JP6595629B2

JP6595629B2 - ウイルス性出血性敗血症ウイルスの地域特異的遺伝型の判別用プローブ及びその用途

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Publication number: JP6595629B2
Application number: JP2017565731A
Authority: JP
Inventors: ミヨンチョ; ミョンエパク; ボヨンチ; ソンドンファン; グァンイルキム; サンジュンアン
Original assignee: National Institute of Fisheries Science
Current assignee: National Institute of Fisheries Science
Priority date: 2015-08-18
Filing date: 2016-08-11
Publication date: 2019-10-23
Anticipated expiration: 2036-08-11
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Description

本発明は魚病ウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（ｖｉｒａｌｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃｅｍｉａｖｉｒｕｓ、ＶＨＳＶ）の地理的分離由来の判別用プローブ及びこれを利用したＶＨＳＶの地域的分離由来の判別方法に関するもので、さらに具体的に地理的分離由来に依存的に現れる遺伝型であるＶＨＳＶＧタンパク質のＣ７５５Ａ及びＡ７５６Ｇの一塩基多型変異（ＳＮＰ）を含むＤＮＡとの結合力が優秀なＰＮＡを利用して遺伝型ごとに互いに異なる融解温度を現せることによって、ＶＨＳＶの地理的分離由来の判別を簡単、迅速、正確に判別するためである。

ニジマスを始とする淡水サケと魚類に感染されて深刻なウイルス疾病を引き起こす病原体として知られたｖｉｒａｌｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃｅｍｉａｖｉｒｕｓ（ＶＨＳＶ）は他の魚類ウイルスであるｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ（ＩＨＮＶ）とｈｉｒａｍｅｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（ＨＩＲＲＶ）と共にｆａｍｉｌｙＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、ｇｅｎｕｓＮｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓに属する約１１，０００ｂｐのｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄＲＮＡｖｉｒｕｓで６つの遺伝子、ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｎ）、ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ）、ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ）、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ）、ｎｏｎ−ｖｉｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＶ）とｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌ）の遺伝子が３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−ＮＶ−Ｌ−５’の順で構成されている（Ｓｃｈｕｔｚｅｅｔａｌ．，１９９９；ｖａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌｅｔａｌ．，２０００；Ｔｒｄｏｅｔａｌ．，２００５）。

ＶＨＳＶは１９６３年デンマークでニジマスから初めて分離された後（Ｊｅｎｓｅｎ，１９６５；Ｗｏｌｆ，１９８８）、大西洋（ＡｔｌａｎｔｉｃＯｃｅａｎ）及び北海（ＮｏｒｔｈＳｅａ）で大西洋マダラ（Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕｓ，Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，１９７９）、ターボット（Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ，Ｓｃｈｌｏｔｆｅｌｄｔｅｔａｌ．，１９９１）、大西洋ニシン（Ｃｌｕｐｅａｈａｒｅｎｇｕｓ，Ｄｉｘｏｎｅｔａｌ．，１９９７）、ホワイティング（Ｍｅｒｌａｎｇｉｕｓｍｅｒｌａｎｇｕｓ，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎｗｔａｌ．，１９９９）、などから分離されており、淡水及び海水魚類の両方に疾病を誘発する病原体として知られている。ヨーロッパ地域だけではなく、１９８０年代後半には北米地域の西部海岸で海水魚類と消夏性サケから分離されて海洋環境にウイルスが広く分布していることが確認された（Ｈｏｐｐｅｒ，１９８９；ＭｅｙｅｒｓａｎｄＷｉｎｔｏｎ，１９９５）。

東アジア地域では日本若狭湾の野生ヒラメで初めて検出された後（Ｔａｋａｎｏｅｔａｌ．，２０００）、養殖ヒラメでもＶＨＳＶによる被害が報告された（Ｉｓｓｈｉｋｉｅｔａｌ．，２００１）。国内でも類似した時期に養殖ヒラメでｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ性の疾病が流行して、この原因体を調査した結果、北米地域及び日本で分離したＶＨＳＶと同一の遺伝型であることに確認された（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００３）。以後、ＶＨＳＶは多様な海産魚類及び淡水魚類で分離されて、養殖ヒラメで毎年継続的な斃死を引き起こす病原体に報告されている（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００４；Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００９；Ｃｈｏｅｔａｌ．，２０１２）。

現在、ＶＨＳＶは世界動物保健機構（ＷｏｒｌｄＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ，ＯＩＥ）の水生動物衛生規約（ＡｑｕａｔｉｃＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈＣｏｄｅ）により‘管理対象疾病（ｎｏｔｉｆｉａｂｌｄｉｓｅａｓｅ）’に指定されており（ＯＩＥ，２０１３）、国内でも水産生物疾病管理法第２条で規定する水産生物伝染病で、防疫措置の対象に含まれて感染や疾病発生が確認されれば移動制限と消毒の措置が実施される疾病である。

最近、多様な水産生物疾病の発生と消費者たちの安全な食べ物に対する需要の増加により全世界的に水産生物の防疫（ＡｑｕａｔｉｃａｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ）、予察（Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）及びモニタリング（Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）の重要性がさらに大きくなっている。また、国家的な予察及び防疫活動だけではなく地域的（ｒｅｇｉｏｎａｌ）で、区域化（ｚｏｉｎｉｎｇ）された水産生物の疾病予察及びモニタリングの研究結果の分析は、今後、水産生物疾病の疫学調査及び疾病管理に必要で有用な資料を提供するだけでなく、自国内の特定疾病に対する無病（清淨）地域を証明できる非常に重要な役割をする（ＦＡＯ，２００４）。従って、ＶＨＳＶの国内分離株の配列変異に対する持続的な研究及び他国家の分離株との配列比較と持続的なモニタリングがさらに重要になった。

全世界的に同定されたＶＨＳＶのＮとＧ遺伝子の塩基配列を比較してみた結果、系統分析学的に４つのｇｅｎｏｔｙｐｅ（Ｉ−ＩＶ）とともにｇｅｎｏｔｙｐｅｓＩ（Ｉａ−Ｉｅ）とＩＶ（ＩＶａとＩＶｂ）にいくつかのｓｕｂｇｒｏｕｐが含まれている（Ｓｎｏｗｅｔａｌ．，１９９９；Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，２００４；Ｌｕｍｓｄｅｎｅｔａｌ．，２００７）。ＧｅｎｏｔｙｐｅＩはヨーロッパの多様な淡水及び海水魚種たちから分離されたＶＨＳＶを含み、バルト海（ＢａｌｔｉｃＳｅａ）、スカゲラク（Ｓｋａｇｅｒｒａｋ）、カテガット（Ｋａｔｔｅｇａｔ）とイギリス海峡（ＥｎｇｌｉｓｈＣｈａｎｎｅｌ）の海水魚類たちから分離された多くのＶＨＳＶの分離株たちも含まれる（Ｄｉｘｏｎｅｔａｌ．，１９９７；Ｔｈｉｅｒｙｅｔａｌ．，２００２；Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，２００４；Ｓｎｏｗｅｔａｌ．，２００４）。ＧｅｎｏｔｙｐｅＩＩはバルト海（ＢａｌｔｉｃＳｅａ）の海水魚類から分離された分離株たちが含まれ（Ｓｎｏｗｅｔａｌ．，２００４）、ｇｅｎｏｔｙｐｅＩＩＩは英国とアイルランドの北海（ＮｏｒｔｈＳｅａ）と北大西洋（ＮｏｒｔｈＡｔｌａｎｔｉｃ）から分離された分離株たちとノルウェー西部のニジマス（ｒａｉｎｂｏｗｔｒｏｕｔ）から分離されたＶＨＳＶが含まれる（Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，２００４；Ｓｎｏｗｅｔａｌ．，２００４；Ｌｏｐｅｚ−Ｖａｚｑｕｅｚｅｔａｌ．，２００６；Ｄａｌｅｅｔａｌ．，２００９）。ＧｅｎｏｔｙｐｅＩＶは北米の太平洋岸（Ｐａｃｉｆｉｃｃｏａｓｔ）と大西洋の海岸（Ａｔｌａｎｔｉｃｃｏａｓｔ）だけでなく、北米の五大湖（ＧｒｅａｔＬａｋｅｓ）地域とアジア地域から分離された分離株たちも含めている（Ｎｉｓｈｉｚａｗａｅｔａｌ．，２００２；Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００３；Ｅｌｓａｙｅｄｅｔａｌ．，２００６；Ｇａｇｎｅｅｔａｌ．，２００７；Ｌｕｍｓｄｅｎｅｔａｌ．，２００７）。従って、ＶＨＳＶの遺伝的距離及び系統分析結果を通じて宿主の魚類種より地理的位置にさらに関係すると見られる。

細菌の遺伝型を分析するための多様な方法が開発されており、遺伝子塩基配列分析法（ｓａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ法（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）、制限断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）法などが使用されているが、相変わらず分析時間が長くて手順がややこしいという問題点を持っている。ここに追加で、病原性を示す遺伝型及び遺伝体マーカーの開発を必要とし、このような遺伝型による病原性を分析して相関関係を確認するための迅速で簡便な分析のための遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）及び遺伝体マーカーの開発、遺伝体マーカーを容易に判別できる方法が必要な実情である。

本発明者らは先行研究でアジアから分離されたＶＨＳＶの系統分析学的比較を遂行したことがある（Ｊ．ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌ．，２６（３）：１４９−１６１）。上記の論文ではＶＨＳＶＧ−タンパク質の遺伝子の７５５番目の塩基配列が韓国分離株ではではＣ＞Ａ変異が発生したということを明らかにした。ただし、上記の論文ではＶＨＳＶ分離株たちのＧタンパク質のフルレングスオープンリーディングフレーム（ｆｕｌｌｌｅｎｇｒｈｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ）をすべて増幅した後、増幅産物をクローニングして再び精製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を確認する作業を経て時間と材料が多く消耗される短所があった。

一般的に、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｃｉｄ，ＰＮＡ）は核酸塩基がリン酸結合ではないペプチド結合で連結された類似ＤＮＡで１９９１年にＮｉｅｌｓｅｎなどによって初めて合成された。ＰＮＡは自然界では発見されず、人工的に化学的な方法で合成される。ＰＮＡは相補的な塩基配列の天然核酸とハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を通じて二本鎖を形成する。長さが同じ場合ＰＮＡ／ＤＮＡの二本鎖はＤＮＡ／ＤＮＡの二本鎖より、ＰＮＡ／ＲＮＡの二本鎖はＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖より安定である。また、ＰＮＡは単一塩基不整合（ｓｉｎｇｌｅｂａｓｅｍｉｓｍａｔｃｈ）のために二本鎖が不安定になる程度が大きいために単一塩基変異多型性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）を検出する能力が天然核酸よりもっと優れている。ＰＮＡは化学的に安定するだけでなく、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）やタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって分解されないので生物学的にも安定である。また、ＰＮＡはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、ＭＮＡ（Ｍｏｐｈｏｌｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）のように遺伝子認識物質の一つとして、基本骨格がポリアミドで構成されている。ＰＮＡは親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）と選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）が大変優秀で、熱／化学的に物性や安定性が高くて保管が容易で容易に分解されない長所がある。

よって、本発明者は韓国の養殖ヒラメから分離したＶＨＳＶ分離株たちのｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ）の塩基配列を分析してＫｏｒｅａｎＶＨＳＶ分離株たちと既報告された日本及び中国の分離株たちを系統発生学的に比較して国内特異的な塩基配列を確認して、区域化（ｚｏｉｎｉｎｇ）された水産生物疾病の予察、遺伝的多様性、分子疫学的特徴分析、モニタリングや疾病管理に必要で有用な資料を提供するために鋭意努力した結果、ＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を判別するための遺伝子マーカー及び上記のＤＮＡと結合力が優秀なＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｃｉｄ，ＰＮＡ）を用いて地域特異的遺伝型ごとに互いに異なる融解温度を現せることによって、ＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を簡単、迅速、正確に判別できることを確認して、本発明を完成するようになった。

本発明の目的は、ＶＨＳＶのターゲット遺伝子の地域特異的遺伝型を判別できるプローブ及びプローブの両末端にレポーターまたはクエンチャーが結合したＰＮＡを提供するところにある。

本発明の他の目的は、上記のプローブまたはＰＮＡを含むＶＨＳＶの塩基多形成の分析キットを提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、上記のプローブまたはＰＮＡを含むＶＨＳＶの遺伝型の判別方法を提供すところにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＧタンパク質の配列で、Ｃ７５５Ａ及びＡ７５６Ｇの一塩基多型変異を含む配列断片と厳格な条件でハイブリダイズできるＶＨＳＶの地域特異的遺伝型の判別用プローブを提供する。

本発明はまた、上記プローブの両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）またはクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されていることを特徴とするＶＨＳＶの地域特異的遺伝型の判別用ＰＮＡ提供する。

本発明はまた、上記のプローブまたはＰＮＡを含むＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別用キットを提供する。

本発明はまた、（ａ）ＶＨＳＶからターゲットＤＮＡを分離する段階；（ｂ）上記ターゲットＤＮＡを上記プローブとハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させる段階；（ｃ）上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高めながら温度別の融解曲線を得る段階；及び（ｄ）上記から得られる融解曲線を分析する段階を含むＶＨＳＶのターゲットＤＮＡの地域特異的遺伝型を決定する段階を含むＰＮＡを利用したＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別方法を提供する。

本発明はまた、（ａ）ＶＨＳＶからターゲットＤＮＡを分離する段階；（ｂ）上記ターゲットＤＮＡを上記のＰＮＡとハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させる段階；（ｃ）上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高めながら温度別の融解曲線を得る段階；及び（ｄ）上記から得られる融解曲線を分析する段階を含むＶＨＳＶのターゲットＤＮＡの地域特異的遺伝型を決定する段階を含むＰＮＡを利用したＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別方法を提供する。

本発明の好ましいほかの実施例によるＶＨＳＶの分離地域を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別用ＰＮＡを使用した融解曲線の分析の技術的な特徴を説明するための概念図である。本発明の好ましいほかの実施例によるＰＮＡを利用したＶＨＳＶの分離地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の判別方法のハイブリダイズ段階と融解曲線を得る段階を説明するための模式図である。本発明によるＶＨＳＶの分離地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の選定のための地域別のＧタンパク質配列の分析結果とＰＮＡの結合部位を説明するための配列図である。本発明によるＶＨＳＶの分離地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定するＧタンパク質の遺伝子上でＰＮＡが含まれている塩基変異部分の一例を説明するための遺伝子の位置図である。本発明によるＶＨＳＶの分離地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の判別用ＰＮＡのＧタンパク質遺伝子内の結合位置と遺伝型による各々のプローブに対する互いに異なるハイブリダイズの程度を探知することの一例を説明するための模式図である。本発明によるＶＨＳＶの分離地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別のためのｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲの反応条件を示す図式である。本発明の実施例に従いＶＨＳＶの分離地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別を各遺伝型別に分析した一例を示す結果グラプである。遺伝型別のＰＮＡプローブの融解曲線のグラプから得た融解温度（Ｔｍ）を遺伝コードで整理した表の一例である。

他の方式で定義されない限り、本明細書で使用したあらゆる技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野に熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を有する。一般的に本明細書で使用された命名法及び以下に記述する実験方法は本技術分野においてよく知られて通常的に使用されるものである。

本発明ではウイルス性出血性敗血症ウイルス（ｖｉｒａｌｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）の地理的遺伝型を迅速で簡便に分析しようとＶＨＳＶの遺伝型を決定する単一塩基多型性のマーカーを選別した。

具体的に、各国の水産生物から分離されたＶＨＳＶを対象にＶＨＳＶ分離株たちの地域特異的な配列を確認するためにＶＨＳＶのＧ−タンパク質の配列を分析した結果、国内の分離株は７５５番目の塩基対がＡに、７５６番目塩基対がＧで示された一方、米国、カナダ及び日本の分離株は７５５番目の塩基対がＣに、７５６番目塩基対がＧで示されて、ヨーロッパの分離株は７５５番目の塩基対がＣに、７５６番目塩基対がＡでしめされたことを確認した（図１、図３）。

即ち、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合力より結合力が優秀なＰＮＡ−ＤＮＡの結合を利用する場合、ＰＮＡは１個の核酸ミスマッチ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｉｓｓｍａｔｃｈ）にも融解温度（Ｔｍ）が１０〜１５℃程度の差異が出る特性を利用してＶＨＳＶの単一塩基多型性変異（ＳＮＰ）および挿入−欠失変異（ＩｎＤｅｌ）での核酸の変化が検出できることを確認した（図２、図４）。

従って、本発明は一観点で、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＧタンパク質の配列で、Ｃ７５５Ａ及びＡ７５６Ｇ一塩基多型の変異を含む配列断片を厳格な条件でハイブリダイズできるＶＨＳＶの地域特異的遺伝型の判別用プローブに関するものである。

本発明において、上記プローブは５〜２０個の塩基で構成されることを特徴とすることができる

本発明において、上記プローブの８番目及び９番目の位置にＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定するＧタンパク質の遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位に相応する配列を有するのを特徴とすることができる。

本発明において、上記プローブは配列番号１で表されることを特徴とすることができる。

本発明は他の観点で、上記プローブの両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）及びクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されているのを特徴とするＰＮＡに関するものである。すなわち、本発明に従うＰＮＡは両末端にはレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とレポーターの蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）できるクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合できる。本発明において、上記のレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓｒｅｄ、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’，−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及びＣｙ５で構成される群から選択される一つ以上でもでき、上記のクエンチャーはＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙで構成される群から選択される一つ以上でも構わないが、これに限定されるものではないが、好ましくはＤａｂｃｙｌを使用するのを特徴とすることができる。

また、ＰＮＡはＴａｑＭａｎプローブのＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄとは異なるｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄを用いて分析することができて、似ている役割をするプローブとしてはｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｐｒｏｂｅ、ｓｃｏｒｐｉｏｎｐｒｏｂｅがある。

図１は本発明の好ましい一つの実施例によるＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別用ＰＮＡの技術的特徴を説明するための概念図であり、ここに示されたことのように、本発明によるＰＮＡは標的核酸とハイブリダイズされた後、蛍光信号を発生させられ、温度が上がることによってプローブの適正融解温度（Ｔｍ）で標的核酸から早く融解されて蛍光信号を消光させる。本発明はこのような温度変化による上記蛍光信号から得られた高解像度の融解曲線分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓ；ＦＭＣＡ）を通じて、標的核酸の塩基変異の有無が検出できることである。

本発明によるＰＮＡは標的核酸の塩基配列と完全なハイブリダイズ（ｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ）をなす場合予想された融解温度（Ｔｍ）値を示すが、塩基変異が存在する標的核酸とは不完全なハイブリダイズ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）をなして予想より低い融解温度（Ｔｍ）値を示すことを特徴とすることができる。

本発明者らは多様な種類のＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する遺伝子部位を比較検討して、配列番号１でなっている塩基配列を含むＰＮＡを製作して、このようなＰＮＡを利用してＶＨＳＶのＤＮＡサンプルから融解曲線を得て、上記の融解曲線から融解温度（Ｔｍ）を確認した結果、後述する実施例で確認できることのように、ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）別に、互いに異なる結果を得ることができた。このような本発明はＤＮＡとの結合力が優秀なＰＮＡを用いてＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）ごとに互いに異なる融解温度（Ｔｍ）を示させることによって、ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を簡単、迅速、正確に判別できることである。

本発明において、上記ＰＮＡの塩基配列の長さは特別に制限されないが、ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を含む５〜２０ｍｅｒの長さで製作できる。

ＰＮＡの長さを調節して望むＴｍ値を持つようにプローブを製作することも出来、同じ長さのＰＮＡプローブでも塩基配列に変化を与えてＴｍ値を調節することも可能である。また、ＰＮＡはＤＮＡより結合力が優秀で基本的なＴｍ値が高いためにＤＮＡより短い長さに制作可能で近く隣にしたＳＮＰでも検出可能である。既存のＨＲＭｍｅｔｈｏｄによるとＴｍ値の差異が約０．５℃で非常に少なくて追加的な分析プログラムか、細密な温度変化または補正を必要にして、このために２個以上のＳＮＰが現れる場合には分析が難しかったが、本発明によるＰＮＡはプローブ配列とＳＮＰに対しては影響を受けないから簡便に分析が可能である。

また、本発明によるＰＮＡは標的核酸と塩基変異を有する標的核酸の融解温度（Ｔｍ）の差異のために、標的核酸の塩基変異の位置がＰＮＡの中心部分（ｃｅｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）に来るようにデザインするのが好ましい。塩基変異の部分がプローブの中心部分（ｃｅｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）に位置すると、プローブの構造的差異を作ることで、ＰＮＡはループ（ｌｏｏｐ）を形成しながら結合することで、このような構造的差異によって融解温度（Ｔｍ）の差異が大きく現れる。

このような理由で、本発明によるＰＮＡが１６個ないし１７個範囲内の塩基配列を含む場合には、８番目ないし９番目の位置中一つ以上の位置に一塩基多型（ＳＮＰ）の部位に相応する配列を持つのが好ましい。このようなＰＮＡは塩基配列の中心部分にＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別部位に相応する配列を含めて構造的な変形を持つことができて、これを通じて完全なハイブリダイズをなす標的核酸（ｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ）との融解温度（Ｔｍ）の差異をさらに大きくすることができる。

また、本発明によるＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別用ＰＮＡは結合する塩基配列（またはＳＮＰ）に従って異なる融解温度（Ｔｍ）を示すために、一つのＰＮＡ（またはプローブ）で２個以上の塩基配列が検出できて、また２個以上のＰＮＡを一つのチューブに包含させて使用することも可能である。

本発明のＰＮＡはＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する技術に関するもので、本発明のＰＮＡをＶＨＳＶの標的核酸とハイブリダイズさせて融解曲線を分析することによって（図２）、ＶＨＳＶの一塩基多型を簡単、迅速、正確に判別することができる。

従って、本発明は他の観点で、（ａ）ＶＨＳＶからターゲットＤＮＡを分離する段階；（ｂ）上記ターゲットＤＮＡを上記プローブとハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させる段階；（ｃ）上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高めながら温度別の融解曲線を得る段階；及び（ｄ）上記から得られる融解曲線を分析する段階を含むＶＨＳＶのターゲットＤＮＡの地域特異的遺伝型を決定する段階を含むＰＮＡを利用したＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別方法に関するものである。

本発明はまた、（ａ）ＶＨＳＶからターゲットＤＮＡを分離する段階；（ｂ）上記ターゲットＤＮＡを上記ＰＮＡとハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させる段階；（ｃ）上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高めながら温度別の融解曲線を得る段階；及び（ｄ）上記から得られる融解曲線を分析する段階を含むＶＨＳＶのターゲットＤＮＡの地域特異的遺伝型を決定する段階を含むＰＮＡを用いたＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別方法に関するものである。

上記ハイブリダイズさせる段階は本発明によるＰＮＡをＶＨＳＶのＤＮＡサンプルと反応させることである。この段階はＰＣＲ過程を含むことができて、ＰＣＲのためのｆｏｒｗａｒｄ／ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓｅｔを利用するのが可能である。このようなハイブリダイズ段階とＰＣＲ条件はこの技術分野で普通の知識を持つ者（以下、‘当業者’という）に広く知られた多様なあらゆる方法を含むことができる。また、ＰＣＲが終わった後にはｍｅｌｔｉｎｇ過程を含むことも可能である。

本発明において、上記ＶＨＳＶのターゲットＤＮＡはＧタンパク質遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位を含むことを特徴とすることができる。一般的にＶＨＳＶの表面にタンパク質を発現するＧタンパク質をコーディングする遺伝子の場合、種判別及び地域区分が可能な遺伝型を持っていて、発源地域を判別するマーカーで効果的である。

また、上記温度別の融解曲線を得る段階はＶＨＳＶのＤＮＡサンプルの融解温度（Ｔｍ）を得るためである。このために、上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高めながら蛍光の強さを測定して、温度による蛍光強さの変化を温度別の融解曲線で得ることができる。すなわち、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ分析方法としてＦＭＣＡ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭｅｌｔｉｎｇＣｕｒｖｅＡｎａｌｙｓｉｓ）を利用することができて、上記ＦＭＣＡはＰＣＲ反応が終わった後作られた産物と入れておいたプローブとの結合力の差異をＴｍで区分して分析することである。例えば、一般的なｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ装置を利用して１℃増加させるたびに蛍光の強さを測定することでＴｍ値を得ることができる。

続いて、上記ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を判別する段階は上記得た融解曲線の融解温度からＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を判別することである。例えば、上記得た融解曲線の融解温度を予め知っているＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の融解温度と比較して、ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を判別することができる。ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）ごとに本発明によるＰＮＡを適用した融解曲線は互いに異なる融解温度（Ｔｍ）を持っていて（図８）、このような差異を利用してＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別が可能である。

これと共に、図７は本発明によるＰＮＡを利用したＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別方法で融解曲線から融解ピーク曲線を得る段階の一例を説明するためのグラプであり、ここに示されたことのように上記融解曲線の傾き値を利用して温度別の融解ピーク曲線を得ることができて、このような融解ピーク曲線はＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の融解温度（Ｔｍ）を把握するのに容易である。このために、上記温度別の融解曲線を得る段階は、上記得た温度別の融解曲線から温度別の融解ピーク曲線を得る段階を含めて、上記ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を判別する段階は上記得た融解ピーク曲線の融解温度からＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を判別するのが可能である。

また、本発明は他の観点で、上記プローブまたはＰＮＡを含むＶＨＳＶの地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別用キットに関するものである。

本発明において、上記キットは多重ターゲットＤＮＡまたは単一ターゲットＤＮＡの塩基多形成の分析用であることを特徴とすることができる。

本発明において、上記キットのプローブはＰＮＡであることを特徴とすることができる。

本発明のキットはバッファー、ＤＮＡ重合酵素助因子およびデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。また、本発明のキットはまた多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、およびＤＮＡ重合酵素の活性を抑制する抗体を含むことも可能である。

このようなキットを利用すると、ＰＮＡによる融解曲線の分析を通じて標的核酸の単一塩基変異及び塩基の欠損または挿入による変異を効果的に検出することができて、これを通じてＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別が可能である。

以下、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１．ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）関与一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーの開発
各国の水産生物から分離されたＶＨＳＶを対象に、ＶＨＳＶ分離株たちの地域特異的な配列の確認のために配列変異が激しいＧ−遺伝子のフルレングスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の配列をＶＨＳＶのＧ−ＯＲＦ−Ｆ１（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧ−３’）とＶＨＳＶ−Ｇ−ＯＲＦ−Ｒ１（５’−ＴＣＡＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣ−３’）のプライマーセットをデザインしてＰＣＲを遂行して、１５２４ｂｐのＰＣＲ産物を得ることができた。増幅されたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を利用してクローニングして、ＥｘｐｒｅｐＴＭＰｌａｓｍｉｄＳＶＤＮＡｐｒｅｐｋｉｔ（ＧｅｎｅＡｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）を用いて精製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を確認した。

各地域で分離されたＶＨＳＶのＧタンパク質の配列をアライメントして、国内で分離されたＶＨＳＶにだけ特異的に発生する遺伝子配列を分析して、国内分離株の判別が可能な配列はＶＨＳＶのＧタンパク質遺伝子の７５５ｂｐ、７５６ｂｐの塩基配列で確認されて、国内分離株はＡ（７５５ｂｐ）、Ｇ（７５６ｂｐ）であり、米国、カナダ、日本分離株はＣ（７５５ｂｐ）、Ｇ（７５６ｂｐ）であり、ヨーロッパ分離株はＣ（７５５ｂｐ）、Ａ（７５６ｂｐ）である。

実施例２．ＶＨＳＶの地域特異的遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の判別用ＰＮＡの製造
ＶＨＳＶで抽出したＲＮＡを逆転写して製作したｃＤＮＡを鋳型でＰＣＲを遂行するためにＧタンパク質のプライマーを製造した。即ち、ＶＨＳＶのＧタンパク質遺伝子の塩基配列を分析して、塩基配列の比較を通じて各発生地域別に類似性を示すＳＮＰを探して、これを基に地域特異的な配列を選択した。

図４は本発明によるＶＨＳＶのＧタンパク質遺伝子の一部とＳＮＰ及びこれより導出されたＰＮＡ探針子の塩基配列の一例を示す図式であり、図５は本発明によるＶＨＳＶのＧタンパク質遺伝子上でＰＮＡ探針子が結合する配列の結合程度を説明するための遺伝子多様性とこれに従うＰＮＡ探針子の結合程度を示した図式である。図５で、地域特異的遺伝型部位の７５５番、７５６番の配列に対するＰＮＡ探針子の結合程度を特異結合と非特異結合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）で表記して、非特異結合の個数により地域区分が可能であることを確認して、これにより上記の位置を中心にする塩基配列（配列番号１）を本発明に従うＰＮＡ探針子の塩基配列で構成した。

このように、本発明によるＰＮＡ探針子の塩基配列を決定して、下記表１に示した。

上記表１でＯはリンカー及びＫはライシン（ｌｙｓｉｎｅ）を意味する。

ＰＮＡ探針子の蛍光測定が可能にするためにＨＥＸを結合して製作した。

その後、上記の表１に示したことのような塩基配列とレポーター及びクエンチャーで本発明によるＰＮＡプローブを製作した。ＰＮＡプローブはＰＮＡプローブデザイナー（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて設計した。本発明で使用したあらゆるＰＮＡプローブはパナジン（Ｐａｎａｇｅｎｅ、韓国）でＨＰＬＣ精製方法を通じて合成し、合成されたあらゆるプローブの純度は質量分析法を用いて確認し、標的核酸との更なる効果的な結合のためにプローブの不必要な二次構造は避けた。

実施例３．ＶＨＳＶサンプルに対する融解曲線の分析
上記実施例１と２に従って製作したＰＮＡプローブを利用して、地域別に分離されたＶＨＳＶのｃＤＮＡサンプルに対して融解曲線を導出して、これを分析して地域特異的な遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）を判別した。

ＰＣＲはＣＦＸ９６^ＴＭＲｅａｌ−Ｔｉｍｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、米国）を利用して遂行し、あらゆる実験条件は一本鎖の標的核酸を生成するために非対称ＰＣＲ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＣＲ）を用いた。非対称ＰＣＲの条件は次のようである；総容量が２０μｌになるように１ＸシソンバイオリアルタイムＦＭＣＡ^ＴＭバッファー（ＳｅａＳｕｎＢｉｏＲｅａｌ−ＴｉｍｅＦＭＣＡ^ＴＭｂｕｆｆｅｒ，シソンバイオ、韓国）、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、２００μＭｄＮＴＰｓ、１．０ＵＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．０５μＭｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ及び０．５μＭｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＣＲ、表２）に０．５μｌプローブ（上記実施例１で製造されたＰＮＡプローブ）３種、０．５μｌＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅのＤＮＡを添加した後リアルタイムＰＣＲを実施した。

図６は本発明の実施例に従ってＶＨＳＶのｃＤＮＡサンプルのＧタンパク質領域を増幅して、上記の実施例１と２に従って製作された本発明によるＰＮＡプローブをハイブリダイズさせて、上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高める過程の温度及び時間条件を示した図表である。ここに示したことのように、リアルタイムＰＣＲの過程は９５℃で５分間変性させた後、９５℃で３０秒、５６℃で４５秒、７４℃で３０秒間反応させた。これを４０サイクル繰返した。融解曲線の分析は９５℃で５分間の変性段階を経た後、８５℃を始めて段階的なハイブリダイズを２５℃まで進行した後２５℃から８５℃まで１℃ずつ上昇させながら蛍光を測定する融解曲線の分析を遂行した。各段階の間ごとに１０秒間の停止状態を維持した。

図７に掲示されたことのように融解曲線は１個のチューブで測定し、各融解曲線でグラプ線の個数は互いに異なるサンプルに対する測定値である。結果で示されたことのように、ＶＨＳＶの分離地域ごとに本発明によるＰＮＡを適用した融解曲線の結果で互いに異なる融解曲線（Ｔｍ）を有していることを確認することができる。

図８は温度別の融解曲線のグラプから得た結果と一塩基多型の標準分析方法であるシークエンシング結果と比較した表の一例である。

これによると、本発明によるＰＮＡ探針子を利用する場合、分離地域によって一貫した融解温度を確認することができて、これを通じて本発明によるＰＮＡプローブを利用するとＶＨＳＶの分離地域の特異的な遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別が可能である。

本発明によるＰＮＡ探針子を利用して未知のＶＨＳＶのｃＤＮＡサンプルに対して種を判別しようとする場合、図８のような融解温度別タイプを予め付与して、これを活用することが可能である。

具体的に、上記実施例２のように融解曲線の分析を実施して得たＴｍ値を６９℃内外のピークをｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈと認識して、５８℃内外のピークをｓｉｎｇｌｅｍｉｓｍａｔｃｈに指定し、４９℃内外のピークをｄｏｕｂｌｅｍｉｓｍａｔｃｈに指定しており、分析結果を使用して国内分離株はｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ、米国、カナダ、日本、中国の分離株はｓｉｎｇｌｅｍｉｓｍａｔｃｈで、ヨーロッパの分離株はｄｏｕｂｌｅｍｉｓｍａｔｃｈでコードを付与し、各分離株ごとに固有の値を持つようにした。

以上で本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とこれらの等価物により定義されると言える。

本発明によるＤＮＡとの結合力が優秀なＰＮＡプローブはＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）ごとに互いに異なる融解温度（Ｔｍ）を現せることによって、ＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）のマーカーを簡単、迅速、正確に判別できる効果がある。

また、本発明によるＶＨＳＶ分離地域の判別用ＰＮＡは塩基配列の中心部分にＶＨＳＶの発源地域別に確認された遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の一塩基多型（ＳＮＰ）部位に相応する配列を含むことによって、構造的な変形を持つことができて、これを通じて完全なハイブリダイズをなす標的核酸（ｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ）との融解温度（Ｔｍ）の差異をさらに大きくできることである。

また、本発明によるＶＨＳＶの分離地域を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別用ＰＮＡは結合する塩基配列（またはＳＮＰ）によって異なる融解温度（Ｔｍ）を示すために、一つのＰＮＡ（またはプローブ）で２個以上の塩基配列を検出できるし、また２個以上のＰＮＡを一つのチューブに包含させて使用することも可能である。

Claims

次の段階を含む、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の地域特異的遺伝型を決定する一塩基多型（ＳＮＰ）の判別方法：
（ａ）ＶＨＳＶからＲＮＡを分離して、逆転写反応を通じてターゲットＤＮＡを得る段階；
（ｂ）上記ターゲットＤＮＡを、配列番号１で表されるＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる段階；
（ｃ）上記のハイブリダイズさせた産物の温度を高めながら温度別の融解曲線を得る段階；及び
（ｄ）上記から得られる融解曲線を分析する段階。
融解曲線のＴｍ値における約６９℃のピークを韓国ＶＨＳＶ分離株と同定し、融解曲線のＴｍ値における約５８℃のピークを米国、カナダ、日本、又は中国のＶＨＳＶ分離株と同定し、融解曲線のＴｍ値における約４９℃のピークをヨーロッパＶＨＳＶ分離株と同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
上記プローブは、両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）またはクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されているＰＮＡプローブであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
上記のレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓｒｅｄ、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’，−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＪＯＥ、Ｃｙ３及びＣｙ５で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
上記のクエンチャーはＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙｌで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。