CN104131008A - Dna标签、pcr引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DNA标签、PCR引物及其应用，其中一组DNA标签，其由SEQ ID NO：79-129所示的核苷酸构成。本发明的一组DNA标签能够用于构建核酸测序文库，以精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DNA标签，通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可以精确地表征DNA的样品来源。

Description

DNA标签、PCR引物及其应用

技术领域

本发明涉及耳聋基因检测技术领域，具体地，涉及DNA标签、PCR引物及其应用，更具体地，涉及一组分离的DNA标签、一组分离的PCR引物、一种构建核酸测序文库的方法、一种核酸测序文库、一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法、一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法以及一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒。

背景技术

耳聋是人类常见疾病之一，2006年底第二次全国残疾人抽样调查结果显示，我国听力残疾者共有2670万人，占残疾人总数的19.3％。1-7岁听力障碍儿童为80万,每年新生聋儿超过3万。导致耳聋的原因有环境因素、遗传因素或者环境因素与遗传因素共同作用。其中遗传因素是主要的部分，据报道，有60％的耳聋是由遗传缺陷引起的。遗传性耳聋根据遗传方式不同可分为常染色体显性遗传(DFNA)、常染色隐性遗传(DFNB)、X连锁遗传(DFN)和线粒体遗传(DFNM)。根据是否伴有其他临床症状，遗传性耳聋可分为综合征性耳聋(SHL)和非综合征性耳聋(NSHL)，非综合征性耳聋具有高度遗传异质性，迄今为止，已定位了100多个NSHL相关位点，克隆了46个基因。

遗传性耳聋不仅影响到患者学习、生活和工作，而且还可以通过基因遗传，将致聋基因传递给后代。因而，耳聋基因检测意义重大。然而，现阶段的耳聋基因检测技术仍有待改进。

发明内容

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前，耳聋基因检测技术主要包括直接测序法(DS)、限制酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、ARMS-PCR法和生物芯片等。然而，现阶段的耳聋基因检测技术仍有待改进。具体地：

直接测序法(DS)是将聚合酶链式反应(PCR)扩增产物纯化、变性后，在测序仪上进行测序，然后寻找突变，然而，该方法成本较高，耗时长，而且通量不高。

限制酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)的原理是在聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA的迁移率除与DNA长度与DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段的基因变异存在。这种方法不能确定变异的位置，需对异常构象带序列进行DNA测序确定突变位点。

限制性片段长度多态性分析(RFLP)是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。这种方法与REF-SSCP一样，需对异常构象带序列进行DNA测序确定突变位点。此外，由于受酶切位点的限制，所以这种方法检出率较低。

变性高效液相色谱分析(DHPLC)的原理是应用离子对反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR扩增产物进行分离。这种方法不能鉴定出具体的碱基突变位置，在筛选新的突变或多态性时，需要进行测序才能得出最后的结论。

ARMS-PCR法的是利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。

目前市售的遗传性耳聋基因检测芯片可同时检测中国人4个耳聋相关基因的9个突变热点，该方法检测位点相对较少，而且成本较高。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够高通量、低成本、快速高效地对DNA样品尤其是多个DNA样品进行多位点的耳聋基因突变检测的方法。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一组DNA标签。根据本发明实施例的一组DNA标签，其由SEQ ID NO：79-129所示的核苷酸构成。本发明的一组DNA标签能够用于构建核酸测序文库，以精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DNA标签(在本文中有时也称为“核酸标签”)，通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可以精确地表征DNA的样品来源。由此，利用上述DNA标签，可以同时构建多种DNA样品的用于测序的核酸测序文库(在本文中，有时也称为DNA标签文库)，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对获得的测序序列进行分类，获得多种DNA样品的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Ion Proton^TM或Ion PGM^TM测序技术，同时对多种DNA进行测序，从而提高DNA测序的效率和通量。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一组PCR引物。根据本发明实施例的一组PCR引物，其由SEQ ID NO：1-78所示的核苷酸构成。本发明的一组PCR引物分别与耳聋基因GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因特异相关，利用该组PCR引物将DNA样品进行PCR扩增，能够一步PCR扩增39个耳聋基因片段，经过测序即可快速获取其DNA序列，耳聋基因检测通量高，突变位点分辨能力和灵敏度好。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一组标签PCR引物。根据本发明实施例的一组标签PCR引物，其是通过将前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述的一组PCR引物的5’末端而获得的。因而，本发明的一组标签PCR引物，可以有51种形式，进而利用本发明的一组标签PCR引物可以一次对51种DNA样品进行耳聋基因的突变检测。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建核酸测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将DNA样品进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物，其中所述PCR扩增采用前面所述的一组标签PCR引物进行；以及纯化回收所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。利用该方法，能够有效地将根据本发明实施例的DNA标签引入到针对DNA样品所构建的用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的核酸测序文库中，从而可以通过对核酸测序文库进行测序，获得DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及DNA标签的序列信息，从而能够对多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息的来源进行区分，进而能够有效确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，从而能够分别确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，提高了耳聋基因突变检测的通量、效率和准确度。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建核酸测序文库的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，以便确定所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息；以及基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。基于该方法，能够有效地对DNA样品进行耳聋基因突变检测，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的构建核酸测序文库的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签，所述多种为2-51种；将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物；对所述核酸测序文库混合物进行测序，以便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及所述DNA标签的序列信息；基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，以便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息；以及基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明实施例的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，能够同时构建多种DNA样品的用于耳聋基因突变检测的核酸测序文库，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，获得多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Ion Proton^TM或Ion PGM^TM测序技术，同时对多种DNA进行测序和耳聋基因突变检测，从而提高了检测的效率和通量。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明实施例的试剂盒，其包括：51种DNA标签，所述分离的DNA标签由SEQID NO：79-129所示的核苷酸构成；以及78种PCR引物，所述分离的PCR引物由SEQ ID NO：1-78所示的核苷酸构成，其中，所述51种DNA标签和78种PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的DNA标签和PCR引物构建标签PCR引物，进而利用标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，能够一次性实现51种DNA样品的耳聋基因突变检测。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明实施例的试剂盒，其包括：51组标签PCR引物，其中每一组所述标签PCR引物均是通过将选自前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述的一组PCR引物的5’末端而获得的，所述51组标签PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够直接方便地利用本发明的标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，能够一次性实现51种DNA样品的耳聋基因突变检测。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的系统，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明实施例，该系统包括：文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，并将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签，所述多种为2-51种；测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述核酸测序文库混合物进行测序，以便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及所述DNA标签的序列信息；数据处理装置，所述数据处理装置与所述测序装置相连，用于基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，以便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息；以及分析装置，所述分析装置与所述数据处理装置相连，用于基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。由此，利用该系统，能够同时构建多种DNA样品的用于耳聋基因突变检测的核酸测序文库，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，获得多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Ion Proton^TM或IonPGM^TM测序技术，同时对多种DNA进行测序和耳聋基因突变检测，从而提高了检测的效率和通量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是实施例1中琼脂糖凝胶电泳分析结果；

图2是实施例1中构建文库的Agilent Bioanalyzer 2100检测结果；

图3是实施例3中样品6～样品55的琼脂糖凝胶电泳分析结果；

图4是实施例3中构建文库的Agilent Bioanalyzer 2100检测结果；

图5是根据本发明实施例的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法的流程示意图；

图6是根据本发明实施例的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的系统的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

如本文中所使用的，术语“PCR”是指聚合酶链式反应。

如本文中可互换使用的，术语“DNA标签”、“标签(index)”或“核酸标签”是指添加在PCR引物5’末端的一小段碱基序列，其通过PCR扩增可以用于标记PCR产物，从而辨别不同模板来源的PCR产物的混合物中各个PCR产物的模板来源。通过在引物的5’末端添加标签，可以对PCR产物进行标记，从而可以将多个不同的PCR产物混合成一个文库，用于进一步的分析和处理。文库中各个不同的PCR产物各自具有独特的标签，从而根据各个PCR产物中独特的标签，可以将各个不同的PCR产物互相区分开来，并将其与PCR模板一一对应。例如，当需要对多个样品进行测序时，可以在用于各个样品的引物的5’末端添加不同的标签，然后用添加了标签的引物分别对各个样品进行PCR反应，从而对各个样品(即，PCR产物)进行标记。PCR反应后，可以将来自各个样品的带有不同标签的PCR产物混合在一起组成一个文库，然后应用高通量测序法同时对文库中的各个PCR产物进行测序。最终，在所得的测序数据中，通过独特的标签，可以将测序结果与各个PCR产物(样品模板)一一对应。

可以仅在用于PCR扩增的引物对的一条引物中引入标签，也可以在引物对的两条引物中都引入标签。当在引物对的两条引物中都引入标签时，每个PCR引物对与一对标签组合成一对标签引物，其中正向和反向PCR引物的5’端分别具有正向标签和反向标签，并且正反标签和正反引物序列是对应的，且正向标签和反向标签可以是相同的，或不同的。

设计标签时需要考虑多种因素，包括：1)标签序列中应当避免3个或3个以上的单碱基重复序列；2)所有标签的同一位点中碱基A和碱基C的总含量应在所有碱基含量的30％-70％之间，例如，当设计100条不同的标签序列时，每一条标签序列的第二个碱基(即所谓的同一位点)中A和C占该100条序列第二个碱基总量的30％-70％；3)标签序列本身的GC含量应在40-60％之间；4)标签之间的序列差异应大于4个碱基；5)标签序列中应避免出现与用于测序的引物相似度高的序列；6)当标签序列添加到PCR扩增引物上后，应避免PCR扩增引物形成发卡结构和二聚体等二级结构。

如本文中所使用的，术语“标签PCR引物”是指带有DNA标签的引物，其包含2个部分，标签部分和引物部分，其中标签部分用于在PCR扩增反应中标记PCR产物，而引物部分与模板碱基互补配对，用于扩增模板，并且其中标签部分，连接至引物部分的5’端。

DNA标签、PCR引物和标签PCR引物

根据本发明的一个方面，本发明提供了一组DNA标签。根据本发明实施例的一组DNA标签，其由SEQ ID NO：79-129所示的核苷酸构成。本发明的一组DNA标签能够用于构建核酸测序文库，以精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DNA标签(在本文中有时也称为“核酸标签”)，通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可以精确地表征DNA的样品来源。由此，利用上述DNA标签，可以同时构建多种DNA样品的用于测序的核酸测序文库(在本文中，有时也称为DNA标签文库)，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对获得的测序序列进行分类，获得多种DNA样品的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Ion Proton^TM或Ion PGM^TM测序技术，同时对多种DNA进行测序，从而提高DNA测序的效率和通量。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一组PCR引物。根据本发明实施例的一组PCR引物，其由SEQ ID NO：1-78所示的核苷酸构成。本发明的一组PCR引物分别与耳聋基因GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因特异相关。具体地，本发明的一组PCR引物是针对GJB2基因编码区、GJB3基因编码区、SLC26A4基因基因编码区和12S rRNA基因的特异性引物，利用该组PCR引物将DNA样品进行PCR扩增，能够一步PCR扩增39个耳聋基因片段，经过测序即可快速获取其DNA序列，耳聋基因检测通量高，突变位点分辨能力和灵敏度好。

需要说明的是，我国主要遗传性耳聋主要的耳聋基因有GJB2基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。具体地：

1、GJB2基因：该基因定位于常染色体13q11-12区域，DNA全长4804bp，含2个外显子，编码区为678bp，编码由266个氨基酸残基组成的缝隙连接蛋白Connexin 26，属于β-2蛋白，是钾离子循环通路的一部分。GJB2基因突变为遗传性耳聋最常见的病因，GJB2基因突变导致的耳聋为语前、双侧、对称性耳聋，听力损失程度变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋。在中国人群中，常见GJB2基因突变类型主要有235delC、299_300delAT、176_191del16等，可占GJB2基因突变人群的80％以上。

2、PDS基因：PDS基因又名SLC26A4基因，该基因定位于常染色体7q31区域，含21个外显子，编码1个由780个氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白Pendrin，属于离子转运体家族，主要与碘/氯离子转运有关。临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。PDS基因突变种类较多，但IVS7-2A>G、2168A>G、1226G>A、1975G>C、1229C>T、1174A>T、1687_1692insA、IVS15+5G>A、2027T>A、589G>A与c.281C>T突变体频率高达82.51％。

3、线粒体基因：线粒体基因突变与氨基糖甙类抗生素(AmAn)引起的药物性耳聋有关，线粒体基因突变会导致线粒体的缺陷，影响到与听力直接相关的耳蜗毛细胞线粒体的产能不足，从而导致耳蜗与前庭细胞损伤或死亡。线粒体DNA基因突变为母系遗传，常在成年早期发生，表现为双侧对称性、以高频听力下降为主、程度不等的感音神经性耳聋。其中，12S rRNA是主要的药物性耳聋相关的线粒体基因，热点突变有1494C>T与1555A>G。

另外，GJB3基因是于1998年由夏家辉院士等克隆定位的，是我国本土克隆和鉴定的第一个耳聋致病基因，定位在1p33-p35，有2个外显子，编码含有270个氨基酸的缝隙连接蛋白Connexin 31。GJB3基因突变可引起常染色体显性或隐性遗传性非综合征性耳聋，被认为与高频听力下降有关。

利用本发明的与GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因特异相关的该组PCR引物，能够有效地实现对我国人群进行耳聋基因检测。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一组标签PCR引物。根据本发明实施例的一组标签PCR引物，其是通过将前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述的一组PCR引物的5’末端而获得的。因而，本发明的一组标签PCR引物，可以有51种形式，进而利用本发明的一组标签PCR引物可以一次对51种DNA样品进行耳聋基因的突变检测。

核酸测序文库构建及耳聋基因检测的方法

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建核酸测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将DNA样品进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物，其中所述PCR扩增采用前面所述的一组标签PCR引物进行；以及纯化回收所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。利用该方法，能够有效地将根据本发明实施例的DNA标签引入到针对DNA样品所构建的用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的核酸测序文库中，从而可以通过对核酸测序文库进行测序，获得DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及DNA标签的序列信息，从而能够对多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息的来源进行区分，进而能够有效确定所述多种DNA样品的每一种的的核酸测序文库的序列信息，从而能够分别确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，提高了耳聋基因突变检测的通量、效率和准确度。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建核酸测序文库的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，以便确定所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息；以及基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。基于该方法，能够有效地对DNA样品进行耳聋基因突变检测，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变，实现耳聋基因检测。

根据本发明的实施例，在进行所述测序之前进一步包括：将所述核酸测序文库依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物的步骤。

根据本发明的实施例，利用高通量测序技术对所述核酸测序文库进行测序。根据本发明具体示例，利用高通量测序技术进行所述测序，优选Solexa、SOLID、单分子、454、Ion Proton^TM和Ion PGM^TM测序平台的至少之一，更优选Ion Proton^TM或Ion PGM^TM。由此，测序通量高，检测结果准确可靠。

根据本发明的实施例，基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括：将所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息与参考数据库进行比对；基于比对结果，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明的一些具体示例，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选NCBI build36。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。发明人惊奇地发现，根据本发明实施例的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，能够同时构建多种DNA样品的用于耳聋基因突变检测的核酸测序文库，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，获得多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Ion Proton^TM或Ion PGM^TM测序技术，同时对多种DNA进行测序和耳聋基因突变检测，从而提高了检测的效率和通量。

具体地，根据本发明的实施例，参照图5，该方法包括以下步骤：

S100：针对多种DNA样品的每一种分别独立地构建核酸测序文库

针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的构建核酸测序文库的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签，所述多种为2-51种。

S200：将多种DNA样品的核酸测序文库进行混合

将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物。

S300：对核酸测序文库混合物进行测序

对所述核酸测序文库混合物进行测序，以便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及所述DNA标签的序列信息。根据本发明的实施例，在进行所述测序之前进一步包括：将所述核酸测序文库混合物依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物的步骤。根据本发明的实施例，利用高通量测序技术进行所述测序，优选Solexa、SOLID、单分子、454、Ion ProtonTM和Ion PGMTM测序平台的至少之一，更优选Ion Proton^TM或IonPGM^TM。由此，测序通量高，突变检测结果准确可靠。

S400：对多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类

基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，以便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息；

S500：确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变

基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明的实施例，基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括：将所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别与参考数据库进行比对；基于比对结果，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明的一些具体示例，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选NCBI build36。

试剂盒

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明实施例的试剂盒，其包括：51种DNA标签，所述分离的DNA标签由SEQID NO：79-129所示的核苷酸构成；以及78种PCR引物，所述分离的PCR引物由SEQ ID NO：1-78所示的核苷酸构成，其中，所述51种DNA标签和78种PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够方便地利用本发明的DNA标签和PCR引物构建标签PCR引物，进而利用标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，能够一次性实现51种DNA样品的耳聋基因突变检测。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。根据本发明实施例的试剂盒，其包括：51组标签PCR引物，其中每一组所述标签PCR引物均是通过将选自前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述的一组PCR引物的5’末端而获得的，所述51组标签PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。由此，利用该试剂盒，能够直接方便地利用本发明的标签PCR引物，根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，能够一次性实现51种DNA样品的耳聋基因突变检测。

耳聋基因检测的系统

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的系统，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因。发明人惊奇地发现，利用该系统，能够同时构建多种DNA样品的用于耳聋基因突变检测的核酸测序文库，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，获得多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Ion Proton^TM或IonPGM^TM测序技术，同时对多种DNA进行测序和耳聋基因突变检测，从而提高了检测的效率和通量。

根据本发明实施例，参照图6，该系统1000包括：文库构建装置100、测序装置200、数据处理装置300和分析装置400。具体地：

文库构建装置100用于针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据前面所述的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，并将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签，所述多种为2-51种。

测序装置200与所述文库构建装置100相连，用于对所述核酸测序文库混合物进行测序，以便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及所述DNA标签的序列信息。

数据处理装置300与所述测序装置200相连，用于基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，以便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息.

分析装置400与所述数据处理装置300相连，用于基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。

根据本发明的实施例，进一步包括文库处理装置500，所述文库处理装置500与所述文库构建装置100和所述测序装置200相连，用于将所述核酸测序文库混合物依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物。

根据本发明的实施例，所述测序装置200为选自Solexa、SOLID、单分子、454、IonProton^TM和Ion PGM^TM测序平台的至少之一，更优选Ion Proton^TM或Ion PGM^TM。由此，测序通量高，突变检测结果准确可靠。

根据本发明的实施例，所述分析装置400进一步包括比对单元，所述比对单元中设置有参考数据库，用于：将所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别与参考数据库进行比对；以及基于比对结果，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本发明的一些具体示例，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选NCBI build36。

实施例1：

根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，进行耳聋基因检测，具体如下：

(1)引物设计

根据GJB2、GJB3和SLC26A4基因的CDS区，12S rRNA，利用引物设计软件设计上述基因位点的扩增引物，扩增引物的长度在20个碱基左右。利用软件设计评估DNA标签(index)序列，标签序列包含7个碱基，设计标签序列时应避免出现与测序的引物相似度高的序列和添加上标签的PCR扩增引物形成发卡结构或二聚体等二级结构。本发明设计的针对上述的GJB2和GJB3基因CDS区，SLC26A4基因2号-21号外显子区，12S rRNA的扩增引物参见表1，DNA标签序列参见表2。

表1

表2(标签，SEQ ID NO：)

(2)PCR扩增和扩增产物混合

通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表3。

试剂Ⅰ成分为:pH为6.8-7.8，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：3 mM MgCl₂，0.2 mMdNTP混合液，1U/μL DNA聚合酶，0.8mM引物。

表3

组分	体积/反应
		模板DNA	5μL
试剂Ⅰ	20μL
		体积	25μL

PCR反应条件为94℃，2分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸15分钟，共扩增35循环；最终72℃延伸5分钟；4℃，结束。在本实施例中，使用的5份样品是已知上述基因序列的人类基因组DNA，样品编号为样品1～样品5使用的标签序列分别是：样品1：AACGTTG(79)、样品2：ACAGATC(80)、样品3：ACCTTCT(81)、样品4：AGACAGA(82)和样品5：AGGTTAG(83)。

PCR结束后，取3μL PCR产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果如图1，根据50bpDNA Maker判断，PCR产物条带大小约为200bp。将本实施例PCR样本Pooling到1.5mL EP管中，混匀，使用磁珠进行纯化，25μL DNA洗脱缓冲液溶解洗脱。

(3)末端修复

将步骤(2)中的纯化产物按照表4配制反应体系，置于20℃进行反应，反应完成后使用磁珠纯化，25μL DNA洗脱缓冲液洗脱。

试剂Ⅱ成分为：pH为7.4-7.6，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：500mM Tris-HCl，100 mM MgCl₂，2-11mM DTT，2.5mM ATP，17.5 U/μl DNA连接酶，50-200mM KCl，01.mMEDTA，0.1μM ATP，末端修复酶。

表4

组分	体积
		混合纯化产物	25μl
试剂Ⅱ	25μl
		体积	50μl

(4)接头连接

将步骤(3)中纯化产物按照表5配制反应体系，反应条件为20℃，20min；65℃，15min；4℃，结束。

试剂Ⅲ成分为：pH为7.5-7.8，溶剂是水，溶质为如下终浓度物质：60mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，20 mM DTT，10mM ATP，350U/μl DNA连接酶，8U/μl切口平移酶。

表5

组分

体积

末端修复产物	25μL
		P1接头	2μL
Barcode	2μL
		试剂Ⅲ	71μL
体积	100μL

P1接头和A接头序列如下：

P1接头：

正链：5’—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT—3’(SEQID NO:130)

负链：5’—ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT—3’(SEQ ID NO:131)

Barcode：

正链：5’—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGGAGCTTCCTCGAT—3’(SEQ ID NO:132)

负链：5’—ATCGAGGAAGCTCCACTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGGTT—3’(SEQ ID NO:133)

(5)文库检测

使用Agilent Bioanalyzer2100检测结果如图2，目的片段范围在260-310bp，目的片段总浓度为116.8 nmol/L。

(6)制备Ion Proton^TM测序模板

①OneTouch^TM2

根据Agilent Bioanalyzer2100检测文库浓度，将文库稀释到80pM，并根据表6配制OneTouch 2的扩增溶液，分别将1500μL的扩增溶液和950μL的Ion OneTouch^TM反应油(IonOneTouch^TMReaction Oil)加入到Ion PI^TMPlus Reaction Filter Assembly后，装载到已完成初始化的OneTouch^TM2仪器上，运行OneTouch^TM2仪器。运行完成后使用无核酸酶水清洗结合模板的ISPs，加入ISP再悬浮溶液至100μL。

表6

成分	体积/μL
		Ion PITMReagent Mix TL	750
Ion PITMPCR Reagent B	450
		Ion PITMEnzyme Mix TL	75
Ion PITMPCR Reagent X	60
		Ion PITM Ion SphereTMParticles(ISPs)	100
稀释后的文库	65
		总体积	1500

②Ion OneTouch^TMES

在8连管中按照表7中的对应关系加入相应的试剂，置于Ion OneTouch^TMES富聚。富聚完成后，使用无核酸酶水清洗富聚后的ISPs。

表7

(7)Ion Proton^TM测序

测序操作流程详见操作说明书，本实施例中采用PI芯片，在芯片中Loading酶、测序引物和制备好的测序模板等，测序过程约2.5个小时便可得到基因序列信息。

(8)结果分析

根据DNA标签序列与样品1～样品5的对应关系将测序数据拆分到单个样品中，将样品1～样品5测序数据与数据库NCBI build36比对，进行变异检测，并进行序列的组装，可得到每个样品PCR扩增的序列信息及其突变情况。本实施例测序得到的序列结果与已知结果完全一致，在样品1中检测出GJB2基因的235delC和427 C>T复合杂合突变，样品2中检测出SLC26A4基因的86A>G杂合突变，样品3中检测出SLC26A4基因的227C>T杂合突变，样品4中检测出SLC26A4基因的754T>C杂合突变，样品5中检测结果正常，测序结果如下：

表8.样品1测序结果：

表9.样品2测序结果

表10.样品3测序结果

表11.样品4测序结果

表12.样品5测序结果

实施例2

根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，进行耳聋基因检测，具体如下：

(1)针对实施例1中的样品1-5，重复实施例1中的引物设计、PCR扩增和扩增产物混合、末端修复、接头连接和文库检测等实验操作，同样获得实施例1中已知浓度的文库样品，备用。

(2)制备Ion PGM^TM测序模板

①OneTouch^TM2

根据Agilent Bioanalyzer2100检测文库浓度，将文库稀释到80pM，并根据表8配制OneTouch 2反应混合物，转入接头装载到已完成初始化的OneTouch^TM2。具体操作流程详见OneTouch^TM说明书。

扩增溶液，分别将1000μL的扩增溶液和1450μL的Ion OneTouch^TM反应油(IonOneTouch^TMReaction Oil)加入到Ion PGM^TMPlus Reaction Filter Assembly后，装载到已完成初始化的OneTouch^TM2仪器上，运行OneTouch^TM2仪器。运行完成后使用无核酸酶水清洗结合模板的ISPs，加入ISP再悬浮溶液至100μL。

表13

②Ion OneTouch^TM ES

运行结束后，在8连管中按照表9中的对应关系加入相应的试剂，置于IonOneTouch^TMES富聚。富聚完成后，使用无核酸酶水清洗富聚后的ISPs。

表14

(3)Ion PGM^TM测序

测序操作流程详见操作说明书，本实施例中采用316芯片，在芯片中Loading酶、测序引物和制备好的测序模板等，测序过程约2.5个小时便可得到基因序列信息。

(8)结果分析

根据DNA标签序列与样品1～样品5的对应关系将测序数据拆分到单个样品中，将样品1～样品5测序数据与数据库NCBI build36比对，进行变异检测，并进行序列的组装，可得到每个样品PCR扩增的序列信息及其突变情况。本实施例测序得到的序列结果与已知结果完全一致，且测序结果同实施例1完全一致，见表8～表12。

实施例3

根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，进行耳聋基因检测，具体如下：

(1)引物设计：根据所选择的待检测和/或分型的耳聋基因突变位点20个，分别是：GJB2基因的35delG、167delT、176-191del16、299_300delAT与235delC，GJB3基因的538C>T与547G>A，SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G与IVS15+5G>A，12S rRNA基因的1494C>T与1555A>G。本发明设计针对上述4个耳聋基因20个突变位点的扩增引物选自实施例1引物参见表15。

表15

(2)除了检测的样本不同，后续实验步骤(即：PCR扩增和扩增产物混合、末端修复、接头连接、文库检测、制备Ion Proton^TM测序模板、Ion Proton^TM测序和结果分析)与实施例1相同。在本实施例中，使用的50份DNA模板是已知上述20个突变位点结果的人类基因组DNA，编号为是样品6～样品55，在实验过程中加入空白对照N监控实验污染情况。

PCR产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果如图3，其中N为空白对照，根据50bpDNA Maker判断，PCR产物条带大小为约200bp。Agilent Bioanalyzer2100检测如图4，目的片段范围在260-310bp，目的片段总浓度为102.7 nmol/L。本实施例测序得到20个位点结果与已知结果完全一致，具体结果如下表16：

表16

实施例4

根据本发明的确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，进行耳聋基因检测，具体如下：

(1)采用实施例3中的样品，按照实施例3中的方法，重复实施例3中的引物设计、PCR扩增和扩增产物混合、末端修复、接头连接和文库检测等实验操作，同样获得实施例1中已知浓度的文库样品，备用。

(2)按照采用实施例3中的方法，制备Ion PGM^TM测序模板、Ion PGM^TM测序和结果分析的方法，均与实施例3相同。

(3)本实施例测序得到的结果与已知结果完全一致，同实施例3完全一致，见表16。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (21)

1.一组DNA标签，其由SEQ ID NO：79-129所示的核苷酸构成。

2.一组PCR引物，其由SEQ ID NO：1-78所示的核苷酸构成。

3.一组标签PCR引物，其是通过将选自权利要求1所述的一组DNA标签中的任意一种连接至权利要求2所述的一组PCR引物的5’末端而获得的。

4.一种构建核酸测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将DNA样品进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物，其中所述PCR扩增采用权利要求3所述的一组标签PCR引物进行；以及

纯化回收所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。

5.一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求4所述的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；

对所述核酸测序文库进行测序，以便确定所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息；以及

基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前进一步包括：将所述核酸测序文库依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物的步骤。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用高通量测序技术进行所述测序，优选Solexa、SOLID、单分子、454、Ion Proton^TM和Ion PGM^TM测序平台的至少之一，更优选Ion Proton^TM或Ion PGM^TM。

8.根据权利要求5所述的方法，基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括：

将所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息与参考数据库进行比对；

基于比对结果，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。

9.根据权利要求8所述的方法，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选NCBI build36。

10.一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因，其特征在于，包括以下步骤：

针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据权利要求4所述的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签，所述多种为2-51种；

将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物；

对所述核酸测序文库混合物进行测序，以便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及所述DNA标签的序列信息；

基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，以便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息；以及

基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在进行所述测序之前进一步包括：将所述核酸测序文库混合物依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物的步骤。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，利用高通量测序技术进行所述测序，优选Solexa、SOLID、单分子、454、Ion Proton^TM和Ion PGM^TM测序平台的至少之一，更优选Ion Proton^TM或Ion PGM^TM。

13.根据权利要求10所述的方法，基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，进一步包括：

将所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别与参考数据库进行比对；

基于比对结果，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选NCBI build36。

15.一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因，其特征在于，所述试剂盒包括：

51种DNA标签，所述分离的DNA标签由SEQ ID NO：78-129所示的核苷酸构成；以及

78种PCR引物，所述分离的PCR引物由SEQ ID NO：1-78所示的核苷酸构成，

其中，所述51种DNA标签和78种PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。

16.一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因，其特征在于，所述试剂盒包括：

51组标签PCR引物，其中每一组所述标签PCR引物均是通过将选自权利要求1所述的一组DNA标签中的任意一种连接至权利要求2所述的一组PCR引物的5’末端而获得的，

所述51组标签PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。

17.一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的系统，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因，其特征在于，包括：

文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述多种DNA样品的每一种，分别独立地根据权利要求4所述的方法构建所述DNA样品的核酸测序文库，并将所述多种DNA样品的核酸测序文库进行混合，以便获得核酸测序文库混合物，其中，不同的DNA样品采用相互不同的DNA标签，所述多种为2-51种；

测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述核酸测序文库混合物进行测序，以便获得所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及所述DNA标签的序列信息；

数据处理装置，所述数据处理装置与所述测序装置相连，用于基于所述DNA标签的序列信息对所述多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息进行分类，以便确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息；以及

分析装置，所述分析装置与所述数据处理装置相连，用于基于所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。

18.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，进一步包括文库处理装置，所述文库处理装置与所述文库构建装置和所述测序装置相连，用于将所述核酸测序文库混合物依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物。

19.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述测序装置为选自Solexa、SOLID、单分子、454、Ion Proton^TM和Ion PGM^TM测序平台的至少之一，更优选Ion Proton^TM或IonPGM^TM。

20.根据权利要求17所述的系统，所述分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中设置有参考数据库，用于：

将所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，分别与参考数据库进行比对；以及

基于比对结果，分别确定所述多种DNA样品耳聋基因是否存在突变。

21.根据权利要求20所述的系统，其特征在于，所述参考数据库为耳聋基因数据库，优选NCBI build36。