CN109468392B - 橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针 - Google Patents
橘臀纹粉蚧的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据橘臀纹粉蚧的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物PCF3/PCR3和探针PC‑MGB，建立了橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定橘臀纹粉蚧，并用于准确区分橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧的目的。
Description
技术领域
本发明涉及农林业和植物检疫技术领域，具体涉及一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测橘臀纹粉蚧的引物和探针。
背景技术
橘臀纹粉蚧Planococcus citris（Risso）又名橘粉蚧、柑橘臀纹粉蚧，隶属于同翅目（Homoptera）粉蚧科（Pseudococcidae）臀纹粉蚧属（Planococcus），是热带、亚热带观赏性植物、水果的主要害虫，其主要为害寄主植物的茎、叶片、花果等幼嫩部位，轻者叶片变黄，重者干枯脱落，使植株发育不良，严重影响水果的经济价值和观赏性植物的品相。同时，橘臀纹粉蚧与另一种重要的检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧P. minor (Maskell)形态相近，且常在一种寄主上混合发生，极易混淆，区分两者难度较大，因此建立快速准确鉴定橘臀纹粉蚧方法十分必要。
《GB/T 35340-2017 大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧检疫鉴定方法》中列出了区分大洋臀纹粉蚧和橘臀纹粉蚧的传统形态学鉴定方法，传统形态学鉴定方法需2—3天，鉴定时间长；传统形态学检测方法需要先制作玻片，观察形态学特征才能鉴定，并且鉴定者需要一定鉴定经验，存在人工误差，影响鉴定准确率。
中国专利申请CN2011100500314公开了南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，其检测目标是南洋臀纹粉蚧，与本发明的检测目标橘臀纹粉蚧种类不同，且设计的引物和探针、PCR反应体系和反应条件均不同。南洋臀纹粉蚧与橘臀纹粉蚧在外部形态上有区别，因此容易区分。
本发明橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，是本领域的技术难题。因此，本领域亟需解决这一技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用橘臀纹粉蚧检测引物及探针可以快速、准确地对橘臀纹粉蚧进行检测鉴定。
本发明根据橘臀纹粉蚧的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物和探针，建立了橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR 检测方法，以达到快速准确检测鉴定橘臀纹粉蚧的目的。
在本发明的一方面，提供一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
(1) 设计引物和探针；
该引物的序列为：
上游引物PCF3：5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’ ， 如SEQ ID NO：6所示序列或其互补链；
下游引物PCR3：5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’ ， 如SEQ ID NO：9所示序列或其互补链；
该探针的序列为：
橘臀纹粉蚧探针PC-MGB：5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’， 如SEQ ID NO：10所示序列或其互补链；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端；
(2) 提取橘臀纹粉蚧DNA；
(3) 采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测，用以区分橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）具体为：取橘臀纹粉蚧单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2×Premix Ex Taq12.5μL，50×ROX Reference Dye0.5μL，步骤（1）设计的上下游引物PCF3/ PCR3(5μmol/L)各1.0μL，PC-MGB探针1.0μL(5μmol/L)，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃ 30sec；然后95℃ 5sec，60℃ 30sec 循环40 次。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测橘臀纹粉蚧的引物，其序列为：
上游引物PCF3：5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’ ， 如SEQ ID NO：6所示序列或其互补链；
下游引物PCR3：5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’ ， 如SEQ ID NO：6所示序列或其互补链。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测橘臀纹粉蚧的探针，其序列为：PC-MGB：5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’， 如SEQ ID NO：10所示序列或其互补链；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端。
上述实时荧光PCR检测方法采用TaqMan探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测，传统的形态学鉴定方法需2—3天；《GB/T 35340-2017 大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧检疫鉴定方法》中列出了区分大洋臀纹粉蚧和橘臀纹粉蚧的形态学鉴定方法，相较于GB/T 35340-2017，本发明检测方法检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测。
2、对橘臀纹粉蚧的鉴定准确率增大，传统的形态学鉴定方法需要先制作玻片，观察形态学特征才能鉴定，并且鉴定者需要一定鉴定经验，存在人工误差，影响鉴定准确率。本发明检测方法则大大提高了对橘臀纹粉蚧的鉴定准确率。
3、橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，部分探针会有假阳性扩增（见实施例1）。不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响，部分引物的扩增效率较低，部分会有假阳性扩增，因此本实验在最终确定方法时，选择了其中扩增效率较高，同时重复性好的PCF3/ PCR3作为扩增引物。其特异性有引物和探针双重保证，为橘臀纹粉蚧的鉴定提供了一种新方法，检测准确度高，分析简单快捷，可用于基层实验室橘臀纹粉蚧快速鉴定（见实施例2）。经过实施例2的对比实验，筛选到PCF3/ PCR3及探针PC-MGB可以检测到橘臀纹粉蚧，可以作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。经实验验证，橘臀纹粉蚧特异性引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB具有特异性好、灵敏度高的特点，检测的最低DNA浓度可达pg级水平，和套式PCR的灵敏度相当，达到了预料不到的技术效果（见实施例3）。
附图说明
图1是本发明实施例1中引物citri -F / citri -R和探针citri -P在橘臀纹粉蚧的mtDNA上的位置示意图；
图2 是本发明实施例1中应用引物citri -F / citri -R和探针citri -P对不同来源的9个臀纹粉蚧属样品实时荧光PCR扩增的结果示意图；
图3 是本发明实施例2中引物PCF1、PCF2、PCF3、PCR1、PCR2、PCR3和探针PC-MGB在橘臀纹粉蚧的mtDNA上的位置示意图；
图4 是本发明实施例2中应用不同引物和探针PC-MGB对CS-1a样品实时荧光PCR扩增的结果示意图；
图5是本发明实施例2中应用引物PCF3/ PCR1和探针PC-MGB对3个臀纹粉蚧属样品实时荧光PCR扩增的结果示意图；
图6 是本发明实施例2中应用引物PCF3/ PCR2和探针PC-MGB对3个臀纹粉蚧属样品实时荧光PCR扩增的结果示意图；
图7 是本发明实施例2中应用引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB对3个臀纹粉蚧属样品实时荧光PCR扩增的结果示意图；
图8是本发明实施例3中的引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB在橘臀纹粉蚧的mtDNA上的位置示意图；
图9 是本发明实施例3中应用本发明的引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB对不同来源的9个臀纹粉蚧属样品实时荧光PCR扩增的结果示意图；
图10 是本发明实施例3中不同稀释浓度的橘臀纹粉蚧样品实时荧光PCR扩增的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.设计引物和探针
根据橘臀纹粉蚧的mtDNA（线粒体DNA）中部分基因的序列设计如下引物citri -F/ citri -R和探针citri -P（引物和探针由上海基康公司合成）：
上游引物citri -F：5’- TCCCCGATTAAATAATTTTAGATTTTG -3’， 如SEQ ID NO：1所示；
下游引物citri -R：5’- GATCTAAAAATAGAAGAAATTCCATTTAAATG -3’，如SEQ IDNO：2所示序列；
探针citri -P：5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’， 如SEQ ID NO：3所示序列；
上述引物及探针的检测原理如图1所示。探针citri -P是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，引物citri -F / citri -R与橘臀纹粉蚧mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针citri -P与橘臀纹粉蚧mtDNA互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针citri-P酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2、提取橘臀纹粉蚧DNA
取橘臀纹粉蚧单头虫样（样品来源见表1）放入研钵，加液氮磨成粉末状，用DNeasy®Blood&Tissue Kit(Qiagen公司)提取样品DNA。
供试样品材料包括上海辰山植物园（简称SCSBG）、云南西双版纳热带植物园（简称XTBG）兰花上采集的橘臀纹粉蚧，以及上海海关（简称SHCC）截获标本。外群应用大洋臀纹粉蚧(P. minor)、南洋臀纹粉蚧(P. lilacinus)，为上海海关截获标本。
表1 样品具体信息
3、实时荧光PCR检测
实时荧光PCR 扩增体系25μL（大连宝生物公司TaKaRa Premix Ex TaqTM）： 2×Premix Ex Taq12.5μL，50×ROX Reference Dye0.5μL，上下游引物citri -F / citri -R(5μmol/L)各1.0μL，citri -P探针(5μmol/L)1.0μL，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。实时荧光PCR 扩增在7500 Real-Time PCR System 定量PCR 扩增仪上进行。打开“7500 FastSystem Software”，设置PCR反应条件，两步法扩增反应程序：预变性95℃ 30sec；然后95℃5sec，60℃ 30sec 循环40 次。点击运行，进行PCR反应，1h左右反应结束，保存文件，打开分析软件。
经PCR扩增，橘臀纹粉蚧特异性引物citri -F / citri -R和探针citri -P对供试的21个橘臀纹粉蚧样品（样品号见表1）均出现荧光增长曲线，有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，但供试的6个（样品号见表1）的大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧样品也有阳性扩增，且TH-1a及TH-3a呈强阳性扩增，空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，部分样品扩增曲线参照图2。由图2表明引物citri -F / citri -R和探针citri -P可以检测橘臀纹粉蚧，但对近似种检测会出现假阳性扩增，不能作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。
实施例2 引物筛选
1. 设计引物和探针
根据橘臀纹粉蚧的mtDNA（线粒体DNA）中部分基因的序列设计如下特异性引物PCF1、PCF2、PCF3/PCR1、PCR2、PCR3和探针PC-MGB（本发明所公开的引物及探针，引物和探针由上海基康公司合成）：
上游引物
PCF1：5’- CTATACCTATCATTATTGGAAG -3’，如SEQ ID NO：4所示序列；
PCF2：5’- CATCAGATTTAATTTTTCCCCG -3’ ，如SEQ ID NO：5所示序列；
PCF3：5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’ ，如SEQ ID NO：6所示序列；
下游引物
PCR1：5’- GCTCTTGATAAAATTGGAATAG -3’ ，如SEQ ID NO：7所示序列；
PCR2：5’- GTAATTGCTCTTGATAAAATTGG -3’ ，如SEQ ID NO：8所示序列；
PCR3：5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’ ，如SEQ ID NO：9所示序列；
橘臀纹粉蚧探针PC-MGB：5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’，如SEQ ID NO：10所示序列；
上述引物及探针的检测原理如图3所示。探针PC-MGB是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，引物与橘臀纹粉蚧mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针PC-MGB与橘臀纹粉蚧mtDNA互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针PC-MGB酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2、提取橘臀纹粉蚧DNA
同实施例1。
3、引物筛选
将上述6条引物依次进行组合，以CS-1a为DNA模板，应用探针PC-MGB进行实时荧光PCR检测，通过比较扩增效率筛选最优引物。实时荧光PCR 扩增体系及反应条件同实施例1。
经实时荧光PCR扩增，引物PCF3/PCR1、PCF3/PCR2、PCF3/ PCR3扩增效率较高（如图4所示）。
分别应用引物PCF3/PCR1、PCF3/PCR2、PCF3/ PCR3及探针PC-MGB，对CS-1a、VN-1a、TH-1a进行实时荧光PCR扩增，结果显示：
①应用引物PCF3/PCR1、PCF3/PCR2及探针PC-MGB对橘臀纹粉蚧CS-1a、VN-1a有阳性扩增，对近似种大洋臀纹粉蚧TH-1a也有阳性扩增，空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，扩增曲线参照图5、图6。由此表明引物PCF3/PCR1、PCF3/PCR2及探针PC-MGB可以检测到橘臀纹粉蚧，但对近似种检测会出现假阳性扩增，引物PCF3/PCR1、PCF3/PCR2不能作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物。
②应用引物PCF3/ PCR3及探针PC-MGB对CS-1a、VN-1a有阳性扩增，对近似种TH-1a、空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，扩增曲线参照图7。由此表明PCF3/ PCR3及探针PC-MGB可以检测到橘臀纹粉蚧，可以作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。
实施例3 橘臀纹粉蚧特异性引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB的验证与检测灵敏度测试
根据橘臀纹粉蚧的mtDNA（线粒体DNA）中部分基因的序列设计如下特异性引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB（本发明所公开的引物及探针，引物和探针由上海基康公司合成）：
上游引物
PCF3：5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’ ，如SEQ ID NO：6所示序列；
下游引物
PCR3：5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’，如SEQ ID NO：9所示序列；
橘臀纹粉蚧探针PC-MGB：5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’，如SEQ ID NO：10所示序列；
上述引物及探针的检测原理如图8所示。探针PC-MGB是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，引物PCF3/ PCR3与橘臀纹粉蚧mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，同时加入的探针PC-MGB与橘臀纹粉蚧mtDNA互补，在低温复性延伸阶段，反应体系中的Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针PC-MGB酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2、提取橘臀纹粉蚧DNA
同实施例1。
3、橘臀纹粉蚧特异性引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB的验证与检测灵敏度测试
经PCR扩增，橘臀纹粉蚧特异性引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB对供试的21个橘臀纹粉蚧样品（样品号见表1）均出现荧光增长曲线，有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，而供试的6个（样品号见表1）大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧样品和空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，部分样品扩增曲线参照图9。由此表明此次实时荧光PCR检测到的是橘臀纹粉蚧，表明引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB可以特异性检测橘臀纹粉蚧。
将CS-1a样品DNA进行10倍梯度稀释，进行检测限位测试。经实时荧光PCR测定（反应体系和反应条件与试验样品相同），荧光信号曲线如图10所示，Ct值分别为1号17.68、2号19.95、3号23.90、4号26.92、5号30.62、6号34.53、7号39.48。由于7号的Ct值在>35，无法确定是否为阳性。所以，橘臀纹粉蚧特异性探针PC-MGB的检测限位CS-1aDNA浓度7.78mg/μL×10-5，即7.78×10-2ng/μL。
由上述3个实施例可以看出，橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，部分探针会有假阳性扩增（见实施例1）。不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响，部分引物的扩增效率较低，部分会有假阳性扩增，因此本实验在最终确定方法时，选择了其中扩增效率较高，同时重复性好的PCF3/ PCR3作为扩增引物。其特异性有引物和探针双重保证，为橘臀纹粉蚧的鉴定提供了一种新方法，检测准确度高，分析简单快捷，可用于基层实验室橘臀纹粉蚧快速鉴定（实施例2）。经过实施例2的对比实验，筛选到PCF3/PCR3及探针PC-MGB可以检测到橘臀纹粉蚧，可以作为橘臀纹粉蚧实时荧光检测用引物和探针。
橘臀纹粉蚧特异性引物PCF3/ PCR3和探针PC-MGB具有特异性好、灵敏度高的特点，检测的最低DNA浓度可达pg级水平，和套式PCR的灵敏度相当，达到了预料不到的技术效果（见实施例3）。
序列表
<110> 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
<120> 橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针
<130> WH-NP-18-100110
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
tccccgatta aataatttta gattttg 27
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
gatctaaaaa tagaagaaat tccatttaaa tg 32
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
ttgaacactt taccctcctt ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
ctatacctat cattattgga ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
catcagattt aatttttccc cg 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
gattttgatt attaattcca tcac 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
gctcttgata aaattggaat ag 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
gtaattgctc ttgataaaat tgg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 9
ttggattacc atttcctaat gg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
ttgaacactt taccctcctt ta 22
Claims (5)
1.一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 设计引物和探针；
该引物的序列为：
上游引物PCF3为如SEQ ID NO：6所示序列：
5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’；
下游引物PCR3为如SEQ ID NO：9所示序列：
5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’；
该探针的序列为：
橘臀纹粉蚧探针PC-MGB为如SEQ ID NO：10所示序列：
5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端；
(2) 提取橘臀纹粉蚧DNA；
(3) 采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测，用以区分橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧。
2.如权利要求1所述的橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）具体为：取橘臀纹粉蚧单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。
3.如权利要求1所述的橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2×Premix Ex Taq12.5μL，50×ROXReference Dye0.5μL，步骤（1）设计的上下游引物PCF3和PCR3各1.0μL，浓度为5μmol/L，PC-MGB探针1.0μL，浓度为5μmol/L，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。
4.如权利要求1或3所述的橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃ 30sec；然后95℃ 5sec，60℃ 30sec循环40 次。
5.一种用于实时荧光PCR检测橘臀纹粉蚧的引物和探针组，其特征在于，所述引物序列为：
上游引物PCF3为如SEQ ID NO：6所示序列：
5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’；
下游引物PCR3为如SEQ ID NO：9所示序列：
5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’；
所述探针序列为：
PC-MGB为如SEQ ID NO：10所示序列：
5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端。
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