CN109610010A - 一种egfr基因的fish探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种EGFR基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。本发明提供的方法使用BAC克隆、酶切打断以及不对称扩增等方法制备探针文库，使得产品灵敏度、特异性以及信号强度均得到有效提高。

Description

一种EGFR基因的FISH探针的制备方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种EGFR基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是细胞表面受体酪氨酸激酶HER/ErbB家族成员，广泛分布于人体多种正常组织的细胞膜上，对细胞的增殖、迁移起到重要的作用。EGFR分子量170KDa，位于细胞膜表面，属于酪氨酸激酶型受体。
EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。
目前对于EGFR基因异常的检测主要有两种方法，一种是基于聚合酶链式反应(PCR)的基因突变检测方法，一种是基于荧光原位杂交法(FISH)的基因扩增检测方法。
基于PCR的基因突变检测方法，例如：
中国专利申请201710153611.3公开了一种EGFR基因检测试剂盒及检测方法。该试剂盒针对EGFR18号外显子、19号外显子、20号外显子、21号外显子区域的特定位点，设计了特异性的扩增引物序列，使得对待测位点的检测假阳性率低，灵敏度高，能够检测出突变比例为5％以上的基因突变；在含待测位点的EGFR核酸片段两端分别F接头和R接头获得文库分子，F接头和R接头上均含有扩增引物结合位点，当对多个含待测位点的EGFR基因片段进行测序时，统一了对文库分子进行扩增的扩增引物，保证了扩增效率的一致性，降低了引物设计难度；R接头设计为发夹结构，能够对扩增产物的末端进行封闭，从而有效避免F接头连接在R接头上，提高了连接效率。
中国专利申请201810278490.X公开了一种直接使用TaqMan探针检测EGFR基因上热点突变的试剂盒，涉及到8个热点位点。每个位点对应于两条上下游引物及特异性的两条TaqMan探针，并且将8个SNP位点分为4组体系，于单管反应体系中同时对2个位点进行检测。该发明试剂盒采用四重探针检测技术，通过特异性扩增，于单个反应体系中检测出两个位点的信息。此试剂盒具有检测速度快、敏感性和特异性好的优点。
中国专利申请201310756037.2公开了一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对EGFR基因外显子设计引物；抽提受试者血浆DNA；将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。
以上检测方法主要针对EGFR的点突变进行检测。
基于FISH技术的检测方法，例如中国专利申请201510050952.9中公开了EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针。该申请所提供的EGFR基因扩增检测试剂盒中的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中EGFR目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。
根据上述申请公开的内容不难看出，其采用的技术思路为：1、涉及扩增引物用于扩增探针并构建探针库(在此步骤中该申请采用常规T-A克隆方式直接对扩增产物进行建库，并未对扩增产物做任何其它处理)；2、将上述探针库标记后直接用于样本检测。
上述技术思路为FISH检测法的常规方式，对其具体操作细节进行深入分析，可以发现：(1)探针针对待检样本的目标DNA区域进行设计，通常情况下一条探针DNA分子结合一条目标DNA分子，一旦发生单条探针脱靶，对检测信号有明显影响；(2)单条探针脱靶对检测信号的影响继而会间接影响检测的准确性，出现假阳性和假阴性信号的可能性增加；(3)除了对检测信号以及准确性的影响之外，单条探针的脱靶也会明显降低检测的灵敏度；(4)此外，针对EGFR涉及的探针分子长度在300bp左右，作为本领域公知，探针分子越大，越不容易进入细胞内部。
由此可见，现有的EGFR基因的检测技术虽然在一些方面取得了比较好的效果，但是由于其设计原理等方面的限制，仍存在诸多技术问题。
针对以上技术问题，本发明提供了一种新的FISH探针制备方法，该方法对常规方法扩增出的探针进行具有针对性的打断处理以及不对称扩增处理等方式，将探针打断成更小的片段，且形成单双链混合的探针组等形式。由此带来的技术改进为：1、获得的探针文库片段更小，更容易进入待检样本细胞，杂交所需时间更短；2、获得探针组是单双链混合，信号强度更好；3、获得的探针文库可以实现多条探针DNA分子结合一条目标DNA分子，即荧光信号会由多条特异性探针组合定位，特异性更高，单条探针脱靶不会对结果信号产生较大的影响，检测灵敏度更高，假阳性和假阴性信号的可能性更小，检测准确性更高。4、具有安全、经济、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点，同时还可应用于石蜡包埋的陈年样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。5、本发明探针组能够保证探针覆盖靶基因所有特异的区域，提高杂交效率和检测信号强度，并显著增强了观察的视觉效果等技术效果。克服了荧光原位杂交多位点联合检测时存在相互干扰、检测耗时较长的问题。
发明内容
鉴于上述本领域存在的技术问题，本发明的公开旨在提供一种EGFR基因的FISH探针文库的制备方法；同时提供由此方法制备得到的用于检测EGFR基因异常的FISH探针文库及包含此探针文库的试剂盒；还提供基于上述制备方法的EGFR基因异常的检测方法。
一方面，本发明提供了一种EGFR基因的FISH探针文库的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)制备得到探针1；
(2)酶切打断步骤(1)获得的探针1，得到探针2；
(3)给步骤(2)获得的探针2添加接头，得到探针3；
(4)对步骤(3)获得的探针3进行不对称扩增，得到FISH探针文库。
所述的制备方法步骤(1)中的探针1为探针1A和/或探针1B；当探针1为探针1A和探针1B时，分别提取BAC克隆质粒制备得到探针1A对应的FISH探针文库以及探针1B对应的FISH探针文库。
所述的探针1A为针对EGFR基因的一条或多条探针。
当探针1A为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合；优选地，当探针1A为多条探针时，各条探针以等摩尔浓度比混合；更优选地，当探针1A为多条探针时，各条探针以1ng/μL的浓度等比例混合。
所述的探针1A能够和EGFR基因的部分或全部序列杂交结合。
所述的探针1A可以选自BAC克隆RP11-443C12、BAC克隆RP11-815K24和BAC克隆RP11-89E8中的一种或多种。
所述的探针1B为针对人类7号染色体着丝粒区域的一条或多条探针。
当探针1B为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合；优选地，当探针1B为多条探针时，各条探针以等摩尔浓度比混合；更优选地，当探针1B为多条探针时，各条探针以1ng/μL的浓度等比例混合。
所述的探针1B能够和7号染色体着丝粒区域的部分或全部序列杂交结合。
所述的探针1B可以选自BAC克隆RP11-1146G20和BAC克隆RP11-438I18中的一种或两种。
本发明中：
所述的BAC克隆RP11-443C12购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-443C12；
所述的BAC克隆RP11-815K24购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-815K24；
所述的BAC克隆RP11-89E8购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-89E8；
所述的BAC克隆RP11-1146G20购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-1146G20；
所述的BAC克隆RP11-438I18购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-438I18。
所述的制备方法步骤(2)中的酶切打断探针1使用的酶为限制性内切酶混合液，所述的限制性内切酶混合液包括AluI、HaeIII、HpyCH4V、MluCI、BfaI、MseI中的两种或者多种；
优选为AluI、HpyCH4V、MluCI和BfaI，且其体积比为1:2:0.5:0.4；
在一些具体的实施方案中，酶切打断探针1使用的酶为AluI(10000U/mL)、HpyCH4V(5000U/mL)、MluCI(10000U/mL)和BfaI(10000U/mL)。
所述的制备方法步骤(2)中的酶切打断探针1后，得到具有5’突出末端或平末端的酶切产物，使用Taq DNA聚合酶进行末端补齐及3’端dA尾添加后，得到探针2。
本发明中：
限制性内切酶AluI购自NEB公司，货号为R0137L；
限制性内切酶HaeIII购自NEB公司，货号为R0108L；
限制性内切酶HpyCH4V购自NEB公司，货号为R0620L；
限制性内切酶MluCI购自NEB公司，货号为R0538L；
限制性内切酶BfaI购自NEB公司，货号为R0568L；
限制性内切酶MseI购自NEB公司，货号为R0525L。
作为一个推荐的酶切打断方法，所述的制备方法步骤(2)中的酶切打断探针1的操作方法可以为以下方法或本领域技术人员根据以下方法针对其中一点或几点参数、一条或几条步骤进行删减、增加或替换后得到的步骤或同等操作方法：
(1)酶切打断的体系为：
(2)酶切打断的条件为：37℃酶切30分钟(min)后，72℃反应20min后，80℃反应20min。
本发明中：
10×CutSmart Buffer购自NEB公司，货号为B7204S；
Taq DNA聚合酶购自NEB公司，货号为M0273L；
dNTP购自NEB公司，货号为N0446S，(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各一支，每支浓度均为100mM，4种1:1混合配成10mM dNTP)。
所述的制备方法中，步骤(3)给探针2添加接头的方法为：通过T4DNA连接酶将探针2和接头序列连接，
其中的接头序列优选为A1接头和A2接头，其中A2接头5’端第一个碱基C含有磷酸化修饰：
名称 碱基序列(5’→3’)
A1接头 CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT
A2接头 CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA
所述的连接反应体系包括：T4DNA连接酶、接头和探针2；
所述的连接反应条件为：12-16℃，15-30min；20-24℃，15-30min；28-37℃，15-30min；65℃，10min；4℃保存。
作为一个推荐的连接方法，所述的制备方法步骤(3)给探针2添加接头的连接方法可以为以下方法或本领域技术人员根据以下方法针对其中一点或几点参数、一条或几条步骤进行删减、增加或替换后得到的步骤或同等操作方法：
(1)连接反应的体系为：
(2)连接反应的条件为：
温度 时间
16℃ 20min
24℃ 20min
37℃ 20min
65℃ 10min
4℃ ∞
在具体的实施方案中，采用纯化试剂盒HiPure Nucleotide Remove Kit对连接产物进行纯化，产物用25μL无菌超纯水洗脱，取20μL用于后续步骤。
本发明中：
T4DNA连接酶及其缓冲液购自NEB公司，货号为M0202L。
所述的制备方法步骤(4)中对探针3进行不对称扩增，通过在扩增使用的dNTP中加入aminoallyl-dUTP实现在FISH探针序列中掺入氨基标记的目的。
所述的不对称扩增体系包括：dNTP、aminoallyl-dUTP、Epimark Hot strat TaqDNA polymerase、引物和探针3。
所述的dNTP和aminoallyl-dUTP的摩尔比为4:1；
所述的dTTP和aminoallyl-dUTP的摩尔比为1:4。
不对称扩增体系的引物为：
名称 碱基序列(5’→3’)
F CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT
R TCGGAGACACTCAGAGATGTGATGG
在一些具体的实施方案中，dNTP和aminoallyl-dUTP的配比为：
dATP(100mM) 20μL
dCTP(100mM) 20μL
dGTP(100mM) 20μL
dTTP(100mM) 4μL
aminoallyl-dUTP(50mM) 32μL
NF水 404μL
所述的不对称扩增反应条件为：95℃，3min，1个循环；94℃，15s，65℃5min，35个循环；4℃，保存。
本发明中：
dATP购自NEB，货号为N0446S；
dGTP购自NEB，货号为N0446S；
dTTP购自NEB，货号为N0446S；
dCTP购自NEB，货号为N0446S；
aminoallyl-dUTP购自Thermo，货号为R1101。
作为一个推荐的方法，所述的制备方法步骤(4)对探针3进行不对称扩增的方法可以为以下方法或本领域技术人员根据以下方法针对其中一点或几点参数、一条或几条步骤进行删减、增加或替换后得到的步骤或同等操作方法：
(1)不对称扩增反应体系：
(2)不对称扩增反应条件：
本发明中：
5X EpiMark Hot Start Taq Reaction Buffer购自NEB公司，货号为B0490；
Epimark Hot strat Taq DNA polymerase购自NEB公司，货号为M0490。
所述的制备方法还包括在步骤(4)之后，对获得的FISH探针文库进行荧光标记；所述的荧光标记的方法为：在FISH探针文库中加入硼酸标记缓冲液和染料。
标记后的FISH探针文库经纯化和沉淀，自然风干后，溶解于TE缓冲液中，测定浓度后，与人Cot-1DNA、杂交缓冲液按比例配置成探针杂交液，-20℃避光冷冻保存。
在一些具体的实施方案中，所述的杂交缓冲液包括：
20×SSC 0.625mL
Dextran Sulfate 1.25g
Deionized Formamide 6.25mL
TE缓冲液 定容至10mL
在一些具体的实施方案中，探针杂交液包括：
标记后的FISH探针文库 20μg
人Cot1-DNA 120μL
杂交缓冲液 补齐至2000μL
其中，人Cot1-DNA购自Invitrogen，货号为15279101。
另一方面，本发明还提供了按照上述制备方法所制备的FISH探针文库；以及包含该FISH探针文库的用于检测EGFR基因异常的试剂盒。
所述的用于检测EGFR基因异常的试剂盒还包括：石蜡包埋组织样本预处理试剂、洗涤缓冲液、DAPI和/或DNA分子杂交试剂。
再一个方面，本发明还提供了一种EGFR基因异常的检测方法，所述的检测方法包含上述制备方法的步骤。
与现有技术相比，本发明至少具有以下进步：
(1)本发明提供了一种新的FISH探针制备思路，对常规方法获得的探针进行具有针对性的打断处理以及不对称扩增处理等方式，将探针打断成更小的片段，且形成单双链混合的探针组等形式，使得：1、获得的探针文库片段更小，更容易进入待检样本细胞，杂交所需时间更短；2、获得探针组是单双链混合，信号强度更好；3、获得的探针文库可以实现多条探针DNA分子结合一条目标DNA分子，即荧光信号会由多条特异性探针组合定位，特异性更高，单条探针脱靶不会对结果信号产生较大的影响，灵敏度更高，假阳性和假阴性信号的可能性更小，检测准确性更高。
(2)本发明提供的探针制备方法，对连接反应条件进行了优化，进一步提高了连接效率，同时发现检测的灵敏度也相应提高。
(3)本发明提供的探针制备方法，对dNTP和aminoallyl-dUTP的摩尔比进行了优化，一方面保证在扩增反应的同时完成有效的氨基标记，另一方面减少制备的荧光原位杂交探针中存在的重复序列被标记(重复序列多为GC序列)，减少重复序列在探针与非靶标DNA片段杂交后产生的荧光信号，即降低了非特异性的荧光信号，减少假阳性发生，大大提高了FISH检测的特异性和灵敏度，具有极高的信噪比和样本检出率。
(4)本发明提供的探针制备方法，对打断采用的限制性酶的配比，反应体系均进行了优化，使得探针酶切、酶切产物末端补齐及3’端dA尾添加于同一体系中完成，节省反应步骤，同时多种酶的联合使用，大大提高探针制备效率，可有效降低探针的生产成本，避免使用昂贵的仪器操作，便于快速、规模化工业生产。
(5)本发明提供的探针制备方法，在进行连接反应时，对连接反应条件进行了优化，采用程序升温的反应条件设置，提高了连接效率。
(6)本发明提供的探针制备方法，在进行不对成扩增时，对引物的配比进行了优化，经不对称扩增反应，获得了合理的单链与双链混合探针体系，无须像传统双链探针一样需要先预变性才能与样本杂交，操作更为便捷。
(7)本发明具有安全、经济、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点；同时，由于陈年组织切片样本的蛋白交联程度高、核酸存在不同程度降解，常规检测试剂检测难度大，而本发明小探针更容易进入细胞，还可应用于石蜡包埋的陈年样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。
(8)本发明探针组能够保证探针覆盖靶基因所有特异的区域，提高杂交效率和检测信号强度，并显著增强了观察的视觉效果的技术效果。克服了荧光原位杂交多位点联合检测时存在相互干扰、检测耗时较长的问题，一步法杂交孵育在2h内快速完成，大大减少了检测时间，提高检测效率，避免检测结果假阴性。提高探针检测稳定性，保证检测结果的一致性和使用有效期长的时效性。该探针组合的特异性和敏感性均达到了100％。
(9)本发明使用的BAC克隆片段大小相近，每一端的荧光强度保持一致，防止一端过强而另一端过弱而影响观察；另外可使原位杂交条件保持一致性。
附图说明
图1为实验例2中的检测结果图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
以下实施方案中未详细描述的操作，根据本领域内的文献所描述的技术和条件，如参考《分子克隆实验指导·第三版》(科学出版社)或者根据相应试剂盒的产品说明书进行。
基础实施例：
一种EGFR基因的FISH探针文库的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备得到探针1A和探针1B；
(2)分别酶切打断步骤(1)获得的探针1A和探针1B后，使用Taq DNA聚合酶进行末端补齐及3’端dA尾添加后，分别得到探针2A和2B；
酶切打断的体系为：
试剂 添加量
10×CutSmart Buffer 5μL
限制性内切酶混合液 2μL
探针1A或1B(1ng/μL) 40μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
10mM dNTP 1μL
ddH<sub>2</sub>O 1.5μL
酶切打断的反应条件为：37℃酶切30分钟min，72℃反应20min，80℃反应20min；
(3)分别给步骤(2)获得的探针2A和2B添加接头，分别得到探针3A和3B；
连接反应的体系为：
其中，接头溶液中含有以下A1接头和A2接头，且二者以等摩尔比混合配制成接头溶液，其中A2接头5’端第一个碱基C含有磷酸化修饰。
名称 碱基序列(5’→3’)
A1接头 CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT
A2接头 CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA
实施例1-7和9-10的连接反应的条件为：
温度 时间
16℃ 20min
24℃ 20min
37℃ 20min
65℃ 10min
4℃ ∞
实施例8的连接反应的条件为：
温度 时间
16℃ 60min
65℃ 10min
4℃ ∞
采用纯化试剂盒HiPure Nucleotide Remove Kit对连接产物进行纯化，产物用25μl无菌超纯水洗脱，取20μl用于后续步骤。
(4)分别对步骤(3)获得的探针3A和3B进行不对称扩增，得到FISH探针文库；
不对称扩增反应体系：
试剂 添加量
5X EpiMark Hot Start Taq Reaction Buffer 10μL
dNTP混合液(含aminoallyl-dUTP) 3μL
Epimark Hot strat Taq DNA polymerase 0.25μL
Nuclease-free water 14.75μL
引物F(1μM) 1μL
引物R(20μM) 1μL
探针3A或3B 20μL
引物F和引物R为：
名称 碱基序列(5’→3’)
引物F CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT
引物R TCGGAGACACTCAGAGATGTGATGG
在实施例1-8、10中，dNTP混合液(含aminoallyl-dUTP)为：
在实施例9中，dNTP混合液(含aminoallyl-dUTP)为：
dATP(100mM) 20μL
dCTP(100mM) 20μL
dGTP(100mM) 20μL
dTTP(100mM) 2μL
aminoallyl-dUTP(50mM) 38μL
NF水 400μL
不对称扩增反应条件为：95℃，3min，1个循环；94℃，15s，65℃5min，35个循环；4℃，保持。
(5)对得到的FISH探针文库进行荧光标记；荧光标记的方法为：在FISH探针文库中加入硼酸标记缓冲液和染料，标记后的FISH探针文库经纯化和沉淀，自然风干后，溶解于TE缓冲液中，测定浓度后，与人Cot-1DNA、杂交缓冲液按比例配置成探针杂交液，-20℃避光冷冻保存。
杂交缓冲液包括：
20×SSC 0.625mL
Dextran Sulfate 1.25g
Deionized Formamide 6.25mL
TE缓冲液 定容至10mL
探针杂交液包括：
荧光标记后的FISH探针文库 20μg
人Cot1-DNA 120μL
杂交缓冲液 补齐至2000μL
实施例1-10
实施例1-10为在基础实施例的基础上，对各项参数进行调整得到以下实施例：
实验例1
采用以上实施例1-10制备的探针杂交液对临床样品进行EGFR基因的检测：具体操作步骤参照中国专利申请CN104561357A中实施例2涉及的检测方法进行。
检测结果表明，本申请和中国专利申请CN104561357A以及安必平公司(LBP)EGFR基因异常检测试剂盒产品检测吻合率达到100％。同时本发明提供的探针文库具有灵敏度和特异性更好的效果。
以上实施例中，实施例1-6比实施例7、8、9、10的探针文库表现出更高的灵敏度和特异性。
其中实施例1-6能够达到：灵敏度为100％，特异性为100％；实施例7-9的灵敏度为85-90％，特异性为80-89％；实施例10的灵敏度为95％，特异性为95％。
按照实施例1-6和实施例10制备的探针文库信号强度高，背景干扰少；按照实施例7-9制备的探针文库信号强度略低于按照实施例1-6制备的探针文库，背景干扰相较于按照实施例1-6制备的探针文库更高。
实验例2
本实验例采用6组福尔马林固定石蜡包埋的肺癌组织样本，每份石蜡组织连续切片2片。12组样本组织从固定包埋开始到进行实验的保存时间分别为6个月、1年、2年、3年、4年以及5年。其中，6组标本依次编号为1-6。
采用上述实施例1提供的方法制备的探针探针以及对比市售试剂盒(EGFR基因检测试剂盒，广州安必平医药科技股份有限公司，国械注准20173400640)分别对上述6组样本进行检测，检测结果分为A(市售试剂对照组)，B(实验组)两组，检测结果图1所示：其中，B1-B6分别为采用实施例1制备的探针针对以上6组样本进行检测的结果；A1-A6分别为采用市售检测试剂盒针对以上6组样本进行检测的结果；由本发明实施例1制备的探针检测灵敏度、特异性以及信号强度明显高于市售试剂盒。
采用本发明实施例2-6制备的检测探针对上述石蜡包埋样品进行检测的结果与实施例1相同或相似，在此不做赘述。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种EGFR基因的FISH探针的制备方法
<130> 20181213
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctctgtatg cgcatcctgt gat 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatcacatc tctgagtgtc tccga 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctctgtatg cgcatcctgt gat 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcggagacac tcagagatgt gatgg 25

Claims (10)

1.一种EGFR基因的FISH探针文库的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
(1)制备得到探针1；
(2)酶切打断步骤(1)获得的探针1，得到探针2；
(3)给步骤(2)获得的探针2添加接头，得到探针3；
(4)对步骤(3)获得的探针3进行不对称扩增，得到FISH探针文库。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述的步骤(1)中的探针1为探针1A和/或探针1B；当探针1为探针1A和探针1B时，分别制备得到探针1A对应的FISH探针文库以及探针1B对应的FISH探针文库；
所述的探针1A为针对EGFR的基因的一条或多条探针；
当探针1A为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合；
所述的探针1B为针对人类7号染色体着丝粒区域的一条或多条探针；
当探针1B为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的探针1A选自BAC克隆RP11-443C12、BAC克隆RP11-815K24和BAC克隆RP11-89E8中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的探针1B可以选自BAC克隆RP11-1146G20、BAC克隆RP11-438I18中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)给探针2添加接头的方法为：通过T4 DNA连接酶将探针2和接头序列连。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的接头序列为A1接头和A2接头，其中A2接头5’端第一个碱基C含有磷酸化修饰：
所述的A1接头的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列：
5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；
所述的A2接头的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列：
5’-CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA-3’。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)中不对称扩增的体系包括：dNTP、aminoallyl-dUTP、Epimark Hot strat Taq DNA polymerase、引物和探针3；
所述的引物为：
正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列：
5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；
负向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列：
5’-TCGGAGACACTCAGAGATGTGATGG-3’。
8.一种EGFR基因的FISH探针文库，其特征在于：所述的FISH探针文库采用的制备方法包含权利要求1-7任意一项所述的制备方法的步骤。
9.一种用于检测EGFR基因异常的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含权利要求8所述的探针文库。
10.一种EGFR基因异常的检测方法，所述的检测方法包含权利要求1-7任意一项所述的制备方法的步骤。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039322A (zh) * 2015-07-01 2015-11-11 益善生物技术股份有限公司 Dna标签序列及测序文库构建方法和试剂盒
CN106480205A (zh) * 2016-11-11 2017-03-08 北京吉因加科技有限公司 用于同时检测多种突变类型的序列组合和探针

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039322A (zh) * 2015-07-01 2015-11-11 益善生物技术股份有限公司 Dna标签序列及测序文库构建方法和试剂盒
CN106480205A (zh) * 2016-11-11 2017-03-08 北京吉因加科技有限公司 用于同时检测多种突变类型的序列组合和探针

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAO LI等: ""Epidermal growth factor receptor and AKT1 gene copy numbers by multi-gene fluorescence in situ hybridization impact on prognosis in breast cancer"", 《CANCER SCIENCE》 *
NORMA J.NOWAK等: ""Genome-wide aberrations in pancreatic adenocarcinoma"", 《CANCER GENETICS AND CYTOGENETICS》 *
史庆华等: ""用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究"", 《遗传学报》 *

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