KR20230141268A - 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(vhsv)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트, 이를 포함하는 VHSV 검출용 조성물, 이를 포함하는 VHSV 검출용 키트 및 이를 이용하여 VHSV를 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 VHSV를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트는 뉴클레오단백질 유전자에 특이적이고, 추출한 RNA의 농도 32 fM까지 검출이 가능한 검출한계를 나타내는 장점이 있다.
Description
본 발명은 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트, 이를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 조성물, 이를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 키트 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법에 관한 것이다.
바이러스성출혈성패혈증(VHS)은 유럽에서 양식되고 있는 연어과 어류와 동아시아에서 양식되고 있는 넙치에서 발생하는 질병으로서, 수온이 8℃ 가량인 겨울에서 봄에 걸쳐 발생하는 계절적 유행병으로 막대한 피해를 입히지만, 수온이 15℃ 이상이 되면 산발적이 되거나 없어진다. 폐사율은 환경조건에 좌우되는데 통상 10~80%로 알려져 있다.
상기 바이러스성출혈성패혈증은 급성, 만성, 신경성으로 분류된다. 급성은 급격한 경과를 거쳐 체색흑화, 단안돌출, 안구 주변과 내부의 출혈, 근육내출혈, 아가미출혈 등을 나타낸다. 만성은 급성에 이어 완만한 경과를 거쳐 양안돌출, 강력한 빈혈을 나타내지만, 출혈 정도는 급성보다도 약하다. 신경성은 유행의 말기에 광분, 선회, 돌진 등 이상행동과 복벽수축을 나타내며, 수일 내에 죽는다.
국내에서는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 진단으로 RT-PCR을 주로 사용되고 있으나(대한민국 등록특허공보 제10-1595442호, 대한민국 등록특허공보 제10-1782489호), 상기 방법은 민감도와 특이도가 우수하다는 장점이 있지만, 전문적인 기술과 특수한 장비를 필요로 하므로 현장에서 사용하기에는 한계가 있는 문제점이 있다.
따라서, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 뉴클레오단백질(nucleoprotein)을 코딩하는 유전자 영역에 특이적인 등온증폭용 프라이머 세트를 제작한 후, VHSV의 시료를 대상으로 역전사 등온증폭반응을 수행한 결과, VHSV의 RNA 핵산을 검출할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함함으로써, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함함으로써, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트는 상기 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 뉴클레오단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 조성물을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 키트는 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 방법은 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 감염증 의심 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 루프 매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 방법은 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 감염증 의심 검체로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼로 전처리하는 단계; 상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 등온증폭 반응은 62~68℃의 온도에서 20~40분 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 및 전기영동으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 형광발색은 100배의 SybrGreen I에서 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)을 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트는 뉴클레오단백질에 특이적이고, 추출한 RNA의 농도 32 fM 까지 검출이 가능한 검출한계를 나타내는 장점이 있다.
또한, 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 진단 방법은 간단한 열처리 기기 만으로 분자진단 검사 결과를 현장에서 30분 이내에 확인할 수 있으므로, 현행 실시간 PCR(Real time PCR) 검사법이 증폭시간만 2시간 정도 소요되는데 비하여 신속하게 검사 결과를 제공할 수 있기 때문에, VHSV 감염증의 진단에 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 뉴클레오단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 LAMP 프라이머 제작에 사용된 표적 염기서열 부위와 LAMP 프라이머들의 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 프라이머 세트별 특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 루프 매개 등온증폭 반응의 온도 최적화 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 검출한계 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 실시간 RT-LAMP 반응을 통한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출한계 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 프라이머 세트별 특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 루프 매개 등온증폭 반응의 온도 최적화 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 검출한계 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 실시간 RT-LAMP 반응을 통한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출한계 실험 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 제1 구현예는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)을 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "등온증폭(isothermal amplification)"은 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성, 어닐링 및 연신 단계가 각각 다른 온도 조건하에서 수행되는 것과 달리, 한 온도 조건하에서 DNA 증폭반응을 수행하기 때문에 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 증폭 방법을 의미한다.
일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 109개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 유지 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한, 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 증폭 산물을 육안으로 관찰할 수 있다는 점에서 간편하게 DNA를 증폭 및 확인할 수 있다.
상기 등온증폭은 루프 매개 등온증폭방법일 수 있다. 상기 용어, "루프 매개 등온증폭 방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 내부 프라이머(inner primer, FIP/BIP), 외부 프라이머(outer primer, B3/F3) 및 루프 프라이머(loop primer, LF/LB)를 사용하여 수행되는 증폭 방법의 하나이다.
이 중 F3, FIP 및 LF는 유전자의 5' 방향에 결합하는 프라이머이며, B3, BIP 및 LB는 3' 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. FIP는 F2와 F1c, BIP는 B2와 B1c의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다 (c는 상보서열을 의미한다).
상기 루프 매개 등온증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다.
본 발명에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 프라이머는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 표적 유전자에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 6의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 키트는 상기 서술한 바와 같은 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물에 포함되는 프라이머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다.
상기 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 상기 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 키트는 이에 포함되는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다.
이때, 상기 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출방법은 상기 서술한 바와 같은 등온증폭용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 구성될 수 있다.
또한, 상기 등온증폭 반응은 루프 매개 등온증폭 방법일 수 있다. 상기 루프 매개 등온증폭 방법은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수도 있다.
상기 시료는 코로나 바이러스를 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 어류, 구체적으로 연어 또는 넙치 유래의 시료일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 등온증폭 방법은 62 내지 68℃, 바람직하게는 64 내지 66℃, 보다 바람직하게는 65℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭 방법은 20~40분, 바람직하게는 25~35분, 보다 바람직하게는 30분 동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 등온증폭은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 일례로, 상기 반응물은 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 반응물에 포함되는 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등은 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 프라이머 세트 설계
루프 매개 등온증폭 방법을 사용하여 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하기 위해 프라이머 설계 및 제작을 하였다.
먼저, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응(LAMP)용 프라이머 세트를 제작하기 위하여, Genebank의 레퍼런스 서열(KM926343.1)을 이용하여 뉴클레오단백질 염기서열 부위의 정보를 확인하였다. LAMP에 사용할 프라이머 세트는 PrimerExploler v5를 이용하여 제작하였다(도 1 참조).
도 1은 타겟 서열과 프라이머 서열의 위치를 나타낸 것으로서, FIP는 F1c-F2로 이루어지고, BIP는 B1c-B2로 이루어지며, C는 상보 서열을, RC는 역 상보서열 (reverse complimentary) 의미한다.
최종 제작된 프라이머 세트의 염기서열을 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5′ → 3') | 서열번호 |
| VH-N-37-F3 | AAAGCTCGCAGGATGTGC | 서열번호1 |
| VH-N-37-B3 | GATCCTCCAGCAGCTTCG | 서열번호2 |
| VH-N-37-FIP | CATGGCTCTGGCCCTTGACTGAAGATCACCAAGGCCCTCTA | 서열번호3 |
| VH-N-37-BIP | GGCGTTGAGGCTCAATGGGAGATGCCCAGGTTGTTGGC | 서열번호4 |
| VH-N-37-LF | CGGTCAGGATGAAGGCG | 서열번호5 |
| VH-N-37-LB | CAGGAATGACCATGATCGGA | 서열번호6 |
<실시예 2> 프라이머 세트의 특이성 확인
상기 제작된 뉴클레오단백질 유전자의 염기서열 부위를 표적으로 하는 프라이머 세트의 특이성을 확인하였다.
본 발명의 프라이머 세트는 검체로부터 핵산을 추출 및 정제하여 분리된 RNA 핵산을 주형으로 역전사 반응과 루프 매개 등온증폭이 동시에 일어나도록 하는 역전사루프 매개등온증폭(RT-LAMP) 방법을 이용하여 검증하였으나, 본 발명에 의한 프라이머 세트는 주형 RNA 핵산에 대해 역전사 반응을 별도의 과정을 거쳐 먼저 수행하여 생성된 cDNA를 이용하여 2차적으로 루프 매개 등온증폭법을 수행하는 방식에도 이용될 수 있다.
통상적인 방법을 이용하여 검체 시료로부터 추출 및 정제를 통해 준비한 RNA 주형 1㎕, 2.5 ㎕의 등온증폭 반응 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1 % Tween® 20, pH 8.8@25 ℃), 6 mM MgSO4 1.5 ㎕, 1.4 mM dNTP mix 3.5 ㎕ , 프라이머 믹스 5 ㎕ (반응농도 F3/B3 프라이머 1.6 μM, FIP/BIP 0.2 μM, LF/LB 0.4 μM), 등온증폭 효소 1 ㎕ (8 unit), 역전사효소 0.5 ㎕ (7.5 unit), RNAse free water 10 ㎕ 를 섞어 최종 부피 25 ㎕ 의 등온증폭 반응을 위한 혼합액을 제조하였다.
상기 혼합액을 65℃에서 30분, 40분, 50분, 60분, 70분 및 80분 동안 반응시킨 후, 최종 LAMP 산물을 수득하였다. 상기 수득된 LAMP 산물을 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 상기 최종 제작된 프라이머 세트인 2번 및 3번 프라이머 세트에서 증폭을 나타낸 반면에, 1번 프라이머 세트는 증폭을 나타내지 아니함을 알 수 있다.
<실시예 3> 루프 매개 등온증폭 반응온도의 최적화
상기 실시예 2에서 특이성이 확인된 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응(LAMP)용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응의 온도를 최적화하기 위한 실험을 다음과 같이 수행하였다.
검체로부터 추출 및 정제를 통해 준비된 RNA 주형으로 사용하였다.
통상적인 방법을 이용하여 검체로부터 추출 및 정제하여 준비한 RNA 주형 1㎕, 2.5 ㎕의 등온증폭 반응 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1 % Tween® 20, pH 8.8@25 ℃), 6 mM MgSO4 1.5 ㎕, 1.4 mM dNTP mix 3.5 ㎕ , 프라이머 믹스 5 ㎕ (반응농도 F3/B3 프라이머 1.6 μM, FIP/BIP 0.2 μM, LF/LB 0.4 μM), 등온증폭 효소 1 ㎕ (8 unit), 역전사효소 0.5 ㎕ (7.5 unit), RNAse free water 10 ㎕ 를 섞어 최종 부피 25 ㎕의 등온증폭 반응을 위한 혼합액을 제조하였다.
상기 혼합액을 50℃, 53℃, 56℃, 59℃, 62℃, 65℃, 68℃ 및 71℃의 다양한 온도에서 30분 동안 반응시킨 후, 최종 LAMP 산물을 수득하였다.
상기 수득된 LAMP 산물을 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 형광발색을 한 결과를 도 3에 나타내었다. 이 때, 상기 형광발색은 발색제로 100X의 SybrGreen I을 사용하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 62℃, 65℃ 및 68℃의 온도에서 30분 동안 반응시에서만 등온증폭의 특성인 래더형 진행을 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 4> 형광신호 분석을 통한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출한계
상기 실시예 2에서 특이성이 확인된 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응(LAMP)용 프라이머 세트를 이용하여, 다음과 같이 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출한계를 확인하였다.
바이러스성출혈성패혈증 양성 또는 음성 검체 시료로부터 통상적인 방법으로 분리한 RNA를 10-1 내지 10-4배로 단계 희석하여 준비하고, 루프 매개 등온증폭 반응온도 및 반응시간을 65℃ 및 30분으로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 LAMP 산물을 수득하였다.
상기 수득된 LAMP 산물을 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(A)및 형광발색(B)을 한 결과를 도 4에 나타내었다. 이 때, 상기 형광발색은 발색제로 100X의 SybrGreen I을 사용하였고, 도 4의 B에서 좌로부터 순서대로 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 배 및 음성 시료의 결과를 나타낸 것이다.
도 4에서 보는 바와 같이, 임상 양성 시료 10-4 배까지 증폭되는 반면에, 10-5 배 이상 및 음성 시료에서는 증폭 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있다. 이 때, 상기 음성 시료로는 RNA를 포함하지 않은 혼합액을 사용하였다.
상기 10-4 배를 농도로 환산하면 58 fM로서, 매우 적은 양의 추출된 RNA 농도라도 검출이 가능함을 알 수 있다.
<실시예 5> 실시간 RT-LAMP 반응을 통한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출한계
상기 실시예 2에서 특이성이 확인된 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 검출을 위한 루프 매개 등온증폭 반응(LAMP)용 프라이머 세트를 이용하여, 다음과 같이 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출한계를 확인하였다.
바이러스성출혈성패혈증 양성 검체 시료로부터 통상적인 방법으로 분리한 RNA를 500 pM, 100 pM, 20 pM, 4 pM, 800 fM, 160 fM, 32 fM 로 단계 희석하여 준비한 후, 실시간 관측을 위해 10X SybrGreen을 첨가하고 루프 매개 등온증폭 반응온도 및 반응시간을 65℃ 및 30분으로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 실시간 LAMP 반응을 관측하였다.
실시간 형광 신호 측정 시스템 (BioRad, CFX 96 Real-Time system)을 이용해 실시간 LAMP 반응에서 생성된 형광 신호를 도 5에 나타내었다. 이 때, 상기 형광발색은 발색제로 10X의 SybrGreen I을 사용하였고, (-) control은 RNA 시료가 포함되지 않은 등온증폭 혼합액을 사용하였다.
도 5에서 보는 바와 같이, 30 분 안에 32 fM의 RNA 까지 실시간 LAMP 반응을 통하여 핵산이 검출되는 것을 확인할 수 있다. 이는 도4에서 확인한 형광발색 신호 분석에 의한 검출한계인 58 fM보다 더욱 낮은 수준이고, 음성 시료에서는 증폭 반응이 일어나지 않아 특이적 반응이 일어남을 확인할 수 있다. 또한, 실시간으로 증폭의 양상을 확인할 수 있다는 장점이 있다.
이와 같이, 실시간 LAMP 반응을 이용하면, LAMP 반응 후에 별도의 형광신호를 측정하는 등의 추가 신호 측정 과정 없이 실시간 검출을 할 수 있고, 30분 만에 32 fM 정도의 매우 적은 양의 추출된 RNA 농도라도 검출이 가능함을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
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<223> reverse primer of VH-N-37-LB
<400> 6
caggaatgac catgatcgga 20
Claims (13)
- 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는, 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 상기 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)의 뉴클레오단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트.
- 제1항 또는 제2항에 따른 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 키트는 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV) 검출용 키트.
- 제1항 또는 제2항의 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 방법은,
바이러스성출혈성패혈증 바이러스 감염증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 루프 매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 방법은,
바이러스성출혈성패혈증 바이러스 감염증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼로 전처리하는 단계;
상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 제1항 또는 제2항의 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 루프 매개 등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 등온증폭 반응은 62~68℃의 온도에서 20~40분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 및 전기영동으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 및 전기영동으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 형광발색은 100배의 SybrGreen I에서 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 형광발색은 100배의 SybrGreen I에서 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV)를 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220040622A KR20230141268A (ko) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(vhsv)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 그의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020220040622A KR20230141268A (ko) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(vhsv)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 그의 용도 |
Publications (1)
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|---|---|
| KR20230141268A true KR20230141268A (ko) | 2023-10-10 |
Family
ID=88292092
Family Applications (1)
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| KR1020220040622A KR20230141268A (ko) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(vhsv)를 검출하기 위한 루프 매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 그의 용도 |
Country Status (1)
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| KR (1) | KR20230141268A (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101595442B1 (ko) | 2015-08-18 | 2016-02-18 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 지역 특이적 유전형 판별용 프로브 및 그 용도 |
| KR101782489B1 (ko) | 2016-04-06 | 2017-09-28 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 pna 프로브 및 그 용도 |
-
2022
- 2022-03-31 KR KR1020220040622A patent/KR20230141268A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
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| KR101782489B1 (ko) | 2016-04-06 | 2017-09-28 | 주식회사 시선바이오머티리얼스 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 pna 프로브 및 그 용도 |
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