JP6687251B2 - ターゲット分析方法およびこれに用いるターゲット分析キット - Google Patents
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Description
前記担体の画分と、前記担体以外の画分とを分離する工程と、
前記担体の画分および前記担体以外の画分の少なくとも一方における前記標識化結合核酸分子の標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする。
前記本発明のターゲット分析方法に使用することを特徴とする。
(a)下記(a1)のポリヌクレオチド
(a1)配列番号1または2の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)下記(b1)のポリヌクレオチド
(b1)配列番号3または4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
前記担体の画分および前記担体以外の画分の少なくとも一方における前記標識化結合核酸分子の酵素反応を検出し、好ましくは、前記酵素の基質の存在下、前記酵素反応を検出する。
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、試料と、ターゲットと結合する標識化結合核酸分子と、前記標識化結合核酸分子に結合するブロッキング核酸分子が固定化された担体とを反応させる工程(反応工程)と、前記担体の画分と、前記担体以外の画分とを分離する工程(分離工程)と、前記担体の画分および前記担体以外の画分の少なくとも一方における前記標識化結合核酸分子の標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程(分析工程)とを含むことを特徴とする。
(a)下記(a1)〜(a3)および(a4)からなる群から選択された少なくとも1つのポリヌクレオチド
(a1)配列番号1または2の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a2)前記(a1)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(a3)前記(a1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(a4)前記(a1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
ピーナッツ結合核酸分子1(配列番号1)
5’-GGATATTGCCTCGCCACAGTTAAGTCAGGTGGTTGGTTATGGTTGGGACTGACTCTCTACAGGGAACGCTCGGATTATC-3’
ピーナッツ結合核酸分子2(配列番号2)
5’-GGTAAGGTCCTCAGTCCTCGATTAGCTATCCTCCCGTTTCCTCTACTTTCTGCGTGATCACGGCGGCTCTCATTAC-3’
(b)下記(b1)〜(b3)および(b4)からなる群から選択された少なくとも1つのポリヌクレオチド
(b1)配列番号3または4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b2)前記(b1)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b3)前記(b1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b4)前記(b1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
相補鎖1(配列番号3)
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAGAGAGTCAGTCCCAACCA-3’
相補鎖2(配列番号4)
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTAGAGGAAACGGGAGGAT-3’
前記(a1)の配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと、前記(b1)の配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組合せ
前記(a1)の配列番号2の塩基配列からなるポリヌクレオチドと、前記(b1)の配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組合せ
(x1)前記試料と前記標識化結合核酸分子とを反応させ、さらに、前記試料と前記標識化結合核酸分子との混合物を、前記担体と反応させる。
(x2)前記標識化結合核酸分子と前記担体とを反応させ、さらに、前記標識化結合核酸分子と前記担体との混合物を、前記試料と反応させる。
(x3)前記試料と、前記結合核酸分子と、前記担体とを一度に反応させる。
本発明のターゲット分析キットは、前述のように、ターゲットと結合する標識化結合核酸分子と、前記標識化結合核酸分子に結合するブロッキング核酸分子が固定化された担体とを含み、前記本発明のターゲット分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析キットは、前記標識化結合核酸分子と前記担体とを含み、前記本発明の分析方法に使用することが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の分析キットは、例えば、前記本発明の分析方法の説明を援用できる。本発明のターゲット分析キットによれば、例えば、前記本発明の分析方法を簡便に実施できる。また、本発明の分析キットによれば、例えば、3分程度と極めて短時間で、且つ優れた分析感度でターゲットを分析できる。本発明の分析キットによれば、例えば、前記結合核酸分子の非特異的な結合を抑制できるため、例えば、優れた分析精度でターゲットを分析できる。
本発明のピーナッツ結合核酸分子は、下記(c1)〜(c3)および(c4)からなる群から選択された少なくとも1つのポリヌクレオチド(以下、「(c)のポリヌクレオチド」ともいう。)を含むことを特徴とする。
(c1)配列番号1、2、5、および6のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(c2)前記(c1)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(c3)前記(c1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
(c4)前記(c1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ピーナッツアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
ピーナッツ結合核酸分子3(配列番号5)
5’-AGTTAAGTCAGGTGGTTGG-3’
ピーナッツ結合核酸分子4(配列番号6)
5’-ATCCTCCCGTTTCCTCTAC-3’
(b)下記(b1)〜(b3)および(b4)からなる群から選択された少なくとも1つのポリヌクレオチド
(b1)配列番号3または4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b2)前記(b1)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b3)前記(b1)のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b4)前記(b1)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
前記(c1)の配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと、前記(b1)の配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組合せ
前記(c1)の配列番号2の塩基配列からなるポリヌクレオチドと、前記(b1)の配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組合せ
前記(c1)の配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチドと、前記(b1)の配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組合せ
前記(c1)の配列番号6の塩基配列からなるポリヌクレオチドと、前記(b1)の配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組合せ
本発明の分析方法および分析キットにより、迅速にピーナッツ等のターゲットを分析できることを確認した。
市販のピーナッツ(種子)について、ミルにより粉砕した。得られた粉末5gを20mLのSB1T緩衝液と混合後、振盪機を用い、室温(25℃前後、以下同様)、90−110rpmの条件で終夜(約16時間、以下同様)振盪した。前記SB1T緩衝液の組成は、40mmol/L HEPES(pH7.5)、125mmol/L NaCl、25mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、0.05(v/v)% Tween(登録商標)20とした。
ピーナッツアレルゲンに結合する標識化結合核酸分子を含む結合核酸分子液は、5’末端がビオチン化された前記配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド(ピーナッツアプタマー)を含む溶液と、ストレプトアビジン標識されたルシフェラーゼ(Streptavidin-Lucia、Invivogen社製)を含む溶液とを混合することにより、調製した。前記標識化結合核酸分子は、前記ストレプトアビジン100pmolあたりに400pmolの前記結合核酸分子を固定化した。前記結合核酸分子液における前記結合核酸分子の濃度は、1pmol/Lとした。また、ブロッキング核酸分子が固定化された担体は、5’末端がビオチン化された前記配列番号3からなるポリヌクレオチドと、ストレプトアビジン標識ビーズ(Invitrogen社製)とを混合し、室温で30分間振盪後、前記SB1T緩衝液で洗浄することにより調製した。前記ブロッキング核酸分子が固定化された担体(固定化ブロッキング核酸分子)は、前記ビーズ1mgあたりに500pmolの前記ブロッキング核酸分子を固定化した。前記洗浄後、前記ビーズは、40mg/mLとなるように前記SB1T緩衝液に懸濁し、ビーズ液を調製した。なお、前記ビーズは、磁性ビーズである。
本発明の分析方法および分析キットにより、食品中のピーナッツを分析できることを確認した。
前記ピーナッツに代えて、市販のクッキー(ミニバタークッキー、Ito Bicuits Co., LTD.社製)、チョコレート(DARSミルクチョコレート、森永製菓社製)、ビスケット(Sand Biscuit、East pigeon Co,.LTD.社製)を用い、前記SB1T緩衝液と混合後、1分間振盪した以外は、前記実施例1(1)と同様にして、クッキー抽出液、チョコレート抽出液およびビスケット抽出液を調製した。そして、各抽出液について、前記実施例1(1)と同様にして、タンパク質濃度を定量した。
前記ピーナッツ抽出液1に代えて、前記クッキー抽出液、前記チョコレート抽出液および前記ビスケット抽出液をそれぞれ用い、前記結合核酸分子および前記ビーズとの混合後の反応液における各抽出液由来のタンパク質濃度が10ppmとなるように添加し、さらに、前記反応液におけるピーナッツタンパク質の濃度が、所定濃度(0.01、0.05、0.25、1.25、または6.25ppm)となるように、前記ピーナッツ抽出液1を添加した以外は、前記実施例1(2)と同様にして、発光量を測定した。
異なる担体を用い、本発明の分析方法および分析キットにより、ピーナッツを分析できることを確認した。
前記実施例1(1)と同様にして、ピーナッツ抽出液1を調製した。
前記ストレプトアビジン標識ビーズに代えて、ストレプトアビジン標識アガロースビーズ(Invitrogen社製)またはストレプトアビジン標識レジン(ポリスチレン)ビーズ(SA-resin beads、Bio-rad社製)を用い、前記酵素として、前記ルシフェラーゼを用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、発光量を測定した。
本発明の分析方法および分析キットにより、ピーナッツを分析でき、且つ非特異的な結合が低減されていることを確認した。
前記実施例1(1)と同様にして、ピーナッツ抽出液1を調製し、タンパク質濃度を定量した。また、前記ピーナッツに代えて、市販のダイズ(種子)を用いた以外は、ダイズ抽出液を調製し、タンパク質濃度を定量した。なお、ダイズは、ピーナッツアレルゲンに相同性の高いタンパク質を含むことが知られている。
前記結合核酸分子液は、前記実施例1(2)と同様にして調製した。また、前記ストレプトアビジン標識ビーズとして、前記ストレプトアビジン標識レジンビーズを用い、前記酵素として、前記ルシフェラーゼを用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、ビーズ液を調製した。つぎに、前記ピーナッツ抽出液1を、前記結合核酸分子および前記ビーズとの混合後の反応液におけるタンパク質濃度が、所定濃度(0、1.25、5、20または80ppm)となるように、前記SB1T緩衝液で希釈し、ピーナッツ希釈液を調製した。つぎに、チューブに、40μLの前記ビーズ液および160μLの前記SB1T緩衝液を添加し、希釈ビーズ液を調製した。また、別のチューブに、250μLの前記結合核酸分子液を添加し、さらに、250μLの前記ピーナッツ希釈液をチューブに添加した。前記添加後、攪拌した。さらに、前記チューブに、200μLの前記希釈ビーズ液を添加後、攪拌し、室温で1分間インキュベートした。
本発明の分析方法および分析キットにより、ピーナッツを分析できることを確認した。
前記ピーナッツの粉末と前記SB1T緩衝液とを混合後、1分間振盪した以外は、前記実施例1(1)と同様にして、振盪後の混合液を調製した。前記振盪後の混合液について、10000g、室温の条件で、30分間遠心した。つぎに、上清を回収後、前記上清について、フィルター(孔径0.8μm)を用いてろ過し、ピーナッツ抽出液2を調製した。そして、前記ピーナッツ抽出液2について、前記実施例1(1)と同様にして、ピーナッツタンパク質濃度を定量した。
本発明の分析方法および分析キットにより、ピーナッツを分析できることを確認した。
本発明の分析方法および分析キットにより、ピーナッツを分析できることを確認した。
Claims (5)
- 試料と、ターゲットと結合する標識化結合核酸分子と、前記標識化結合核酸分子に結合するブロッキング核酸分子が固定化された担体とを反応させる工程と、
前記担体の画分と、前記担体以外の画分とを分離する工程と、
前記担体の画分および前記担体以外の画分の少なくとも一方における前記標識化結合核酸分子の標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程とを含み、
前記標識化結合核酸分子が、下記(a)のポリヌクレオチドからなり、
前記ブロッキング核酸分子が、下記(b)のポリヌクレオチドからなることを特徴とする、ターゲット分析方法:
(a)下記(a1)のポリヌクレオチド;
(a1)配列番号1または2の塩基配列からなるポリヌクレオチド:
(b)下記(b1)のポリヌクレオチド;
(b1)配列番号3または4の塩基配列からなるポリヌクレオチド。 - 前記試料と、前記標識化結合核酸分子とを反応させる工程と、
前記試料および前記標識化結合核酸分子の混合物と、前記担体とを反応させる工程とを含む、請求項1記載のターゲット分析方法。 - 前記担体が、ビーズである、請求項1または2に記載のターゲット分析方法。
- 前記ビーズが、ポリスチレン製ビーズである、請求項3記載のターゲット分析方法。
- ターゲットと結合する標識化結合核酸分子と、前記標識化結合核酸分子に結合するブロッキング核酸分子が固定化された担体とを含み、
請求項1から4のいずれか一項に記載のターゲット分析方法に使用し、
前記標識化結合核酸分子が、下記(a)のポリヌクレオチドからなり、
前記ブロッキング核酸分子が、下記(b)のポリヌクレオチドからなることを特徴とする、ターゲット分析キット:
(a)下記(a1)のポリヌクレオチド;
(a1)配列番号1または2の塩基配列からなるポリヌクレオチド:
(b)下記(b1)のポリヌクレオチド;
(b1)配列番号3または4の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
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