CN105039322A - Dna标签序列及测序文库构建方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA标签,以及来5’末端连接有该DNA标签的PCR引物对,本发明还提供了由所述DNA标签和PCR引物对组成的构建测序文库的方法和试剂盒。本发明所提供的DNA标签与扩增引物形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达到优化、平衡的检测产品,一次可以检测1-20个不同来源的样品,能够准确区分各种样本来源的碱基序列,本发明所述的高通量测序与测序法的吻合率高达100%。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及一种DNA标签序列及测序文库构建方法和试剂盒。
技术背景
DNA测序(DNAsequencing)作为一种重要的实验技术,在生物学研究中有着广泛的应用。1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法,Sanger法因为既简便又快速,并经过后续的不断改良,成为了迄今为止DNA测序(即一代测序)的主流。一代测序作为基因组研究的主要研究手段和金标准,在过去的几十年里取得了重大的成就,也使得临床分子诊断成为了可能,但成本较高,耗时较长,通量低限制了其在临床的广泛应用。随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,这促使了新一代DNA测序技术的诞生,第二代测序技术是相应于以Sanger测序法为代表的第一代测序技术而得名。
第二代测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。二代测序是一项新的低成本,高通量,高准确度的快速测序技术,在临床和科学研究方面都有着广泛的应用。
目前常用的测序方法根据影响力、测序原理等不同主要有以下几种:以HeliScopeTIRM和PacificBiosciencesSMRT为代表的单分子测序,以454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、ABISOLiD测序为代表的二代高通量测序、DNA纳米球测序以及2010年LifeScience公司推出的IonPersonalGenomeMachine(PGM)测序等。
但目前二代测序所需的标签文库制备的方法存在着一些缺陷:现有测序平台的建库步骤多且复杂,各个步骤都是独立制备的,需要分别进行纯化,以保证各个步骤之间不会互相干扰和污染,从而造成DNA文库样品在纯化过程中不可避免的损失,操作过程繁琐。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种DNA标签,该DNA标签与PCR引物连接构成标签扩增引物,通过PCR扩增使PCR产物带上相应的DNA标签,并通过将多个不同样品来源的带有不同DNA标签的PCR产物混合成一个文库,从而实现高通量测序。
实现上述目的的技术方案如下。
一种DNA标签序列,包含至少一条以上序列,每条序列由6-8个碱基组成、且1)标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列;2)标签序列的GC含量在40%~60%之间;3)标签序列与扩增引物组合成标签引物后,内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构;4)不同的标签序列之间不存在非特异性结合,5)标签序列中不含有与扩增引物相似度大于80%的序列;6)标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异性结合。
在其中一个实施例中,所述DNA标签序列,其选自SEQIDNO:41-SEQIDNO:60中的至少一条。
在其中一个实施例中,所述DNA标签序列,其选自SEQIDNO:21-SEQIDNO:40中的至少一条。
在其中一个实施例中,所述DNA标签序列,其选自SEQIDNO:1-SEQIDNO:20中的至少一条。
本发明的另一目的是提供一种DNA标签构建测序文库的试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种DNA标签构建测序文库的试剂盒,包括有:针对不同样品的不同引物组,每组引物组包含有至少一对PCR引物对,且每对PCR引物对中至少一条的5’端连接有DNA标签序列,所述同一引物组的DNA标签序列相同,不同引物组的DNA标签序列不同,所述DNA标签序列如上所述。
在其中一个实施例中,PCR引物对选自SEQIDNO:61和62,SEQIDNO:63和64、SEQIDNO:65和66、SEQIDNO:67和68。
本发明的另一目的是提供一种DNA标签构建测序文库的方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种DNA标签构建测序文库的方法,主要包括以下步骤:
A、提取样本中的DNA;
B、采用上述DNA标签构建测序文库的试剂盒,用针对目标基因突变位点的标签PCR引物,PCR扩增不同的待测样品,针对每种不同的待测样品的标签PCR引物中的DNA标签序列不同;
C、纯化回收PCR扩增产物,并将不同待测样品的扩增产物混合,构成核酸测序文库。
在其中一个实施例中,所检测的样品的数量为1-20个,所述DNA标签序列选自SEQIDNO:41-SEQIDNO:60,或所述DNA标签序列选自SEQIDNO:21-SEQIDNO:40,或所述DNA标签序列选自SEQIDNO:1-SEQIDNO:20。
本发明的另一目的是提供一种高通量测序的方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种高通量测序的方法,主要包括以下步骤:
A、采用上述的DNA标签构建测序文库的方法,建立核酸测序文库;
B、将核酸测序文库依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物;
C、对上述连接产物进行测序,以确定所述核酸测序文库的序列信息。
在其中一个实施例中,所述步骤B中的所述接头的碱基序列如SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示。
本发明的主要优点在于:
1.本发明所设计的DNA标签序列具有非常好的特异性,DNA标签序列与扩增引物组合成标签引物后,内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构;不同的DNA标签序列之间不存在非特异性结合,标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异性结合。
2、本发明所提供的DNA标签与扩增引物形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达到优化、平衡的检测产品,一次可以检测1-20个不同来源的样品,能够准确区分各种样本来源的碱基序列,与测序法的吻合率高达100%。
3.本发明的检测方法步骤简单,可通过一步PCR扩增即可完成一个样品中多种目标检测序列的扩增,并使其扩增产物均带上一个特定的DNA标签,通过将带有不同标签的不同样品PCR产物混合,实现一次检测多个样品多种PCR产物的并行检测,避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术,特别符合临床需要。
5.本发明对第一代测序技术进行改进,使得所设计的DNA标签能适用于不同的检测项目,具有很强的拓展性,同时,二代测序技术使得检测的灵敏度进一步得到提高,信噪比增强,检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明在其中一个方面,涉及到一种DNA标签序列,其包含有至少一条以上的序列,每条序列由6-8个碱基组成、且i)标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列;ii)标签序列的GC含量在40%~60%之间;iii)标签序列与扩增引物组合成标签引物后,内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构;iv)不同的标签序列之间不存在非特异性结合,v)标签序列中不含有与扩增引物相似度大于80%的序列;vi)标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异性结合。
所使用的DNA标签,是指添加在PCR引物5’末端的一小段碱基序列,针对每个样品的PCR引物,其中的每对引物中的至少一条与一种DNA标签相连接,通过PCR扩增使该种样品来源的PCR产物带上相应的DNA标签,从而通过DNA标签精确地表征DNA的样本来源,并通过将多个不同样品来源的PCR产物(带有不同的DNA标签)混合成一个文库,从而实现一次测序中完成多个样品的高通量测序,其中,同一批待检测样品所用的标签的碱基个数相同。
本发明所述的DNA标签,可以在一条PCR引物中引入,也可以在两条PCR扩增引物中引入,所述的DNA标签序列与扩增引物相对应,可分为正向标签和反向标签序列,两者可以是相同的,也可以是不同的,其中,在PCR引物的5’末端添加DNA标签形成“标签引物”,具体为:
正向标签引物=5’-正向标签-正在扩增引物-3’端。
反向标签引物=5’-反向标签-反向扩增引物-3’端。正向标签和反向标签,序列可以相同,也可以不同。
每对标签引物由两部分组成,两条引物中的至少一条分别为5’端的DNA标签和3’端的扩增引物,其中,DNA标签用于在PCR扩增反应中标记PCR产物,扩增引物部分与模板碱基互补配对,从而启动PCR聚合反应。
实施例1一种DNA标签
本实施例在满足上述DNA标签设计条件的基础上,设计了三组特异性高的DNA标签,如表1、表2、表3所示,其中,表1的DNA标签序列为6个碱基,表2的DNA标签序列为7个碱基,表3的DNA标签序列为8个碱基,其中,同一个测序反应体系的PCR扩增引物,选用同一个列表中的DNA标签,通过与PCR扩增引物相结合,组成相应的标签扩增引物。
表1DNA标签序列(6bp)
SEQIDNO. | 标签序列(5’→3’) | SEQIDNO. | 标签序列(5’→3’) |
1 | TAGCCA | 11 | GATACG |
2 | ACATGC | 12 | GTACAG |
3 | TGTGCA | 13 | GACTGT |
4 | ACGTTG | 14 | AGTGCT |
5 | GAGCTA | 15 | TACCAG |
6 | GTCTGA | 16 | TTCGCA |
7 | CAGACT | 17 | GTATCG |
8 | TGAGCT | 18 | TTGCAG |
9 | AGCTCT | 19 | TGCAGT |
10 | GTCAGT | 20 | CTATGA |
表2DNA标签序列(7bp)
SEQIDNO. | 标签序列(5’→3’) | SEQIDNO. | 标签序列(5’→3’) |
21 | AGATCTG | 31 | ATGTCGA |
22 | TGACTAC | 32 | CTCTATG |
23 | TGTCTGA | 33 | TGCACGT |
24 | GTCGAGA | 34 | AGCATGA |
25 | GTCTGAT | 35 | TGACAGA |
26 | GCTGTAC | 36 | AGCTGTC |
27 | TCTCCAG | 37 | TCTAGAC |
28 | GTACTGA | 38 | TGTCGTG |
29 | AGTATCG | 39 | AGTGTAC |
30 | CTGAGTT | 40 | ACAAGTG |
表3DNA标签序列(8bp)
SEQIDNO. | 标签序列(5’→3’) | SEQIDNO. | 标签序列(5’→3’) |
41 | TCGACTGA | 51 | TCCAATGA |
42 | TCAGTGCA | 52 | ACGAGATC |
43 | TGACTGAG | 53 | GAGATCGT |
44 | GAGTCAGT | 54 | GACATCAG |
45 | GTAGAGTG | 55 | GTGCTCTA |
46 | TGCGTAGT | 56 | GTACTGAG |
47 | TGTACGTC | 57 | AGTCTTCG |
48 | ATCGTGCT | 58 | GAGCTCAT |
49 | GATGCTAG | 59 | TGTCGACT |
50 | TCGTCATG | 60 | GTCTGCAT |
实施例2标签PCR引物、由PCR引物对和DNA标签构建的测序文库的试剂盒
1、PCR扩增引物
本实施例以EGFR基因和BRAF基因突变检测为例,使用实施例1中所述DNA标签序列,与目标检测的EGFR基因和BRAF基因突变位点的扩增引物,构建成测序文库的试剂盒。即构建具体的标签PCR引物,根据本发明确定多种DNA样本目标检测基因是否存在突变的方法。
本发明针对EGFR基因和BRAF基因设计PCR引物,利用该组PCR引物将DNA样品进行PCR扩增,能够一步PCR扩增出目标检测基因片段,具体PCR引物为:
表4PCR扩增引物
2、标签PCR引物和DNA标签构建测序文库的试剂盒
本发明DNA标签构建测序文库试剂盒,包括有:针对不同样品的不同PCR引物组,所述每一组PCR引物包含有至少一对PCR引物对,且每对PCR引物对中至少一条的5’端连接有DNA标签序列,所述同一引物组的DNA标签序列相同,不同引物组的DNA标签序列不同,所述DNA标签序列来源于实施例1,所述PCR引物来源于实施例2。
本实施例中,使用上述扩增引物和表3中DNA标签构建标签PCR引物,在EGFR基因和BRAF基因的正向扩增引物和反向扩增引物的5’末端均引入相同的DNA标签,从而形成“标签引物”,并将该标签扩增引物混合,形成标签引物组,实现一个样品中目标检测EGFR基因和BRAF基因含有突变位点序列的并行扩增。
每组标签PCR引物可分别对应于一个待检测样品,其中,第一样品使用一种DNA标签与表4所述的扩增引物相连,从而形成第一样品的“标签引物组”,第二样品使用另一种DNA标签与表4所述的扩增引物相连,从而形成第二样品的“标签引物组”,如此类推,不同样品的PCR扩增引物,使用不同的DNA标签进行标记,并形成与待检测样品一一对应的“标签引物组”,具体如表5所示,本实施例使用根据上述原则构建的标签引物,针对20种样品分别设计了5’端连接有DNA标签的扩增引物。
表5标签PCR引物
样品序号 | 连接于扩增引物5’端的DNA标签 |
1 | SEQ ID NO.41 |
2 | SEQ ID NO.42 |
3 | SEQ ID NO.43 |
4 | SEQ ID NO.44 |
5 | SEQ ID NO.45 |
6 | SEQ ID NO.46 |
7 | SEQ ID NO.47 |
8 | SEQ ID NO.48 |
9 | SEQ ID NO.49 |
10 | SEQ ID NO.50 |
11 | SEQ ID NO.51 |
12 | SEQ ID NO.52 |
13 | SEQ ID NO.53 |
14 | SEQ ID NO.54 |
15 | SEQ ID NO.55 |
16 | SEQ ID NO.56 |
17 | SEQ ID NO.57 |
18 | SEQ ID NO.58 |
19 | SEQ ID NO.59 |
20 | SEQ ID NO.60 |
标签PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液,其中,每种标签贮存液分开保存,并做好标记。
实施例3使用实施例2中标签PCR引物对样品进行检测
一、样本的DNA提取:
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
配制标签引物工作液:依照表5中20个样本的顺序,分别取带有DNA标签的PCR引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,组装成20管标签PCR扩增引物,混合均匀即为多重PCR引物工作液,针对每一种样本,每管工作液中含有5’端引入特定DNA标签的、针对EGFR基因和BRAF基因的扩增引物。分别扩增含突变位点的靶标序列,PCR反应体系如下:
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃20s,56℃30s,72℃30s,30个循环;72℃10min;
将20个样品PCR反应后的产物混合,并进行2.5%的琼脂糖凝胶电泳,切胶回收大小为110~210bp的片段,纯化产物做好标记,于4℃保存备用。
三、末端修复
将步骤二的纯化产物进行末端修复,在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系:具体如下:
将上述配制所得的混合液置于25℃,进行反应1h。反应完成后利用市售的试剂盒或磁珠进行纯化,最后纯化产物溶于40μl的洗脱缓冲液中。
四、连接接头
本实施例中,所选择的A1接头和A2接头具体如表6所示,其中,不同样本使用相同的A1接头和相同的A2接头。
表6A1接头和A2接头
名称 | 碱基序列(5’→3’) | SEQ ID NO. |
A1接头 | CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT | 69 |
A2接头 | CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA | 70 |
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条序列分别用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。
各取A1接头和A2接头贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,配制成接头工作液;
配置连接接头反应体系,具体步骤如下:
末端修复产物 | 40μL |
MgCl2(200mM) | 7μL |
连接缓冲液(10×) | 10μL |
接头工作液 | 8μL |
Tris-HCl(500mM) | 10μL |
二硫苏糖醇(100mM) | 15μL |
T4 DNA连接酶(200U/ul) | 10μL |
总体积 | 100μL |
配置好的反应体系置于20℃,20min;65℃,15min。反应完成后使用磁珠进行纯化;纯化产物置于4℃保存备用。
五、文库检测
扩增所得PCR产物进行纯化,并用AgilentBioanalyzer2100或Q-PCR检测片段大小及文库浓度。
六、使用IonProtonTM制备测序模板
根据IonProtonTM测序仪配套试剂盒,使用步骤五所得测序文库制备测序模板,具体操作,参看产品说明书。
七、上机测序
严格按照仪器操作说明书进行测序操作,本实施例中采用PI芯片,在芯片中加载酶、测序引物和制备好的测序模板等,测序过程约2.5个小时,便可得到测序序列信息。
八、测序结果的分析
根据DNA标签序列与样品1~20的对应关系,将每个样品测序所得的数据与直接测序法进行对比,计算本发明所提供的检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的EGFR基因和BRAF基因目标突变位点的检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的标签扩增引物能够在检测过程中准确地检测出20个样品的EGFR和BRAF基因目标突变位点的SNP类型,且结果稳定可靠。具体的测序结果如下:
表7检测结果对比
样本号 | 本发明检测结果 | 直接测序法 |
1 | 野生型 | 野生型 |
2 | 19M4突变 | 19M4突变 |
3 | 野生型 | 野生型 |
4 | 野生型 | 野生型 |
5 | 野生型 | 野生型 |
6 | 野生型 | 野生型 |
7 | T790M突变 | T790M突变 |
8 | 野生型 | 野生型 |
9 | 野生型 | 野生型 |
10 | 野生型 | 野生型 |
11 | 野生型 | 野生型 |
12 | 野生型 | 野生型 |
13 | L858R突变 | L858R突变 |
14 | 野生型 | 野生型 |
15 | 野生型 | 野生型 |
16 | 野生型 | 野生型 |
17 | 野生型 | 野生型 |
18 | V600E突变 | V600E突变 |
19 | 野生型 | 野生型 |
20 | 野生型 | 野生型 |
实施例4选择不同长度DNA标签对测序结果的影响
一、标签PCR引物的设计(不同长度DNA标签的选择)
以EGFR基因和BRAF基因为例,使用表4中扩增引物,分别与表1(SEQIDNO.1~20)、表2(SEQIDNO.21~40)、表3(SEQIDNO.41~60)的DNA标签,构建标签PCR引物,具体如表8所示。
本实施例中,在EGFR基因和BRAF基因的正向扩增引物和反向扩增引物的5’末端均引入相同的DNA标签,从而形成“标签引物”,并将该标签扩增引物混合,形成标签引物组,实现一个样品中目标检测EGFR基因和BRAF基因含有突变位点序列的并行扩增。
例如:第一样品使用一种SEQIDNO.1标签与表4所述的扩增引物(正向扩增引物和反向扩增引物)相连,从而形成第一样品的“标签引物组”,第二样品使用SEQIDNO.2标签与表4所述的扩增引物相连,从而形成第二样品的“标签引物组”,如此类推,不同样品的PCR扩增引物,使用不同的DNA标签进行标记,并形成与待检测样品一一对应的“标签引物组”,具体如表8所示。
本实施例使用根据上述原则构建的标签引物,分别使用表1(6bp)、表2(7bp)表3(8bp)的DNA标签,设计三组对比实验,对20种样品分别进行PCR扩增,将本实验组内的PCR产物进行混合、末端修复、文库检测、制备测序模板、上机测序等对比其检测效果,具体操作如实施例2和实施例3所示。
表8DNA标签的选用
样本号 | Group1 | Group2 | Group3 |
21 | SEQ ID NO.1 | SEQ ID NO.21 | SEQ ID NO.41 |
22 | SEQ ID NO.2 | SEQ ID NO.22 | SEQ ID NO.42 |
23 | SEQ ID NO.3 | SEQ ID NO.23 | SEQ ID NO.43 |
24 | SEQ ID NO.4 | SEQ ID NO.24 | SEQ ID NO.44 |
25 | SEQ ID NO.5 | SEQ ID NO.25 | SEQ ID NO.45 |
26 | SEQ ID NO.6 | SEQ ID NO.26 | SEQ ID NO.46 |
27 | SEQ ID NO.7 | SEQ ID NO.27 | SEQ ID NO.47 |
28 | SEQ ID NO.8 | SEQ ID NO.28 | SEQ ID NO.48 |
29 | SEQ ID NO.9 | SEQ ID NO.29 | SEQ ID NO.49 |
30 | SEQ ID NO.10 | SEQ ID NO.30 | SEQ ID NO.50 |
31 | SEQ ID NO.11 | SEQ ID NO.31 | SEQ ID NO.51 |
32 | SEQ ID NO.12 | SEQ ID NO.32 | SEQ ID NO.52 |
33 | SEQ ID NO.13 | SEQ ID NO.33 | SEQ ID NO.53 |
34 | SEQ ID NO.14 | SEQ ID NO.34 | SEQ ID NO.54 |
35 | SEQ ID NO.15 | SEQ ID NO.35 | SEQ ID NO.55 |
36 | SEQ ID NO.16 | SEQ ID NO.36 | SEQ ID NO.56 |
37 | SEQ ID NO.17 | SEQ ID NO.37 | SEQ ID NO.57 |
38 | SEQ ID NO.18 | SEQ ID NO.38 | SEQ ID NO.58 |
39 | SEQ ID NO.19 | SEQ ID NO.39 | SEQ ID NO.59 |
40 | SEQ ID NO.20 | SEQ ID NO.40 | SEQ ID NO.60 |
二、样品检测
采用上述设计的标签PCR引物,按实施例2、实施例3所述检测过程和方法对样品21-40进行检测,检测结果如下:
表9样本检测结果(MFI)与基因突变分析
样本号 | Group1 | Group2 | Group3 | 直接测序法 |
21 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
22 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
23 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
24 | 19M4突变 | 19M4突变 | 19M4突变 | 19M4突变 |
25 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
26 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
27 | T790M突变 | T790M突变 | T790M突变 | T790M突变 |
28 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
29 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
30 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
31 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
32 | V600E突变 | V600E突变 | V600E突变 | V600E突变 |
33 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
34 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
35 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
36 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
37 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
38 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
39 | L858R突变 | L858R突变 | L858R突变 | L858R突变 |
40 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
从上述实施例可以看出,本发明提供的不同长度的DNA标签序列,其构建的标签PCR引物,检测效果相同,其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例5不同数量和位置的DNA标签对测序结果的影响
一、标签PCR引物的设计(不同数量和位置的DNA标签)
以EGFR基因和BRAF基因为例,分别在EGFR基因和BRAF基因目标检测突变位点的正向扩增引物和/或反向扩增引物的5’末端引入DNA标签,从而形成“标签引物”,具体见表10,并将该标签扩增引物混合,对样品中目标检测EGFR基因和BRAF基因含有突变位点序列的并行扩增,从而考察不同数量和位置的DNA标签对检测结果的影响。
本实施例使用根据上述原则构建的标签引物,设计三组对比实验,对5种样品分别进行PCR扩增,将本实验组内的PCR产物进行混合、末端修复、文库检测、制备测序模板、上机测序等对比其检测效果,具体操作如实施例2和实施例3所示。
表10DNA标签的选用
二、样品检测
采用上述设计的标签PCR引物,按实施例2、实施例3所述检测过程和方法对样品41-45进行检测,检测结果如下:
表11样本检测结果(MFI)与基因突变分析
样本号 | Group1 | Group2 | Group3 | 直接测序法 |
41 | V600E突变 | V600E突变 | V600E突变 | V600E突变 |
42 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
43 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
44 | L858R突变 | L858R突变 | L858R突变 | L858R突变 |
45 | 野生型 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
从上述实施例可以看出,分别在EGFR基因和BRAF基因目标检测突变位点的正向扩增引物、反向扩增引物、正向扩增引物和反向扩增引物的5’末端引入DNA标签,其检测结果一致,其他类似情况的具体检测数据省略。
实施例6不同的DNA标签对测序结果的影响
一、标签PCR引物的设计(相同和不同的DNA标签)
以EGFR基因和BRAF基因为例,分别在EGFR基因和BRAF基因目标检测突变位点的正向扩增引物和反向扩增引物的5’末端引入相同的DNA标签和不同的DNA标签,从而形成“标签引物”,具体见表12,并将该标签扩增引物混合,对样品中目标检测EGFR基因和BRAF基因含有突变位点序列的并行扩增,从而考察在正向扩增引物和反向扩增引物中引入相同的DNA标签与不同的DNA标签对检测结果的影响。
本实施例使用根据上述原则构建的标签引物,设计两组对比实验,对5种样品分别进行PCR扩增,将本实验组内的PCR产物进行混合、末端修复、文库检测、制备测序模板、上机测序等对比其检测效果,具体操作如实施例2和实施例3所示。
表12DNA标签的选用
二、样品检测
采用上述设计的标签PCR引物,按实施例2、实施例3所述检测过程和方法对样品46-50进行检测,检测结果如下:
表13样本检测结果(MFI)与基因突变分析
样本号 | Group1 | Group2 | 直接测序法 |
46 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
47 | T790M突变 | T790M突变 | T790M突变 |
48 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
49 | 野生型 | 野生型 | 野生型 |
50 | 19M4突变 | 19M4突变 | 19M4突变 |
从上述实施例可以看出,分别在EGFR基因和BRAF基因目标检测突变位点的正向扩增引物和反向扩增引物的5’末端引入相同的DNA标签和不同的DNA标签,其检测结果一致,其他类似情况的具体检测数据省略。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种DNA标签序列,其特征是,包含至少一条以上序列,每条序列由6-8个碱基组成、且i)标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列;ii)标签序列的GC含量在40%~60%之间;iii)标签序列与扩增引物组合成标签引物后,内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构;iv)不同的标签序列之间不存在非特异性结合,v)标签序列中不含有与扩增引物相似度大于80%的序列;vi)标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异性结合。
2.根据权利要求1所述的DNA标签序列,其特征是,所述DNA标签序列选自SEQIDNO:41-SEQIDNO:60中的至少一条。
3.根据权利要求1所述的DNA标签序列,其特征是,所述DNA标签序列其选自SEQIDNO:21-SEQIDNO:40中的至少一条。
4.根据权利要求1所述的DNA标签序列,其特征是,所述DNA标签序列选自SEQIDNO:1-SEQIDNO:20中的至少一条。
5.一种DNA标签构建测序文库的试剂盒,其特征是,包括有:针对不同样品的不同引物组,每组引物组中包含有至少一对PCR引物对,且每对PCR引物对中至少一条的5’端连接有DNA标签序列,所述同一引物组的DNA标签序列相同,不同引物组的DNA标签序列不同,所述DNA标签序列选自权利要求1~4。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征是,PCR引物对选自SEQIDNO:61和62,SEQIDNO:63和64、SEQIDNO:65和66、SEQIDNO:67和68。
7.一种DNA标签构建测序文库的方法,其特征是,主要包括以下步骤:
A、提取样本中的DNA;
B、采用权利要求5或6所述的试剂盒,PCR扩增不同的待测样品,针对不同待测样品的不同引物组,其DNA标签序列不同;
C、纯化回收PCR扩增产物,并将不同待测样品的扩增产物混合,构成核酸测序文库。
8.根据权利要求7所述的DNA标签构建测序文库的方法,其特征是,所检测的样品的数量为1-20个,所述DNA标签序列选自SEQIDNO:41-SEQIDNO:60,或所述DNA标签序列选自SEQIDNO:21-SEQIDNO:40,或所述DNA标签序列选自SEQIDNO:1-SEQIDNO:20。
9.一种高通量测序的方法,其特征是,主要包括以下步骤:
A、采用权利要求7-8任一项所述的DNA标签构建测序文库的方法,建立核酸测序文库;
B、将核酸测序文库依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物;
C、对上述连接产物进行测序,以确定所述核酸测序文库的序列信息。
10.根据权利要求9所述的高通量测序的方法,其特征是,所述步骤B中所述接头的碱基序列如SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示。
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