CN114606229B - 山药潜隐病毒的rt-lamp检测引物组及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了山药潜隐病毒的RT‑LAMP检测引物组，其引物组包括一对外引物YLV‑F3、YLV‑B3，一对内引物YLV‑FIP、YLV‑BIP，一对环引物YLV‑LF、YLV‑LB，成功建立了YLV的环介导恒温快速扩增的可视化检测体系，该检测体系反应速度快，灵敏度高，特异性强，操作简单，可以直接观察到检测结果。为YLV的田间检测提供了一种方便，快速可靠的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体是涉及山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组及检测方法。
背景技术
病毒病是威胁山药生产的重要病害，影响山药的品质和产量，造成经济损失。山药潜隐病毒(Yam latent virus,YLV)是山药上的重要病毒，属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。建立快速准确检测山药病毒的方法在病毒病防控中具有重要意义。LAMP是2000年由日本的Notomi等发明的一种能够在恒温条件下快速扩增核酸片段的技术。特异性核苷酸延伸是通过具有链置换活性的DNA聚合酶和两对内外引物实现的。LAMP已被广泛应用于病毒检测领域。Fukuta等建立了日本山药花叶病毒(Japanese yam mosaic virus,JYMV)的检测技术。Chukwuemeka等建立了山药花叶病毒(Yam mosaic virus,YMV)的RT-LAMP检测体系，目前尚无关于YLVRT-LAMP检测方法的报道。
现有RT-PCR和荧光定量PCR等分子检测技术虽然具有高特异性和灵敏度的特点，但需要特定的仪器设备和专业的实验人员来完成，不适用于基层检测。血清学检测需要特异性抗血清，制作过程繁杂、成本昂贵，易出现假阳性。生物学鉴定和电镜观察费时费工，需要检测样品中病毒含量高。RT-LAMP作为一种新型的检测技术，具有简便、快速、特异等特点，不需要对模板进行热变性，可在等温条件下进行反应，短时间内即可获得试验结果。基于此，本研究建立了针对YLV的RT-LAMP快速检测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是克服现有技术的不足，对YLVRT-LAMP检测技术的反应条件进行优化，验证RT-LAMP扩增的特异性和灵敏度，建立一种YLV的快速、特异性好、灵敏度高的检测技术，应用于山药田间样品的检测，为山药病毒病害的监测防控提供技术支持，提供一种山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组及检测方法。
本发明所采用的技术方案是：
山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物YLV-F3、YLV-B3，一对内引物YLV-FIP、YLV-BIP，一对环引物YLV-LF、YLV-LB，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
YLV-F3：5’-TCCTTTCCCCCTGTGATTTC-3’；
YLV-B3:5’-TCACTTGGGCTTTTATGCTTG-3’；
内引物：
YLV-FIP：5’
-GCTGAGGGGTTGGTTCGAAGACCAGAGCAATGTCCTTGTGCGT-3’；
YLV-BIP：5’
-GGTTGAACAGCAGCCGGATTCCATTACAACGATAGATTTGCCG-3’；
环引物：
YLV-LF：5’-GCCTAGAGAGAAGCTCGCTCATA-3’；
YLV-LB：5’-ctacatagtcaaagcagtcaaagg-3’；
山药潜隐病毒的RT-LAMP检测方法，包括以下步骤：
步骤1：病毒总RNA提取及cDNA的合成：按照柱式植物总RNA提取试剂盒说明书要求提取叶片总RNA，按照PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
步骤2：RT-LAMP扩增：以经步骤1提取的RNA为模板合成cDNA，采用上述的RT-LAMP检测引物进行RT-LAMP反应；反应体系为25μL：模板1μL、1×ThermoPol Buffer、YLV-FIP和YLV-BIP引物各1.6μmol·L-1；、YLV-F3和YLV-B3引物各0.2μmol·L-1、YLV-LF和YLV-LB引物各0.4μmol·L-1、Mg2+6mM、dNTPs 1.4mM、Bst DNA polymerase 8U，ddH2O补足25μL；RT-LAMP反应条件为58℃-65℃反应1h，85℃反应5min，冰上终止反应；
步骤3：RT-LAMP反应结束后，取5μL RT-LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，出现瀑布状条带的判断为阳性，无条带判断为阴性；同时向剩余反应产物中加入0.2μL的SYBRGreen I，肉眼观察RT-LAMP产物颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。
本发明有益效果在于：
1.通过设计六条特异性RT-LAMP检测体系，加入SYBR green I进行可视化检测。灵敏度检测结果表明该方法的灵敏度是常规PCR的100倍，可以检测到5.08×101个拷贝/μL。
2.利用该方法对山药上的YLV、BBWV2和YoMV等三种RNA病毒进行检测，只有YLV检测出阳性结果，表明本实验建立的RT-LAMP具有很好的特异性。
3.在田间样品的检测中，RT-LAMP的检测结果与RT-PCR检测结果一致，表明本发明的RT-LAMP的检测方法具有可靠性。
4.成功建立了YLV的环介导恒温快速扩增的可视化检测体系，反应灵敏，特异性强，操作简单，可以直接观察到检测结果。为YLV的田间检测提供了一种方便，快速的方法。
附图说明
图1为YLV分离物的核苷酸序列比对和RT-LAMP的引物设计图；根据检测山药病样的YLV病毒CP基因测序获得的五个分离物的核苷酸序列设计RT-LAMP特异性扩增引物YLV-F3、YLV-B3、YLV-FIP、YLV-BIP、YLV-LF和YLV-LB共6条。
图2为本发明中实施例1的RT-LAMP检测结果图；其中A：RT-LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳图，B:RT-LAMP产物的可视化检测图；M：2000DNAMarker，1：RT-LAMP产物，2：阴性对照。
图3为本发明中实施例3RT-LAMP不同温度条件产物琼脂糖凝胶电泳图；其中A：RT-LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳图，B：RT-LAMP产物的可视化检测图；M：2000DNA Marker；1-6：42℃、44℃、50℃、58℃、65℃和70℃。
图4为本发明中实施例4的RT-LAMP特异性验证图；其中A：RT-LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳图，B:RT-LAMP产物的可视化检测图；M：2000DNA Marker；1：感染YLV山药叶片RNA为模板；2：感染BBWV-2山药叶片总RNA为模板；3：感染YoMV山药叶片总RNA为模板；4：健康山药叶片RNA为模板；5：ddH2O为空白对照模板。
图5为本发明中实施例5的RT-LAMP灵敏度检测电泳图；其中A：普通RT-PCR检测电泳图，B：RT-LAMP检测电泳图，C：RT-LAMP产物的可视化检测图；M：2000DNAMarker；1：5.08×106拷贝/μL；2：5.08×105拷贝/μL；3：5.08×104拷贝/μL；4：5.08×103拷贝/μL；5：5.08×102拷贝/μL；6：5.08×101拷贝/μL；7：5.08拷贝/μL。
图6为本发明中实施例6常规RT-PCR和RT-LAMP检测YLV的应用；其中A为普通RT-PCR检测电泳图，B为RT-LAMP可视化检测图；M:2000DNAMarker；1；2；3；4；5；11；12；13出现绿色为阳性反应，6；7；8；9；10；14；15出现橙色为阴性反应，16为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1根据检测山药病样的YLV病毒CP基因测序获得的五个分离物的核苷酸序列设计RT-LAMP特异性扩增引物YLV-F3、YLV-B3、YLV-FIP、YLV-BIP、YLV-LF和YLV-LB共6条，YLV分离物的序列比对与RT-LAMP引物位置见图1；同时设计RT-PCR扩增引物YLV-F和YLV-R共2条，引物序列见表1。
表1RT-LAMP和RT-PCR特异性检测YLV引物
具体步骤如下：
步骤1：根据检测山药病样的YLV病毒CP基因测序获得的五个分离物的核苷酸序列设计RT-LAMP特异性扩增引物YLV-F3、YLV-B3、YLV-FIP、YLV-BIP、YLV-LF和YLV-LB共6条，普通RT-PCR检测引物两条，并由上海生工生物工程有限公司合成；
步骤2：病毒总RNA提取及cDNA的合成：取山药样品叶片约0.1g，液氮冷冻后迅速研磨，按照柱式植物总RNA提取试剂盒说明书要求提取叶片总RNA，按照PrimeScriptTMⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
步骤3：以经步骤2获得的RNA为模板合成cDNA，步骤1中的引物进行RT-LAMP扩增；
步骤4：RT-LAMP反应体系和反应程序如下：
反应体系25μL：模板1μL、1×ThermoPol Buffer、YLV-FIP和YLV-BIP引物各1.6μmol·L-1；、YLV-F3和YLV-B3引物各0.2μmol·L-1、YLV-LF和YLV-LB引物各0.4μmol·L-1、Mg2+6mM、dNTPs 1.4mM、Bst DNA polymerase 8U，ddH2O补足25μL；。
RT-LAMP反应条件为58℃-65℃反应1h，85℃反应5min，冰上终止反应。
步骤5：反应结束后，取5μL RT-LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在1×TBE和120V的电压下电泳35min。阳性结果出现瀑布状条带，而阴性对照没有条带，同时向反应产物中加入0.2μL的SYBR Green I，肉眼观察RT-LAMP产物颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性，具体实验结果如图2所示。
实施例2RT-LAMP产物鉴定
将RT-LAMP产物经琼脂糖电泳分离后，切取大小266bp左右的条带，胶回收试剂盒回收产物连接于pMD19-T载体，连接产物转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆进行测序。利用BLAST对测序结果与GenBank已报道序列进行比对。利用BLAST对测序结果与GenBank已报道序列进行比对。结果显示，序列与YLV(登录号YP_009116872.1)的核苷酸序列同源性为94.10％。说明RT-LAMP扩增出的产物是YLV。
实施例3RT-LAMP的反应条件优化
设置42℃、44℃、50℃、58℃、65℃和70℃6个不同的反应温度，反应时间设定1h。对RT-LAMP反应体系条件进行优化，确定最佳反应温度。利用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。
结果显示：在设置的六个不同反应温度下，50℃-65℃均有目标条带，58℃-65℃时条带最为清晰。
实施例4RT-LAMP特异性验证
采用优化好的反应体系和反应条件对山药病毒进行检测，以感染YLV、蚕豆萎蔫病毒-2(Broad bean wilt virus-2,BBWV-2)、油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)叶片的RNA为模板，以ddH2O为空白对照，分别进行RT-LAMP特异性检测。
结果显示，RT-LAMP扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析，只有感染YLV的样品有瀑布状条带，其它样品没有条带，加入SYBR Green I，只有感染YLV的样品为绿色，其他样品为橙色。
实施例5RT-LAMP灵敏度检测
提取YLV质粒，用微量核酸检测仪测定浓度，换算成拷贝数为5.08×1010，分别稀释为5.08×106拷贝/μL、5.08×105拷贝/μL、5.08×104拷贝/μL、5.08×103拷贝/μL、5.08×102拷贝/μL，5.08×101拷贝/μL，5.08拷贝/μL，以此作为模板进行实施例1步骤4进行RT-LAMP反应，结果表明RT-LAMP最低可以检测到5.08×101个拷贝/μL。
实施例6RT-LAMP的检测方法的应用
利用实施例1中的步骤2提取田间采集的15份病样，根据实施例1的步骤3进行RT-LAMP扩增。反应结束后，加入SYBR green I进行可视化检测，8份出现绿色，7份为橙色。颜色结果与PCR电泳结果一致，证明建立的可视化方法可靠。本实验所设计的RT-LAMP引物可用于山药潜隐病毒的快速检测，实用性强。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省农业科学院植物保护研究所
<120> 山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组及检测方法
<141> 2022-03-22
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tcctttcccc ctgtgatttc 20
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<211> 21
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<400> 6
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Claims (2)
1.山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组，其特征是：包括如下三个引物对：
外引物：
YLV-F3：5’-TCCTTTCCCCCTGTGATTTC-3’；
YLV-B3:5’-TCACTTGGGCTTTTATGCTTG-3’；
内引物：
YLV-FIP：5’
-GCTGAGGGGTTGGTTCGAAGACCAGAGCAATGTCCTTGTGCGT-3’；
YLV-BIP：5’
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环引物：
YLV-LF：5’-GCCTAGAGAGAAGCTCGCTCATA-3’；
YLV-LB：5’-CTACATAGTCAAAGCAGTCAAAGG-3’。
2.权利要求1所述的山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组用于检测山药潜隐病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)病毒总RNA提取及cDNA的合成：按照柱式植物总RNA提取试剂盒说明书要求提取叶片总RNA，按照PrimeScriptTMⅡ 1st StrandcDNA Synthesis Kit合成cDNA；
(2)RT-LAMP扩增：以经步骤(1)提取的RNA为模板合成cDNA，采用权利要求1所述的RT-LAMP检测引物进行RT-LAMP反应，RT-LAMP反应条件为58℃-65℃反应1h，85℃反应5min，冰上终止反应；反应体系为25μL：模板1μL、1×ThermoPol Buffer、YLV-FIP和YLV-BIP引物各1.6μmol·L-1；YLV-F3和YLV-B3引物各0.2μmol·L-1、YLV-LF和YLV-LB引物各0.4μmol·L-1、Mg2+6mM、dNTPs 1.4mM、Bst DNApolymerase 8U，ddH2O补足25μL；
(3)RT-LAMP反应结束后，取5μLRT-LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，出现瀑布状条带的判断为阳性，无条带判断为阴性；同时向剩余反应产物中加入0.2μL的SYBR Green I，肉眼观察RT-LAMP产物颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。
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| 引起甘蔗花叶病的病原分子生物学进展;梁姗姗;罗群;陈如凯;高三基;;植物保护学报;20170615(03);全文 * |
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