CN118006766A - Pola2在诊断代谢综合征中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了POLA2在诊断代谢综合征中的应用。本发明通过对在线数据平台进行分析，筛选出能够诊断代谢综合征的关键基因，并进一步通过收集真实的临床样本进行验证，证实POLA2可作为代谢综合征的诊断标志物，且具有较高的诊断效能，为代谢综合征的诊断及后续的治疗提供了新的方向，在临床上具有广阔的应用前景。

Description

POLA2在诊断代谢综合征中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及POLA2在诊断代谢综合征中的应用。

背景技术

代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）也称之为X综合征、Reaven综合征或胰岛素抵抗综合征等，是一种普遍发生的疾病状态，同时并发多种疾病，包括中心性肥胖、高血压、胰岛素抵抗和血脂异常（特别是高甘油三酯血症和高密度脂蛋白水平降低）。

代谢综合征是导致心脑血管疾病的病理基础，可造成多种疾病的发生率上升，如高血压、冠心病、脑卒中及癌症等。因此，通过筛选发现MetS的诊断标志物，尽早干预，对延缓疾病进展至关重要。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了POLA2在诊断代谢综合征中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测样本中POLA2表达水平的试剂在制备诊断代谢综合征的产品中的应用。

进一步，所述试剂选自特异性识别POLA2的探针、特异性扩增POLA2的引物或特异性结合POLA2基因编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

进一步，所述产品包括芯片、试纸、试剂盒或核酸膜条。

进一步，所述试剂盒还包括通过RT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测POLA2基因或蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。

进一步，所述样本选自血液。

进一步，所述血液为外周血。

本发明的第二方面提供了一种诊断代谢综合征的产品，所述产品包括检测POLA2表达水平的试剂。

本发明的第三方面提供了一种筛选治疗代谢综合征的候选药物的方法，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有POLA2基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中POLA2基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制POLA2基因或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗代谢综合征的候选药物。

本发明的第四方面提供了一种诊断代谢综合征的系统，所述系统包括：

获取单元：用于获取样本中POLA2的表达水平；

处理单元：用于根据POLA2的表达水平，获得诊断代谢综合征的结果。

本发明的第五方面提供了POLA2在构建诊断代谢综合征的计算模型中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明通过对在线数据平台进行分析，筛选出能够诊断代谢综合征的关键基因，并进一步通过收集真实的临床样本进行验证，证实POLA2可作为代谢综合征的诊断标志物，且具有较高的诊断效能，为代谢综合征的诊断及后续的治疗提供了新的方向，在临床上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是差异基因的热图和火山图，其中，1A是差异基因的热图，1B是差异基因的火山图；

图2是GSEA分析结果图，其中，2A是氨基酸-tRNA生物合成通路基因集图，2B是B细胞信号通路基因集图；

图3是GSEA分析结果图，3A是DNA复制信号通路基因集图，3B是n-聚糖生物合成通路基因集图，3C是原发免疫缺陷通路基因集图；

图4是WGCNA分析筛选枢纽靶点图，其中，4A是聚类树分析图，4B是规模独立性图，4C是平均连通性图；

图5是是聚类树形图；

图6是基因相关性分析图，其中，6A是模块-表型相关性分析图，6B是brown模块内基因的模块-表型关联性性分析图；

图7是枢纽基因分析图；

图8是韦恩分析图；

图9是在线数据库中POLA2基因的ROC曲线图；

图10是临床样本中POLA2基因的表达水平图；

图11是临床样本中POLA2基因的ROC曲线图。

具体实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本发明提供了检测POLA2表达水平的试剂在制备诊断代谢综合征的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，POLA2（DNA聚合酶α2，辅助亚基，DNA polymerasealpha 2, accessory subunit）包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的POLA2，以及源自细胞中加工的任何形式的POLA2，以及POLA2的变体（例如剪接变体或等位变体）。该术语涵盖例如人的POLA2以及来自任何其它脊椎动物来源的POLA2，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物（例如小鼠和大鼠）的POLA2，基因ID：23649。

在本发明的一种实施方式中，诊断、诊断的、进行诊断及这些术语的变化型是指基于与个体相关的一个或其以上的征兆、症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的（即，不存在疾病或疾患），或者可被诊断为不健康的/异常的（即，存在疾病或疾患）。诊断、诊断的、进行诊断等包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现。

在本发明的一种实施方式中，表达水平或者水平，是指本发明中POLA2的绝对量或相对量。可以通过多种技术确定本发明中POLA2的表达水平，特别地，可以通过使用本领域技术人员熟知的方法对本发明中POLA2的绝对量或相对量进行检测。

所述试剂选自特异性识别POLA2的探针、特异性扩增POLA2的引物或特异性结合POLA2基因编码的蛋白的结合剂。

在本发明的一种实施方式中，特异性识别POLA2的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基或更长，甚至整个基因。

在本发明的一种实施方式中，引物是指短的核酸分子，例如DNA寡核苷酸，可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的，例如引物将在非常高严紧性杂交条件下与靶核酸分子杂交。

在本发明的具体实施方式中，引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰。这些修饰的非限制性实例包括甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体（例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等），或修饰带电荷的连接体（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括可检测标记。

在本发明的一种实施方式中，可检测标记是指能够产生表明在测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的组合物。合适的标记包括但不限于放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁粒、生物发光部分。因此，标记是能够由装置或方法检测的任意组合物，包括但不限于光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学、化学检测装置或任何其他合适的装置。在一些实施方式中，标记可无需借助于装置而在视觉上检测。标记用于指代具有可检测的物理性质的任何化学基团或部分或能够导致化学基团或部分表现出可检测的物理性质的任何化合物，诸如催化底物转化成可检测产物的酶。标记还涵盖抑制特定物理性质的表现的化合物。标记也可以是作为结合对的成员的化合物，其另一个成员具有可检测的物理性质。

其中，放射性同位素包括但不限于³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I。

酶包括但不限于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酶。

荧光分子包括但不限于FITC、罗丹明、镧系磷光体（lanthanide phosphors）。

所述产品包括芯片、试纸、试剂盒或核酸膜条。

在本发明的一种实施方式中，芯片也称为阵列，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

术语“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针（例如寡核苷酸）或结合剂（例如抗体）。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。

在本发明的一种实施方式中，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的探针，所述探针包括用于检测POLA2基因转录水平的针对POLA2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的POLA2蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括人POLA2基因在内的多个基因（例如，与代谢综合征相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人POLA2蛋白在内的多个蛋白质（例如与代谢综合征相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与代谢综合征相关的标志物同时检测，可大大提高诊断代谢综合征的准确率。

在本发明的一种实施方式中，试剂盒还可以包括荧光色素，可使用多种已知的荧光色素。例如，可列举出使用具有标识功能的嵌入剂（intercalator）的方法、使用在相对扩增的DNA序列特异性地杂交的核苷酸上结合荧光物质的探针的方法等。作为嵌入剂，可列举出作为不饱和型荧光色素的溴化乙锭、SYBR GreenI、作为饱和型荧光色素的Resolight、EvaGreen。对于使用量而言，按照使用的荧光色素的制造销售厂商的推荐。

所述试剂盒还包括说明书，说明书可以包括关于获得样本、处理样本的指导。

此外，试剂盒中可包含作为PCR的阳性对照而使用的细菌的基因组DNA、作为阴性对照而使用的无菌水。

在本发明的一种实施方式中，试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样本可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血清样品、尿液样品或皮肤。

在本发明的一种实施方式中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的探针；所述基底可以是任何适于固定探针的基底，包括但不限于尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠。

本发明提供了一种诊断代谢综合征的系统，所述系统包括：

获取单元：用于获取样本中POLA2的表达水平；

处理单元：用于根据POLA2的表达水平，获得诊断代谢综合征的结果。

若POLA2的表达水平呈现显著性上调，则诊断为代谢综合征。

在本发明的一种实施方式中，系统的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。而且，根据本发明的系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。

例如，用于执行所选任务的硬件可以是芯片或电路。作为软件，所选任务可实施为通过计算机使用任何合适的操作系统执行的多个软件指令。在本发明中，根据如本发明所述方法和/或系统的示例性实施方式的一个或多个任务可通过处理单元，如用于执行多个指令的计算平台来执行。可选地，该处理单元包括用于存储指令和/或数据的易失性存储器，和/或用于存储指令和/或数据的非易失性存储器，例如，磁性硬盘和/或可移动介质。可选地，还提供网络连接。还可选地提供显示器和/或用户输入装置诸如键盘或鼠标。

本发明提供了POLA2在构建诊断代谢综合征的计算模型中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述计算模型包括POLA2的表达水平。正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将POLA2水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。例如，在数学上组合POLA2和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1在线数据平台筛选差异基因

1差异表达分析

1.1实验方法

数据下载及筛选差异基因

从GEO数据库下载数据集GSE98895，对获得的数据进行标准化处理，采用R语言limma包筛选MetS的差异基因，选择P<0.05和|log₂fold change （FC）|>1.5为阈值。

1.2实验结果

GSE98895数据集共40个样本（20个MetS和20个正常人），经过标准化处理后通过R语言的limma包分析数据集的差异基因，并通过热图和火山图进行可视化表达，通过对比研究共发现185个差异基因，其中61个基因上调，124个基因下调（图1）。

2基因富集分析（GSEA）

2.1实验方法

根据|NES|>1，NOM p <0.05，FDR <0.25筛选通路下的基因集。

2.2实验结果

对GSE98895数据集的GSEA的KEGG富集分析共得到30个基因集的结果，根据筛选，最后获得5个通路下的基因集，共计236个基因（图2，图3）。

3加权基因共表达网络分析获得枢纽基因

3.1实验方法

通过分级聚类将差异基因进行模块化表达，分析各模块内的基因与疾病的相关性，选相关度最高的模块内的基因作为枢纽基因。

3.2实验结果

对GSE98895数据集进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），通过计算基因之间的表达相关性，将具有表达相关性的基因聚类到一个模块中，然后再分析模块与样本特征之间的相关性，搭建样本特征与基因表达共表达网络从而分析其中的枢纽基因。首先通过聚类树分析所有样本基因表达无离群值（图4A），筛选数据集中mad>1的前5000个基因数据进行WGCNA分析，建立共表达网络，选择无尺度拓扑分析R²>0.85的power=14作为软阈值（图4B，4C），基于加权相关性，进行层级聚类分析，并进行聚类分析，获得不同的基因模块，通过融合相似的模块，共产生15个基因模块（图5），再进行基因模块与表型的相关性分析（图6A），发现与MetS相关性最高的是brown模块，因此，brown作为关键模块，其中基因共有530个，对模块内基因的模块-表型关联性性进行分析，绘制散点图，发现二者相关性良好，选择MM值大于0.8且GS值大于0.5的基因作为WGCNA分析的枢纽基因，共计56个（图6B）。对枢纽基因进行拓扑重叠热图分析，其中颜色越深表示两个基因之间拓扑重叠度越高（图7）。

4关键基因的筛选

4.1实验方法

将DEGs与GSEA的结果进行合并去除重复基因，与WGCNA分析的枢纽基因进行韦恩分析（图8）。

4.2实验结果

将DEGs与GSEA的结果进行合并去除重复基因，共计1149个，与WGCNA分析的枢纽基因进行韦恩分析，获得关键基因POLA2。

5在线数据库对4个关键基因的验证（ROC曲线）

AUC值大于0.75越趋近于1，证明该靶点可作为诊断，敏感性和特异性较好。本研究中POLA2的AUC为0.9275，具有较高的诊断效能，故POLA2可作为MetS的诊断基因（图9）。

实施例2临床样本中对关键基因的表达水平

1实验材料

试剂：ZYMO Direct-zol™ RNA MiniPrep R2050； PrimeScript™RT reagentKit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） （RR047A）；TAKARA-TB Green® Premix ExTaq™II （Tli RNaseH Plus）（RR820A）仪器：Applied Biosystems 7500 Real Time PCRSystem。

临床样本：2022年8月至2023年11月在鄂尔多斯市中心医院收集的70名MetS患者及30名健康志愿者。

2实验方法

为了进一步确证关键基因对于诊断MetS的准确性，在临床样本中进行验证。拟招募100名参与者，包括MetS患者70名，30名健康志愿者。根据AHA/NHLBI+IDF组织于2009制定的统一的MetS的定义方式作为入排标准，合并以下3项原则即为MetS：1.腰围：男≥90 cm；女≥80 cm；2.空腹血糖≥5.6 mmol/L（100 mg/dL）或正在接受糖尿病治疗；3.血压≥130/85 mmHg或正在接受高血压药物治疗；4.总甘油三酯≥1.7 mmol/L（150 mg/dL）或正在接受降甘油三酯脂药物治疗；5.高密度胆固醇：男<1.0 mmol/L（40 mg/dL），女<1.3 mmol/L（50mg/dL）或进行胆固醇药物调节治疗。

排除标准：年龄<18岁或>60岁的MetS患者被排除在外。此外，如果患者合并以下疾病则被排除在外：1.肿瘤；2.HIV或HBV等感染；3.甲状腺疾病；4.继发性高血压（肾性、紧张性、肿瘤性、息肉细胞瘤、及肾动脉狭窄引起的高血压）；5.Ⅰ型糖尿病；6.贫血。

患者在开始研究前签署知情同意书。

采集患者血样于含有EDTA的管中并混匀，采用Trizol法提取全血中总的RNA，通过提取外周血样本中的总RNA，反转录获得cDNA，将cDNA模板用ABI 7500荧光定量仪进行荧光定量PCR检测（染料法）。荧光定量法是一种基于荧光染料和探针的实时定量PCR技术。通过使用特定的荧光染料标记探针，在PCR反应过程中，随着DNA的合成，荧光染料逐渐累积，从而实现对DNA合成过程的实时监测。通过比较不同样本的荧光信号强度，可以定量分析基因的表达水平。

设计荧光定量PCR引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，具体引物序列如表1所示。

表 1引物序列

荧光定量PCR反应：将cDNA与荧光染料混合，进行荧光定量PCR反应，每个处理采用3次技术重复。

3实验结果

通过基因检测手段分析100名患者血样中POLA2的表达量，发现MetS组的POLA2显著高于正常人组（对照），提示POLA2可作为代谢综合征诊断的标志物（图10）。

ROC曲线分析结果表明，POLA2的AUC为0.7939，具有较高的诊断效能（图11）。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中POLA2表达水平的试剂在制备诊断代谢综合征的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自特异性识别POLA2的探针、特异性扩增POLA2的引物或特异性结合POLA2基因编码的蛋白的结合剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试纸、试剂盒或核酸膜条。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括通过RT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测POLA2基因或蛋白表达水平的试剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。

7.一种诊断代谢综合征的产品，其特征在于，所述产品包括检测POLA2表达水平的试剂。

8.一种筛选治疗代谢综合征的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有POLA2基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中POLA2基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制POLA2基因或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗代谢综合征的候选药物。

9.一种诊断代谢综合征的系统，其特征在于，所述系统包括：

获取单元：用于获取样本中POLA2的表达水平；

处理单元：用于根据POLA2的表达水平，获得诊断代谢综合征的结果。

10.POLA2在构建诊断代谢综合征的计算模型中的应用。