmicos de nuevos agentes terapeuticos suponen un reto. Dado que una parte sustancial de los sujetos de experimentos no mostraran progresion de la enfermedad durante el estudio, tradicionalmente se necesitan grandes numeros de sujetos para diferenciar compuestos activos de placebo. Ademas, dado que muchos sujetos tratados pueden no tener ninguna progresion medible, y por tanto ningun beneficio por el farmaco medible, el valor percibido de un farmaco eficaz puede ser muy inferior a su valor real para pacientes que tienen OA progresiva.

Grandes cantidades de datos proporcionan apoyo para un papel central de la interleucina-1 (IL-1) en la patogenesis de la OA incluyendo modelos de susceptibilidad en animales, modelos de terapia dirigida a IL-1 y estudios de asociacion genetica. ((Loughlin et al, Arthritis Rheum 2002;46(6): 1519-27; Meulenbelt et al, Arthritis Rheum

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2004;50(4):1 179-86; Moos et al, Arthritis Rheum 2000;43(11):2417-22; Stern et al, Osteoarthritis Cartilage 2003;1l(6):394-402; Smith et al, Genes Immun 2004;5(6):451-60; y Moxley et al, Osteoarthritis Cartilage 2007;15(10):1 106-12). Por ejemplo, evidencias de la bibliograffa sugieren que la predisposicion genetica es un determinante importante de la patologfa en pacientes con OA de mano (Moxley et al: Osteoarthritis Cartilage 2007;15(10):1 106-12). El arffculo de Stern et al (2003) comenta una asociacion de osteoartritis de mano erosiva con un polimorfismo de un unico nucleotido en el gen que codifica para IL-p. Aunque existe una bibliograffa sustancial sobre el papel de la IL-1 y en menor medida de la TNF-alfa (Botha-Scheepers et al, Ann Rheum Dis 2007) sobre la patogenesis de la OA, se ha realizado menos trabajo sobre asociaciones geneticas de estos mediadores inflamatorios. Tales asociaciones son necesarias para desarrollar terapias que se dirijan de manera apropiada a subpoblaciones de pacientes con OA cuya enfermedad es muy probable que responda a inhibidores de IL-1 y TNF. Ademas, sigue habiendo una necesidad de un marcador fiable para predecir que pacientes con osteoartritis experimental progresion de enfermedad grave.

Examen de genotipo

Los metodos tradicionales para examinar enfermedades hereditarias han dependido o bien de la identificacion de productos genicos anomalos (por ejemplo, anemia falciforme) o bien de un fenotipo anomalo (por ejemplo, retraso mental). Estos metodos tienen una utilidad limitada para enfermedades hereditarias con aparicion tardfa y sin fenotipos facilmente identificables tales como, por ejemplo, la enfermedad vascular. Con el desarrollo de metodologfa de examen genetico sencilla y economica, ahora es posible identificar polimorfismos que indican una propension a desarrollar enfermedad, incluso cuando la enfermedad es de origen poligenico. El numero de enfermedades que pueden examinarse mediante metodos de biologfa molecular continua creciendo al aumentar el entendimiento de la base genetica de trastornos multifactoriales.

El examen genetico (tambien denominado genotipado o examen molecular) puede definirse de manera amplia como pruebas para determinar si un paciente tiene mutaciones (alelos o polimorfismos) que o bien provocan un estado patologico o bien estan “ligados” a la mutacion que provoca un estado patologico. Ligamiento se refiere al fenomeno de que secuencias de ADN que estan proximas entre sf en el genoma tienen tendencia a heredarse juntas. Dos secuencias pueden estar ligadas debido a alguna ventaja selectiva de la herencia conjunta. Sin embargo, mas normalmente, dos secuencias polimorficas se heredan de manera conjunta debido a la infrecuencia relativa con la que se producen eventos de recombinacion meiotica dentro de la region entre los dos polimorfismos. Se dice que los alelos polimorficos heredados de manera conjunta estan en desequilibrio de ligamiento entre sf porque, en una poblacion de seres humanos dada, tienden o bien a producirse ambos juntos o bien a no producirse en absoluto en cualquier miembro particular de la poblacion. De hecho, cuando se encuentra que multiples polimorfismos en una region cromosomica dada estan en desequilibrio de ligamiento entre sf, definen un “haplotipo” genetico casi estable. En cambio, eventos de recombinacion que se producen entre dos loci polimorficos hacen que se separen en cromosomas homologos diferenciados. Si la recombinacion meiotica entre dos polimorfismos ffsicamente ligados se produce con suficiente frecuencia, parecera que los dos polimorfismos se segregan independientemente y se dice que estan en equilibrio de ligamiento.

Aunque la frecuencia de recombinacion meiotica entre dos marcadores es generalmente proporcional a la distancia ffsica entre ellos en el cromosoma, la aparicion de “puntos calientes” asf como regiones de recombinacion cromosomica reprimida pueden dar como resultado discrepancias entre la distancia ffsica y de recombinacion entre dos marcadores. Por tanto, en determinadas regiones cromosomicas, multiples loci polimorficos que abarcan un dominio cromosomico amplio pueden estar en desequilibrio de ligamiento entre sf, y de ese modo definir un haplotipo genetico de amplia extension. Ademas, cuando se encuentra una mutacion que provoca enfermedad dentro de, o en ligacion con, este haplotipo, pueden usarse uno o mas alelos polimorficos del haplotipo como indicador de diagnostico o de pronostico de la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Esta asociacion entre polimorfismos por lo demas benignos y un polimorfismo que provoca enfermedad se produce si la mutacion patologica surgio en el pasado reciente, de modo que no ha transcurrido tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio mediante eventos de recombinacion. Por tanto, la identificacion de un haplotipo humano que abarca o esta ligado con un cambio mutacional que provoca enfermedad, sirve como medida predictiva de la probabilidad de un individuo de haber heredado esa mutacion que provoca enfermedad. De manera importante, tales procedimientos de pronostico o diagnostico pueden usarse sin necesitar la identificacion y el aislamiento de la lesion real que provoca enfermedad. Esto es significativo porque la determinacion precisa del defecto molecular implicado en un proceso patologico puede ser diffcil y laboriosa, especialmente en el caso de enfermedades multifactoriales tales como trastornos inflamatorios.

De hecho, la correlacion estadfstica entre un trastorno inflamatorio y un polimorfismo de IL-1 no indica necesariamente que el polimorfismo provoque directamente el trastorno. En vez de eso, el polimorfismo correlacionado puede ser una variante alelica benigna que esta ligada con (es decir en desequilibrio de ligamiento con) una mutacion que provoca trastorno que se ha producido en el pasado evolutivo reciente del ser humano, de modo que no ha transcurrido tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio mediante eventos de recombinacion en el segmento cromosomico intercalado. Por tanto, para los fines de ensayos de diagnostico y de pronostico para detectar una enfermedad particular, puede usarse la deteccion de un alelo polimorfico asociado con esa enfermedad sin tener en cuenta si el polimorfismo esta directamente implicado en la etiologfa de la enfermedad. Ademas, cuando

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un locus polimorfico benigno dado esta en desequilibrio de ligamiento con un locus polimorfico que provoca enfermedad aparente, tambien es probable que todav^a otros loci polimorficos que estan en desequilibrio de ligamiento con el locus polimorfico benigno esten en desequilibrio de ligamiento con el locus polimorfico que provoca enfermedad. Por tanto, estos otros loci polimorficos tambien seran de pronostico o diagnostico de la probabilidad de haber heredado el locus polimorfico que provoca enfermedad. De hecho, puede seleccionarse como diana un haplotipo humano de amplia extension (que describe el patron tfpico de herencia conjunta de alelos de un conjunto de marcadores polimorficos ligados) para fines de diagnostico una vez que se ha extrafdo una asociacion entre una enfermedad o estado particular y un haplotipo humano correspondiente. Por tanto, la determinacion de la probabilidad de un individuo de desarrollar una enfermedad o estado particular puede realizarse caracterizando uno o mas alelos polimorficos asociados con enfermedad (o incluso uno o mas haplotipos asociados con enfermedad) sin determinar o caracterizar necesariamente la variacion genetica causante.

Genetica de la agrupacion genica de IL-1

La agrupacion genica de IL-1 esta en el brazo largo del cromosoma 2 (2q13) y contiene al menos nueve genes de IL1, incluyendo los genes bien descritos para IL-1 a (IL-1A), IL-1 p (IL-1B) y el antagonista de receptor de IL-1 (IL- 1RN), dentro de una region de 430 Kb (Nicklin, et al. (1994) Genomics, 19: 3824; Dunn 2001; Sims 2001; Nicklin 2002). Las moleculas agonistas, IL-1 a e IL-1 p, tienen una potente actividad proinflamatoria y estan al inicio de muchas cascadas inflamatorias. Sus acciones, con frecuencia a traves de la induccion de otras citocinas tales como IL-6 e IL-8, conducen a la activacion y al reclutamiento de leucocitos en un tejido danado, la produccion local de agentes vasoactivos, y respuesta de fiebre en el cerebro y respuesta en fase aguda hepatica. Las tres moleculas de IL-1 se unen a receptores de IL-1 de tipo I y de tipo II, pero solo el receptor de tipo I transduce una senal al interior de la celula. En cambio, el receptor de tipo II se desprende de la membrana celular y actua como receptor senuelo. Por tanto, el antagonista de receptor y el receptor de tipo II tienen ambos acciones antiinflamatorias.

La produccion inapropiada de IL-1 desempena un papel central en la patologfa de muchas enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide, trastorno inflamatorio del intestino, psoriasis y similares. Ademas, hay diferencias estables entre individuos en cuanto a las tasas de produccion de IL-1, y parte de esta variacion puede explicarse mediante diferencias geneticas en loci genicos de IL-1. Por tanto, los genes de IL-1 son candidatos razonables para determinar parte de la susceptibilidad genetica a enfermedades inflamatorias, la mayona de las cuales tienen una etiologfa multifactorial con un componente poligenico.

Se sabe que determinados alelos de la agrupacion genica de IL-1 estan asociados con estados patologicos particulares. Por ejemplo, se ha notificado que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) (patente estadounidense n.° 5.698.399) y el alelo 1 de IL-1Rn (VNTR) (Keen R W et al., (1998) Bone 23:367-371) estan asociados con OA. Ademas, se ha notificado que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) esta asociado con nefropatfa en diabetes mellitus (Blakemore, et al. (1996) Hum. Genet 97(3): 369-74), alopecia areata (Cork, et al., (1995) J. Invest. Dermatol. 104(5 Sup.): 15S-16S; Cork et al. (1996) Dermatol Clin 14: 671-8), enfermedad de Graves (Blakemore, et al. (1995) J. Clin. Endocrinol. 80(1): 111-5), lupus eritematoso sistemico (Blakemore, et al. (1994) Arthritis Rheum. 37: 1380-85), liquen escleroso (Clay, et al. (1994) Hum. Genet. 94: 407-10) y colitis ulcerosa (Mansfield, et al. (1994) Gastoenterol. 106(3): 63742)).

Ademas, se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1A del marcador-889 y el alelo 2 de IL-1B (TaqI) del marcador +3954 estan asociados con enfermedad periodontal (patente estadounidense n.° 5.686.246; Kornman y diGiovine (1998) Ann Periodont 3: 327-38; Hart y Kornman (1997) Periodontol 2000 14: 202-15; Newman (1997) Compend Contin Educ Dent 18: 8814; Kornman et al. (1997) J. Clin Periodontol 24: 72-77). Tambien se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1A del marcador-889 esta asociado con artritis cronica juvenil, particularmente iridociclitis cronica (McDowell, et al. (1995) Arthritis Rheum. 38: 221-28). Tambien se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1B (TaqI) del marcador +3954 de IL-1B esta asociado con psoriasis y diabetes insulinodependiente en pacientes con DR3/4 (di Giovine, et al. (1995) Cytokine 7: 606; Pociot, et al. (1992) Eur J. Clin. Invest. 22: 396-402). Adicionalmente, tambien se ha encontrado que el alelo 1 de IL-1RN (VNTR) esta asociado con retinopatfa diabetica (vease el documento estadounidense con n.° de serie 09/037472 y el documento PCT/GB97/02790). Ademas, se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) esta asociado con colitis ulcerosa en poblaciones caucasicas de Norteamerica y Europa (Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106: 637-42). Resulta interesante que esta asociacion es particularmente fuerte dentro de poblaciones de judfos Ashkenazi etnicamente relacionados (documento PCT WO97/25445).

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona metodos novedosos para determinar si un sujeto corre riesgo de progresion de enfermedad grave y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis. En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de deteccion de la predisposicion para el riesgo de progresion de enfermedad grave y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis en un sujeto que comprende detectar en el sujeto el genotipo en IL1RN rs9005 G>A;

en el que la presencia de genotipo G/G indica que el sujeto tiene predisposicion a la progresion de enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de este genotipo indica que el sujeto no tiene

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predisposicion a los mismos; y

en el que la presencia de genotipo A/A o G/A indica que el sujeto esta protegido frente a la progresion a enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de estos genotipos indica que el sujeto no esta protegido frente a los mismos.

En aun otro aspecto, la presente invencion proporciona el metodo anterior para seleccionar sujetos con osteoartritis para su inclusion en o exclusion de ensayos clmicos.

La disminucion de la funcion ffsica asociada con OA puede determinarse usando cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como midiendo la anchura del espacio articular (JSW) y/o el estrechamiento del espacio articular (JSN).

Segun algunas realizaciones, se proporcionan metodos para seleccionar sujetos con osteoartritis para su inclusion en o exclusion de ensayos clmicos basandose en la probabilidad de su progresion de la enfermedad y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis que comprenden determinar el tipo del acido nucleico del sujeto en el locus polimorfico IL 1RN rs9005 G>A, en los que el genotipo del sujeto con respecto a dicho locus proporciona informacion sobre el riesgo del sujeto para la progresion de enfermedad grave de osteoartritis, y permite la seleccion de sujetos de estudio que son adecuados para los criterios del ensayo clmico.

Preferiblemente, la etapa de deteccion del metodo se selecciona del grupo que consiste en: a) hibridacion de oligonucleotidos espedfica de alelo; b) analisis del tamano; c) secuenciacion; d) hibridacion; e) digestion con 5' nucleasa; f) polimorfismo de conformacion monocatenario; g) hibridacion espedfica de alelo; h) extension espedfica de cebador; e i) ensayo de ligacion de oligonucleotidos. Preferiblemente, antes de, o junto con, la deteccion, se somete la muestra de acido nucleico a una etapa de amplificacion.

Segun algunas realizaciones, el metodo de la invencion comprende ademas proporcionar recomendaciones para el tratamiento medico de la osteoartritis basandose en las necesidades predichas del sujeto a una determinada edad.

En la siguiente descripcion detallada y las reivindicaciones se exponen otras realizaciones y ventajas de la invencion.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

La presente invencion se basa al menos en parte, en la identificacion de determinados patrones de haplotipo y alelos inflamatorios y la asociacion (hasta un grado estadfsticamente significativo) de estos patrones con el desarrollo de estados relacionados con OA tales como progresion de la enfermedad de OA y progresion de JSN. Por tanto, la deteccion de los alelos que comprenden haplotipos y alelos asociados con OA en un sujeto puede indicar que el sujeto tiene o tiene predisposicion al desarrollo de un estado relacionado con OA particular. La osteoartritis tambien se conoce por muchos otros nombres: enfermedad degenerativa de las articulaciones, artritis hipertrofica, artritis traumatica y osteoartritis (Rottensten K., Chronic Dis Can. 1996; 17(3-4):92-107).

La progresion de la enfermedad de OA puede definirse en cuanto al grado de discapacidad, empeoramiento radiografico de OA y/o la necesidad de cirugfa (Dougados M., Arthritis Rheum. mayo de 2004; 50(5): 1360-5). La progresion de la enfermedad en osteoartritis es habitualmente lenta, y se produce a lo largo de anos o decadas. La tasa de progresion es variable entre individuos, y muchos pacientes con osteoartritis clmicamente diagnosticada pueden no padecer progresion apreciable o bien por sus smtomas o bien por cambios radiograficos a lo largo de largos periodos. La progresion radiografica grave es la complicacion mas temida de la OA, ya que sugiere una destruccion irreversible de las articulaciones.

Por tanto, la invencion proporciona un metodo de deteccion de la predisposicion para el riesgo de progresion de enfermedad grave y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis en un sujeto que comprende detectar en el sujeto el genotipo en IL1RN rs9005 G>A; en el que la presencia de genotipo G/G indica que el sujeto tiene predisposicion a la progresion de enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de este genotipo indica que el sujeto no tiene predisposicion a los mismos; y en el que la presencia de genotipo A/A o G/A indica que el sujeto esta protegido frente a la progresion a enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de estos genotipos indica que el sujeto no esta protegido frente a los mismos.

El conocimiento de los alelos particulares asociados con una susceptibilidad a desarrollar osteoartritis, junto o combinado con informacion sobre otros factores contribuyentes de OA permite una personalizacion de la prevencion o el tratamiento segun el perfil genetico del individuo, el objetivo de la “farmacogenomica”. Por tanto, la comparacion del perfil genetico de un individuo con el perfil de la poblacion para osteoartritis permite la seleccion de farmacos u otros regfmenes terapeuticos que se espera que sean seguros y eficaces para un paciente o poblacion de pacientes particular (es decir, un grupo de pacientes que tienen la misma alteracion genetica). Pueden centrarse recursos medicos de manera temprana en aquellos pacientes que corren riesgo de progresion y enfermedad grave.

Cualquier regimen de tratamiento o preventivo requiere un nivel de compromiso por parte del medico y el sujeto. Los

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metodos de la presente invencion ayudan a garantizar que se da el nivel requerido de atencion a aquellos que tienen predisposicion a riesgo aumentado de estados asociados con OA. Tales sujetos pueden elegir usar de manera agresiva farmacos contra la osteoartritis modificadores de la enfermedad (DMOAD), tambien denominados farmacos contra la osteoartritis modificadores de la estructura (SMOAD). Los DMOAD o agentes terapeuticos contra la OA se refieren a cualquier agente o regimen terapeutico (incluyendo medios farmaceuticos, nutraceuticos y quirurgicos) que previene o retrasa el desarrollo de, o alivia los smtomas de, osteoartritis en el sujeto. El agente terapeutico puede ser un polipeptido, peptidomimetico, acido nucleico u otra molecula organica o inorganica, preferiblemente una “molecula pequena” incluyendo vitaminas, minerales y otros nutrientes. Los DMOAD incluyen, pero no se limitan a, glucosamina, sulfato de condroitina, doxiciclina, risedronato, diacerema e hialuronano i.a. Los metodos de la presente invencion ayudaran a los medicos, pacientes y aseguradoras a decidir quien necesita estas modalidades.

Otra cuestion es la cirugfa de artroplastia. La articulacion sometida a artroplastia solo dura 15 anos, por lo que con frecuencia son necesarias segundas cirugfas diffciles en pacientes mas jovenes. Los metodos de la presente invencion pueden usarse para gestionar el tratamiento de la OA basandose en la probabilidad de progresion radiografica. Los metodos de la presente invencion pueden usarse para evaluar la probabilidad de que un sujeto requiera una primera o segunda cirugfa de artroplastia.

Con frecuencia la edad es una consideracion cuando se decide el momento de la cirugfa. La edad tambien influye en esa progresion de enfermedad. Para los fines del tratamiento medico de la OA, la edad puede dividirse en niveles asignandose opciones de tratamiento o desenlaces medicos a cada nivel. De esta manera, la progresion de la enfermedad puede tratarse a lo largo de toda la vida del sujeto. Pueden definirse cuatro niveles de edad como < 40 anos, 40-55 anos, 56-70 anos y >70 anos.

Varias escalas de clasificacion en grados estan disponibles para que los expertos en la tecnica correlacionen el grado radiografico de osteoartritis con el grado real de degeneracion de cartflago articular dentro de cualquier articulacion particular. Estas incluyen, pero no se limitan a, escalas de clasificacion en grados de Kellgren-Lawrence, Ahlback y Brandt. Vease Kellgren J, Lawrence J. Radiologic assessment of osteoarthritis. Ann Rheum Dis 1957; 16: 494-501; Ahlback S. Osteoarthritis of the knee: a radiographic investigation. Acta Radiol Diagn (Stockh) 1968; [sup. 227]: 7-72; Brandt K, Fife R, Braunstein E, Katz B. Radiographic grading of the severity of knee osteoarthritis: relation of the Kellgren and Lawrence grade to a grade based on joint space narrowing and correlation with arthroscopic evidence of articular cartilage degeneration. Arthritis Rheum 1989; 32:1584 -1591. El de Kellgren-Lawrence es el metodo preferido para evaluar la presencia y la gravedad de la osteoartritis. A continuacion se proporciona una breve explicacion de la escala de clasificacion en grados radiografica de Kellgren-Lawrence y la escala de clasificacion en grados radiografica de Brandt. Un experto en la tecnica apreciara las diferencias en los criterios y/o la metodologfa de estos y otros sistemas de clasificacion en grados conocidos en la tecnica, tambien se aprecia que estos sistemas de clasificacion en grados son equivalentes para la evaluacion de la presencia y la gravedad de la osteoartritis.

Escala de clasificacion en grados radiografica de Kellgren-Lawrence de osteoartritis

Grado de Osteoartritis

Descripcion

0 - Ninguna

Sin hallazgos radiograficos de osteoartritis

1 -Dudosa

Osteofitos minusculos de dudosa significacion clmica

2 - Minima

Osteofitos definidos con espacio articular no afectado

3 - Moderada

Osteofitos definidos con estrechamiento del espacio articular moderado

4 - Grave

Osteofitos definidos con estrechamiento del espacio articular grave y esclerosis subcondral

Escala de clasificacion en grados radiografica de Brandt de osteoartritis

Grado de Osteoartritis

Descripcion

0 - Ninguna

Sin hallazgos radiograficos de osteoartritis

1 -Dudosa

< 25% de estrechamiento del espacio articular con caractensticas secundarias

2 - Minima

50-75% de estrechamiento del espacio articular sin caractensticas secundarias

3 - Moderada

50-75% de estrechamiento del espacio articular con caractensticas secundarias

4 - Grave

> 75% de estrechamiento del espacio articular con caractensticas secundarias

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Medicion de la progresion de OA y progresion de JSW.

La conservacion de la integridad del cartflago articular se considera generalmente un aspecto importante de la OA que debe medirse en la evaluacion de la eficacia de cualquier tratamiento y como medida importante de evaluacion de la progresion de la enfermedad de OA. La distancia entre huesos en la radiograffa simple es la mejor medida sustituta disponible para el grosor del cartflago articular. La perdida de espacio articular dentro de la rodilla se ha equiparado con la perdida de cartflago articular. Por tanto, es comun que los medicos cuantifiquen este deterioro midiendo la cantidad de espacio entre los diferentes componentes de la articulacion. Un estrechamiento del espacio articular indica un empeoramiento de la osteoartritis. El estrechamiento del espacio articular (JSN) se usa con frecuencia como medida de desenlace para normalizar la posicion radioanatomica de la articulacion en examenes radiologicos en serie.

El estrechamiento del espacio articular o adelgazamiento del cartflago articular asociado con OA puede medirse usando cualquier metodo conocido en la tecnica. La obtencion de imagenes por resonancia magnetica es un metodo preferido para monitorizar la estructura de la articulacion. La anchura del espacio articular (JSW) radiografica por artrograffa de doble contraste es un metodo preferido. Se prefieren mediciones continuas de JSW. Alternativamente, puede usarse una JSW minima (es decir, JSW del compartimento medial medida en el punto mas estrecho). La progresion de OA puede medirse comparando la frecuencia con la que los sujetos muestran perdida de JSW. Esta frecuencia u otra medida de la tasa de JSN puede usarse para medir la progresion de OA.

Ensayos clmicos

Hay varios estudios que notifican los ensayos clmicos de supuestos farmacos contra OA modificadores de la enfermedad (DMOAD). Los metodos de la presente invencion le permitiran a un investigador seleccionar sujetos de estudio que corren un riesgo aumentado o un riesgo disminuido (dependiendo de los objetivos del estudio) de progresion de la enfermedad de OA. Segun una realizacion, se proporcionan metodos para seleccionar sujetos con osteoartritis para su inclusion en ensayos clmicos basandose en su predisposicion a la progresion de la enfermedad y tasa aumentada de estrechamiento del espacio articular de osteoartritis. Los sujetos que tienen un genotipo que indica que el sujeto tiene predisposicion a riesgos aumentados de progresion de la enfermedad y/o estrechamiento del espacio articular de osteoartritis pueden seleccionarse en un estudio que investiga la eficacia de determinados DMOAD. Los metodos de la presente invencion pueden usarse para seleccionar sujetos de estudio para ensayos clmicos que investigan la eficacia y seguridad de terapias para OA, la progresion de la enfermedad de Oa y/o la tasa de JSN.

Ademas, la capacidad de seleccionar como diana poblaciones que se espera que muestren el mayor beneficio clmico, basandose en el perfil genetico, puede permitir: 1) el reposicionamiento de farmacos ya comercializados; 2) el rescate de candidatos farmacologicos cuyo desarrollo clmico se ha interrumpido como un resultado de limitaciones de seguridad o eficacia, que son espedficos para subgrupos de pacientes; y 3) un desarrollo acelerado y menos costoso de agentes terapeuticos candidatos y un etiquetado de farmacos mas optimo (por ejemplo, ya que la medicion del efecto de diversas dosis de un agente sobre la mutacion causante es util para optimizar la dosis eficaz).

Deteccion de alelos

Pueden identificarse patrones de haplotipo detectando cualquiera de los alelos componentes usando cualquiera de una variedad de tecnicas disponibles, incluyendo: 1) realizar una reaccion de hibridacion entre una muestra de acido nucleico y una sonda que puede hibridarse con el alelo; 2) secuenciar al menos una parte del alelo; o 3) determinar la movilidad electroforetica del alelo o fragmentos del mismo (por ejemplo, fragmentos generados mediante digestion con endonucleasa). El alelo puede someterse opcionalmente a una etapa de amplificacion antes de la realizacion de la etapa de deteccion. Se seleccionan metodos de amplificacion preferidos del grupo que consiste en: reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), reaccion en cadena de la ligasa (LCR), amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), clonacion y variaciones de los anteriores (por ejemplo RT-PCR y amplificacion espedfica de alelo). Pueden seleccionarse oligonucleotidos necesarios para la amplificacion, por ejemplo, del interior de los loci genicos de IL-1, o bien que flanquean el marcador de interes (tal como se requiere para amplificacion por PCR) o bien que se solapan directamente con el marcador (tal como en la hibridacion por ASO). En una realizacion particularmente preferida, la muestra se hibrida con un conjunto de cebadores, que se hibridan en 5' y 3' en una secuencia sentido o antisentido con el alelo asociado con enfermedad vascular, y se somete a una amplificacion por PCR.

Tambien puede detectarse un alelo indirectamente, por ejemplo analizando el producto de protema codificado por el ADN. Por ejemplo, cuando el marcador en cuestion da como resultado la traduccion de una protema mutante, la protema puede detectarse mediante cualquiera de una variedad de metodos de deteccion de protemas. Tales metodos incluyen inmunodeteccion y pruebas bioqmmicas, tales como fraccionamiento por tamano, en el que la protema tiene un cambio del peso molecular aparente mediante truncamiento, elongacion, plegamiento alterado o modificaciones postraduccionales alteradas.

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Una orientacion general para disenar cebadores para amplificacion de secuencias genomicas cromosomicas humanas unicas es que presentan una temperatura de fusion de al menos aproximadamente 50°C, en la que puede estimarse una temperatura de fusion aproximada usando la formula Tfus =[2X(n.° de A o T)+4X(n.° de G o C)].

Estan disponibles muchos metodos para detectar alelos espedficos en loci polimorficos humanos. El metodo preferido para detectar un alelo polimorfico espedfico dependera, en parte, de la naturaleza molecular del polimorfismo. Por ejemplo, las diversas formas alelicas del locus polimorfico pueden diferir en un unico par de bases del ADN. Tales polimorfismos de un unico nucleotido (o SNP) son agentes de contribucion principales de la variacion genetica, que comprenden aproximadamente el 80% de todos los polimorfismos conocidos, y se estima que su densidad en el genoma humano es en promedio de 1 por cada 1.000 pares de bases. Los SNP se producen con la mayor frecuencia de forma bialelica unicamente en dos formas diferentes (aunque en teona son posibles hasta cuatro formas diferentes de un SNP, correspondientes a las cuatro bases de nucleotidos diferente que se producen en el ADN). No obstante, los SNP son mutacionalmente mas estables que otros polimorfismos, haciendo que sean adecuados para estudios de asociacion adecuados en los que se usa el desequilibrio de ligamiento entre marcadores y una variante desconocida para mapear mutaciones que provocan enfermedad. Ademas, dado que los SNP normalmente solo tienen dos alelos, pueden genotiparse mediante un ensayo de positivo/negativo simple en vez de una medicion de longitud, haciendo que sean mas susceptibles de automatizacion.

Esta disponible una variedad de metodos para detectar la presencia de un alelo polimorfico de un unico nucleotido particular en un individuo. Avances en este campo han proporcionado genotipado de SNP a gran escala preciso, facil y economico. Por ejemplo, muy recientemente se han descrito varias tecnicas nuevas incluyendo hibridacion espedfica de alelo dinamica (DASH), electroforesis en gel diagonal en serie de microplacas (MADGE), pirosecuenciacion, ligacion espedfica de oligonucleotidos, el sistema TaqMan asf como diversas tecnologfas de “chip” de ADN tales como los chips de SNP Affymetrix. Estos metodos requieren la amplificacion de la region genetica diana, normalmente mediante PCR. Todavfa otros metodos recien desarrollados, basados en la generacion de pequenas moleculas de senal mediante escision invasiva seguido por espectrometna de masas o sondas candado inmovilizadas y amplificacion en drculo rodante, podnan eliminar eventualmente la necesidad de PCR. A continuacion se resumen varios de los metodos conocidos en la tecnica para detectar polimorfismos de un unico nucleotido espedficos. Se entiende que el metodo de la presente invencion incluye todos los metodos disponibles.

Se han desarrollado varios metodos para facilitar el analisis de polimorfismos de un unico nucleotido. En una realizacion, el polimorfismo de una unica base puede detectarse usando un nucleotido resistente a exonucleasa especializado, tal como se da a conocer, por ejemplo, en Mundy, C. R. (patente estadounidense n.° 4.656.127). Segun el metodo, se permite que un cebador complementario a la secuencia alelica inmediatamente en 3' con respecto al sitio polimorfico se hibride con una molecula diana obtenida de un animal o ser humano particular. Si el sitio polimorfico en la molecula diana contiene un nucleotido que es complementario al derivado de nucleotido resistente a exonucleasa particular presente, entonces ese derivado se incorporara al final del cebador hibridado. Tal incorporacion hace que el cebador sea resistente a exonucleasa, y de ese modo permite su deteccion. Dado que se conoce la identidad del derivado resistente a exonucleasa de la muestra, un hallazgo de que el cebador se ha vuelto resistente a exonucleasas revela que el nucleotido presente en el sitio polimorfico de la molecula diana era complementario al del derivado de nucleotido usado en la reaccion. Este metodo tiene la ventaja de que no requiere la determinacion de grandes cantidades de datos de secuencias externas.

Opcionalmente, se usa un metodo basado en disolucion para determinar la identidad del nucleotido de un sitio polimorfico. Cohen, D. et al. (patente francesa 2.650.840; solicitud de PCT n.° WO91/02087). Como en el metodo de Mundy de la patente estadounidense n.° 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario a secuencias alelicas inmediatamente en 3' con respecto a un sitio polimorfico. El metodo determina la identidad del nucleotido de ese sitio usando derivados de didesoxinucleotidos marcados, que, si son complementarios al nucleotido del sitio polimorfico, se incorporaran en el extremo terminal del cebador.

Un metodo alternativo, conocido como analisis de fragmentos geneticos o GBATM se describe por Goelet, P. et al. (solicitud de PCT n.° 92/15712). El metodo de Goelet, P. et al. usa mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario a la secuencia en 3' con respecto a un sitio polimorfico. Por tanto, el terminador marcado que se incorpora se determina mediante el, y es complementario al, nucleotido presente en el sitio polimorfico de la molecula diana que esta evaluandose. Al contrario que el metodo de Cohen et al. (patente francesa 2.650.840; solicitud de PCT n.° WO91/02087) el metodo de Goelet, P. et al. es preferiblemente un ensayo en fase heterogenea, en el que el cebador o la molecula diana se inmoviliza en una fase solida.

Recientemente, se han descrito varios procedimientos de incorporacion de nucleotidos guiados por cebador para someter a ensayo sitios polimorficos en ADN (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estos metodos se diferencian de GBATM en cuanto a que todos ellos se basan en la incorporacion de desoxinucleotidos marcados para distinguir entre bases en un sitio polimorfico. En un formato de este tipo, dado que la senal es proporcional al numero de desoxinucleotidos incorporados, los polimorfismos que se producen en tramos del mismo nucleotido

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pueden dar como resultado senales que son proporcionales a la longitud del tramo (Syvanen, A.-C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).

Para mutaciones que producen terminacion prematura de la traduccion de la protema, la prueba de truncamiento de protema (PTT) ofrece un enfoque de diagnostico eficaz (Roest, et al., (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt, et al., (1994) Genomics 20:1-4). Para PTT, inicialmente se afsla ARN de tejido disponible y se somete a transcripcion inversa, y se amplifica mediante PCR el segmento de interes. Entonces se usan los productos de PCR de transcripcion inversa como molde para la amplificacion por PCR anidada con un cebador que contiene un promotor de ARN polimerasa y una secuencia para iniciar la traduccion eucariota. Tras la amplificacion de la region de interes, los motivos unicos incorporados en el cebador permiten la transcripcion y traduccion in vitro secuencial de los productos de PCR. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio de productos de traduccion, la aparicion de polipeptidos truncados indica la presencia de una mutacion que provoca la terminacion prematura de la traduccion. En una variacion de esta tecnica, se usa ADN (como contraposicion a ARN) como molde de PCR cuando la region de interes diana se deriva de un unico exon.

Puede utilizarse cualquier tipo de celula o tejido para obtener muestras de acido nucleico para su uso en el diagnostico descrito en el presente documento. En una realizacion preferida, la muestra de ADN se obtiene de un lfquido corporal, por ejemplo, sangre, obtenida mediante tecnicas conocidas (por ejemplo venopuncion) o saliva. Alternativamente, pueden realizarse pruebas de acido nucleico en muestras secas (por ejemplo cabello o piel). Cuando se usa ARN o protema, las celulas o tejidos que pueden usarse deben expresar un gen de IL-1.

Tambien pueden realizarse procedimientos de diagnostico in situ directamente sobre secciones de tejido (fijadas y/o congeladas) de tejido de paciente obtenido de biopsias o resecciones, de tal manera que no se necesita ninguna purificacion de acido nucleico. Pueden usarse reactivos de acido nucleico como sondas y/o cebadores para tales procedimientos in situ (vease, por ejemplo, Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).

Ademas de metodos que se centran principalmente en la deteccion de una secuencia de acido nucleico, tambien pueden evaluarse perfiles en tales esquemas de deteccion. Pueden generarse perfiles de huellas, por ejemplo, usando un procedimiento de presentacion diferencial, analisis de tipo Northern y/o RT-PCR.

Un metodo de deteccion preferido es la hibridacion espedfica de alelo usando sondas que se solapan con una region de al menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1 y que tienen aproximadamente 5, 10, 20, 25 o 30 nucleotidos alrededor de la mutacion o region polimorfica. Preferiblemente, varias sondas que pueden hibridarse espedficamente con otras variantes alelicas implicadas en una reestenosis se unen a un soporte de fase solida, por ejemplo, un “chip” (que puede contener hasta aproximadamente 250.000 oligonucleotidos). Pueden unirse oligonucleotidos a un soporte solido mediante una variedad de procedimientos, incluyendo litograffa. El analisis de deteccion de mutacion usando estos chips que comprenden oligonucleotidos, tambien denominadas “alineamientos de sondas de ADN”, se describe, por ejemplo, en Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244. Opcionalmente, un chip comprende todas las variantes alelicas de al menos una region polimorfica de un gen. Entonces se pone en contacto el soporte de fase solida con un acido nucleico de prueba y se detecta la hibridacion con las sondas espedficas. Por consiguiente, puede identificarse la identidad de numerosas variantes alelicas de uno o mas genes en un experimento de hibridacion simple.

Estas tecnicas tambien pueden comprender la etapa de amplificar el acido nucleico antes del analisis. Los expertos en la tecnica conocen tecnicas de amplificacion e incluyen, pero no se limitan a, clonacion, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), reaccion en cadena de la polimerasa de alelos espedficos (ASA), reaccion en cadena de la ligasa (LCR), reaccion en cadena de la polimerasa anidada, replicacion de secuencias autosostenida (Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificacion de la transcripcion (Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177) y Q-beta replicasa (Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197).

Pueden someterse a ensayo productos de amplificacion de una variedad de maneras, incluyendo analisis del tamano, digestion por restriccion seguida por analisis del tamano, deteccion de cebadores oligonucleotidicos marcados con etiqueta espedficos en los productos de reaccion, hibridacion de oligonucleotidos espedficos de alelo (ASO), deteccion de 5'-exonucleasa espedfica de alelo, secuenciacion, hibridacion, y similares.

Los medios de deteccion basados en PCR pueden incluir amplificacion multiplex de una pluralidad de marcadores simultaneamente. Por ejemplo, en la tecnica se conoce bien seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no se solapan en cuanto al tamano y que pueden analizarse simultaneamente. Alternativamente, es posible amplificar diferentes marcadores con cebadores que estan marcados de manera diferencial y por tanto pueden detectarse cada uno de manera diferencial. Evidentemente, los medios de deteccion basados en hibridacion permiten la deteccion diferencial de multiples productos de PCR en una muestra. En la tecnica se conocen otras tecnicas para permitir analisis de multiplex de una pluralidad de marcadores.

En una realizacion meramente ilustrativa, el metodo incluye las etapas de (i) recoger una muestra de celulas de un

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paciente, (ii) aislar acido nucleico (por ejemplo, genomico, ARNm o ambos) de las celulas de la muestra, (iii) poner en contacto la muestra de acido nucleico con uno o mas cebadores que se hibridan espedficamente en 5' y 3' con al menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1 en condiciones de tal manera que se produce hibridacion y amplificacion del alelo, y (iv) detectar el producto de amplificacion. Estos esquemas de deteccion son especialmente utiles para la deteccion de moleculas de acido nucleico si tales moleculas estan presentes en cantidades muy bajas.

En una realizacion preferida del metodo, el alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1 se identifica mediante alteraciones en patrones de escision con enzimas de restriccion. Por ejemplo, se afsla ADN de muestra y de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o mas endonucleasas de restriccion, y se determinan los tamanos de longitud de fragmentos mediante electroforesis en gel.

En aun otra realizacion, puede usarse cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciacion conocidas en la tecnica para secuenciar directamente el alelo. Las reacciones de secuenciacion a modo de ejemplo incluyen aquellas basadas en tecnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert ((1977) Proc. Natl Acad Sci USA 74:560) o Sanger (Sanger et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463). Tambien se contempla que puede usarse cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciacion automatizados cuando se realizan los ensayos objeto (vease, por ejemplo Biotechniques (1995) 19:448), incluyendo secuenciacion mediante espectrometna de masas (vease, por ejemplo, la publicacion PCT WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159). Resultara evidente para un experto en la tecnica que, para determinadas realizaciones, se necesita determinar la aparicion de solo una, dos o tres de las bases de acido nucleico en la reaccion de secuenciacion. Por ejemplo, puede llevarse a cabo localizacion de residuos de A o similar, por ejemplo, cuando solo se detecta un acido nucleico.

En una realizacion adicional, puede usarse proteccion frente a agentes de escision (tales como una nucleasa, hidroxilamina o tetroxido de osmio y con piperidina) para detectar bases con apareamiento erroneo en heteroduplex de ARN/ARN o ARN/ADN o ADN/AdN (Myers, et al. (1985) Science 230:1242). En general, la tecnica de “escision de apareamiento erroneo” comienza proporcionando heteroduplex formados mediante hibridacion de ARN o ADN (marcado) que contiene el alelo de tipo natural con la muestra. Los duplex bicatenarios se tratan con un agente que escinde regiones monocatenarias del duplex tales como las que existiran debido a apareamientos erroneos de pares de bases entre las cadenas de control y de muestra. Por ejemplo, pueden tratarse duplex de ARN/ADN con ARNasa y tratarse fubridos de ADN/ADN con S1 nucleasa para digerir enzimaticamente las regiones con apareamiento erroneo. En otras realizaciones, pueden tratarse duplex o bien ADN/ADN o bien ARN/ADN con hidroxilamina o tetroxido de osmio y con piperidina con el fin de digerir regiones con apareamiento erroneo. Tras la digestion de las regiones con apareamiento erroneo, entonces se separa el material resultante por tamano sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de mutacion. Vease, por ejemplo, Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; y Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realizacion preferida, el ADN o ARN de control puede marcarse para su deteccion.

En todavfa otra realizacion, la reaccion de escision de apareamiento erroneo emplea una o mas protemas que reconocen pares de bases con apareamiento erroneo en aDn bicatenario (las denominadas enzimas “de reparacion de apareamiento erroneo de ADN”). Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en apareamientos erroneos de G/A y la timidina ADN glicosilasa de celulas HeLa escinde T en apareamientos erroneos de G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). Segun una realizacion a modo de ejemplo, se hibrida una sonda basada en un alelo de un haplotipo de locus de IL-1 con un ADNc u otro producto de ADN de una(s) celula(s) de prueba. Se trata el duplex con una enzima de reparacion de apareamiento erroneo de ADN, y los productos de escision, si los hay, pueden detectarse a partir de protocolos de electroforesis o similares. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.459.039.

En otras realizaciones, se usaran alteraciones en la movilidad electroforetica para identificar un alelo de locus de IL- 1. Por ejemplo, puede usarse polimorfismo de conformacion monocatenario (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforetica entre acidos nucleicos mutantes y de tipo natural (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, vease tambien Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:7379). Se desnaturalizan fragmentos de ADN monocatenario de alelos de locus de IL-1 de muestra y de control y se deja que vuelvan a naturalizarse. La estructura secundaria de acidos nucleicos monocatenarios vana segun la secuencia, la alteracion resultante en la movilidad electroforetica permite la deteccion incluso de un cambio de una unica base. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede potenciarse usando ARN (en vez de ADN), en el que la estructura secundaria es mas sensible a un cambio en la secuencia. En una realizacion preferida, el metodo objeto usa analisis de heteroduplex para separar moleculas de heteroduplex bicatenarias basandose en cambios en la movilidad electroforetica (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).

En aun otra realizacion, se somete a ensayo el movimiento de alelos en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de agente desnaturalizante usando electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacion (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como metodo de analisis, se modificara el ADN para garantizar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo anadiendo un anclaje de GC de aproximadamente 40 pb de aDn rico en GC con alto punto de fusion mediante PCR. En una realizacion adicional, se usa un gradiente

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de temperature en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad de ADN de control y de muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

Los ejemplos de otras tecnicas para detectar alelos incluyen, pero no se limitan a, hibridacion de oligonucleotidos selectiva, amplificacion selectiva, o extension de cebadores selectiva. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores oligonucleotfdicos en los que la mutacion conocida o diferencia de nucleotidos (por ejemplo, en variantes alelicas) se situa de manera central y despues se hibrida con ADN diana en condiciones que permiten hibridacion unicamente si se encuentra un apareamiento perfecto (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230). Tales tecnicas de hibridacion de oligonucleotido espedficas de alelo pueden usarse para someter a prueba una mutacion o region polimorfica por cada reaccion cuando se hibridan oligonucleotidos con ADN diana amplificado por PCR o varias mutaciones o regiones polimorficas diferentes cuando los oligonucleotidos se unen a la membrana de hibridacion y se hibridan con ADN diana marcado.

Alternativamente, puede usarse tecnologfa de amplificacion espedfica de alelo que depende de la amplificacion por PCR selectiva junto con la presente invencion. Los oligonucleotidos usados como cebadores para la amplificacion espedfica pueden portar la mutacion o region polimorfica de interes en el centro de la molecula (de modo que la amplificacion depende de la hibridacion diferencial) (Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' de un cebador en el que, en condiciones apropiadas, puede evitarse el apareamiento erroneo, o reducir la extension de polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 1 1:238). Ademas, puede ser deseable introducir un sitio de restriccion novedoso en la region de la mutacion para crear deteccion basada en escision (Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se espera que en determinadas realizaciones tambien puede realizarse amplificacion usando ligasa Taq para la amplificacion (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). En tales casos, se producira ligacion unicamente si hay un apareamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia en 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutacion conocida en un sitio espedfico buscando la presencia o ausencia de amplificacion.

En otra realizacion, se lleva a cabo la identificacion de la variante alelica usando un ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA), tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.998.617 y en Landegren, U. et al. ((1988) Science 241:1077-1080). El protocolo de OLA usa dos oligonucleotidos que estan disenados para poder hibridarse con secuencias contiguas de una unica cadena de una diana. Uno de los oligonucleotidos esta unido a un marcador de separacion, por ejemplo, biotinilado, y el otro esta marcado de manera detectable. Si se encuentra la secuencia complementaria precisa en una molecula diana, los oligonucleotidos se hibridaran de tal manera que sus extremos terminales sean contiguos, y crearan un sustrato de ligacion. La ligacion permite entonces recuperar el oligonucleotido marcado usando avidina, u otro ligando de biotina. Nickerson, D. A. et al. han descrito un ensayo de deteccion de acido nucleico que combina atributos de PCR y OLA (Nickerson, D. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27). En este metodo, se usa PCR para lograr la amplificacion exponencial de ADN diana, que entonces se detecta usando OLA.

Se han desarrollado varias tecnicas basadas en este metodo de OLA y pueden usarse para detectar alelos de un haplotipo de locus de IL-1. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.593.826 da a conocer un OLA usando un oligonucleotido que tiene un grupo amino en 3' y un oligonucleotido fosforilado en 5' para formar un conjugado que tiene un enlace fosforamidato. En otra variacion de OLA descrita en Tobe et al. ((1996) Nucleic Acids Res 24: 3728), OLA combinado con PCR permite determinar el tipo de dos alelos en un unico pocillo de microtitulacion. Marcando cada uno de los cebadores espedficos de alelo con un hapteno unico, es decir digoxigenina y fluorescerna, cada reaccion de OLA puede detectarse usando anticuerpos espedficos de hapteno que estan marcados con diferentes indicadores enzimaticos, fosfatasa alcalina o peroxidasa del rabano. Este sistema permite la deteccion de los dos alelos usando un formato de alto rendimiento que conduce a la produccion de dos colores diferentes.

Los cebadores particularmente preferidos para su uso en un metodo de diagnostico incluyen SEQ ID NO: 1-25.

SNP

SEQ ID NO Proposito Secuencia

IL1RN rs9005 G>A

SEQ ID NO: 1 PCR TG AGC AAATGT GGCTCCTGG GGGTTGT

SEQ ID NO: 2

PCR CCC AAAGCCTGTC AAGGCCA AGGACAT

SEQ ID NO: 3

SBE GATGGCT GTGCCT CT GCCT GT CTCCCCCACC

IL1RN rs419598 T>C

SEQ ID NO: 4 PCR ACAAGTTCTGGGGGACACAG

SEQ ID NO: 5

PCR AGGCCATGGTGCTGCAGACA

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IL 1RN rs315952 T>C

SEQ ID NO: 7 PCR GCCTCAGCTCTCACCTGCCCA TCTTTTG

SEQ ID NO: 8

PCR AGGCAGCATGGAGGCTGGTC AGTTGAA

SEQ ID NO: 9

SBE GACAAGCGCTTCGCCTTCATC CGCTCAGACAG

PCR = Reaccion en cadena de la polimerasa SBE = Genotipado por extension de una unica base

El diseno de oligonucleotidos adicionales para su uso en la amplificacion y deteccion de alelos polimorficos de IL-1 se facilita por la disponibilidad tanto de informacion de secuencia actualizada del cromosoma humano 2q 13 (que contiene el locus de IL-1 humana) como de informacion de polimorfismos humanos actualizada disponible para este locus. Por ejemplo, la secuencia de ADN para IL-1A, IL-1B e IL-1RN puede encontrarse en el sitio web del National Center for Biotechnology Information (
http://www.ncbi.nlm-nih.gov/) usando el registro de GenBank n.° X03833, n.° X04500 y n.° X64532 respectivamente. Pueden disenarse facilmente cebadores adecuados para la deteccion de un polimorfismo humano en estos genes usando esta informacion de secuencia y tecnicas convencionales conocidas en la tecnica para el diseno y la optimizacion de secuencias de cebadores. El diseno optimo de tales secuencias de cebador puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de programas de seleccion de cebadores comercialmente disponibles tales como Primer 2.1, Primer 3 o GeneFisher (vease tambien, Nicklin M. H. J., Weith A. Duff G. W., “A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1a, interleukin-1 p, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes” Genomics 19: 382 (1995); Nothwang H. G., et al. “Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13” Genomics 41: 370 (1997); Clark, et al. (1986) Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914 [aparece una fe de erratas publicada en Nucleic Acids Res., 15:868 (1987) y el proyecto Genome Database (GDB)).

Adicionalmente se dan a conocer kits para realizar los ensayos descritos anteriormente. Los kits pueden incluir medios para determinar si un sujeto porta al menos un alelo que comprende un haplotipo o alelo asociado con OA. El kit tambien puede contener medios de recogida de muestra de acido nucleico. El kit tambien puede contener una muestra de control o bien positiva o bien negativa o un patron y/o un dispositivo algontmico para evaluar los resultados y reactivos y componentes adicionales incluyendo: reactivos de amplificacion de ADN, ADN polimerasa, reactivos de amplificacion de acido nucleico, enzimas restrictivas, tampones, un dispositivo de toma de muestras de acido nucleico, dispositivo de purificacion de ADN, desoxinucleotidos, oligonucleotidos (por ejemplo sondas y cebadores), etc.

Para su uso en un kit, los oligonucleotidos pueden ser cualquiera de una variedad de composiciones naturales y/o sinteticas tales como oligonucleotidos sinteticos, fragmentos de restriccion, ADNc, acidos nucleicos peptfdicos sinteticos (ANP), y similares. El kit y metodo de ensayo tambien pueden emplear oligonucleotidos marcados para permitir la facilidad de identificacion en los ensayos. Los ejemplos de marcadores que pueden emplearse incluyen radiomarcadores, enzimas, compuestos fluorescentes, estreptavidina, avidina, biotina, restos magneticos, restos de union a metales, restos de anticuerpos o antfgenos, y similares.

Tal como se describio anteriormente, el control puede ser un control positivo o negativo. Ademas, la muestra de control puede contener los productos positivos (o negativos) de la tecnica de deteccion de alelo empleada. Por ejemplo, cuando la tecnica de deteccion de alelo es amplificacion por PCR, seguida por fraccionamiento por tamano, la muestra de control puede comprender fragmentos de ADN del tamano apropiado. Asimismo, cuando la tecnica de deteccion de alelo implica deteccion de una protema mutada, la muestra de control puede comprender una muestra de protema mutada. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control comprenda el material que va a someterse a prueba. Por ejemplo, los controles pueden ser una muestra de ADN genomico o una parte clonada de la agrupacion genica de IL-1. Sin embargo, preferiblemente la muestra de control es una muestra altamente purificada de ADN genomico cuando la muestra que va a someterse a prueba es ADN genomico.

Los oligonucleotidos presentes en dicho kit pueden usarse para la amplificacion de la region de interes o para la hibridacion directa de oligonucleotidos espedficos de alelo (ASO) con los marcadores en cuestion. Por tanto, los oligonucleotidos pueden o bien flanquear el marcador de interes (tal como se requiere para amplificacion por PCR) o bien solaparse directamente con el marcador (tal como en la hibridacion por ASO).

La informacion obtenida usando los ensayos y kits descritos en el presente documento (sola o junto con informacion sobre otro defecto genetico o factor del entorno, que contribuye a la osteoartritis) es util para determinar si un sujeto asintomatico tiene o es probable que desarrolle la enfermedad o el estado particular. Ademas, la informacion puede permitir un enfoque mas personalizado para prevenir la aparicion o progresion de la enfermedad o el estado. Por ejemplo, esta informacion puede permitirle a un medico recetar mas eficazmente una terapia que tratara la base molecular de la enfermedad o el estado.

El kit tambien puede incluir, opcionalmente, medios de toma de muestras de ADN. Un experto en la tecnica conoce bien medios de toma de muestras de ADN y pueden incluir, pero no se limitan a, sustratos, tales como papeles de

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filtro, AmpliCard™ (University of Sheffield, Sheffield, Inglaterra S10 2JF; Tarlow, J W, et al., J. of Invest. Dermatol. 103:387-389 (1994)) y similares; reactivos de purificacion de ADN tales como kits de NucleonTM, tampones de lisis, disoluciones de proteinasa y similares; reactivos de PCR, tales como tampones de reaccion 10X, polimerasa termoestable, dNTP, y similares; y medios de deteccion de alelos tales como la enzima de restriccion Hinfl, oligonucleotidos espedficos de alelo, cebadores oligonucleotidicos degenerados para PCR anidada a partir de sangre seca.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos comunmente por un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque en la practica o pruebas de la presente invencion pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados.

En caso de conflicto, primara la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos, no se pretende que sean limitativos. Otras caractensticas y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y las reivindicaciones.

Tal como se usa a lo largo de esta divulgacion, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a “una composicion” incluye una pluralidad de tales composiciones, asf como una composicion individual, y una referencia a “un agente terapeutico” es una referencia a uno o mas agentes terapeuticos y/o farmaceuticos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente.

El termino “alelo” se refiere a las diferentes variantes de secuencia encontradas en diferentes regiones polimorficas. Por ejemplo, IL-1RN (VNTR) tiene al menos cinco alelos diferentes. Las variantes de secuencia pueden ser cambios de una unica base o de multiples bases, incluyendo sin limitacion inserciones, deleciones o sustituciones, o pueden ser un numero variable de repeticiones de secuencia.

El termino “patron alelico” se refiere a la identidad de un alelo o alelos en una o mas regiones polimorficas. Por ejemplo, un patron alelico puede consistir en un unico alelo en un sitio polimorfico, tal como para el alelo 1 de IL-1RN (VNTR), que es un patron alelico que tiene al menos una copia del alelo 1 de IL-1 RN en VNTR de los loci genicos de IL-1RN. Alternativamente, un patron alelico puede consistir en un estado o bien homocigotico o bien heterocigotico en un unico sitio polimorfico. Por ejemplo, el alelo 2,2 de IL-1-RN (VNTR) es un patron alelico en el que hay dos copias del segundo alelo en el marcador VNTR de IL-1RN que corresponde al estado de alelo 2 de IL- RN (VNTR) homocigotico. Alternativamente, un patron alelico puede consistir en la identidad de alelos en mas de un sitio polimorfico.

La “actividad biologica” o “bioactividad” o “actividad” o “funcion biologica”, que se usan de manera intercambiable, para los fines en el presente documento significan una funcion efectora o antigenica que se realiza directa o indirectamente por un polipeptido de IL-1 (ya sea en su conformacion nativa o desnaturalizada), o mediante cualquier subsecuencia de la misma. Las actividades biologicas incluyen union a un peptido diana, por ejemplo, un receptor de IL-1. Una bioactividad de IL-1 puede modularse afectando directamente a un polipeptido de IL-1. Alternativamente, una bioactividad de IL-1 puede modularse modulando el nivel de un polipeptido de IL-1, tal como modulando la expresion de un gen de IL-1.

Tal como se usa en el presente documento el termino “fragmento bioactivo de un polipeptido de IL-1” se refiere a un fragmento de un polipeptido de IL-1 de longitud completa, en el que el fragmento imita o antagoniza espedficamente la actividad de un polipeptido de IL-1 de tipo natural. El fragmento bioactivo es preferiblemente un fragmento que puede interaccionar con un receptor de interleucina.

Los terminos “control” o “muestra de control” se refieren a cualquier muestra apropiada para la tecnica de deteccion empleada. La muestra de control puede contener los productos de la tecnica de deteccion de alelo empleada o el material que va a someterse a prueba. Ademas, los controles pueden ser controles positivos o negativos. A modo de ejemplo, cuando la tecnica de deteccion de alelo es amplificacion por PCR, seguida por fraccionamiento por tamano, la muestra de control puede comprender fragmentos de ADN de un tamano apropiado. Asimismo, cuando la tecnica de deteccion de alelo implica la deteccion de una protema mutada, la muestra de control puede comprender una muestra de una protema mutante. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control comprenda el material que va a someterse a prueba. Por ejemplo, los controles pueden ser una muestra de ADN genomico o una parte clonada de la agrupacion genica de IL-1. Sin embargo, cuando la muestra que va a someterse a prueba es ADN genomico, la muestra de control es preferiblemente una muestra altamente purificada de ADN genomico.

Las expresiones “alteracion del gen” y “alteracion dirigida” o cualquier expresion similar se refieren a la interrupcion espedfica del sitio de una secuencia de ADN nativa para prevenir la expresion de ese gen en la celula en comparacion con la copia de tipo natural del gen. La interrupcion puede provocarse mediante deleciones,

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inserciones o modificaciones en el gen, o cualquier combinacion de las mismas.

Se pretende que el termino “haplotipo” tal como se usa en el presente documento se refiera a un conjunto de alelos que se heredan juntos como grupo (estan en desequilibrio de ligamiento) a niveles estadfsticamente significativos (Pcorr <0,05). Tal como se usa en el presente documento, la expresion “un haplotipo de IL-1” se refiere a un haplotipo en los loci de IL-1. Un haplotipo proinflamatorio o inflamatorio de IL-1 se refiere a un haplotipo que es indicativo de actividades agonistas aumentadas y/o antagonistas disminuidas.

Los terminos “agrupacion genica de IL-1” y “loci de IL-1” tal como se usan en el presente documento incluyen todo el acido nucleico en o cerca de la region 2q13 del cromosoma 2, incluyendo al menos los genes de IL-1A, IL-1B e IL- 1RN y cualquier otra secuencia unida (Nicklin et al., Genomics 19: 382-84, 1994). Los terminos “IL-1A”, “IL-1B” e “IL- 1RN” tal como se usan en el presente documento se refieren a los genes que codifican para IL-1 alfa, IL-1 beta y antagonista de receptor de IL-1, respectivamente. El numero de registro genico para IL-1A, IL-1B e IL-1RN es X03833, X04500 y x64532, respectivamente.

“Mutacion funcional de IL-1” se refiere a una mutacion dentro de la agrupacion genica de IL-1 que da como resultado un fenotipo alterado (es decir, afecta a la funcion de un gen o protema de IL-1). Los ejemplos incluyen: alelo 2 de IL- 1A (+4845), alelo 2 de IL-1B (-3737), alelo 2 de IL-1B (+6912), alelo 2 de IL-1B (-31) y alelo 2 de IL-1RN (+2018).

“Alelo Y de IL-1 X (Z)” se refiere a una forma alelica particular, denominada Y, que se produce en un sitio polimorfico de locus de IL-1 en el gen X, en el que X es IL-1 A, B o RN y situada en o cerca del nucleotido Z, en el que el nucleotido Z se numera con respecto al sitio de inicio de la transcripcion principal, que es el nucleotido +1, del gen X de IL-1 particular. Tal como se usa adicionalmente en el presente documento, el termino “alelo de IL-1 X (Z)” se refiere a todos los alelos de un sitio polimorfico de IL-1 en el gen X situados en o cerca del nucleotido Z. Por ejemplo, el termino “alelo de IL-1RN (+2018)” se refiere a formas alternativas del gen de IL-1RN en el marcador +2018. “Alelo 2 de IL-1RN (+2018)” se refiere a una forma del gen de IL-1RN que contiene una citosina (C) en la posicion +2018 de la cadena sentido. Clay et al., Hum. Genet. 97:723-26, 1996. “Alelo 1 de IL-1RN (+2018)” se refiere a una forma del gen de IL-1 RN que contiene una timina (T) en la posicion +2018 de la cadena positiva. Cuando un sujeto tiene dos alelos de IL-1RN identicos, se dice que el sujeto es homocigotico, o que tiene el estado homocigotico. Cuando un sujeto tiene dos alelos de IL-1RN diferentes, se dice que el sujeto es heterocigotico, o que tiene el estado heterocigotico. El termino “alelo 2,2 de IL-1RN (+2018)” se refiere al estado de alelo 2 de IL-1RN (+2018) homocigotico. A la inversa, el termino “alelo 1,1 de IL-1RN (+2018)” se refiere al estado de alelo 1 de IL-1RN (+2018) homocigotico. El termino “alelo 1,2 de IL-1RN (+2018)” se refiere al estado de alelo 1 y 2 heterocigotico.

Alternativamente, un alelo se nombra mediante el nucleotido en el sitio polimorfico. Por ejemplo, “alelo T de IL-1RN (+2018)” se refiere a una forma del gen de IL-1 RN que contiene una timina (T) en la posicion +2018 de la cadena positiva.

Se pretende que “relacionado con IL-1” tal como se usa en el presente documento incluya todos los genes relacionados con los genes del locus de IL-1 humana en el cromosoma humano 2 (2q 12-14). Estos incluyen genes de IL-1 de la agrupacion genica de IL-1 humana ubicados en el cromosoma 2 (2q 13-14) que incluyen: el gen de IL-1 A que codifica para interleucina-1a, el gen de IL-1B que codifica para interleucina-1p, y el gen de IL- 1RN (o IL-1ra) que codifica para el antagonista de receptor de interleucina-1. Ademas estos genes relacionados con IL-1 incluyen los genes de receptor de IL-1 humana de tipo I y tipo II ubicados en el cromosoma humano 2 (2q12) y sus homologos de raton ubicados en el cromosoma de raton 1 en la posicion 19,5 cM. La interleucina-1 a, la interleucina- 1p y la interleucina-1RN estan relacionadas en la medida en que todas se unen a receptores de tipo I de IL-1, sin embargo solo la interleucina-1a y la interleucina-1p son ligandos agonistas que activan receptores de tipo I de IL-1, mientras que la interleucina-1RN es un ligando antagonista que se produce de manera natural. Cuando se usa el termino “IL-1” en referencia a un polipeptido o producto genico, se pretende que haga referencia a todos los productos genicos codificados por el locus de interleucina-1 en el cromosoma humano 2 (2q 12-14) y sus correspondientes homologos de otras especies o variantes funcionales de los mismos. Por tanto, el termino IL-1 incluye polipeptidos secretados que fomentan una respuesta inflamatoria, tales como IL-1 a e IL-1 p, asf como un polipeptido secretado que antagoniza respuestas inflamatorias, tales como antagonista de receptor de IL-1 y el receptor de tipo II (senuelo) de IL-1.

Un “receptor de IL-1” o “IL-1 R” se refiere a diversos receptores de protemas unidos a membrana celular que pueden unirse a y/o transducir una senal de un ligando codificado por el locus de IL-1. El termino se aplica a cualquiera de las protemas que pueden unirse a moleculas de interleucina-1 (IL-1) y, en su configuracion nativa como protemas de membrana plasmatica de mairnfero, supuestamente desempenan un papel en la transduccion de la senal proporcionada por IL-1 a una celula. Tal como se usa en el presente documento, el termino incluye analogos de protemas nativas con actividad de union a IL-1 o transduccion de senal. Los ejemplos incluyen los receptores de IL-1 humano y murino descritos en la patente estadounidense n.° 4.968.607. El termino “acido nucleico de IL-1” se refiere a un acido nucleico que codifica para una protema de IL-1.

Se pretende que un “polipeptido de IL-1” y una “protema de IL-1” abarquen polipeptidos que comprenden la

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secuencia de aminoacidos codificada por las secuencias de ADN genomico de IL-1 identificadas por los numeros de registro de GenBank X03833, X04500 y X64532, o fragmentos de los mismos, y homologos de los mismos e incluyen polipeptidos agonistas y antagonistas.

“Riesgo aumentado” se refiere a una frecuencia de aparicion estadfsticamente superior de la enfermedad o el estado en un individuo que porta un alelo polimorfico particular en comparacion con la frecuencia de aparicion de la enfermedad o el estado en un miembro de una poblacion que no porta el alelo polimorfico particular.

Se pretende que el termino “interaccionar” tal como se usa en el presente documento incluya relaciones o asociaciones detectables (por ejemplo interacciones bioqmmicas) entre moleculas, tales como interacciones de naturaleza entre protema-protema, protema-acido nucleico, acido nucleico-acido nucleico y protema-molecula pequena o acido nucleico-molecula pequena.

El termino “aislado” tal como se usa en el presente documento con respecto a acidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moleculas separadas de otros ADN, o ARN, respectivamente, que estan presentes en la fuente natural de la macromolecula. Por ejemplo, preferiblemente un acido nucleico aislado que codifica para uno de los polipeptidos de IL-1 objeto no incluye mas de 10 kilobases (kb) de secuencia de acido nucleico que flanquea inmediatamente de manera natural el gen de IL-1 en ADN genomico, mas preferiblemente no mas de 5 kb de tales secuencias de flanqueo que se producen de manera natural, y lo mas preferiblemente menos de 1,5 kb de tal secuencia de flanqueo que se produce de manera natural. El termino aislado tal como se usa en el presente documento tambien se refiere a un acido nucleico o peptido que esta sustancialmente libre de material celular, material viral, o medio de cultivo cuando se produce mediante tecnicas de ADN recombinante, o precursores qmmicos u otros productos qmmicos cuando se sintetiza de manera qmmica. Ademas, se pretende que un “acido nucleico aislado” incluya fragmentos de acido nucleico que no se producen de manera natural como fragmentos y no se encontrara en el estado natural. El termino “aislado” tambien se usa en el presente documento para hacer referencia a polipeptidos que se afslan de otras protemas celulares y se pretende que abarque polipeptidos tanto purificados como recombinantes.

“Desequilibrio de ligamiento” se refiere a la herencia conjunta de dos alelos a frecuencias mayores que lo que se esperana a partir de las frecuencias de aparicion separadas de cada alelo en una poblacion de control dada. La frecuencia de aparicion esperada de dos alelos que se heredan de manera independiente es la frecuencia del primer alelo multiplicada por la frecuencia del segundo alelo. Se dice que los alelos que se producen de manera conjunta a las frecuencias esperadas estan en “desequilibrio de ligamiento”. Con frecuencia la causa del desequilibrio de ligamiento no queda clara. Puede deberse a la seleccion de determinadas combinaciones de alelos o a la reciente mezcla de poblaciones geneticamente heterogeneas. Ademas, en el caso de marcadores que estan muy estrechamente ligados a un gen de enfermedad, se espera una asociacion de un alelo (o grupo de alelos ligados) con el gen de enfermedad si la mutacion de enfermedad se produjo en el pasado reciente, de modo que no ha transcurrido un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio mediante eventos de recombinacion en la region cromosomica espedfica. Cuando se hace referencia a patrones alelicos que estan compuestos por mas de un alelo, un primer patron alelico esta en desequilibrio de ligamiento con un segundo patron alelico si todos los alelos que comprenden el primer patron alelico estan en desequilibrio de ligamiento con al menos uno de los alelos del segundo patron alelico. Un ejemplo de desequilibrio de ligamiento es el que se produce entre los alelos en los sitios polimorficos de IL-1Rn (+2018) e IL-1RN (VNTR). Los dos alelos en IL-1RN (+2018) estan en desequilibrio de ligamiento al 100% con los dos alelos mas frecuentes de IL-1RN (VNTR), que son el alelo 1 y el alelo 2.

El termino “marcador” se refiere a una secuencia en el genoma que se sabe que vana entre individuos. Por ejemplo, el gen de IL-1RN tiene un marcador que consiste en un numero variable de repeticiones en tandem (VNTR).

Un “gen mutado” o “mutacion” o “mutacion funcional” se refieren a una forma alelica de un gen, que puede alterar el fenotipo de un sujeto que tiene el gen mutado con respecto a un sujeto que no tiene el gen mutado. El fenotipo alterado provocado por una mutacion puede corregirse o compensarse mediante determinados agentes. Si un sujeto debe ser homocigotico para esta mutacion para tener un fenotipo alterado, se dice que la mutacion es recesiva. Si una copia del gen mutado es suficiente para alterar el fenotipo del sujeto, se dice que la mutacion es dominante. Si un sujeto tiene una copia del gen mutado y tiene un fenotipo que es intermedio entre el de un sujeto que es homocigotico para el gen de tipo natural y el de un sujeto homocigotico para el gen mutado, se dice que la mutacion es codominante.

Un “animal no humano” de la invencion incluye mairnferos tales como roedores, primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, etc., anfibios, tales como miembros del genero Xenopus, y aves transgenicas (por ejemplo pollos, pajaros, etc.). El termino “animal quimerico” se usa en el presente documento para hacer referencia a animales en los que se encuentra el gen recombinante, o en los que el gen recombinante se expresa en algunas, pero no en todas, las celulas del animal. El termino “animal quimerico espedfico de tejido” indica que uno de los genes de IL-1 recombinantes esta presente y/o se expresa o altera en algunos tejidos pero no en otros. El termino “mam^fero no humano” se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia, a excepcion de los seres humanos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “acido nucleico” se refiere a polinucleotidos u oligonucleotidos

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tales como acido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando sea apropiado, acido ribonucleico (ARN). Tambien debe entenderse que el termino incluye, como equivalentes, analogos o bien de ARN o bien de ADN preparados a partir de analogos de nucleotidos (por ejemplo acidos nucleicos peptfdicos) y, segun sea aplicable para la realizacion que este describiendose, polinucleotidos monocatenarios (sentido o antisentido) y bicatenarios.

El termino “polimorfismo” se refiere a la coexistencia de mas de una forma de un gen o parte (por ejemplo, variante alelica) del mismo. Una parte de un gen del que hay al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de nucleotidos diferentes, se denomina “region polimorfica de un gen”. Una secuencia genetica espedfica en una region polimorfica de un gen es un alelo. Una region polimorfica puede ser un unico nucleotido, cuya identidad difiere en diferentes alelos. Una region polimorfica tambien puede tener varios nucleotidos de longitud.

El termino “propension a enfermedad”, tambien “predisposicion” o “susceptibilidad” a enfermedad o cualquier expresion similar, significa que determinados alelos se descubre mediante el presente documento que estan asociados con, o predicen, la incidencia en un sujeto de desarrollar una enfermedad particular (por ejemplo una enfermedad vascular). Por tanto, los alelos se representan de manera excesiva en cuanto a la frecuencia en individuos con enfermedad en comparacion con individuos sanos. Por tanto, estos alelos pueden usarse para predecir la enfermedad incluso en individuos antes de los smtomas o antes de la enfermedad.

Se pretende que “molecula pequena” tal como se usa en el presente documento se refiera a una composicion que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente 4 kD. Las moleculas pequenas pueden ser acidos nucleicos, peptidos, peptidomimeticos, hidratos de carbono, lfpidos u otras moleculas organicas o inorganicas.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “se hibrida espedficamente” o “detecta espedficamente” se refiere a la capacidad de una molecula de acido nucleico para hibridarse con al menos aproximadamente 6 nucleotidos consecutivos de un acido nucleico de muestra.

“Secuencia reguladora de la transcripcion” es un termino generico usado a lo largo de la memoria descriptiva para hacer referencia a secuencias de ADN, tales como senales de iniciacion, potenciadores y promotores, que inducen o controlan la transcripcion de secuencias que codifican para protemas con las que estan operativamente unidas.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “transgen” significa una secuencia de acido nucleico (que codifica, por ejemplo, para uno de los polipeptidos de IL-1, o un transcrito antisentido de los mismos) que se ha introducido en una celula. Un transgen debe ser parcial o totalmente heterologo, es decir, foraneo, para la celula o el animal transgenico en el que se introduce, o, es homologo para un gen endogeno de la celula o el animal transgenico en el que se introduce, pero que se disena para insertarse, o se inserta, en el genoma del animal de tal manera que se altera el genoma de la celula en la que se inserta (por ejemplo, se inserta en una ubicacion que difiere de la del gen natural o su insercion da como resultado una desactivacion). Un transgen tambien puede estar presente en una celula en forma de un episoma. Un transgen puede incluir una o mas secuencias reguladoras de la transcripcion y cualquier otro acido nucleico, tal como intrones, que puede ser necesario para la expresion optima de un acido nucleico seleccionado.

Se pretende que el termino “tratar” tal como se usa en el presente documento abarque curar asf como mejorar al menos un smtoma de un estado o enfermedad.

El termino “vector” se refiere a una molecula de acido nucleico, que puede transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un acido nucleico que puede realizar replicacion extracromosomica. Los vectores preferidos son aquellos que pueden realizar replicacion y/o expresion autonomas de acidos nucleicos a los que estan unidos. Los vectores que pueden dirigir la expresion de genes a los que estan operativamente unidos se denominan en el presente documento “vectores de expresion”. En general, los vectores de expresion utiles en tecnicas de ADN recombinante estan con frecuencia en forma de “plasmidos” que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario circulares que, en su forma de vector, no estan unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, “plasmido” y “vector” se usan de manera intercambiable ya que el plasmido es la forma de vector mas comunmente usada. Sin embargo, se pretende que la invencion incluya otras formas de vectores de expresion tales como para que sirvan para funciones equivalentes y que lleguen a conocerse en la tecnica con posterioridad al presente documento.

El termino “alelo de tipo natural” se refiere a un alelo de un gen que, cuando esta presente en dos copias en un sujeto, da como resultado un fenotipo de tipo natural. Puede haber varios alelos de tipo natural diferentes de un gen espedfico, dado que determinados cambios de nucleotidos en un gen pueden no afectar al fenotipo de un sujeto que tiene dos copias del gen con los cambios de nucleotido.

Ejemplo 1

Los polimorfismos de IL-1 RN estan asociados con la gravedad radiografica en osteoartritis.

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Antecedentes/fin: Sigue habiendo una necesidad de marcadores fiables para predecir que pacientes con osteoartritis (OA) experimentaran progresion de la enfermedad. Estudios anteriores sugirieron que la inflamacion puede ser importante en la patogenesis y progresion de la OA. Se realizo un estudio en sujetos con OA de rodilla para investigar polimorfismos genicos candidatos seleccionados para determinar asociaciones con gravedad radiografica.

Metodos: Ochenta pacientes con OA, con OA de rodilla de NYUHJD, cumplieron con los criterios de inclusion en este analisis retrospectivo transversal. Se determino el genotipo de pacientes caucasicos de cualquier sexo, libres de enfermedad cronica, con un diagnostico radiografico de OA de rodilla, para determinar polimorfismos de un unico nucleotido (SNP). Se dividieron estos sujetos en dos grupos: uno que tema puntuaciones de mdice de rodilla de Kellgren-Lawrence (KL) de uno o dos, y el otro, puntuaciones de KL de tres o cuatro. Se separo un subconjunto con datos disponibles (N=36) mediante anchura del espacio articular (JSW) o bien por encima o bien por debajo de la mediana. Se realizo un analisis estadfstico usando la prueba exacta de Fisher y la Chi cuadrado, con regresion logfstica, ajustando para la edad, sexo e IMC para evaluar asociaciones de gravedad radiografica con SNP individuales y con haplotipos.

Resultados: Tras el ajuste para la edad, sexo e IMC, SNP de antagonista de receptor de IL1 (IL1RN) individuales estaban fuertemente asociados con gravedad radiografica de KL y anchura del espacio articular (JSW; tabla 1). Ademas, se asocio portar o bien una o bien dos copias de un haplotipo que consistfa en (ACT): IL1RN rs9005, IL1RN rs419598, IL1RN rs315952 (la frecuencia de haplotipo en este estudio de OA era del 32%) con un riesgo sustancialmente disminuido de gravedad radiografica (GR de 0,14; IC del 95% de 0,05-0,37), y con aumento de JSW (3,99 ± 1,76 mm frente a 3,16 ± 1,94 mm; p= 0,0056) en comparacion con el 68% restante de la poblacion con OA.

Conclusion: Los SNP de IL1RN estan asociados con la gravedad radiografica en OA, y pueden predecir la posibilidad de gravedad radiografica y progresion. Estos marcadores geneticos pueden ser utiles para el tratamiento medico de la OA, y tambien como herramienta que beneficia a sujetos con progresion radiografica en ensayos clmicos de DMOAD.

Tabla 1. Asociacion de SNP con gravedad radiografica

Puntuacion de KL >2 (N=80) JSW < mediana (N=36)

SNP

Genotipo Frecuencia p GR (95% CI) p GR (95% CI)

IL1RN rs9005 G>A

GG 55% <0,0002 6,51 (2,33-18,17) 0,007 14,5 (2,05-103,1)

AA/AG 45% 1,0 1,0

IL1RN rs419598 T>C

TT 65% 0,14 2,05 (0,77-5,41) 0,016 28,7 (1,86-445,0)

CC/CT 35% 1,0 1,0

IL1RN rs315952 T>C

CC/CT 47% 0,015 3,09 (1,22-1,79) NS NS

TT 52% 1,0

Definiciones de genotipos:

IL1RN_rs315952 T/T 1,1

T/C 1,2 C/C 2,2

IL1RN_rs9005 G/G 1,1

G/A 1,2 A/A 2,2

IL1RN +(2018)_rs419598 T/T 1,1

T/C 1,2 C/C 2,2

Pares de haplotipos de IL-1RN:

Sfmbolo de gen (HGNC)

IL1RN

Cromosoma 2

Ubicacion 2q14.2

Pos en cr 2 113607883(+)

ID de dbSNP rs9005

Secuencia ccaccG/Aggctg

Cebador en 5' (de 5' a 3') Cebador en 3' (de 5' a 3') Alelo 1 G

Alelo 2 A

IL1RN

Cromosoma 2

Ubicacion 2q14.2

Pos en cr 2 113603678(+)

5

10

15

20

25

ID de dbSNP Secuencia

Cebador en 5' (de 5' a 3') Cebador en 3' (de 5' a 3') Alelo 1 Alelo 2

T

C

rs419598

gttgcC/Tggata

IL1RN

Cromosoma Ubicacion Pos en cr 2 ID de dbSNP Secuencia

Cebador en 5' (de 5' a 3') Cebador en 3' (de 5' a 3') Alelo 1 Alelo 2

2

2q14.2

113606775(+)

rs315952

gacagC/Tggccc

T

C

Lista de referencias

1. Loughlin J, Dowling B, Mustafa Z, Chapman K. Association of the interleukin-1 gene cluster on chromosome 2q13 with knee osteoarthritis. Arthritis Rheum 2002;46(6):1519-27.

2. Meulenbelt I, Seymour AB, Nieuwland M, Huizinga TW, van Duijn CM, Slagboom PE. Association of the interleukin-1 gene cluster with radiographic signs of osteoarthritis of the hip. Arthritis Rheum 2004;50(4):1179-86.

3. Moos V, Rudwaleit M, Herzog V, Hohlig K, Sieper J, Muller B. Association of genotypes affecting the expression of interleukin-1beta or interleukin-1 receptor antagonist with osteoarthritis. Arthritis Rheum 2000;43(11):2417-22.

4. Stern AG, de Carvalho MR, Buck GA, Adler RA, Rao TP, Disler D, et al. Association of erosive hand osteoarthritis with a single nucleotide polymorphism on the gene encoding interleukin-1 beta. Osteoarthritis Cartilage 2003; 11(6):394-402.

5. Smith AJ, Keen LJ, Billingham MJ, Perry MJ, Elson CJ, Kirwan JR, et al. Extended haplotypes and linkage disequilibrium in the IL1R1-IL1A-IL1B-IL1RN gene cluster: association with knee osteoarthritis. Genes Immun 2004;5(6):451-60.

7. Moxley G, Han J, Stern AG, Riley BP. Potential influence of IL1B haplotype and IL1A-IL1B-IL1RN extended haplotype on hand osteoarthritis risk. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(10):1106-12.

8. Botha-Scheepers SA, Watt I, Slagboom E, de Craen AJ, Meulenbelt I, Rosendaal FR, et al. Innate production of Tumor Necrosis Factor-{alpha} and Interleukin-10 is associated with radiological progression of knee osteoarthritis. Ann Rheum Dis 2007.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Metodo de deteccion de la predisposicion para el riesgo de progresion de enfermedad grave y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis en un sujeto que comprende detectar en el sujeto el 5 genotipo en IL1RN rs9005 G>A;

   en el que la presencia de genotipo G/G indica que el sujeto tiene predisposicion a la progresion de enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de este genotipo indica que el sujeto no tiene predisposicion a los mismos; y

   10

   en el que la presencia de genotipo A/A o G/A indica que el sujeto esta protegido frente a la progresion a enfermedad grave y el estrechamiento del espacio articular y la ausencia de estos genotipos indica que el sujeto no esta protegido frente a los mismos.

   15 2. Metodo para seleccionar sujetos con osteoartritis para su inclusion en o exclusion de ensayos clmicos que

   comprende detectar la predisposicion para el riesgo de progresion de enfermedad grave y estrechamiento del espacio articular de osteoartritis en un sujeto segun la reivindicacion 1 e incluir o excluir a dicho sujeto del ensayo clmico segun el riesgo del sujeto y los criterios del ensayo clmico.

   20 3. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de deteccion se

   selecciona del grupo que consiste en: a) hibridacion de oligonucleotidos espedfica de alelo; b) analisis del tamano; c) secuenciacion; d) hibridacion; e) digestion con 5' nucleasa; f) polimorfismo de conformacion monocatenario; g) hibridacion espedfica de alelo; h) extension espedfica de cebador; e i) ensayo de ligacion de oligonucleotidos.

   25
2. 4. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que antes de, o junto con, la deteccion, se somete la muestra de acido nucleico a una etapa de amplificacion.
3. 5. Metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas proporcionar recomendaciones para el

   30 tratamiento medico de la osteoartritis basandose en las necesidades predichas del sujeto a una

   determinada edad.