CN106661637B - 检测核酸的方法和其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供利用基于核酸杂交的捕获和能够连接的PCR的组合检测生物样品中靶标核酸、检测生物样品中病原体、和诊断个体中疾病的简单、特异和敏感的方法。所述方法特别用于检测低水平核酸和病原体和用于多个生物样品的自动化和处理。

Description

检测核酸的方法和其应用

相关申请的交叉引用

该申请要求2014年9月5日提交的名称为“Methods of detecting nucleic acidsand applications thereof(检测核酸的方法和其应用)”的美国临时专利申请号62/046,810的优先权，其以其全部通过引用被并入本文。

发明背景

核酸，作为诊断靶标，在临床环境中具有很大的重要性。许多年来，DNA已成功用作许多疾病诊断的分子靶标，这些疾病包括出生前状况(Lun et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(50):19920-5,2008)、癌症(Gormally et al.,Mutat.Res.635(2-3):105-17,2007)和传染病(Hawkes和Kain,Expert Rev.AntiInfect.Ther.5(3):485-95,2007)。基于DNA的诊断学包括聚合酶链反应(PCR)(Rougemontet al.,J.Clin.Microbiol.42(12):5636-43,2004)、环介导等温扩增(LAMP)(Hopkins etal.,J.Infect.Dis.208(4)；645-652,2013)等，其全部提供靶标DNA的敏感检测。然而，它们主要依赖检测前DNA的提取，提取过程可以是艰苦的和易于污染。这在大量样品被处理的环境中特别有问题。

RNA也是诊断学的良好靶标(Miura et al.,Clin.Med.Oncol.2:511-27,2008；Nget al.,Clin.Chem.48(8):1212-7,2002；Skog et al.,Nat.Cell Biol.10(12):1470-U209,2008；Murphy et al.,Amer.J.Trop.Med.Hyg.86(3):383-94,2012；Mens et al.,Malar.J.5:80,2006；Mitra et al.,Front.Genet.3:17,2012)。目前的RNA检测方法主要包括微阵列杂交、反转录PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)和RNA杂交试验。微阵列试验能同时测量大量基因的表达水平或基因分型单个RNA样品中基因组的多个区域。然而当大量样品中只有少量基因需要测试时，如在临床诊断环境中，微阵列的使用变得不切实际，因为成本效益低和劳动力需求高。反转录PCR是目前最广泛使用的RNA定量技术，但是由于它依赖RNA的纯化和反转录，所以定量的准确性和再现性可由提取和反转录过程的多变效率而减少(Bustin和Nolan,J.Biomol.Tech.15(3):155-66,2004)。

NASBA(Schneider et al.,J.Clin.Microbiol.43(1):402-5,2005)和大小编码的连接介导的聚合酶链反应(SL-PCR)(Arefian et al.,Nucleic Acids Res.39(12),2011)检测RNA，无需在前的反转录，使特异、敏感、定量的RNA检测成为可能。然而，它们都仍然依赖RNA的提取和DNA的净化，这都是需要专家经验和易错的过程(Peirson和Butler,MethodsMol.Biol.362:315-27,2007)。

先前由发明人开发的基于杂交的RNA检测技术避免了RNA纯化和反转录，敏感和特异、高通量测量全血中RNA水平(Zheng et al.,Clin.Chem.52(7):1294-302,2006)。虽然能多重检测，但是该方法要求特别制作的分支DNA多聚体作为信号放大器，这妨碍其在普通实验室环境中的应用。

依赖连接的PCR试验(Hsuih et al.,J.Clin.Microbiol.34(3):501-7,1996)也检测RNA而无需RNA提取或反转录。该试验使用两个DNA捕获探针用于RNA分离和两个DNA半探针(hemiprobes)用于随后的PCR。DNA捕获探针具有靶标互补序列以及生物素部分——其可结合到具有链霉亲和素的表面。两个DNA半探针被设计为彼此并排结合到靶标RNA。靶标RNA由锚定到固体表面的捕获探针通过生物素和链霉亲和素之间的相互作用直接从样品裂解物纯化。然后半探针可通过与连接酶温育而互相连接(参见EP1311703)以形成充当PCR模板的完全探针。

本文讨论的所有参考文献以其全部通过引用被并入。

发明简述

一方面，本发明提供检测生物样品中靶标核酸(target necleic acid)的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂(extender)捕获所述靶标核酸，其中捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列(靶标核酸上的这种区域本文称作捕获靶向序列)和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列(靶标核酸上的这种区域本文称作检测靶向序列)；c)连接所述多个检测探针以形成连接的检测序列，其中检测探针与固定到固体载体的靶标核酸杂交；d)扩增所述连接的检测序列；和e)检测扩增的连接的检测序列。

在一些实施方式中，所述多个检测探针包括5’检测探针和3’检测探针，其中与5’检测探针中的序列互补的靶标核酸的区域(靶标核酸的所述区域为5’检测探针的检测靶向序列)是5’至与3’检测探针中的序列互补的靶标核酸的区域(靶标核酸的所述区域为3’检测探针的检测靶向序列)。在另一个实施方式中，所述多个检测探针进一步包括至少一个内部检测探针，其与5’和3’检测探针的检测靶向序列之间的靶标核酸的区域互补。在一些实施方式中，5’检测探针和任何内部检测探针在它们的5’端被磷酸化。在一些实施方式中，5’检测探针和任何内部检测探针在它们的5’端未被磷酸化。

在一些实施方式中，连接步骤通过连接酶，如T4连接酶进行。在一些实施方式中，当与靶标核酸杂交时检测探针之间的任何缺口已用聚合酶或反转录酶填补之后，连接步骤通过连接酶，如T4连接酶进行。在一些实施方式中，检测探针未磷酸化，在用聚核苷酸激酶，如T4聚核苷酸激酶磷酸化检测探针之后，连接步骤通过连接酶，如T4连接酶进行。

在一些实施方式中，扩增步骤包括使用与5’检测探针上的区域互补的第一引物和对应于3’检测探针上的区域的第二引物的PCR扩增。

在一些实施方式中，靶标核酸在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是mRNA、核糖体RNA、mRNA的剪接同种型、或非编码RNA。在一些实施方式中，核糖体RNA是18S核糖体RNA。

在另一个实施方式中，靶标核酸是DNA。

在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、干血斑、血浆样品、血清样品、血凝块、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿、和唾液。

在一些实施方式中，所述方法是高通量的。

另一方面，本发明提供诊断个体中疾病的方法。在一些实施方式中，疾病由病原体引起。在一些实施方式中，疾病，如传染病，通过检测来自个体的生物样品中的病原体核酸来诊断。在一些实施方式中，疾病与异常靶标核酸(如体液样品中的循环肿瘤核酸或出生前核酸)相关，并通过检测来自个体的生物样品中的异常靶标核酸来诊断。

再一方面，本发明提供检测个体中遗传变异(如突变)的方法。在一些实施方式中，遗传变异与疾病相关。

再一方面，本发明提供检测生物样品中外来核酸的方法。在一些实施方式中，外来核酸的来源选自污染物、病原体等。

在一些实施方式中，提供检测生物样品中多个靶标核酸的方法。

在一些实施方式中，提供使用矩阵混合策略针对一种或多种靶标核酸的存在筛选大量样品的方法。

附图简述

图1显示使用能够连接的PCR检测生物样品中靶标核酸存在的示例方法的示意图。

图2A和2B每个显示当使用连接形成线性连接的检测序列的检测探针时，使用基于核酸杂交的捕获组合本申请的能够连接的PCR，在靶标核酸的捕获和检测期间形成的示例复合物的结构和特点的示意图。

图3A和3B每个显示当使用连接形成环状连接的检测序列的一种或多种检测探针时，使用基于核酸杂交的捕获组合本申请的能够连接的PCR，在靶标核酸的捕获和检测期间形成的示例复合物的结构和特点的示意图。

图4显示LE-PCR技术的定量性质，其中来自样品RT-qPCR的Ct值与样品中恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的浓度相关。

图5显示来自在不同温度储存的干血斑的18S rRNA的稳定性，如使用分支DNA探针检测通过RNA杂交所测定的。

图6显示用来自干血斑的混合样品的LE-PCR的检测灵敏度的保持。

图7显示通过LE-PCR组合使用Taqman探针的RT-qPCR的非编码RNA的特异检测。

图8A、8B和8C显示检测A/B型流感和副流感病毒1IVT-RNA的LE-PCR的灵敏度。

图9显示LE-PCR的工作流程的示意图。

发明详述

本发明提供适合样品如生物样品中感兴趣的核酸的临床测定的简化的核酸扩增和检测系统。该方法利用基于核酸杂交的捕获和扩增，如基于连接的扩增，以直接检测生物样品中的核酸，无需核酸制备。该方法敏感、有效和易于适应使用者的需要，因此特别适合临床环境，尤其当同时分析多个生物样品时。

本申请的方法代表较现有的依赖连接的扩增方法——其依赖生物素-链霉亲和素(strepavidin)相互作用以将靶标核酸锚定到固体载体——的显著进步。参见，例如，Hsuihet al.,J.Clin.Microbiol.34(3):501-7,1996。生物素和链霉亲和素之间的亲和性格外高，二者的缀合在RNA/DNA杂交温度迅速且不可逆(Anders et al.,Electrophoresis 26(3):501-510,2005)。另一方面，捕获探针和靶标核酸(如RNA)之间的杂交缓慢并可占用超过16小时，尤其当靶标稀少时。因此，在具有生物素的捕获探针与靶标RNA杂交之前，具有生物素的捕获探针将被锚定到涂有链霉亲和素的表面。这导致三个后果。第一，与处于溶液相中的捕获探针相比，当捕获探针被锚定到表面时，捕获探针将具有较低的捕获效率。第二，由于生物素-链霉亲和素缀合是不依赖序列的过程，所以靶标特异的捕获探针将以随机方式而不是有利于捕获的构型被锚定到表面，和由于空间效应将不能有效捕获靶标。第三，由于生物素和链霉亲和素相互作用是不可逆的，所以结合到表面的游离捕获探针将阻止靶标/捕获探针复合物结合到表面。因此，使用基于生物素-链霉亲和素的捕获的依赖连接的PCR试验的灵敏度低(Hsuih et al.,J.Clin.Microbiol.34(3):501-7,1996)，该试验尚未广泛使用。

本发明提供可选的扩增系统——称作能够连接的PCR(LE-PCR)，其利用核酸杂交以将靶标核酸锚定到固体载体。基于核酸杂交的捕获依赖互补核酸序列的退火——可逆过程，并且当组合基于连接的PCR时具有通过改变参数而优化杂交严格性，产生用于检测稀释的靶标核酸的高度选择性和敏感的试验的潜力，所述参数包括但不限于温度、温育时间、洗涤、和不同靶标核酸特异的探针的数目和构型。该方法与现有方法相比因此显著更灵敏和特异，和导致至少以下优点：1)适合临床实验室环境，2)检测生物样品中少量核酸的能力，任选地没有核酸制备，3)获得可控和一致的(可标准化的)结果的能力，4)同时检测生物样品中多个不同靶标核酸的能力，5)混合样品和保持检测灵敏度的能力，和6)与目前可获得的方法相比减少的所需成本和技术。

进一步，本方法允许多个样品的较容易自动化和连续处理。例如，多个样品，不论来源(例如，人、家畜、植物、水)或类型(例如，血液、唾液、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿等)可平行测定。不同的靶标核酸可在被平行处理的样品的每个中检测。多个靶标核酸(如来自单个病原体或来自多个不同病原体)可在被平行处理的样品的每个中同时检测。

因此，本申请一方面提供使用基于连接的扩增联合基于核酸杂交的靶标核酸捕获(LE-PCR)来检测(包括测序)来自生物样品的靶标核酸的方法。另一方面，提供使用其它已知的核酸扩增技术，如PCR、LAMP和RCA，联合基于核酸杂交的靶标核酸捕获来检测(包括测序)来自生物样品的靶标核酸的方法。另一方面，提供使用本文描述的方法检测生物样品中的病原体的方法。进一步提供使用本文描述的方法诊断疾病和检测遗传变异的方法。还提供用于实施本文描述的方法的试剂盒和制品。

如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述或该(the)”包括复数的指示物，除非上下文另外清楚地指出。

本文提到“约”值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。

本发明的方法

本申请提供检测生物样品中靶标核酸的方法，包括使生物样品与检测探针、捕获延伸剂和捕获探针接触。捕获延伸剂每个包括a)与靶标核酸的区域互补的捕获序列；和b)与捕获探针中的序列互补的固定序列。捕获探针结合到固体载体，因此通过结合的捕获探针与捕获延伸剂的固定序列的杂交来固定与捕获延伸剂的捕获序列杂交的靶标核酸。检测探针每个包括与靶标核酸的区域互补的序列，并可进一步包括与靶标核酸的任何区域都不互补的共用(generic)序列和包括用于扩增的共用引物结合部位。在提供识别单个靶标核酸的多个检测探针的情况下，与固定在固体载体上的靶标核酸杂交的检测探针可被连接以形成单个连接的检测序列。一旦连接，连接的检测序列可被扩增和检测。这样的方法允许生物样品被处理而无需来自生物样品的核酸的纯化或当靶标核酸是RNA时无需反转录。检测探针可在靶标核酸被固定到固体载体之前或之后与靶标核酸杂交。可选地，检测探针的杂交和固定反应同时进行。

本文所用的“生物样品”指来自生物源如动物、植物、食物来源、或环境来源的样品，也指包括来自多个生物源的样品。

本文所用的“核酸”包括DNA(如基因组DNA)和RNA(如mRNA或rRNA)。

当提到核酸区域时本文所用的“连续的”指该区域无重叠和不同区域之间有不超过约500个碱基，例如，核酸的连续区域可被0、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个碱基中的约任意一个分隔。连续区域之间可具有或可没有缺口。当不同区域之间没有缺口时连续区域视为彼此“相邻”。当提到核酸区域时本文所用的“非连续的”指该区域无重叠和它们由超过约500个碱基分隔，例如，核酸的非连续区域可由550、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个碱基中约任意一个分隔。

因此，在一些实施方式中，提供检测样品中靶标核酸的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂捕获靶标核酸，其中捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列；c)连接所述多个检测探针以形成连接的检测序列；d)扩增所述连接的检测序列；和e)检测(如测序)扩增的连接的检测序列。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。邻近的连续区域可彼此相邻(即，它们之间没有缺口)，或它们之间可具有不超过约500个碱基的缺口。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的相邻区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。邻近的非连续区域由超过约500个碱基分隔。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述捕获延伸剂不与检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行，以便通过与靶标核酸杂交的捕获延伸剂和结合到固体载体的捕获探针的相互作用，靶标核酸首先被捕获和固定到固体载体，之后是检测探针与结合的靶标核酸的杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行，以便首先形成靶标核酸和杂交的检测探针的复合物，之后是通过与靶标核酸杂交的捕获延伸剂和结合到固体载体的捕获探针的相互作用，捕获和固定靶标核酸/检测探针复合物。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行，以便允许靶标核酸与以下杂交：i)检测探针；ii)游离的捕获延伸剂；和iii)与结合的捕获探针杂交的固定的捕获延伸剂。在一些实施方式中，样品是生物样品。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、血浆样品、血清样品、干血斑、血凝块、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18SrRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在一些实施方式中，提供检测生物样品中包括靶标核酸的病原体的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂捕获所述靶标核酸，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列；c)连接所述多个检测探针以形成连接的检测序列；d)扩增所述连接的检测序列；和e)检测(如测序)扩增的连接的检测序列，其中扩增的连接的检测序列的检测指示生物样品中病原体的存在。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的相邻区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，捕获延伸剂不与检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、干血斑、血凝块、血浆样品、血清样品、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18S rRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在一些实施方式中，提供诊断个体中由包括靶标核酸的病原体引起的疾病的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂捕获所述靶标核酸，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列；c)连接所述多个检测探针以形成连接的检测序列；d)扩增所述连接的检测序列；和e)检测(如测序)扩增的连接的检测序列，其中所述扩增的连接的检测序列的检测指示个体中疾病的阳性诊断。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的相邻区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述捕获延伸剂不与检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，所述捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、干血斑、血凝块、血浆样品、血清样品、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18S rRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在一些实施方式中，提供诊断个体中与异常靶标核酸(如体液样品中的循环肿瘤核酸或出生前核酸)相关的疾病的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂捕获所述靶标核酸，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列；c)连接所述多个检测探针以形成连接的检测序列；d)扩增所述连接的检测序列；和e)检测(如测序)扩增的连接的检测序列，其中所述扩增的连接的检测序列的检测指示个体中疾病的阳性诊断。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的相邻区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述捕获延伸剂不与检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、干血斑、血凝块、血浆样品、血清样品、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18S rRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在一些实施方式中，提供通过检测个体中的遗传变异来诊断个体中疾病的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂从个体的生物样品捕获包括遗传变异的靶标核酸，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列，并且其中检测探针中的至少一个是变异特异的检测探针，其优先与包括全部或部分变异的靶标核酸上的区域杂交；c)连接所述多个检测探针以形成连接的检测序列；d)扩增所述连接的检测序列；和e)检测扩增的连接的检测序列，其中扩增的连接的检测序列的检测指示个体中疾病的阳性诊断。在一些实施方式中，变异特异的检测探针与包括全部或部分变异的靶标核酸上的区域而不与不包括全部或部分变异的相应区域杂交。在一些实施方式中，变异特异的检测探针与包括全部或部分变异的靶标核酸上的区域杂交比与不包括全部或部分变异的相应区域杂交强至少约10x、20x、30x、40x、50x、100x、150x、200x、300x、400x、500x、或更多倍。在一些实施方式中，变异是突变或单核苷酸多态性(SNP)等。在一些实施方式中，与包括全部或部分变异的靶标核酸上的区域杂交的变异特异的检测探针和与不包括全部或部分变异的靶标核酸上的区域杂交的相应的野生型特异的探针均存在，以便野生型特异的检测探针将抑制变异特异的检测探针与不包括全部或部分变异的区域杂交。野生型特异的检测探针在其5’端未磷酸化，而变异特异的探针在其5’端磷酸化，以便在随后的连接反应中与靶标核酸杂交的野生型特异的检测探针不能与相邻检测探针连接，阻止连接的检测序列的形成和随后来自不包括变异的靶标核酸的所述连接的检测序列的扩增。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的相邻区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述捕获延伸剂不与检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、干血斑、血凝块、血浆样品、血清样品、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18SrRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在一些实施方式中，提供通过检测个体中的遗传变异来诊断个体中疾病的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂从个体的生物样品捕获包括遗传变异的靶标核酸，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列，其中靶标核酸包括两个检测靶向序列之间的缺口区域，其与检测探针中任何一个是不可杂交的，并且其中缺口区域包括变异；c)填补由包括变异的缺口区域分隔的两个检测探针之间的缺口；d)连接所述多个检测探针以形成包括变异的连接的检测序列；e)扩增所述连接的检测序列；和f)检测扩增的连接的检测序列中的变异，其中扩增的连接的检测序列中变异的存在指示个体中疾病的阳性诊断。在一些实施方式中，变异是突变或SNP等。在一些实施方式中，检测通过测序扩增的连接的检测序列来进行。在一些实施方式中，检测通过进行单碱基延伸来进行。在一些实施方式中，检测通过MALDI-TOF来进行。在一些实施方式中，缺口填补通过DNA聚合酶或反转录酶来进行。在一些实施方式中，所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，所述检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，捕获延伸剂不与检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，缺口填补通过引物延伸来进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、血浆样品、血清样品、干血斑、血凝块、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18S rRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品的细胞内，细胞裂解可使用本领域已知的任何方法来进行。在一些实施方式中，裂解通过向反应容器中的生物样品添加足够体积的裂解溶液来进行。裂解溶液可以是本领域已知的用于裂解细胞的任何溶液，包括，例如，包括以下的溶液：a)调节裂解物的酸度和渗透性的盐；和b)破碎膜结构的洗涤剂，如TritonX-100和SDS。在一些实施方式中，裂解溶液是这样的溶液，其包括约10至约20mM Tris-HCl(如约15mM Tris-HCl)、约130至约170mM NaCl(如约150mM NaCl)、约0.5至约2mM EDTA(如约1mM EDTA)、和约0.5至约2％Triton X-100(如约1％Triton X-100)。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包括约0.5至约2mM EGTA(如约1mM EGTA)。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包括约0.5至约3mg/ml蛋白酶K(如约1.5mg/ml蛋白酶K)。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包括探针混合物，所述探针混合物包括检测探针和捕获延伸剂。在一些实施方式中裂解反应在反应容器中进行，包括但不限于，离心管(如微量离心管)或多孔板。在一些实施方式中，裂解反应在约37至约65℃(如约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃中的任何一个)的温度温育。在一些实施方式中，裂解反应温育约10至约60分钟(如约20、25、30、35或40分钟中的任何一个)。在一些实施方式中，裂解反应伴随剧烈的震动进行。

固定捕获探针的固体载体可以是微粒或固体表面，例如许多种容器，例如，离心管、柱、多孔板孔、过滤器、管道等任一个的器壁表面。固体表面还可以是纸，例如，硝酸纤维素纸的表面，或膜，例如，尼龙膜的表面。在一些实施方式中，多孔板孔是优选的固体表面。在一些实施方式中，当使用颗粒时，它们将具有约0.4至约200微米，更通常约0.8至约10微米范围的尺寸。颗粒可包括任何方便的材料，如氧化铁、多种聚合物或玻璃。在一些实施方式中，颗粒是选自磁珠、Luminex微球体和Illumina珠的珠。捕获探针可通过本领域已知的任何方法通过官能团稳定地附接于固体载体。在一些实施方式中，当使用珠用于多重靶标扩增时，珠被设计以捕获不同靶标核酸，且每个珠与仅仅一个具有不同序列的捕获探针变体结合，并且用于不同靶标核酸的捕获延伸剂含有不同固定序列，其与不同捕获探针变体中的仅仅一个中存在的序列互补，以便一个靶标核酸将不会同时固定到两个或多个与不同捕获探针结合的珠上，两个或多个不同靶标核酸也不会固定到单个珠上，因此防止这些情况中任一个引起的固定效率的减低。相似地，多孔板可用于通过不同捕获探针来捕获不同靶标核酸。

在一些实施方式中，杂交在水性介质，特别地缓冲的水性介质中进行，其可包括多种添加物。在一些实施方式中，可被使用的添加物包括低浓度的洗涤剂(约0.1至约1％)、盐，例如，柠檬酸钠(约0.017至约0.170M)、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷、载体核酸、载体蛋白等。在一些实施方式中，非水性溶剂可添加到水性介质中，如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、醇、和甲酰胺。在一些实施方式中，这些其它溶剂将以约2至约50％范围的量存在。在一些实施方式中，杂交在约45至约65℃(如约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃中的任何一个)进行。在一些实施方式中，杂交进行约4至约24小时(如约10、12、14、16、18、或20小时中的任何一个)。杂交的严格性可通过控制温度、盐浓度、溶剂系统、温育时间等来控制以实现期望的选择性和/或灵敏度。因此在一些实施方式中，取决于感兴趣的序列的长度和性质，严格性将变化。通常，当需要变异特异的检测探针检测靶标核酸中的变异时，杂交条件的严格性使得靶标核酸的区域和经设计与靶标核酸的区域互补的检测探针的序列之间的单个错配将阻止杂交。可选地，可使用不太严格的杂交反应条件，例如当通用、简并检测探针用于与靶标核酸的多个区域杂交时。

在一些实施方式中，杂交在杂交容器中进行。在一些实施方式中，在存在裂解步骤的情况下，杂交容器可以是用于裂解的同一反应容器。在一些实施方式中，在存在裂解步骤的情况下，杂交容器不是用于裂解的反应容器，并且将裂解物从用于裂解的反应容器转移至杂交容器。在一些实施方式中，杂交容器是多孔板(包括但不限于96孔板)。在一些实施方式中，杂交容器，如多孔板的孔的表面，与可与捕获延伸剂杂交的捕获探针预缀合。在一些实施方式中，杂交容器是离心管(如微量离心管)。在一些实施方式中，杂交容器没有与捕获探针预缀合，并且微粒固体载体，如珠或微球体，与可与捕获延伸剂杂交的捕获探针预缀合和添加至杂交容器。

在一些实施方式中，杂交步骤的未结合的组分——包括未结合的探针和核酸——与结合到固体载体的杂交的复合物分离。在一些实施方式中，杂交步骤的未结合的组分通过洗涤结合的杂交的复合物而分离。在一些实施方式中，洗涤结合的杂交的复合物包括约1至约5个用适当洗涤溶液的洗涤步骤中的任何一个，其中每个洗涤步骤之后上清液可被分离或丢弃。洗涤步骤的条件可通过本领域已知的任何方法来改变以控制针对结合的杂交的复合物的选择性和/或灵敏度的水平，所述方法可包括改变洗涤溶液的严格性、改变与洗涤溶液的温育时间、改变洗涤步骤进行的温度、和/或改变在洗涤步骤期间施加的搅拌等。洗涤步骤的洗涤溶液可以是本领域已知的用于杂交后洗涤以去除未结合的组分的任何溶液。在一些实施方式中，洗涤溶液包括约0.1至约2X SSC中任何一个(约如0.1、0.2、0.5、1、或2XSSC中任何一个)。在一些实施方式中，在每个连续的洗涤步骤，洗涤溶液的严格性保持一样，例如，第一、第二和第三洗涤步骤用包括约0.1X SSC的洗涤溶液进行。在一些实施方式中，在每个连续的洗涤步骤，洗涤溶液的严格性增加，例如，第一洗涤溶液包括约2X SSC，第二洗涤溶液包括约1X SSC和第三洗涤溶液包括约0.1X SSC。洗涤溶液的严格性可使用本领域已知的任何方法，如例如改变洗涤溶液的盐浓度来控制。

用于本发明的洗涤步骤中的程序将依赖固体载体的性质而变化。在一些实施方式中，在固体载体是表面，如多孔板孔的表面的情况下，如上所述，上清液可被分离或丢弃和表面被洗涤。在一些实施方式中，在固体载体是颗粒的情况下，如上所述，颗粒可被洗涤，其中离心、过滤或在外部磁场的影响下分配到容器侧面将提供颗粒与上清液的分离，允许上清液的分离或丢弃。

在一些实施方式中，在包括靶标核酸和杂交的检测探针的复合物捕获在固体载体上和未结合的反应组分分离之后，杂交的检测探针的相邻5’和3'端使用连接剂连接在一起以形成包括杂交的检测探针的单个核酸分子，本文称作连接的检测序列。在一些实施方式中，连接剂可以是酶，例如，DNA或RNA连接酶，或化学接合剂，例如，溴化氰或碳二亚胺(Sokolova et al.,FEBS Lett.232:153-155,1988)。优选的DNA连接酶包括T4DNA连接酶。连接的检测序列的存在指示样品中靶标核酸的存在。在一些实施方式中，连接的检测序列充当多种扩增系统，如PCR、LAMP或SDA中任何一种的模板。处理之后保持未连接的检测探针中的任何一个在方法中的随后步骤中不会被扩增。

在一些实施方式中，5’检测探针和任何内部检测探针提供有磷酸化的5’端，并且连接可进行而没有额外的步骤。在一些实施方式中，检测探针未磷酸化，并且连接步骤进一步包括用能磷酸化检测探针5’端的酶处理。检测探针的磷酸化可使用本领域已知的任何方法来进行。在一些实施方式中，磷酸化酶是激酶，如T4聚核苷酸激酶。在一些实施方式中，磷酸化反应在连接之前但是杂交之后进行。在一些实施方式中，磷酸化步骤在与连接相同的时间进行。

在一些实施方式中，没有酶用于检测探针的连接，连接自动地进行。3’检测探针和任何内部检测探针的3’端以及5’检测探针和任何内部检测探针的5’端可分别含有适当的化学修饰，如化学攻击基团和离去基团，以便连接步骤通过在相邻的检测探针之间形成共价键化学地进行，而不使用酶。(Y.Xu,N.B.Karalkar,E.T.Kool."NonenzymaticAutoligation in Direct Three-Color Detection of RNA and DNA Point Mutations"Nat.Biotech.2001,19,148-152.)

在一些实施方式中，在杂交的检测探针包括与靶标核酸的非相邻区域互补的序列的情况下，连接步骤进一步包括用能填补非相邻的检测探针之间缺口的酶处理。缺口填补反应可使用本领域已知的任何方法进行。在一些实施方式中，缺口填补酶是DNA聚合酶或反转录酶，分别取决于靶标核酸是DNA或RNA。在一些实施方式中，缺口在连接之前填补。在一些实施方式中，缺口在与连接相同的时间填补。

连接的检测序列可通过本领域已知的任何方法来检测，包括实时PCR或其等同物、凝胶电泳、基于质谱的检测或测序等。在一些实施方式中，连接的检测序列通过本领域已知的任何方法来扩增。在一些实施方式中，连接的检测序列通过PCR扩增以产生PCR产物。在一些实施方式中，PCR产物通过本领域已知的任何方法来检测。在一些实施方式中，连接的检测序列使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来扩增和检测。在一些实施方式中，连接的检测序列(有或没有扩增)通过测序来检测。

在一些实施方式中，在基于PCR的技术用于扩增的情况下，提供PCR引物，即，与5’检测探针上的区域互补的第一引物，该区域本文称作5’引物结合部位，和对应于3’检测探针上的区域的第二引物，该区域本文称作3’引物结合部位。在一些实施方式中，5’和3’检测探针上的引物结合部位是与靶标核酸可杂交的序列的部分。可选地，在一些实施方式中至少一个5’检测探针的3’端含有共用的3’尾序列，以及至少一个3’检测探针的5’端含有共用的5’尾序列，这些共用的尾序列用于设计通用PCR引物。当多个靶标核酸被检测时，通用PCR引物特别有用。例如，两组探针(每组包括：a)检测探针，包括共用的3’和5’尾——分别包括共用的5’和3’引物结合部位；和b)捕获延伸剂；其中第一组的检测探针和捕获延伸剂对HIV-1特异，而第二组的检测探针和捕获延伸剂对HCV特异)可在本发明的方法中的任何一个中一起使用，只有一对共用的PCR引物用于扩增对HIV-1或HCV特异的连接的检测序列中的每个。

因此，在一些实施方式中，提供检测样品中多个靶标核酸的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂捕获所述多个靶标核酸中的一个，其中捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使所述多个靶标核酸中的一个与包括第一引物结合部位和第二引物结合部位的多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的序列；c)对所述多个靶标核酸中的每个进行步骤a)和b)；d)连接所述多个检测探针以形成对所述多个靶标核酸中的每个特异的多个连接的检测序列；e)扩增所述多个连接的检测序列；和f)检测多个扩增的连接的检测序列。在一些实施方式中，对所述多个靶标核酸中的每个特异的多个检测探针中的每个包括相同的第一引物结合部位和相同的第二引物结合部位，以及扩增步骤使用具有对应于第一和第二引物结合部位的引物对的PCR来进行。该方法和用于检测多个靶标核酸的该方法的变型，称作多重LE-PCR。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的所述多个检测探针与靶标核酸的连续区域杂交。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的所述多个检测探针与靶标核酸的相邻区域杂交。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的所述多个检测探针中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的检测探针和捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的捕获延伸剂不与对应于靶标核酸的检测探针杂交的区域之间的任何区域杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，样品是生物样品。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、干血斑、血凝块、血浆样品、血清样品、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18S rRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

在如上所述的多重LE-PCR的一些实施方式中，捕获延伸剂中的每个包括相同的共用固定序列，以及捕获探针中的每个包括与共用固定序列杂交的相同的共用区域，允许对靶标核酸中任何一个特异的连接的检测序列的扩增和检测。在多重LE-PCR的一些实施方式中，对于靶标核酸中的每个，对靶标核酸特异的所述多个捕获延伸剂中的每个包括相同的固定序列，其不同于对不同靶标核酸特异的其它捕获延伸剂中的任何一个的固定序列，以及对于每个固定序列提供包括与固定序列杂交的区域的捕获探针，其中不同的捕获探针中的每个只附接至特异的固体载体，该特异的固体载体可与其它捕获探针附接的固体载体分离。例如，在多重LE-PCR的一些实施方式中，对靶标核酸A特异的多个捕获延伸剂每个包括固定序列A，对靶标核酸B特异的多个捕获延伸剂每个包括固定序列B，捕获探针A可与固定序列A杂交并且只附接至A型珠，捕获探针B可与固定序列B杂交并且只附接至B型珠，以及A型珠可通过本领域已知的任何方法如通过流式细胞术等与B型珠分离，以便对靶标核酸A特异的连接的检测序列的扩增和检测可与对靶标核酸B特异的连接的检测序列的扩增和检测单独进行，因此允许单独检测来自单个样品的靶标核酸中的每个，同时仍然需要只使用一个共用的PCR引物对。

在靶标核酸PCR扩增的现有方法中，在单个反应容器中用多个引物对检测多个靶标的尝试已受限于变化的引物效率和引物对之间的竞争。相比之下，在本发明的优选实施方式中，提供检测探针以便产生多个连接的检测序列，每个对应于不同的靶标核酸，其中每个连接的检测序列包括相同的共用3’和5’引物结合部位。在多重LE-PCR的一些实施方式中，对于所述多个靶标核酸中的每个，对应于靶标核酸的所述多个检测探针包括相同的共用5’和3’引物结合部位。因此可使用多组检测探针和捕获延伸剂，每组对多个靶标核酸中的一个特异，但是只需要一对共用PCR引物来扩增对应于所述多个靶标核酸中每个的连接的检测探针。通过改变检测探针的靶标特异区域的长度，对应于特定靶标的扩增的PCR产物可通过大小来鉴定。对不同靶标核酸特异的Taqman探针也可用于RT-qPCR以检测多重LE-PCR测定中相应靶标核酸的存在。

在一些实施方式中提供测序多个靶标核酸的方法，包括：a)如上所述进行多重LE-PCR捕获，其中对于每个靶标核酸，对应于靶标核酸的所述多个检测探针的检测靶向序列包括缺口；b)用聚合酶填补与靶标核酸结合的检测探针之间的任何缺口；c)连接结合的检测探针以形成连接的检测序列；d)用一对共用PCR引物扩增连接的检测序列，其中引物具有与下一代测序(NGS)程序相容的额外的5’指标序列，导致对应于所述多个靶标核酸中每个的扩增的连接的检测序列的混合物；和e)将混合物进行测序(例如Illumina NGS程序)。在一些实施方式中，混合物中每个靶标的量通过测量靶标序列的“数字计数”来测定。在一些实施方式中，任何序列变体通过比较序列读数与参考序列来鉴定。在一些实施方式中，MALDI-TOF检测用于检测已知序列变体的存在，例如通过使用ddNTP和只是结合变异部位上游的引物使混合物进行一轮单碱基延伸反应和使用MALDI-TOF质谱仪检测延伸产物。

在一些实施方式中，多组检测探针和捕获延伸剂可靶向例如特定病原体，例如丙型肝炎病毒(HCV)的所有菌种，并且探针可被剪裁以检测和进一步鉴定病原体(例如HCV)的各个HCV基因型。

在一些实施方式中，多组检测探针和捕获延伸剂可靶向例如特定基因的所有外显子，其的突变可对疾病例如癌症的诊断、治疗和预后具有重要性。在一些实施方式中，多组检测探针和捕获延伸剂可靶向候选基因组的所有已知的序列变体，其的序列变异可对疾病例如癌症的诊断、治疗和预后具有重要性。

在一些实施方式中，提供检测探针以便连接的检测序列形成环化核酸分子，其中检测探针具有与靶标核酸的连续区域互补的5’和3’端，并且该检测探针在本文称作环化检测探针。在一些实施方式中，当与环化检测探针一起使用基于PCR的技术扩增时，提供两个引物，第一引物与环化检测探针的第一引物结合部位互补，第二引物具有位于环化检测探针的第一引物结合部位和3’端之间的第二引物结合部位的序列。在一些实施方式中，如上所述包括第一引物和第二引物的引物对被设计为共用的，其中引物对应于环化检测探针和靶标核酸之间的互补区域外的环化检测探针的共用区域，以便引物对可用于扩增本发明的所有连接的检测序列，其由包括对应于共用引物对的共用引物结合部位的环化检测探针的连接引起，而不论靶标核酸的序列。在一些实施方式中，环化的连接的检测序列使用滚环扩增(RCA)来扩增，其中RCA扩增的产物将保持附接至与固体载体结合的靶标核酸-捕获延伸剂-捕获探针复合物，允许RCA扩增的产物被单独检测。

在本文描述的方法中任何一个的一些实施方式中，所述多个检测探针由单个检测探针替换，省略了连接步骤，检测探针通过本领域已知的任何方法，如PCR、LAMP和RCA来扩增和检测。因此，例如，在一些实施方式中提供检测样品中靶标核酸的方法，包括：a)通过多个捕获延伸剂捕获靶标核酸，其中捕获延伸剂中的每个包括与靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将靶标核酸固定到固体载体；b)使靶标核酸与包括与靶标核酸上的区域杂交的序列的检测探针接触；c)扩增所述检测探针；和d)检测(如测序)扩增的检测探针。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，所述多个捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的非连续区域杂交。在一些实施方式中，检测探针和至少一个捕获延伸剂与靶标核酸的连续(如相邻)区域杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂与靶标核酸的同一条链杂交。在一些实施方式中，在靶标核酸具有超过一条链的情况下，捕获延伸剂中的至少一些与靶标核酸的不同链杂交。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之前进行。在一些实施方式中，步骤a)在步骤b)之后进行。在一些实施方式中，步骤a)和步骤b)同时进行。在一些实施方式中，样品是生物样品。在一些实施方式中，生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、血浆样品、血清样品、干血斑、血凝块、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿和唾液。在一些实施方式中靶标核酸在生物样品中是游离的，如不在细胞内。在一些实施方式中，靶标核酸在生物样品中结合在细胞内，所述方法进一步包括在步骤a)和b)之前的细胞裂解。在一些实施方式中，靶标核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是信使RNA。在一些实施方式中，RNA是核糖体RNA，如18S rRNA。在一些实施方式中，靶标核酸是DNA，如基因组DNA。

PCR产物还可通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来鉴定。PCR产物可在扩增期间用抗原，例如地高辛配基标记。标记的PCR产物然后在其上具有与检测探针的靶标特异区域杂交的核酸探针的多孔板上被捕获，该靶标特异区域存在于扩增的产物中。标记的捕获的产物然后可通过向多孔板的每个孔加入针对抗原标记的酶缀合的抗体，例如辣根过氧化物酶抗地高辛配基抗体，以及颜色指示剂来检测。每个孔的光密度提供PCR产物的量的度量，其进而指示原始样品中靶标核酸的存在。

取决于标记的性质，多种技术可用于检测标记的存在。对于荧光剂，大量不同的荧光计可用。对于化学发光剂，发光计或薄膜可用。关于酶，荧光的、化学发光的(chemiluminiscent)或有色产物可被提供并且进行荧光测量、发光测量(luminometrically)、分光光度测量或视觉测定。已用于免疫测定和适用于免疫测定的技术的多种标记可与主题测定一起使用。

本方法可以与为了测试目的由临床诊断实验室获得的常规生物样品一起使用。在一些实施方式中，可用于本方法的生物样品包括全血、干血斑、分离的白血细胞、血浆样品、血清样品、培养的细胞、组织活组织检查、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、痰、尿等，即，通常送到临床实验室分析的任何患者样品

本文描述的方法可用于高通量环境，即，至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或10,000个生物样品中任何一个可通过进行本文描述的方法中的任何一个而同时处理。

在一些实施方式中，提供用于检测多个样品中每个的靶标核酸的样品混合策略，包括：a)将待测的所述多个样品随机分布进n x m矩阵(n＝m或n＝m+1)，其中m由样品大小决定；b)混合来自每行的每个样品部分和混合来自每列的每个样品部分；c)使用本文描述的方法中任一个检测混合的样品中靶标核酸的存在；和d)单独重新测试在阳性行和阳性列交叉处的样品，其中在阴性行和阴性列交叉处的样品被宣告对靶标核酸阴性，当重新测试时发现对靶标核酸阳性的单独重新测试的样品被宣告对靶标核酸阳性。

本连接依赖的扩增方法特别用于福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样本中靶标序列的检测和克服了用于FFPE样本中靶标RNA序列检测的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的现有技术方法中的缺陷。RT-PCR具有可变的检测灵敏度，可能是因为福尔马林固定期间RNA-RNA和RNA-蛋白质交联物的形成阻止反转录酶延伸引物。在本方法中，不管交联物，探针可与靶标杂交，不需要反转录，并且扩增探针而不是靶标序列。因此本方法的灵敏度没有被交联物的存在而损害。

使用基于核酸杂交的捕获和能够连接的PCR检测生物样品中靶标核酸的总示意性描述在图1中提供。

探针和PCR引物

用于本发明方法的多核苷酸探针和PCR引物可通过已知的自动化多核苷酸合成技术，例如通过利用核酸合成仪的标准亚磷酰胺技术，从三磷酸核苷合成。这样的合成仪可获自，例如Applied Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)。

在一些实施方式中，如图2中所描述的，所述方法使用多核苷酸探针用于捕获和检测靶标核酸。在一些实施方式中，提供多个多核苷酸检测探针，例如第一检测探针(5’检测探针)和第二检测探针(3’检测探针)，以及多个多核苷酸捕获延伸剂，例如第一捕获延伸剂(捕获延伸剂1)和第二捕获延伸剂(捕获延伸剂2)。在一些实施方式中，进一步提供额外的检测探针，其是内部检测探针(内部检测探针1，IDP1)。在一些实施方式中，提供多个内部检测探针。在一些实施方式中提供多核苷酸捕获探针。在一些实施方式中提供多个捕获探针。探针可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸分子，分子类型的选择取决于随后的扩增方法。本文提到"探针"通常指多拷贝探针。也考虑具有修饰主链的核苷酸。

在一些实施方式中，检测探针包括两种探针(5’检测探针和3’检测探针)，其每个包括与靶标核酸的区域互补的序列(这样的序列在本文称作CR)。在一些实施方式中，5’和3’检测探针进一步包括不与靶标核酸的任何区域互补的序列(这样的序列在本文称作NCR)。参见图2。在一些实施方式中，5’和3’检测探针的NCR分别包括共用的5’和3’引物结合部位，并可与不同CR——其与不同靶标核酸序列互补——组合，允许使用单个PCR引物对用于对不同靶标核酸序列特异的不同的连接的检测序列随后的扩增和检测。在一些实施方式中，检测探针进一步包括至少一个内部检测探针(IDP)，其与位于5’和3’检测探针的检测靶向序列两侧的靶标核酸的区域互补。在一些实施方式中，设计靶向单个核酸的检测探针，以便它们的检测靶向序列是连续的，例如它们由不超过约500个核苷酸(如约0、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸中任何一个)分隔。在一些实施方式中，设计靶向单个核酸的检测探针，以便它们的检测靶向序列是相邻的，即，检测靶向序列包括靶标核酸的不间断序列。在一些实施方式中，设计靶向单个核酸的检测探针以便它们的检测靶向序列中的至少一些是非连续的，例如它们由至少约500个核苷酸(如约550、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个碱基中任何一个)分隔。检测靶向序列是无重叠的。

在一些实施方式中，5’检测探针和任何内部检测探针的5’端被磷酸化。在一些实施方式中，5’检测探针和任何内部检测探针的5’端未被磷酸化。

在一些实施方式中，多核苷酸检测探针中的每个的长度为约20至约200个核苷酸，例如长度为约20至约40、约40至约60、约60至约80、约80至约100、约100至约120、约120至约140、约140至约160、约160至约180、约180至约200个核苷酸。在一些实施方式中，探针连接之后，连接的检测序列的长度为至少约80至约400，包括例如约80至约120、约120至约160、约160至约200、约200至约300、约300至约400个核苷酸。连接的检测序列的长度使得该序列适合通过PCR、LAMP、Qβ复制酶或SDA反应扩增。在一些实施方式中，对于5’和3’检测探针CR的长度与NCR的长度之比为约0.5至约2。

在一些实施方式中，捕获延伸剂中的每个包括捕获序列(CS)和固定序列(IS)，其中捕获序列与靶标核酸的区域互补以及固定序列与靶标核酸的任何区域不互补并包括与捕获探针的部分互补的序列，如图2中所描绘的。在一些实施方式中，捕获延伸剂的固定序列是共用的，并且可与对不同靶标核酸序列特异的不同捕获序列组合，允许使用可与每个捕获延伸剂杂交的单个捕获探针。在一些实施方式中，固定序列可直接连接至捕获序列或由中间的非互补序列与其隔开。在一些实施方式中，如需要，捕获延伸剂可包括其它非互补序列。这些非互补序列不应阻碍捕获或固定序列与它们的靶标杂交或引起非特异杂交发生。在一些实施方式中，设计靶向单个核酸的捕获延伸剂，以便它们的捕获靶向序列中的至少一些是连续的(如相邻的)，例如它们由不超过约500个核苷酸(如约0、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸中任何一个)分隔。在一些实施方式中，设计靶向单个核酸的捕获延伸剂，以便它们的捕获靶向序列中的至少一些是非连续的，例如它们由至少约500个核苷酸(如约550、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个碱基中任何一个)分隔。捕获靶向序列是无重叠的。

在一些实施方式中，多核苷酸捕获延伸剂中的每个的长度为约50至约300个核苷酸，例如长度为约50至约70、约70至约90、约90至约110、约110至约130、约130至约150、约150至约200、约200至约300个核苷酸。在一些实施方式中，捕获延伸剂中捕获序列的长度与固定序列的长度之比为约0.5:1至约2:1，包括例如约0.5:1至约1:1、约1:1至约1.5:1、约1.5:1至约2:1。

在一些实施方式中，本文描述的捕获探针包括与捕获延伸剂的固定序列互补的序列。在一些实施方式中，捕获延伸剂中的每个包括共用的固定序列，和提供单个捕获探针，其包括与共用的固定序列互补的序列。在一些实施方式中，提供a)多个捕获延伸剂，每个包括不同的固定序列，和b)多个捕获探针，每个包括与不同的固定序列中的一个互补的序列。在一些实施方式中，捕获探针以允许随后与相应的捕获延伸剂杂交的方式结合至固体载体。捕获探针与结合至靶标核酸的捕获延伸剂的杂交导致靶标核酸连同任何杂交的检测探针与固体载体的缔合。

在一些实施方式中，提供：a)包括5’捕获序列和3’固定序列的捕获延伸剂和经设计以在5’端连接至固体载体的相应捕获探针，如图2A所描绘的，或b)包括3'捕获序列和5'固定序列的捕获延伸剂和经设计以在3’端连接至固体载体的相应捕获探针。在一些实施方式中，提供a)和b)，如图2B所描绘的。

将理解，两个核酸序列的杂交无需所述序列之间的完全互补。因此在本发明的方法中任何一个的一些实施方式中，检测探针和捕获延伸剂的靶标结合序列不必具有与它们的靶标核酸序列的完全互补性。在一些实施方式中，捕获延伸剂的固定序列不必具有与相应的捕获探针中的序列的完全互补性。在一些实施方式中，异源双链体将满足这样的情况：少于约20％的碱基(如少于约20、15、10或5％的碱基中任何一个)是错配，忽略五个或更多个核苷酸的环。因此在一些实施方式中，检测探针和/或捕获延伸剂包括与靶标核酸中它们的相应靶标序列少于约20％(如少于约20、15、10或5％中任何一个)的碱基对错配。在一些实施方式中，捕获延伸剂包括固定序列，固定序列包括与相应的捕获探针中它们的靶标序列少于约20％(如少于约20、15、10或5％中任何一个)的碱基对错配。在其它实施方式中，如当使用变异特异的检测探针(如突变特异的检测探针)时，具有100％互补性——即，无碱基对错配——的同源双链体是期望的。

在一些实施方式中，提供a)多个检测探针，以便靶向单个核酸的检测探针的检测靶向序列是连续的和无重叠的，和b)多个捕获延伸剂，以便靶向单个核酸的检测探针和捕获延伸剂的检测靶向序列和捕获靶向序列是无重叠的。在一些实施方式中，提供a)多个检测探针，以便靶向单个核酸的检测探针的检测靶向序列是连续的和无重叠的，和b)多个捕获延伸剂，以便靶向单个核酸的检测探针和捕获延伸剂的检测靶向序列和捕获靶向序列是连续的和无重叠的，如图2中所描绘的。在一些实施方式中，捕获靶向序列不在检测靶向序列之间。与检测探针和捕获延伸剂的序列互补的靶标核酸区域的连续安排允许增加靶标核酸复合物捕获的效率。这是因为1)由于相邻的碱基配对之间的碱基堆积作用(Dimitrovand Zuker,Biophys.J.87(1):215-226,2004)，即由于碱基堆积作用，相邻探针和靶标之间的相互作用导致更强的、更稳定的螺旋形成，一个捕获延伸剂/检测探针与靶标的杂交将促进相邻捕获延伸剂/检测探针与靶标的杂交，且产生的双螺旋比单个捕获延伸剂/检测探针与靶标的杂交形成的双螺旋更稳定；和2)一个捕获延伸剂与捕获探针的杂交将使邻近的捕获延伸剂接近附近的捕获探针用于进一步杂交和与捕获探针结合的固体载体的缔合，因此增加检测测定的灵敏度。这种构型的增加的热动力稳定性将有利于杂交的靶标核酸复合物与多个捕获延伸剂的结合，因此增加相对于与少于全组捕获延伸剂杂交的脱靶标核酸的区别，导致增加的检测测定的特异性。这对于其中单个反应中多个靶标可被检测的多重PCR反应是特别期望的。

在本发明的方法中任何一个的一些实施方式中，该方法进一步包括提供：a)超过两种检测探针；和/或b)超过两种捕获延伸剂，增加与靶标核酸互补的检测探针和捕获延伸剂的总特异序列，和从而提供甚至更高的捕获效率。

本发明的进一步方面提供一种或多种捕获延伸剂，如上面所描述的那些，以及单个检测探针，也称作环化检测探针，其与靶标核酸杂交并在它的游离末端连接之后环化，如图3A所示。在一些实施方式中，设计环化检测探针以便与靶标核酸序列互补的探针区域位于探针的每一端。在一些实施方式中，当环化检测探针与靶标杂交时，它的末端彼此相邻放置，导致与连接剂如连接酶连接之后闭合的环状分子的形成。该环状分子，也称作连接的检测序列，或更具体地，环化的连接的检测序列，然后可在扩增步骤，例如PCR、RCA期间充当模板。

进一步考虑使用多个检测探针，其可被连接以形成单个共价闭合的连接的检测序列。在本文呈现的方法中任何一个的一些实施方式中，所述多个检测探针(在本文称作环化检测探针)包括：a)一个或多个内部检测探针，其与靶标核酸的区域杂交；和b)额外的检测探针，包括i)与靶标核酸的区域互补的3'末端，该靶标核酸的区域为与内部检测探针互补的靶标核酸区域的下游；和ii)与靶标核酸的区域互补的5'末端，该靶标核酸的区域为与内部检测探针互补的靶标核酸区域的上游，通过多个连接事件其可形成单个共价闭合的连接的检测序列，如图3B所描绘的。在一些实施方式中，两种连接酶，例如酶促和化学连接酶，用于使环化检测探针共价闭合，其中连接的顺序被控制。

因此，在本文呈现的方法中任何一个的一些实施方式中，所述方法进一步包括设计检测探针为环化检测探针。

本发明的另一个实施方式提供减少利用环化检测探针的扩增方法中的遗留污染和背景的方法。目前的能够连接的扩增方法，不像常规的扩增方法，涉及连接的检测序列而不是靶标核酸的扩增。当连接的检测序列是闭合的环状分子时，它没有易受外切核酸酶消化的游离端。环化检测探针连接，即环化之后，用外切核酸酶处理反应混合物提供"清理"步骤和因此通过消化未连接的检测探针和其它线性DNA片段但不是闭合的环状分子而减少背景和遗留污染。环化的检测序列保持完整，用于随后的扩增和检测。在常规PCR中，使用外切核酸酶消除单链引物或遗留DNA片段引起靶标核酸也将被降解的风险。本发明没有遭受这种风险，因为靶标核酸未被扩增。在优选实施方式中，外切核酸酶是外切核酸酶III、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶或核酸酶BAL-31。外切核酸酶在连接之后和扩增之前加入反应，以及例如在37℃温育三十分钟。

因此，在本文呈现的方法中任何一个的一些实施方式中，所述方法进一步包括：a)设计检测探针为环化检测探针；和b)环化检测探针连接之后，但在连接的检测序列扩增之前，使用本领域已知的任何方法通过外切核酸酶处理来消化未连接的环化检测探针和其它线性核酸。

在一些实施方式中，环化的连接的检测序列也可通过大的聚合物的产生而被扩增和检测。在一些实施方式中，聚合物通过以下产生：a)第一引物沿着环化的连接的检测序列滚环延伸和下游序列的置换，产生包括多单元的连接的检测序列的单链DNA，其中每个单元充当随后扩增的模板；和b)第二引物与单链DNA聚合物的结合和延伸。通过使用引物延伸/置换和PCR，用相同循环数产生更加可检测到的产物。

在一些实施方式中，与靶标核酸互补的检测探针和捕获延伸剂的序列每个长度为约15至约60个核苷酸，优选长度为约18至约35个核苷酸，其提供用于探针与靶标核酸充分杂交的足够长度。它们被设计以与靶标核酸的不同序列杂交。该序列可基于许多种考虑来选择。在一些实施方式中，取决于靶标核酸的性质，与靶标核酸互补的检测探针和捕获延伸剂的序列包括选自共有序列、与多态性相关的序列、对具体表型或基因型特异的序列、对具体菌株特异的序列等的序列。

在一些实施方式中，连接的检测序列的引物结合部位包括富G-C序列，其在与引物杂交后，如下面所讨论的，提供更稳定的双链体分子，即，需要较高的温度来变性的双链体分子。在一些实施方式中，包括富G-C引物结合部位的连接的检测序列可使用双温PCR反应来扩增，其中引物杂交和延伸均可在约60至约65℃的温度进行(与在通常用于PCR扩增的较低温度杂交相反)和在约92℃的温度变性，如下面所讨论的。双温反应的使用减少每个PCR扩增循环的长度和导致较少的测定时间。

在一些实施方式中，检测探针和捕获延伸剂与预期摩尔的靶标核酸之比将每个为至少化学计量的和优选过量的。在一些实施方式中，它将在约2:1至约10,000:1的范围内。在一些实施方式中，每种探针的浓度可在约10^-9至约10^-6M的范围，靶标核酸浓度在约10^-18至约10^-10M变化。

用于本方法的PCR引物可通过已知的自动化合成技术从三磷酸核苷合成，如上面针对多核苷酸探针的合成而讨论的。在一些实施方式中，PCR引物的长度可为约10至约60个核苷酸，优选长度为约18至约35个核苷酸，长度为约16至约21个核苷酸最优选。还优选引物被设计以便它们不具有任何二级结构，即，每个引物自身内不含有互补区域——其可导致自身退火。

在一些实施方式中，PCR引物和连接的检测序列的PCR引物结合部位的高G-C含量允许在双温进行PCR反应，而不是通常的三温方法。

PCR和RT-PCR反应

在一些实施方式中，本文描述的PCR和RT-PCR反应混合物可包括dNTP、引物、热稳定的DNA聚合酶、和/或缓冲剂。

在一些实施方式中，可使用的DNA聚合酶包括但不限于Taq、Pfu、Vent、和Sequitherm DNA聚合酶(EPICENTRE)。

在一些实施方式中，PCR和RT-PCR反应混合物可获自商业上可用的试剂盒，例如，PCT试剂盒、实时PCR试剂盒、一步RT-PCR试剂盒或一步RT-qPCR试剂盒。

在一些实施方式中，合适的缓冲剂可用于维持PCR反应的pH，例如，可使用两性离子缓冲剂如Tricine、HEPES、和Bicine或可使用非两性离子缓冲剂如Tris。在一些实施方式中，缓冲剂可通过包括多种盐和添加物来优化，包括氯化镁、氯化钾、硫酸铵、明胶、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、聚胺、甜菜碱、氯化四甲铵(TMAC)、和二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施方式中，也可使用非还原糖如海藻糖、蔗糖和棉子糖和两性离子表面活性剂如CHAPS。

用于本发明方法中任何一个的引物对可基于检测探针的非互补区域(NCRs)来设计。在一些实施方式中，引物对将是共用的引物对，对应于存在于由于与它们的靶标核酸杂交的检测探针的连接而形成的多个连接的检测序列中的共用引物结合部位。在一些实施方式中，引物，例如用荧光染料标记，以容易检测。

PCR扩增的连接的检测序列可通过本领域已知的任何方法来检测，其可包括，例如实时PCR、荧光检测、凝胶电泳、测序、MALDI-TOF质谱法如MassARRAY测定、微阵列杂交测定或执行相似功能的其它方法。

在一些实施方式中，实时PCR反应可用双链DNA结合染料，例如SYBR Green或EvaGreen来检测。在一些实施方式中，实时PCR产物通过将荧光标记，例如Cy3、Cy5、荧光素、罗丹明、罗丹明红、TET、或其它荧光分子掺入引物中来检测。

在一些实施方式中，含有5’荧光报道分子和3’猝灭剂的双标记探针用于增加实时PCR反应的灵敏度。在一些实施方式中，荧光报道分子是Cy3、Cy5、荧光素、罗丹明、罗丹明红、TET或其它荧光分子。在一些实施方式中，使用的猝灭剂包括BHQ-1、TAMRA、BHA-2、BHQ-3和其它猝灭分子。在一些实施方式中，含有5’荧光报道分子和3’猝灭剂和形成发夹结构的双标记探针用于增加实时PCR的灵敏度。

在本发明的方法中任何一个的一些实施方式中，连接的检测序列的扩增和检测包括：a)使用RT-qPCR来扩增连接的检测序列，其中测定Ct值；和b)比较测定的Ct值与预定的阈值Ct，其中低于预定的阈值的Ct值指示样品中连接的检测序列的存在。在一些实施方式中，阈值Ct设为40。在一些实施方式中，阈值Ct是约35、36、37、38、39或40中任何一个。在一些实施方式中阈值Ct实验地设为对照反应的Ct，其中所有的反应条件，包括试剂浓度和循环温度，与测试反应相同，除了已知缺少靶标核酸外。

PCR的变型已被开发和可用于本发明。在一些实施方式中，使用两组引物和两个连续的PCR运行来嵌套PCR反应以增加特异性。可选地，在一些实施方式中通过添加多组引物至反应，PCR反应被多重化。

在一些实施方式中，引物退火至连接的检测序列在约37至约50℃进行；在存在三磷酸核苷的情况下通过Taq聚合酶延伸引物序列在约70至约75℃进行；和释放延伸的引物的变性步骤在约90至约95℃进行。在一些实施方式中，使用双温PCR技术，并且退火和延伸步骤均在约60至约65℃进行，因此减少每个扩增循环的长度和导致较少的测定时间。

例如，合适的三温PCR扩增(如Saiki et al.,Science 239:487-491,1988所提供的)可如下进行：

聚合酶链反应(PCR)在含有0.01至1.0ng的模板连接的检测序列、10至100pmol的每个共用引物、1.5单位的Taq DNA聚合酶(Promega Corp.)、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dTTP、15mM MgCl2、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、50mM KCl、1μg/ml明胶、和10μl/ml Triton X-100(Saiki,1988)的约25-50μl样品中进行。反应在94℃温育1分钟，约37至约55℃温育2分钟(取决于引物的特性)，和约72℃温育3分钟和重复30-40，优选35个循环。每个反应的4μl等分部分由通过2％琼脂糖凝胶的电泳来分析，并且样品中的DNA产物通过用溴化乙锭染色凝胶来可视化。

双温PCR技术，如上面所讨论的，与上面的区别仅在于在单个温度，例如约60至约65℃约5分钟而不是在两个温度进行退火/延伸步骤。例如，连接的检测序列可通过实时定量PCR通过以下来检测：添加含有1X

Premix Ex(Takara,RR820)和100nM引物的25ulPCR混合物至含有如本发明的方法中任何一个所述制备的连接的检测序列的微孔板的每个孔，在Roche LC480II上使用在95℃30sec的最初变性步骤，之后在95℃变性5sec和在60℃退火20sec的45个循环来扩增和检测。

待检测的病原体

本文描述的方法可用于诊断疾病，例如与本文描述的病原体中任一个相关的疾病。在一些实施方式中，个体不具有该疾病的症状。

可被诊断的疾病的实例包括但不限于：疟疾，例如通过检测疟原虫属(genusPlasmodium)的原生动物；肝炎，例如通过检测甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎病毒；HIV感染，例如通过检测人免疫缺陷病毒；疱疹，例如通过检测单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型；单核细胞增多症，例如通过检测Epstein-Barr病毒；睡眠病，例如通过检测锥虫；水痘，例如通过水痘带状疱疹病毒检测,麻疹和腮腺炎，通过检测副粘病毒科病毒、葡萄球菌感染或中毒性休克综合征，通过检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、气性坏疽，通过检测产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、结膜炎，通过检测埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、百日咳，通过检测百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、肺结核，通过检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、军团病，通过检测嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、炭疽感染，通过检测炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、梅毒，通过检测苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱，通过检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒，通过检测伤寒沙门菌(S.Typhi)、消化性溃疡病，通过检测幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、破伤风，通过检测破伤风杆菌(Clostridum tetani)、肉毒中毒，通过检测肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、莱姆病，通过检测伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(B.Garinii)和阿氏疏螺旋体(B.afzelii)、和流感，通过检测H5N1、H1N1、H3N2、H7N9和其它病毒。

使用本文描述的方法可检测的病原体包括，但不限于，细菌、真菌、病毒、古细菌、原生生物、原生动物和孢子。在一些实施方式中，病原体是热稳定的。

在一些实施方式中，病原体是原生动物。示例的原生动物包括，但不限于，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、布鲁斯锥虫(Trypanosoma brucei)、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、和鼠弓形虫(Toxoplasmagondii)。

在一些实施方式中，病原体是病毒。示例的病毒包括，但不限于，HIV-I、HIV-2、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、埃博拉病毒、西尼罗病毒、和疱疹病毒如HSV-2、腺病毒、登革热血清型1至4、埃博拉、肠病毒、单纯疱疹病毒1型或2型、流感、日本马脑炎(Japanese equine encephalitis)、诺沃克(Norwalk)、乳头瘤病毒、细小病毒B19、风疹、麻疹、牛痘、水痘、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、人类疱疹病毒6、人类疱疹病毒7、人类疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、流感病毒B、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、Rous肉瘤病毒、黄热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、Sindbis病毒、人T细胞白血病病毒1型、汉他病毒、风疹病毒、猴免疫缺陷病毒、H3N2病毒、H5N1病毒、H1N1病毒和其任何组合。

在一些实施方式中，病原体是流感病毒。流感病毒可被分成三组：A型流感、B型流感、和C型流感。A型和B型流感病毒引起季节性流行病。A型流感病毒根据它们的血凝素(HA)类型和它们的神经氨酸酶(NA)类型来表征。有17种不同H抗原(H1至H17)和10种不同N抗原(N1至N10)，总共170种不同的可能组合。此外，每个类型内有含有遗传变异的菌株。在每个流行季节，不同流感变体在人群中流通，这可导致基因交换和可导致新的和更多病原变体。因此监测和能够检测和诊断流感病毒型和亚型具有极其重要的重要性。

A型流感病毒可感染人类、鸟类、猪、马、犬、鲸、海豹和猫。鸟类是A型流感病毒的无症状携带者。此外，A型流感病毒的一些株可在不同物种之间传播，例如从猪或鸟类到人类。因此期望本病原体检测方法可用于检测人类以及动物中的流感感染。

H1N1病毒是一类A型流感病毒。H1N1是季节性流感的主要原因，其每年影响大约15％的全球人口。此外，H1N1病毒已引起几种主要的流行病和大流行病。例如，1918-19的流感流行是最具破坏性的流感爆发，已估计杀死2千5百万人，并且由H1N1病毒引起。在2009年，发生了另一次H1N1爆发，在猪开始，并蔓延到全世界，引起大流行病。

H7N9和H5N1也是流感A型禽流感病毒。H7N9病毒首先在2013年4月在中国报道并已在鸟类和人类中被报道。尽管有许多例与禽暴露相关的H7N9病毒感染，但是尚未有持续向前的病毒传播给其它人的证据。尽管先前H7亚型禽流感病毒的感染是轻的，但是新的H7N9株已导致超过40人死亡。具有确认的H7N9感染的患者的临床所见包括高热、无痰干咳和痰咳、呼吸短促、呼吸困难、缺氧、胸成像上记录的下呼吸道模糊的证据、固结和浸润。H7N9病毒的并发症包括脓毒性休克、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、难治的低氧血症、急性肾功能障碍、多器官功能障碍、横纹肌溶解、脑病、以及细菌和真菌感染。

流感病毒可通过靶向HA或NA基因的探针来检测。探针可被设计以扩增种型。例如H1通用探针可用于检测禽、猪和人源的H1病毒。可选地，探针可被设计以特异地检测病毒亚型。例如，靶向人源的H1N1探针可被设计，其将不靶向猪源的H1N1病毒。作为另一个实例，可使用核苷酸125和302之间的HA基因片段，并且可设计可在大流行和季节性H1N1株之间区分的探针。可利用相似的方法来检测其它流感株和亚型。

在一些实施方式中，病原体是真菌或酵母。示例的真菌和酵母包括，但不限于，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、类星形念珠菌(Candida stellatoidea)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、维斯念珠菌(Candida viswanathii)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、劳伦梯隐球菌(Cryptococcuslaurentii)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、加特隐球酵母(Cryptococcusgattii)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、耶氏肺囊虫(Pneumocystisjirovecii)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carini)、葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、和其任何组合。

在一些实施方式中，病原体是细菌。示例的细菌包括但不限于：炭疽、弯曲杆菌(Campylobacter)、霍乱、白喉、产肠毒素大肠杆菌、贾第虫(giardia)、淋球菌(gonococcus)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌B(Hemophilusinfluenza B)、未分型的流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza non-typable)、脑膜炎球菌(meningococcus)、百日咳(pertussis)、肺炎球菌(pneumococcus)、沙门氏菌(salmonella)、志贺菌(shigella)、链球菌B(Streptococcus B)、A组链球菌(group AStreptococcus)、破伤风(tetanus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、耶尔森菌(yersinia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌种(Pseudomonas species)、梭状芽胞杆菌种(Clostridia species)、结核分枝杆菌(Myocobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、布鲁杆菌种(Brucella species)、嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)、立克次体(Rickettsiae)、魏氏梭菌(Clostridium peifringens)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)、和其任何组合。

在一些实施方式中，病原体是植物病原体。示例的植物病原体包括，但不限于，例如，黑曲霉菌(Aspergillus niger)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides)、青霉菌某种(Penicillium spp.)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、李痘病毒(plum poxvirus)、拟茎点霉(Phomopsis viticola)、梨水疫病欧文氏菌(Erwinia amylovora)、菊花褪绿斑驳类病毒(chrysanthemum clorotic mottle viroid)、菊花矮化类病毒(chrysanthemum stunt viroid)、马铃薯纺锤形块茎类病毒(potato spindle tuberviroid)、啤酒花潜隐类病毒(hop latent viroid)、鳄梨日斑病类病毒素(avocadosunblotch viroid)、番茄黄化类并素(tomato chlorotic viroid)、柑桔裂皮类病毒(citrus exocortis voroid)、椰子死亡类病毒(coconut cadang-cadang viroid)、椰子败生类病毒(coconut tinangaja viroid)、蕃茄雄株类病毒(tomato plant macho viroid)、柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、Cordana johnstonii、尖孢镰刀菌(Fusarium)、oxysporum、白锈菌(Albugo candida)、麦角菌(Claviceps purpurea)、柄锈菌(Puccinia coronata)、柑橘黑斑病菌(Guignardia citricarpa)、咖啡锈菌(Hemileiacoffeicola)、咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、棉根腐病菌(Phymatotrichopsis omnivora)、粒线虫属某种(Anguina spp.)、薄孔菌属某种(Antrodia spp.)、重蜜环菌某种(Armillaria spp.)、球二孢某种(Botryodiplodiaspp.)、葡萄座腔菌属某种(Botryosphaeria spp.)、尾孢某种(Cercospora spp.)、旋孢腔菌某种(Cochliobolus spp.)、Diaphorthe属某种、镰刀菌某种(Fusarium spp.)、异皮线虫某种(Heterodera spp.)、小球腔菌某种(Leptosphaeria spp.)、小球壳属某种(Mycosphaerella spp.)、粉孢子某种(Oidium spp.)、斜尖状孢子菌某种(Peronosporaspp.)、拟盘多毛孢属某种(Pestalotiosis spp.)、茎点霉某种(Phoma spp.)、疫霉某种(Phytophthora spp.)、假尾孢菌属某种(Pseudocercospora spp.)、Phythium属某种、柱隔孢某种(Ramularia spp.)、壳针孢某种(Septoria spp.)、外囊菌属某种(Taphrina spp.)、单胞锈菌某种(Uromyces spp.)、黑星菌某种(Venturia spp.)和黄单胞菌某种(Xanthomonas spp.)。

在一些实施方式中，病原体是食物病原体。示例的食物病原体包括但不限于，例如，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、大肠杆菌0157:H7(Escherichia coli 0157:H7)、兰伯贾第虫(Escherichia coli 0157:H7)、甲型肝炎、戊型肝炎、单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、诺瓦克(Norwalk)或诺瓦克样病毒(Norwalk-like virus)、诺如病毒(norovirus)、沙门菌某种(Salmonella spp.)、葡萄球菌某种(Staphylococcus spp.)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、弧菌某种(Vibrio spp.)、耶尔森菌某种(Yersinia spp.)、杯状病毒(calciviruses)、札幌病毒(Sapporo virus)、轮状病毒(rotavirus)、星状病毒(astrovirus)、麦角真菌(ergot fungus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、麦角菌某种(Clavicepsspp.)、毛线虫(Trichinella)、禽流感(Avian influenza)、链球菌某种(Streptococcusspp.)、布鲁菌某种(Brucella spp.)、溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、类志贺毗邻单胞菌(Pleisomonas shigelloides)、温和气单胞菌(Aeromonas sobira)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、和其它。

试剂盒和装置

本文还提供用于进行本文描述的方法中任何一个的试剂盒。例如，在一些实施方式中，提供试剂盒，其包括：1)多个捕获延伸剂，2)多个检测探针；和3)多个捕获探针。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括固体载体。在一些实施方式中，捕获探针固定在固体载体上。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括一组或多组用于PCR扩增的引物。

试剂盒可进一步包括，例如，用于进行本发明的裂解和杂交步骤的反应混合物。在一些实施方式中，试剂盒包括裂解混合物，如例如，包括约10至约20mM Tris-HCl(如约15mMTris-HCl)、约130至约170mM NaCl(如约150mM NaCl)、约0.5至约2mM EDTA(如约1mMEDTA)、和约0.5至约2％Triton X-100(如约1％Triton X-100)的溶液。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包括约0.5至约2mM EGTA(如约1mM EGTA)。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包括约0.5至约3mg/ml蛋白酶K(如约1.5mg/ml蛋白酶K)。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包括探针混合物，其包括检测探针和捕获延伸剂。

在一些实施方式中，检测探针和捕获延伸剂靶向单个靶标核酸。在一些实施方式中，检测探针和捕获延伸剂靶向多个不同靶标核酸。在一些实施方式中，试剂盒包括可与固体载体缀合的捕获探针。在一些实施方式中，试剂盒包括与固体载体，如96孔板中孔的表面缀合的捕获探针。在一些实施方式中，试剂盒包括可与捕获探针缀合的珠。在一些实施方式中，试剂盒包括与捕获探针预先缀合的珠。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括进行本文描述的方法中任何一个的说明书。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括阳性或阴性对照样品。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括针对生物样品中对照核酸的检测探针和捕获延伸剂的对照组。

实施例

提供以下实施例来说明但不是限制本发明。

实施例1：针对来自中国当地居民和归来的旅行者的混合的干血斑中疟原虫的灵敏、低成本的活性分子筛选

材料和方法

来自研究组的现场样品

血涂片和干血斑从2013年5月至10月采集自两个组。第一组(n＝505)来自中国云南秋山(Qiushan)，包括226名当地居民和279名小学儿童。虽然在过去的6个月里两名儿童已被诊断有间日疟原虫感染，但是在取样日该研究中测试的人没有显示疟疾相关的症状。该组的全血液样品本采集在EDTA或肝素管中和在-20℃储存直到实时PCR测试。第二组(n＝2855)来自中国云南腾冲和安徽肥东，由当地患者和从疟疾流行环境返回的旅行者(n＝560)组成。

采集样品伴有书面知情同意。伦理批准由中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会授予。

通过能够连接的PCR检测18S rRNA

DBS的3mm直径穿凿样(punched-out)圆在56℃伴随剧烈震动用100μl裂解混合物(中国北京的Diacurate Inc)、191μl水、3μl探针混合物——检测探针1(SEQ ID NO：1)、检测探针2(SEQ ID NO：2)、内部检测探针(SEQ ID NO：3)、捕获延伸剂1(包括捕获序列1，SEQID NO：4，可操作地连接至与捕获探针的17个碱基互补的序列)、捕获延伸剂2(包括捕获序列2，SEQ ID NO：5，可操作地连接至与捕获探针的17个碱基互补的序列)和捕获延伸剂3(包括捕获序列3，SEQ ID NO：6，可操作地连接至与捕获探针的17个碱基互补的序列)，每个对疟原虫某种18S rRNA特异——和3μl蛋白酶K(50mg/ml)裂解30min(混合的血斑作为单个穿孔(punch)裂解)。然后将裂解物转移至与捕获探针(疟疾PAN HT-PCR筛选1.0试剂盒，中国北京的Diacurate Inc)预先缀合的96孔板。在55℃过夜温育之后，每个孔用150μl洗涤缓冲剂(中国北京的Diacurate Inc)洗涤3次，然后与50μl连接缓冲剂(中国北京的DiacurateInc)在37℃温育30分钟。然后将板再次相似地洗涤，和用于实时qPCR，25μl/孔PCR混合物——含有1x

Premix Ex(Takara,RR820)和100nM引物(PCR引物1，SEQ ID NO：7和PCR引物2，SEQ ID NO：8)。扩增和检测在Roche LC480II上在以下条件下进行：在95℃30s，以及在95℃5s和在60℃20s的45个循环。使用默认设置从65℃至90℃制作解链曲线(meltcurve)。如果Ct<40和解链曲线与阳性对照中的相同，则认为样品为阳性。至少一个阳性对照和一个阴性对照包括在每个实验中。每个测试一式两份地(in duplicate)进行。

通过RDT的诊断

该研究中每个样品的RDT测试根据制造商的协议用CARESTART^TM(Accessbio,Monmouth Junction,NJ)进行。试剂盒在W.H.O.发行的RDT采购推荐的名单之中。(W.H.O.,Information note on recommended selection criteria for malaria rapiddiagnostic test,http://www.who.int/malaria/diagnosis_treatment/diagnosis/RDT_selection_criteria.pdf)。

通过标准的实时qPCR的诊断

DNA用QIAamp DNA血微型试剂盒(QIAGEN)，根据制造商的说明书从200μl解冻的血液或干血斑提取。疟原虫属18s rRNA筛选引物、探针序列和实时qPCR条件获自Rougemontet al(Rougemont et al.,J.Clin.Microbiol.42(12):5636-43,2004)。如果Ct大于40，则认为样品是阴性的。对于每个实验，包括至少一个阳性和一个阴性样品。每个样品一式两份地测试。

混合体大小(Pool size)

为了测定能够连接的PCR检测混合的干血斑中靶标RNA的能力，我们通过将75μl培养的恶性疟原虫株3D7(50个寄生虫/μl)、或来自健康志愿者的全血在Whatman 3MM滤纸上弄上斑点，和风干4小时，制备了对照。将直径3mm的穿孔从阳性对照恶性疟原虫斑点和阴性对照干血斑移除，1个阳性对照穿孔与0、10、20、25或35个阴性对照穿孔组合。混合的穿孔使用标准的裂解方案裂解和使用能够连接的PCR一式两份地测试。

应用于活性筛选的混合策略

我们采用矩阵混合策略。所有的样品在n×m矩阵(n＝m或n＝m+1,m由样品大小决定)中随机分布，样品根据行和列来混合，混合体通过能够连接的PCR来测试。以这种方式，每个样品在行混合体中测试一次和在列混合体中测试一次。在阳性行和列混合体的交叉处的样品再单独测试，并且所有其它的宣告为阴性。每个测试一式两份地进行。

结果

能够连接的PCR的分析性能

我们首先制备了新鲜人红细胞培养的恶性疟原虫(隔离群3D7)的3倍、11个点连续稀释物，范围是70p/μl至0.0012p/μl。检测限确定为产生阳性结果的添加到健康人血的最小量的红细胞培养的恶性疟原虫。测定给出了约0.01个寄生虫/μl的检测限，信号与寄生虫数目成比例(R²＝0.996)(图4，标准曲线)，指示我们的测定是高度敏感的，和能够在完整样品中定量低寄生虫血症。采集自健康志愿者的全血液样品本用作阴性对照。

在不同温度储存的干血斑中疟原虫18S rRNA的稳定性

我们通过以下模拟了在现场干血斑的采集：将培养的恶性疟原虫(50p/μl)以75-μl等分部分在Whatman 903滤纸上弄上斑点，风干4小时，密封在具有干燥剂的塑料袋中，和储存在室温、4℃或-20℃直到使用。在第3、6、12和21天，一个3mm直径的穿孔从不同储存的干血斑中的每个移除和进行细胞裂解。测试之前将裂解物储存在-20℃。我们先前的研究指出这样的裂解物中的RNA在-20℃超过3个月是稳定的(Cheng et al.,J.Clin.Microbiol.51(1)：125-30,2013)。所有的裂解物在第21天通过RNA杂交试验来平行测定。没有观察到显著的18S rRNA降解(图5，储存和信号)。

混合体大小

虽然阳性DBS与阴性DBS的混合没有显著减小检测信号(图6，混合体大小)，但是超过20个穿孔的混合使得用移液器吸取足够的裂解物进行重复试验变得困难。大混合体的第二洗脱只给出减小的信号(图6，混合体大小)。虽然离心可用于更有效地回收裂解物，但是这可将复杂性添加至试验和潜在地引起交叉污染。小于20的混合体大小因此被鉴定为最优策略。对于在本研究中进行的活性疟疾筛选，在DBS样品分批到达我们的实验室的情况下，为了提供及时的诊断结果，一旦收到足够的数量，就测试样品以允许15和20之间的混合体大小的矩阵混合策略。

针对疟疾的活性筛选

对于505个无症状个体的组，使用全血液样品本，显微镜检查没有检测到任何感染，而RDT检测到三个。使用混合的DBS，LE-PCR检测到四个阳性样品，不同于通过RDT检测的那些(表1)。所有7个阳性DBS样品来自儿童。7个相应的全血液样品也通过标准的实时qPCR来检测，给出与能够连接的PCR相同的结果。3个月之后的随访和医疗史回顾也指示能够连接的PCR诊断比RDT提供的那些诊断更可靠：取样日之后没有RDT-阳性儿童显示疟疾相关的症状，虽然1个月之前他们中有一个具有疟疾相关的症状，并且取样之后10天能够连接的PCR-阳性儿童其中有一个发展了疟疾相关的症状和由当地CDC证实具有间日疟原虫感染。剩下的3个能够连接的PCR-阳性儿童在取样日之后2个月内发展了疟疾相关的症状。由于极端受限的当地医疗资源，他们转向私人医疗保健机构进行治疗，而没有进行任何疟疾测试。

表1

对于第二组受试者，我们检测了来自2855个DBS的10个感染，其中8个是返回的旅行者，而2个是当地居民。这些结果与对全血样品的显微镜检查一致。10个阳性样品也通过实时qPCR测试：7个证明是间日疟原虫感染，2个是恶性疟原虫感染和1个是混合感染。

讨论

为了努力消除疟疾，疟疾监测系统的目的是通过足够早地检测和治疗所有的疟疾感染，不论有症状或没有症状的，包括当地传播和输入感染，来停止当地传播(Cotter etal.,Lancet 382(9895)：900-11,2013；W.H.O.,World Malaria Report 2013)。这使针对全体有危险的群体的活性疟疾筛选而不是传统的诊所被动诊断成为必要。W.H.O.最近提出在消除阶段，所有的实验室诊断服务应对患者免费(W.H.O.,Disease Surveillance formalaria elimination:An operational manual,2012)。对能够以低成本和高通量方式检测非常低水平感染的诊断方法的需求从未如此强烈。

在我们先前的工作中描述的疟原虫18S rRNA杂交试验显示比RDT和标准实时qPCR更好的灵敏度和通量(Cheng et al.,J.Clin.Microbiol.51(1)：125-30,2013)，提供在发达国家疟疾大规模筛选的理想的备选。然而，对于大多数疟疾消除努力集中的资源有限的地区，杂交试验的成本可呈现问题。该研究中描述的能够连接的实时qPCR方法通过显著减少需要的多核苷酸探针的数目和通过用常用的基于SYBR绿的实时qPCR代替昂贵的分支DNA检测而具有与先前的RNA杂交试验相比几乎90％减少的成本，同时保留检测灵敏度和高样品通量和维持相似的样品处理工作流程。它能够以96孔板形式检测恶性疟原虫的18SrRNA，全血中检测阈值低至0.01p/μl，并且不需要RNA纯化或反转录。每个测试(包括副本(duplicate))总成本少于2美元，而其它基于RNA/DNA的诊断方法仅仅针对RNA/DNA制备程序就可花费更多。

如本研究所描述的矩阵混合策略的实行允许成本的进一步减少，同时提高样品通量。不像更早的利用混合策略的疟疾测试(Taylor et al.,J.Clin.Microbiol.48(2):512-9,2010；Hsiang et al.,J.Clinc Microbiol.48(10):3539-43,2010)，当与DBS的混合组合时LE-PCR显现不牺牲任何灵敏度；针对多达36个的混合体大小，随着增加与单个低寄生虫血症的样品混合的阴性样品的数目，Ct值保持几乎恒定。这不是令人惊讶的，因为阴性样品的混合没有减少裂解混合物中阳性样品的浓度，并且在过夜杂交期间LE-PCR优先保持靶向的RNA。脱靶标的核酸在PCR模板形成之前被洗掉。以这种方式，每个混合体中的阴性样品很少影响阳性样品的检测。

在该研究中，针对无症状的个体的活性筛选，LE-PCR花费少于152美元(包括副本)以从505个样品检测中到所有4个感染。低传播区域的较大规模的筛选根据样品比率将产生甚至更低的成本，因为混合体大小可被增加，在更多的样品当中分摊每个测试的成本。这在第二组的活性筛选中被证明，在我们的策略使用小于400个测试从2855个DBS中检测到10个感染的情况下，与单独测试每个样品相比节省约86％的成本和劳动。

基于PCR的测试众所周知需要高水平的专门技术，以及难以避免的交叉/遗留污染。另一方面，LE-PCR没有遭受这些问题。我们让两个有很少分子诊断学经验的临床医师培训5天，他们就能够独立地使用矩阵混合策略进行LE-PCR。在LE-PCR中污染也是可容易避免的，因为靶标核酸和PCR模板均锚定到了板底部，直到实时qPCR过程开始，并且实时qPCR结束之后板没有打开就被丢弃。以这种方式，交叉污染和遗留污染均被避免。

当使用矩阵混合策略筛选大量样品时，在该研究中实行的LE-PCR变得格外具有时效性。当使用96孔板用ELISA样工作流程平行测试样品时，在每个运行中数千样品可由单个技师诊断。此外，LE-PCR适合自动化，其可进一步增加样品处理能力。

低流行环境中的亚明显感染(subpatent infections)可以是所有传播事件中20–50％的根源(Okell et al.,Nat.Commun.3：1237,2012)。在该研究中，LE-PCR在显微镜检查和RDT均未检测到的4名儿童中成功地检测到了无症状的感染，这些儿童中的一个在取样后10天内显示症状。如果基于LE-PCR的活性筛选变成每天的常规，它的3天周转时间将足以帮助像该儿童的无症状患者获得治疗，允许他们避免遭受疾病痛苦和有助于消除其它人重要的感染源头。

对没有疟疾感染的人开过量抗疟药仍然盛行，导致不必要的副作用和增加的抗药性风险(W.H.O.,World Malaria Report:2014；Sansom,.Lancet Infec.Dis.9(10):596,2009；W.H.O.,WHO informal consultation on fever management in peripheralhealth care settings:A global review of evidence and practice,2013)。经W.H.O.推荐(W.H.O.,WHO informal consultation on fever management in peripheralhealth care settings:A global review of evidence and practice,2013)，RDT已成功实行以排除许多寄生虫阴性的患者免于接受抗疟药(W.H.O.,World Malaria Report：2014)。然而，如在本研究所示，RDT不可足以停止抗疟药的过量开处方：对于本研究中的3个RDT-阳性儿童，通过标准的实时qPCR(Rougemont et al.,J.Clin.Microbiol.42(12):5636-43,2004)、RNA杂交试验(Cheng et al.,J.Clin.Microbiol.51(1):125-30,2013)和LE-PCR，他们被确定为寄生虫阴性的，指示RDT诊断学可不足以消除过量开处方。另一方面，LE-PCR显示0％假阳性率，如通过与使用标准的实时qPCR的诊断相比所测定的，并且如果作为针对疟疾检测的常规活性筛选诊断学实行，可显著减少过量开处方的可能性。

作为全世界疟疾根除努力的一部分，在资源有限、有危险的地区，当地传播或输入的疟疾感染的鉴定现在可使用如下的策略进行：首先，干血斑由当地疾病控制机构在活性筛选中采集和通过邮件送到中心临床实验室；然后实验室用混合策略使用能够连接的实时qPCR以96孔板形式逐批测试样品(单个运行中一个技师可容易处理对来自数千个个体的混合样品的数百个试验)；阳性样品在2至3天内被鉴定，并且可包括另外的天数用于使用标准的qPCR证实和种鉴定；结果通过网络化的快速通讯迅速反馈到当地和州监测机构。总周转时间应在一周内，提供实行有效干预策略的时间，因此最小化疾病的传播。

实施例2：非编码RNA的特异检测

为了监测培养的细胞中长的非编码RNA MALAT的水平，我们首先制备了裂解细胞的10倍连续稀释物，然后使用LE-PCR测试裂解物。使用34个细胞/孔至34400个细胞/孔的范围，试验显示Ct和细胞数之间良好的关联(R²＝0.96，图1)，证明该试验的定量性质。为了测定该试验的特异性，用对MALAT(FAM标记的)或GAPDH(HEX标记的)特异的taqman探针使用针对MALAT或GAPDH的LE-PCR探针进行实时qPCR。只有当使用MALAT捕获延伸剂与MALATtaqman探针，或当使用GAPDH捕获延伸剂与GAPDH taqman探针时检测到扩增(图7)。该结果显示该试验是高度特异的。还进行了使用混合组的探针的MALAT/GAPDH的多重检测(数据未显示)。

实施例3：A/B型流感和副流感病毒1的检测

用于检测A/B型流感和副流感存在的LE-PCR的阈值使用对应于每个病毒的体外转录的RNA的连续稀释物如在实施例1中针对恶性疟原虫所先前描述的那样来测定，并发现为低至每100ul反应7528个IVT-RNA分子(图8A、8B和8C)。

实施例4：来自鼻和咽拭子的检测

我们还用临床鼻和咽拭子样品测试了LE-PCR。鼻和咽拭子样本采集自流感患者(n＝13)。样品使用如实施例1中所描述的LE-PCR以及通过seeplexTMRV试剂盒(Seegene,Korea)来诊断。我们的LE-PCR试验具有与针对B型流感的seeplexTMRV试剂盒的结果80％的一致和针对A型流感的结果75％的一致。

实施例5：LE-PCR的工作流程

LE-PCR包括三个步骤。第一，样品处理：干的血液样品在一步骤中裂解以释放18SrRNA。第二，PCR模板形成：与样品裂解物过夜温育期间，捕获延伸剂和检测探针与疟原虫18S核糖体RNA的高度保守区中的连续序列杂交；捕获延伸剂的尾与预先缀合到96孔板中孔表面的捕获探针杂交，而检测探针的尾提供通用引物结合部位；未结合的探针被洗掉，而相邻彼此杂交的检测探针被连接以形成含有通用引物结合部位的单个ssDNA。第三，实时qPCR：先前步骤中形成的ssDNA连同通用引物用作PCR模板。参见图9。

序列

检测探针1

TGGAAGTATTTTAGACAAATGCTTTCTTTTTGGTCATAGCTGTTTCCTG(SEQ ID NO：1)

检测探针2

TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTTCGACGGTATCTGATCGTCTTCACT(SEQ ID NO：2)

内部检测探针

CCCTTAACTTTCGTTCTTGATTAA(SEQ ID NO：3)

捕获序列1

TCTAAGAATTTCACCTCTGACATCTG(SEQ ID NO：4)

捕获序列2

GCAGTTGTTCGTCTCCAGAAAA(SEQ ID NO：5)

捕获序列3

TCGGCATAGTTTATGGTTAAGATTA(SEQ ID NO：6)

PCR引物1

TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：7)

PCR引物2

CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO：8)

Claims (20)

1.检测生物样品中靶标核酸的方法，包括：

a)通过多个捕获延伸剂捕获所述靶标核酸，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与相同靶标核酸上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将所述靶标核酸固定到所述固体载体；

b)使所述靶标核酸与多个检测探针接触，其中所述多个检测探针中的每个包括与所述相同靶标核酸相同链上的区域杂交的序列，其中所述多个检测探针包括5’检测探针和3’检测探针；

c)连接与所述靶标核酸杂交的所述多个检测探针以形成连接的检测序列；

d)扩增所述连接的检测序列；和

e)检测扩增的连接的检测序列。

2.权利要求1所述的方法，其中所述5’检测探针在其5’端被磷酸化。

3.权利要求2所述的方法，其中所述多个检测探针进一步包括至少一个内部检测探针，所述内部检测探针与所述5’探针杂交的区域和所述3’探针杂交的区域之间的区域杂交，其中所述内部检测探针在其5’端被磷酸化。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述连接步骤通过连接酶进行。

5.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤a)和b)同时进行。

6.权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括通过用DNA聚合酶或反转录酶处理填补与所述靶标核酸杂交的检测探针之间的任何缺口。

7.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤包括使用与所述5’检测探针上的区域互补的第一引物和在序列上对应于所述3’检测探针上的区域的第二引物进行PCR扩增。

8.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶标核酸是RNA。

9.权利要求8所述的方法，其中所述RNA是非编码RNA、或循环RNA。

10.权利要求8所述的方法，其中所述RNA是mRNA或核糖体RNA。

11.权利要求8所述的方法，其中所述RNA是mRNA的剪接同种型。

12.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶标核酸是DNA。

13.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞裂解物。

14.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自细胞裂解物、组织匀浆、血液样品、鼻拭子、咽拭子、颊拭子、尿、和唾液。

15.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自干血斑、血浆样品、血清样品、血凝块。

16.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量的。

17.权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括检测遗传变异，其中所述靶标核酸包括所述变异，和所述多个检测探针中的至少一个可与包括全部或部分所述变异的所述靶标核酸的区域杂交，其中所述方法不用于疾病的诊断。

18.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶标核酸是外源核酸。

19.检测生物样品中多个靶标核酸的方法，包括：

a)通过多个捕获延伸剂捕获所述多个靶标核酸中的一个，其中所述捕获延伸剂中的每个包括与所述靶标核酸之一上的区域杂交的捕获序列和与缀合到固体载体的捕获探针杂交的固定序列，从而将所述靶标核酸固定到所述固体载体；

b)使所述多个靶标核酸中的同一个与多个检测探针接触，所述检测探针包括第一引物结合部位和第二引物结合部位，其中所述多个检测探针中的每个包括与所述靶标核酸上的区域杂交的序列，其中所述多个检测探针包括5’检测探针和3’检测探针；

c)针对所述多个靶标核酸中的每个进行步骤a)和b)；

d)连接所述多个检测探针以形成对所述多个靶标核酸中的每个特异的多个连接的检测序列；

e)扩增所述多个连接的检测序列；和

f)检测多个扩增的连接的检测序列。

20.权利要求19所述的方法，其中所述第一引物结合部位是所述多个检测探针中每个共有的第一共用引物结合部位，所述第二引物结合部位是所述多个检测探针中每个共有的第二共用引物结合部位，和所述扩增步骤使用对应于所述第一和第二共用引物结合部位的共用PCR引物对来进行。

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