CN111057773B - 小金蝠蛾的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针 - Google Patents

小金蝠蛾的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草寄主昆虫小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针,根据小金蝠蛾的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物XJF2/XJR2和探针PC‑MGB2,建立了小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法,以达到快速准确检测鉴定小金蝠蛾,并用于在多种冬虫夏草寄主昆虫中准确区分小金蝠蛾的目的。

Description

小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针
技术领域
本发明涉及中药材和植物检疫技术领域,具体涉及一种小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法;此外,本发明还涉及检测小金蝠蛾的引物和探针。
背景技术
小金蝠蛾Hepialus xiaojincusis,隶属于鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)蝠蛾属(Hepialus),是四川省小金县的冬虫夏草寄主昆虫,冬虫夏草是我国名贵的中药材,被称为“中药三宝”之一,在我国仅在青藏高原的西藏、青海、四川、云南、甘肃五省部分地区有分布。同时,冬虫夏草寄主昆虫具有种类的狭域分布、垂直分布特征,通常一个产区的冬虫夏草寄主昆虫为一种昆虫,在中药材领域,不同地区的冬虫夏草品级相差较大。因此,区分冬虫夏草的产区,能有效的区分冬虫夏草的品级,因此建立不同产地冬虫夏草的快速准确鉴定方法十分必要。
冬虫夏草的品级根据寄主昆虫的产地、大小及颜色进行区分,而冬虫夏草的形态学观察不能确定其产地,影响鉴定准确率,进而影响冬虫夏草的正确评级。
中国发明专利申请CN201210506713公开了一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法,其运用冬虫夏草菌和冬虫夏草寄主昆虫通用引物进行双重PCR扩增的鉴别冬虫夏草原粉,与本专利申请目标和方法不同,无法进行冬虫夏草寄主昆虫检测。
中国发明专利申请CN201711340871公开了冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法,其通过常规PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的携带情况的方法,用于检测冬虫夏草菌培养液,与本专利申请目标和方法不同。
中国发明专利申请CN201210034612公开了一种鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法,通过设计冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾科特异性引物以区别冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾科与其它鳞翅目昆虫,用于鉴别冬虫夏草真伪,根据最新冬虫夏草寄主昆虫研究进展,冬虫夏草寄主昆虫分类地位变化,冬虫夏草寄主昆虫主要集中在蝙蝠蛾科现钩蝠蛾属(Thitarodes)、无钩蝠蛾属( Ahamus) 和蝠蛾属( Hepialus)(邹志文等,2010;邱乙等,2015)。该专利中将是否为蝙蝠蛾科昆虫作为鉴定冬虫夏草真伪的标准已不符合实际情况。另外,其目标与方法与本专利申请不同。
中国发明专利申请CN201910910660公开了荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针,其针对人工培育冬虫夏草夏草过程中出现的寄主昆虫致死菌-粉拟青霉菌的实时荧光检测方法,检测目标与本专利申请检测目标不同。
目前没有四川省小金县冬虫夏草寄主昆虫小金蝠蛾的实时荧光鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。
本发明针对名贵中药冬虫夏草的寄主昆虫进行鉴定区分。中药材冬虫夏草为冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae昆虫幼虫上以后形成的僵虫和菌子实体的干燥体,无法在形态上区分冬虫夏草的寄主昆虫,且冬虫夏草寄主昆虫种类繁多,地理分布较近的种类分子水平的差异也较小,这对实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度,是本领域的技术难题。因此,本领域亟需解决这一技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法;为此,本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用小金蝠蛾检测引物及探针可以快速、准确地对四川省小金县产的冬虫夏草进行检测鉴定。
本发明根据小金蝠蛾的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物和探针,建立了小金蝠蛾的实时荧光PCR 检测方法,以达到快速准确检测鉴定小金蝠蛾的目的。
在本发明的一方面,提供一种小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法,包括如下步骤:
(1) 设计引物和探针;
该引物的序列为:
上游引物XJF2:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’ ,如SEQ ID NO:4所示序列或其互补链;
下游引物XJR2:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’ ,如SEQ ID NO:5所示序列或其互补链;
该探针的序列为:
小金蝠蛾探针PC-MGB2:5’- TGAAATTGGTATAATATGGCCACC -3’ ,如SEQ ID NO:7所示序列或其互补链,荧光基团连接在探针的5’末端,淬灭基团连接在3’末端;
(2) 提取小金蝠蛾DNA;
(3) 采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测,用以区分小金蝠蛾和其它冬虫夏草寄主昆虫。
作为本发明优选的技术方案,步骤(2)具体为:取小金蝠蛾虫、蛹及虫草样放入研钵,加液氮磨成粉末状,用试剂盒提取样品DNA。
作为本发明优选的技术方案,步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL,包括2×Premix Ex Taq12.5μL,50×ROX Reference Dye0.5μL,步骤(1)设计的上下游引物XJF2和XJR2各1.0μL,浓度为5μmol/L,PC-MGB探针1.0μL,浓度为5μmol/L,DNA模板2.0μL,超纯水补至25μL。
作为本发明优选的技术方案,步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应程序为:预变性95℃ 10min;然后95℃ 15sec,60℃ 30sec 循环40 次。
上述实时荧光PCR检测方法采用TaqMan探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。
此外,本发明还提供一种用于检测小金蝠蛾的引物,其序列为:
上游引物XJF2:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’ ,如SEQ ID NO:4所示序列或其互补链;
下游引物XJR2:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’ ,如SEQ ID NO:5所示序列或其互补链;
此外,本发明还提供一种用于检测小金蝠蛾的探针,其序列为:
小金蝠蛾探针PC-MGB2:5’- TGAAATTGGTATAATATGGCCACC -3’ ,如SEQ ID NO:7所示序列或其互补链,荧光基团连接在探针的5’末端,淬灭基团连接在3’末端。
此外,本发明还提供一种用于检测小金蝠蛾的试剂盒,该试剂盒包括如下引物和探针:所述引物如下:
上游引物XJF2:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’ ,如SEQ ID NO:4所示序列或其互补链;
下游引物XJR2:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’ ,如SEQ ID NO:5所示序列或其互补链;
所述探针如下:
小金蝠蛾探针PC-MGB2:5’- TGAAATTGGTATAATATGGCCACC -3’ ,如SEQ ID NO:7所示序列或其互补链,荧光基团连接在探针的5’末端,淬灭基团连接在3’末端。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1、检测时间大大缩短,可以在6个小时内完成检测,监测结果准确,优于人为直观判定结果。
2、对四川省小金县冬虫夏草的鉴定准确率高,中药材冬虫夏草的鉴定需要鉴定者的经验,完全由人工判定,影响鉴定准确率。本发明检测方法使四川省小金县的冬虫夏草鉴定结果精准。
3、小金蝠蛾与其地理种群相近的冬虫夏草寄主昆虫在分子水平上的差异也较小,探针选择不好会有假阳性扩增(见实施例1)。这对四川省小金县冬虫夏草实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度。不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响,因此本实验在最终确定方法时,通过比对冬虫夏草现有寄主昆虫线粒体全序列,选择了其中扩增效率较高的XJF2/ XJR2作为扩增引物(见实施例2)。其特异性有引物和探针双重保证,为小金蝠蛾的鉴定提供了一种新方法,检测准确度高,分析简单快捷,可用于四川省小金县冬虫夏草的快速鉴定(见实施例3)。经实验验证,小金蝠蛾特异性引物XJF2/ XJR2和探针PC-MGB2具有特异性好、灵敏度高的特点,检测的最低DNA浓度可达pg级水平,和套式PCR的灵敏度相当,达到了预料不到的技术效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中引物XJF1 /XJR1和探针PC-MGB1在小金蝠蛾的mtDNA上的位置示意图;
图2 是本发明实施例1中应用引物XJF1 /XJR1和探针PC-MGB1对不同来源的9个蝠蛾科样品实时荧光PCR扩增的结果示意图;
图3是本发明实施例2中引物XJF2 /XJR2和探针PC-MGB2在小金蝠蛾的mtDNA上的位置示意图;
图4是本发明实施例2中应用不同引物与探针PC-MGB2组合后扩增效率对比结果示意图。
图5是本发明实施例3中应用引物XJF2 /XJR2和探针PC-MGB2对不同来源的6个小金蝠蛾样品实时荧光PCR扩增结果示意图;
图6是本发明实施例3中应用引物XJF2 /XJR2和探针PC-MGB2对不同来源的7个冬虫夏草样品实时荧光PCR扩增的结果示意图;
图7是本发明实施例3中将XJ01样品DNA进行10倍梯度稀释,进行检测限位测试,经实时荧光PCR测定的荧光信号曲线示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述条件,或按制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.设计引物和探针
根据小金蝠蛾的mtDNA(线粒体DNA)中部分基因的序列设计如下引物XJF1 / XJR1和探针PC-MGB1(引物和探针由上海基康公司合成):
该引物的序列为:
上游引物XJF1:5’- CCTGGATCTTTAATTGGAGATGATC -3’ ,如SEQ ID NO:1所示;
下游引物XJR1:5’- GTCAATTTCCAAAACCACCAATTAT -3’ ,如SEQ ID NO:2所示;
该探针PC-MGB1的序列为:
小金蝠蛾探针PC-MGB1:5’- TTACAGCTCATGCTTTTAT -3’ ,如SEQ ID NO:3所示,荧光基团连接在探针的5’末端,淬灭基团连接在3’末端;
上述引物及探针的检测原理如图1所示。探针PC-MGB1是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,引物XJF1 /XJR1与小金蝠蛾mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,同时加入的探针PC-MGB1与小金蝠蛾mtDNA互补,在低温复性延伸阶段,反应体系中的Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针PC-MGB1酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2、提取小金蝠蛾DNA
取小金蝠蛾成虫、蛹、冬虫夏草头部(样品来源见表1)放入研钵,加液氮磨成粉末状,用DNeasy®Blood&Tissue Kit(Qiagen公司)提取样品DNA。
供试样品材料包括四川省小金县小金蝠蛾成虫、四川省小金县小金蝠蛾蛹,以及四川省小金县产冬虫夏草样品。外群冬虫夏草样品采自四川省石渠县、理县、康定县、黑水县、西藏林芝、西藏亚东、青海达日、青海军工县冬虫夏草。
表1 样品具体信息
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3、实时荧光PCR检测
实时荧光PCR 扩增体系25μL(大连宝生物公司TaKaRa Premix Ex TaqTM): 2×Premix Ex Taq12.5μL,50×ROX Reference Dye0.5μL,上下游引物XJF / XJR (5μmol/L)各1.0μL,XJ-P探针(5μmol/L)1.0μL,DNA模板2.0μL,超纯水补至25μL。实时荧光PCR 扩增在7500 Real-Time PCR System 定量PCR 扩增仪上进行。打开“7500 Fast SystemSoftware”,设置PCR反应条件,两步法扩增反应程序:预变性95℃ 10 Min;然后95℃15sec,60℃ 30sec 循环40 次。点击运行,进行PCR反应,1h左右反应结束,保存文件,打开分析软件。
经PCR扩增,小金蝠蛾特异性引物XJF1 / XJR1和探针XJ -P1对供试的1个小金蝠蛾样品(样品号见表1)出现荧光增长曲线,有强的荧光信号增加,表现为阳性扩增,样品扩增曲线参照图2。但供试的9个样品中的8个(样品号见表1)均出现阳性扩增,空白对照则没有检测到荧光信号,表现为阴性。
实施例2 引物筛选
1. 设计引物和探针
根据小金蝠蛾的mtDNA(线粒体DNA)中部分基因的序列设计如下特异性引物XJF2/ XJR2、XJR3和探针PC-MGB2(本发明所公开的引物及探针,引物和探针由上海基康公司合成):
上游引物
XJF2:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’,如SEQ ID NO:4所示序列;
下游引物
XJR 2:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’ ,如SEQ ID NO:5所示序列;
XJR3:5’- GGGATTTGAAAAGGATTAAATGAAAT -3’ ,如SEQ ID NO:6所示序列;
小金蝠蛾探针PC-MGB2:5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’,如SEQ ID NO:7所示序列;
上述引物及探针的检测原理如图3所示。探针PC-MGB2是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,引物与小金蝠蛾mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,同时加入的探针PC-MGB2与小金蝠蛾mtDNA互补,在低温复性延伸阶段,反应体系中的Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针PC-MGB2酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2、提取小金蝠蛾DNA
同实施例1。
3、引物筛选
将上述3条引物依次组合,以XJ01为DNA模板,应用探针PC-MGB2进行实时荧光PCR检测,通过比较扩增效率筛选最优引物。实时荧光PCR 扩增体系及反应条件同实施例1。
经实时荧光PCR扩增,引物XJF2/XJR2比引物XJF2/XJR3扩增效率更高(如图4所示)。
实施例3 小金蝠蛾特异性引物XJF2 / XJR2及探针PC-MGB2验证与检测灵敏度测试
1.根据小金蝠蛾的mtDNA(线粒体DNA)中部分基因的序列设计如下特异性引物XJF2 / XJR2和探针PC-MGB2(本发明所公开的引物及探针,引物和探针由上海基康公司合成):
上游引物
XJF2:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’ ,如SEQ ID NO:4所示序列;
下游引物
XJR2:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’,如SEQ ID NO:5所示序列;
小金蝠蛾探针PC-MGB2:5’- TGAAATTGGTATAATATGGCCACC -3’,如SEQ ID NO:7所示序列;
上述引物及探针的检测原理如图3所示。探针PC-MGB2是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,引物XJF2 / XJR2与小金蝠蛾mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,同时加入的探针PC-MGB2与小金蝠蛾mtDNA互补,在低温复性延伸阶段,反应体系中的Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针PC-MGB2酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2.提取小金蝠蛾DNA
同实施例1。
3.小金蝠蛾特异性引物XJF2 / XJR2和探针PC-MGB2的验证与检测灵敏度测试
经PCR扩增,小金蝠蛾特异性引物XJF2 / XJR2和探针PC-MGB2对供试的6个小金蝠蛾样品(样品号见表1)均出现荧光增长曲线,有强的荧光信号增加,表现为阳性扩增,扩增曲线参照图5,而供试的7个(样品号见表1)四川省阿坝州理县及黑水县冬虫夏草、四川省甘孜州康定县及石渠县冬虫虫草、青海果洛州达日县冬虫夏草、青海果洛州军工县冬虫夏草、西藏林芝冬虫夏草、西藏亚东县康布乡冬虫夏草和空白对照则没有检测到荧光信号,表现为阴性,样品扩增曲线参照图6。由此表明此次实时荧光PCR检测到的是小金蝠蛾,表明引物XJF2 / XJR2和探针PC-MGB2可以特异性检测小金蝠蛾及四川省小金县冬虫夏草。
将XJ01样品DNA进行10倍梯度稀释,进行检测限位测试。经实时荧光PCR测定(反应体系和反应条件与试验样品相同),荧光信号曲线如图7所示,Ct值分别为1号18.43、2号20.95、3号24.59、4号27.72、5号29.64、6号34.53、7号37.39。由于7号的Ct值在>35,无法确定是否为阳性。所以,小金蝠蛾特异性探针PC-MGB2的检测限位DNA浓度334×10-5ng/μL,即3.34×10-3ng/μL。
由上述3个实施例可以看出,冬虫夏草寄主蝠蛾分子水平上差异较小,这对小金蝠蛾实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度,部分探针会有假阳性扩增(见实施例1)。因此本实验在最终确定方法时,选择了其中扩增效率较高,同时重复性好的XJF2 /XJR2作为扩增引物。其特异性有引物和探针双重保证,为小金蝠蛾的鉴定及四川省小金县冬虫夏草的溯源提供了一种新方法,检测准确度高,分析简单快捷,可用于四川省小金县冬虫夏草的溯源(实施例3)。筛选到XJF2 / XJR2及探针PC-MGB2可以检测到小金蝠蛾,可以作为小金蝠蛾实时荧光检测用引物和探针。
小金蝠蛾特异性引物XJF2 / XJR2和探针PC-MGB2具有特异性好、灵敏度高的特点,检测的最低DNA浓度可达pg级水平,和套式PCR的灵敏度相当,达到了预料不到的技术效果。
序列表
<110>上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
<120>小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针
<130> YXSC-WH-NP-20-100600
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
cctggatctt taattggaga tgatc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
gtcaatttcc aaaaccacca attat 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
ttacagctca tgcttttat 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
ttccatagaa ggctatcccc c 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
gatgggctca tgtaacagta attcc 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
gggatttgaa aaggattaaa tgaaat 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
tgaaattggt ataatatggc cacc 24

Claims (5)

1.一种小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1) 设计引物和探针;
该引物的序列为:
上游引物XJF2为如SEQ ID NO:4 所示序列:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’;
下游引物XJR2为如SEQ ID NO:5所示序列:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’;
该探针的序列为:
小金蝠蛾探针PC-MGB2为如SEQ ID NO:7 所示序列:5’- TGAAATTGGTATAATATGGCCACC-3’ ,荧光基团连接在探针的5’末端,淬灭基团连接在3’末端;
(2) 提取小金蝠蛾DNA;
(3) 采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测,用以区分小金蝠蛾和其它冬虫夏草寄主昆虫。
2.如权利要求1所述的小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法,其特征在于,步骤(2)具体为:取小金蝠蛾虫、蛹及虫草样放入研钵,加液氮磨成粉末状,用试剂盒提取样品DNA。
3.如权利要求1所述的小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法,其特征在于,步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL,包括2×Premix Ex Taq12.5μL,50×ROXReference Dye0.5μL,步骤(1)设计的上下游引物XJF2和XJR2各1.0μL,浓度为5μmol/L,PC-MGB2探针1.0μL,浓度为5μmol/L,DNA模板2.0μL,超纯水补至25μL。
4.如权利要求1或3所述的小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法,其特征在于,步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应程序为:预变性95℃ 10min;然后95℃ 15sec,60℃ 30sec 循环40 次。
5.一种用于实时荧光PCR检测小金蝠蛾的试剂盒,其特征在于,包括如下引物和探针,所述引物如下:
上游引物XJF2为如SEQ ID NO:4 所示序列:5’- TTCCATAGAAGGCTATCCCCC -3’;
下游引物XJR2为如SEQ ID NO:5所示序列:5’- GATGGGCTCATGTAACAGTAATTCC -3’;
所述探针如下:
小金蝠蛾探针PC-MGB2为如SEQ ID NO:7所示序列:5’- TGAAATTGGTATAATATGGCCACC -3’ ,荧光基团连接在探针的5’末端,淬灭基团连接在3’末端。
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