CN113667762A - 基于环境dna的岩原鲤实时荧光pcr扩增引物、探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR检测用引物和探针的组合物，并建立了岩原鲤的实时荧光PCR检测方法，达到精确鉴定岩原鲤的目的。根据岩原鲤的线粒体DNA中12SrRNA的基因序列设计特异性引物，上游引物YYLF1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物YYLR1核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针YYL‑MGB1：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。只需采集岩原鲤生活的水域水样，既能应用在水体中岩原鲤的定性检测上，特异性高、时效性好；又能定量检测出环境中岩原鲤的密度，有利于反映出岩原鲤在不同样点的生物量及时空动态，从而为长江禁渔大背景下岩原鲤的人工放流效果评价和资源管理保护提供参考。

Description

基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物、探针及检测 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针及其检测方法。

背景技术

岩原鲤(Procypris rabaudi Tchang)属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，原鲤属(Procypris)，是长江上游及其支流的一种特有鱼类，主要分布于宜昌以上长江水系的干、支流及金沙江中下游的江河中，属上等食用珍贵鱼品。岩原鲤野外资源量自上世纪70年代以来急剧下降，被列为易危物种和濒危鱼类。受限于现在的观察和采样技术，截止目前，关于岩原鲤的保护生物学信息相当有限，对它的分布范围和种群情况尚不清楚。因此建立岩原鲤的快速准确鉴定方法十分必要。环境DNA技术是一种高灵敏度、低成本、无损伤的物种监测新技术，只需要从水环境样品直接提取DNA，就能够快速检测出目标物种。

受到调查人员专业背景和物种本身生物学特性的限制，部分生物类群的生物学信息获取的准确性和信息量很有限，例如岩原鲤大多栖息在底质多岩石的水体底层，这使得调查人员很难察觉，影响鉴定准确率。再加上长江干流2020年起禁止捕捞十年，使得直接监测和评估岩原鲤种群愈发困难。

中国发明专利申请CN 112126693A公开了一种岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法，其运用岩原鲤亲子鉴定用引物组中的20对微卫星引物进行梯度PCR扩增获取基因分型数据，与本专利申请目标和方法不同，无法进行岩原鲤检测。且目前没有岩原鲤环境DNA的实时荧光鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。

本发明针对长江经济鱼类中的岩原鲤进行鉴定区分。受限于现在的观察和采样技术，关于岩原鲤的保护生物学信息相当有限，对它的分布范围和种群情况尚不清楚。且长江鱼类种类繁多，地理分布较近的种类分子水平的差异也较小，这对实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，是本领域的技术难题。因此，本领域亟需解决这一技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耗时短、灵敏度高的基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物。

本发明的另一目的在于提供上述基于环境DNA的岩原鲤的检测方法。

本发明的又一目的在于提供上述基于环境DNA的岩原鲤的检测试剂盒。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增引物的上游引物为YYLF1、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物为YYLR1、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为YYL-MGB1、其核苷酸序列如SEQID No.3所示。

上述一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物的制备方法是根据岩原鲤的线粒体DNA(mtDNA)中12SrRNA基因的序列设计，并建立了岩原鲤环境DNA的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定岩原鲤的目的。

采用上述组合物对基于环境DNA的岩原鲤的的检测方法，其特征在于：上述实时荧光PCR扩增体系优选为20μL，包括10μL 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix(市售产品)，2μLDNA Buffer(Optional)(市售产品)，上下游引物YYLF1和YYLR1各0.4μL，浓度为10μmol/L，YYL-MGB1探针0.4μL，浓度为10μmol/L，DNA模板1μL，超纯水补至20μL。

进一步的，上述实时荧光PCR反应程序为：预变性94℃3min；然后94℃5sec，60℃30sec循环40次。

一种用于检测岩原鲤的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如下引物和探针：上游引物YYLF1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物YYLR1：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针YYL-MGB1核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明具有如下有益效果：

由于原有岩原鲤鉴定方法需要依靠鉴定者的经验，完全由人工判定，影响鉴定准确率，本发明公开的一种基于环境DNA检测长江特有经济鱼类岩原鲤的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据岩原鲤的mtDNA中12SrRNA的基因序列设计特异性引物和探针，建立了岩原鲤的实时荧光PCR检测方法。检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测，监测结果精确，优于人为直观判定结果。

岩原鲤与其地理种群相近的鲤科鱼类在分子水平上的差异也较小，特别是鲤鱼，探针选择不好会有假阳性扩增，探针的设计需高度保守，理论上一个碱基不同就有可能不能匹配。这对岩原鲤实时荧光特异性探针的设计造成一定难度。且不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响。因此本实验在最终确定方法时，通过比对岩原鲤线粒体全序列DNA，发现编码12SrRNA的基因序列特异性高，因此以此序列为模板，设计了扩增效率较高的YYLF1/YYLR1作为扩增引物。经大量试验验证，岩原鲤特异性引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1相结合具有特异性好、灵敏度高的特点，可以特异性检测岩原鲤DNA，有效区分岩原鲤和其他鲤科鱼类，检测的最低DNA浓度可达5×10^-6ng/uL。特异性有引物和探针双重保证，为岩原鲤的鉴定提供了一种新方法，无需采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤，检测准确度高，分析简单快捷，可用于岩原鲤的快速鉴定。有利于反映出岩原鲤在不同样点的生物量及时空动态，从而为长江禁渔大背景下岩原鲤的人工放流效果评价和资源管理保护提供参考。

附图说明

图1：本发明引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1在岩原鲤的mtDNA上的位置。

图2：本发明应用引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1对岩原鲤和其他鱼类样品实时荧光PCR扩增的结果。

图3：本发明岩原鲤样品DNA构建的质粒进行10倍梯度稀释后经实时荧光PCR测定的荧光信号曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。

实施例1

岩原鲤环境DNA的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

1.设计引物和探针。

根据岩原鲤的线粒体DNA(mtDNA)中12SrRNA的基因序列设计如下引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1(引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。

该引物的序列为：上游引物YYLF1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物YYLR1：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针YYL-MGB1：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端。

上述引物及探针的检测原理如图1所示。探针YYL-MGB1是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，引物YYLF1/YYLR1与岩原鲤mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针YYL-MGB1与岩原鲤mtDNA互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针YYL-MGB1酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

2、提取岩原鲤DNA。

取岩原鲤肌肉放入研钵，加液氮磨成粉末状，用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen公司)提取样品DNA，供试岩原鲤取自四川省农业科学院水产研究所宜宾基地。

3、实时荧光PCR检测。

实时荧光PCR扩增体系20μL(生工生物工程(上海)股份有限公司，2×TaqMan FastqPCR Master Mix)：2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL，DNA Buffer(Optional)2μL，上下游引物YYLF1/YYLR1(10μmol/L)各0.4μL，YYL-MGB1探针(10μmol/L)0.4μL，DNA模板1.0μL，超纯水补至20μL。实时荧光PCR扩增在Bio-rad CFX Connect PCR仪上进行。打开“Bio-Rad CFX Maestro”，设置PCR反应条件，两步法扩增反应程序：预变性94℃3min；然后94℃5sec，60℃30sec循环40次。点击运行，进行实时荧光PCR反应，1h左右反应结束，保存文件，打开分析软件。

经实时荧光PCR扩增，岩原鲤特异性引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1对供试的1个岩原鲤样品出现荧光增长曲线，有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增(CT值＜35)，样品扩增曲线参照图2。供试的YYL样品出现阳性扩增，空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性。

实施例2

岩原鲤引物YYLF1/YYLR1及探针YYL-MGB1特异性验证与灵敏度测试，包括如下步骤：

1、提取DNA。

取岩原鲤和其他鱼类肌肉(样品及来源见表1)放入研钵，加液氮磨成粉末状，用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen公司)提取样品DNA。

表1受试样品具体信息

序号	编号	种名	产地	数量(条)
					1	YYL	岩原鲤	四川省宜宾市	1
2	JY	鲫	重庆市北碚区	1
					3	HSY	黄颡鱼	重庆市北碚区	1
4	NQ	泥鳅	重庆市北碚区	1
					5	HS	黄鳝	重庆市北碚区	1
6	LY	鲢	重庆市北碚区	1
					7	YY	鳙	重庆市北碚区	1
8	BDCWH	斑点叉尾鮰	重庆市北碚区	1
					9	LiY	鲤	重庆市北碚区	1

2、岩原鲤引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1的特异性验证。

经实时荧光PCR扩增，岩原鲤特异性引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线，有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，扩增曲线参照图2，而供试的8个(样品号见表1)鲫、黄颡鱼、泥鳅、黄鳝、鲢、鳙、斑点叉尾鮰、鲤和空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，样品扩增曲线参照图2。由此表明此次实时荧光PCR检测到的是岩原鲤，表明引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1可以特异性检测岩原鲤。

3、岩原鲤特异性引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1灵敏度测试。

将YYL样品DNA构建的质粒进行10倍梯度稀释，进行检测限位测试，质粒的初始浓度为50ng/μL。经实时荧光PCR测定(反应体系和反应条件与试验样品相同)，荧光信号曲线如图3所示，Ct值分别为：1号13.49、2号16.30、3号20.16、4号23.56、5号27.08、6号30.34、7号34.07。由于8号的Ct值在>35，无法确定是否为阳性。所以，岩原鲤特异性探针YYL-MGB1的检测限位DNA浓度50×10^-7ng/μL，即5×10^-6ng/μL。

实时荧光PCR检测的最低DNA浓度可达pg级水平，和套式PCR的灵敏度相当。因此，利用实时荧光PCR检测方法可以提高岩原鲤环境DNA的检测灵敏度，达到预料不到的效果。长江鱼类分子水平上差异较小，这对岩原鲤实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度。因此本实验在最终确定方法时，选择了其中扩增效率较高，同时重复性好的YYLF1/YYLR1作为扩增引物，并筛选到特异性好的探针YYL-MGB1。引物和探针双重保证，为岩原鲤的鉴定提供了一种新方法，检测准确度高，分析简单快捷。

序列表

<110> 西南大学

<120> 基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物、探针及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagtgggaa gaaatgggct ac 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgacgggcg gtgtgtac 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcatagaac atcacgaaca t 21

Claims (4)

1.一种基于环境DNA的岩原鲤实时荧光PCR扩增引物和探针的组合物，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增引物的上游引物为YYLF1、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物为YYLR1、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为YYL-MGB1、其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

2.采用如权利要求1所述组合物对基于环境DNA的岩原鲤的检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR扩增体系优选为20μL，包括10μL 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix ，2μLDNA Buffer(Optional) ，上下游引物YYLF1和YYLR1各0.4μL，浓度为10μmol/L，YYL-MGB1探针0.4μL，浓度为10μmol/L，DNA模板1μL，超纯水补至20μL。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应程序为：预变性94℃ 3min；然后94℃ 5sec，60℃ 30sec 循环40 次。

4.一种用于检测岩原鲤的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如下引物和探针：上游引物YYLF1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示 ，下游引物YYLR1核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针YYL-MGB1：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示 。

Images