WO2015045593A1 - ターゲットの分析方法および分析キット - Google Patents

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WO2015045593A1
WO2015045593A1 PCT/JP2014/069390 JP2014069390W WO2015045593A1 WO 2015045593 A1 WO2015045593 A1 WO 2015045593A1 JP 2014069390 W JP2014069390 W JP 2014069390W WO 2015045593 A1 WO2015045593 A1 WO 2015045593A1
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acid molecule
complex
enzyme
binding
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嘉仁 吉田
克紀 堀井
巌 和賀
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Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to a target analysis method and an analysis kit.
  • Non-Patent Document 1 a sensor including a binding nucleic acid molecule (so-called aptamer) that specifically binds to a target, instead of an antibody that specifically binds to the target.
  • aptamer a binding nucleic acid molecule
  • DNAzyme a sensor in which the binding nucleic acid molecule is linked to a DNA (hereinafter referred to as DNAzyme) having a catalytic ability for redox reaction is reported.
  • the binding nucleic acid molecule and DNAzyme self-associate in the absence of the target, thereby inhibiting the catalytic ability of DNAzyme (OFF).
  • the self-association occurs due to contact between the target and the aptamer. The association is released and the catalytic ability of DNAzyme is generated (ON). For this reason, if the target is present, an oxidation-reduction reaction occurs due to the DNAzyme in which the catalytic ability is generated. Therefore, the target can be indirectly analyzed by measuring the reaction.
  • the senor needs to control the catalytic ability of DNAzyme in the sensor to ON-OFF in the presence of the target and in the absence of the target. Further, in the analysis using the sensor, in order to further improve the analysis sensitivity, for example, it is necessary to use DNAzyme that exhibits stronger catalytic ability.
  • ELAA Enzyme-linked Aptamer Assay
  • binding nucleic acid molecule uses, for example, the binding nucleic acid molecule labeled with biotin, and an enzyme such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase fused with streptavidin.
  • an enzyme such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase fused with streptavidin.
  • the binding of the target to the binding nucleic acid molecule is analyzed by binding to the biotin-labeled nucleic acid molecule and detecting the substrate of each enzyme.
  • labeling to the binding nucleic acid molecule is essential, and various condition setting improvements are required, for example, to further improve the analysis sensitivity.
  • an object of the present invention is to provide a new method capable of easily analyzing a target using a bound nucleic acid molecule and an analysis kit used therefor.
  • the target analysis method of the present invention comprises a complex forming step in which a bound nucleic acid molecule that binds to a target is contacted with a sample to form a complex of the bound nucleic acid molecule and the target in the sample, and the complex image.
  • a nuclease treatment step for releasing a nucleic acid monomer from at least one of a fraction and a fraction other than the complex by a nuclease treatment an enzyme treatment step for reacting the released nucleic acid monomer with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate, the enzyme reaction And a detection step of analyzing the target that formed the complex from the detection result of the enzyme reaction.
  • the analysis kit of the present invention includes a binding nucleic acid molecule that binds to a target, a nuclease, and an enzyme using a nucleic acid monomer as a substrate, and is characterized by being used in the target analysis method of the present invention.
  • a complex of the target and the binding nucleic acid molecule is formed, nucleic acid monomers from a fraction of the complex or a fraction other than the complex are released, and the released nucleic acid monomer is A target can be easily detected by performing an enzyme reaction using a substrate.
  • this method for example, it is not necessary to link DNAzyme to an aptamer as described above, and therefore, it is not necessary to control ON / OFF of the catalytic ability of DNAzyme depending on the presence or absence of a target.
  • the analysis method of the present invention can be easily carried out. Since the present invention is a method for detecting a target using an aptamer, it can be said to be an extremely useful technique for research and examination in various fields such as clinical medicine, food, and environment.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing another example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic view showing another example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view showing another example of the analysis method of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the light emission amount in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the light emission amount in Example 2.
  • FIG. 7 is a graph showing the light emission amount in Example 3.
  • the analysis method of the present invention includes, as described above, a complex formation step in which a bound nucleic acid molecule that binds to a target is brought into contact with a sample to form a complex between the bound nucleic acid molecule and the target in the sample, and the complex
  • a nuclease treatment step for liberating a nucleic acid monomer by nuclease treatment from at least one of a fraction of the body and a fraction other than the complex an enzyme treatment step for reacting the liberated nucleic acid monomer with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate
  • the method includes a detection step of detecting the enzyme reaction, and an analysis step of analyzing the target that has formed the complex from the detection result of the enzyme reaction.
  • the analysis method of the present invention includes, for example, a separation step of separating the complex fraction and the fraction other than the complex from the complex formation reaction system after the complex formation step. Have.
  • the complex-forming reaction system and an immobilized binding substance are brought into contact with each other, and the complex is bound to the binding substance.
  • a fraction and a fraction other than the complex are separated, and the binding substance is a binding substance that binds to the target.
  • the immobilized binding substance is washed to remove the unreacted binding nucleic acid molecule.
  • the complex fraction is subjected to nuclease treatment to release the nucleic acid monomer from the complex.
  • a fraction other than the complex is subjected to nuclease treatment to release the nucleic acid monomer from the unreacted bound nucleic acid molecule.
  • the binding nucleic acid molecule is a binding nucleic acid molecule to which a polynucleotide is added, and the polynucleotide is a polynucleotide containing a nucleic acid monomer that is used as a substrate by the enzyme.
  • the bound nucleic acid molecule is a bound nucleic acid molecule supported on a carrier.
  • the carrier is a carrier to which a polynucleotide is further added, and the polynucleotide is a polynucleotide containing a nucleic acid monomer used as a substrate by the enzyme.
  • the reaction system in the complex formation step is nuclease treated to release the nucleic acid monomer from the unreacted binding nucleic acid molecule.
  • the binding nucleic acid molecule is a hybrid formed body with a single-stranded nucleic acid molecule containing a complementary sequence, and the hybrid formed body and the sample are contacted in the complex forming step.
  • Forming a complex between the binding nucleic acid molecule and the target in the hybrid former, and releasing the single-stranded nucleic acid molecule from the hybrid former, and in the nuclease treatment step The reaction system is treated with nuclease to release the nucleic acid monomer from the released single-stranded nucleic acid molecule.
  • the binding nucleic acid molecule is a hybrid formed with a single-stranded nucleic acid molecule that is supported on a carrier and includes a complementary sequence.
  • the sample to form a complex of the binding nucleic acid molecule and the target in the hybrid, and to release the single-stranded nucleic acid molecule from the hybrid, in the nuclease treatment step
  • the reaction system in the complex formation step is treated with nuclease to release the nucleic acid monomer from the released single-stranded nucleic acid molecule.
  • the analysis method of the present invention includes, for example, a separation step of separating the released single-stranded nucleic acid molecule from the reaction system of the complex formation step after the complex formation step, and the nuclease treatment step
  • the separated single-stranded nucleic acid molecule is subjected to nuclease treatment to release the nucleic acid monomer from the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the nuclease is a nuclease using a single-stranded nucleic acid molecule as a substrate.
  • the nuclease is an exonuclease.
  • the nucleic acid monomer that is the substrate of the enzyme is an adenosine nucleotide
  • the adenosine nucleotide is, for example, at least one of ribonucleotide and deoxyribonucleotide.
  • the enzyme is a protein having luciferase activity, and a specific example is luciferase.
  • the enzyme reaction is performed in the presence of a reagent, and the reagent generates a signal by an enzyme reaction using the nucleic acid monomer as a substrate, or the nucleic acid monomer.
  • the reagent generates a signal by an enzyme reaction using the nucleic acid monomer as a substrate, or the nucleic acid monomer.
  • the analysis method of the present invention detects, for example, a signal generated by the enzyme reaction or a signal lost by the enzyme reaction in the detection step.
  • the signal is at least one of an optical signal and an electrical signal.
  • the carrier is a bead or a plate.
  • the analysis kit of the present invention includes, for example, a binding nucleic acid molecule that binds to a target, a nuclease, and an enzyme using a nucleic acid monomer as a substrate, and is characterized by being used in the target analysis method of the present invention.
  • the binding nucleic acid molecule is a binding nucleic acid molecule to which a polynucleotide is added, and the polynucleotide is a polynucleotide containing a nucleic acid monomer that is used as a substrate by the enzyme.
  • the analysis kit of the present invention is, for example, a bound nucleic acid molecule in which the bound nucleic acid molecule is supported on a carrier.
  • the carrier is a carrier to which a polynucleotide is further added, and the polynucleotide is a polynucleotide containing a nucleic acid monomer used as a substrate by the enzyme.
  • the binding nucleic acid molecule is a hybrid forming body with a single-stranded nucleic acid molecule containing a complementary sequence, and the binding nucleic acid molecule in the hybrid forming body and the binding nucleic acid molecule are contacted with the target.
  • the target forms a complex and releases the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the nuclease is a nuclease using a single-stranded nucleic acid molecule as a substrate.
  • the analysis kit of the present invention is, for example, a hybrid formed body with a single-stranded nucleic acid molecule in which the binding nucleic acid molecule is supported on a carrier and includes a complementary sequence, and the hybrid formed body is brought into contact with the target.
  • the binding nucleic acid molecule and the target in the above form a complex and release the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the nuclease is an exonuclease.
  • the nucleic acid monomer that is the substrate of the enzyme is an adenosine nucleotide
  • the adenosine nucleotide is, for example, at least one of ribonucleotide and deoxyribonucleotide.
  • the enzyme is a protein having luciferase activity, and a specific example is luciferase.
  • the analysis kit of the present invention further includes, for example, a reagent, and the reagent is a reagent that generates a signal by an enzyme reaction using the monomer as a substrate or a reagent that loses a signal by an enzyme reaction using the monomer as a substrate. is there.
  • the signal is at least one of an optical signal and an electrical signal.
  • the carrier is a bead or a plate.
  • the target analysis method of the present invention includes, as described above, a complex forming step in which a bound nucleic acid molecule that binds to a target is brought into contact with a sample to form a complex of the bound nucleic acid molecule and the target in the sample.
  • Nuclease treatment step for releasing nucleic acid monomer by nuclease treatment from at least one of a fraction of the complex and a fraction other than the complex, and an enzyme treatment for reacting the released nucleic acid monomer with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate
  • a detection step for detecting the enzyme reaction
  • an analysis step for analyzing the target on which the complex is formed from the detection result of the enzyme reaction.
  • “analysis” is a concept including, for example, quantitative analysis, semi-quantitative analysis, and qualitative analysis.
  • the binding nucleic acid molecule is not particularly limited as long as it is a nucleic acid molecule that binds to a target.
  • the binding nucleic acid molecule is also referred to as an aptamer, for example.
  • the target is not particularly limited, and any target can be selected. And according to the said arbitrary target, what is necessary is just to use the binding nucleic acid molecule couple
  • the target include microorganisms, viruses, low molecular compounds, food allergens, pesticides, and mold poisons.
  • the binding nucleic acid molecule may be, for example, a single strand or a double strand, preferably a single strand.
  • the length of the binding nucleic acid molecule is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 18 base length, 20 base length, 24 base length, and the upper limit is, for example, 120 base length, 60 base length, 26 base length. is there.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample may be, for example, a sample including a target or a sample in which it is unknown whether the target is included.
  • the sample is preferably a liquid sample, for example.
  • nuclease treatment step for example, only a fraction of the complex may be subjected to nuclease treatment, or only a fraction other than the complex may be subjected to nuclease treatment, or the reaction in the complex formation step.
  • a nuclease treatment may be performed on the system (that is, a mixed system of a fraction of the complex and a fraction other than the complex).
  • the present invention provides the formation of the complex after the complex formation step and before the nuclease treatment step. It is preferable to include a separation step of separating a fraction of the complex and a fraction other than the complex from the reaction system.
  • the method for separating the fraction of the complex from the fraction other than the complex is not particularly limited.
  • the carrier and the complex are bound and the fraction of the complex is recovered by collecting the carrier.
  • the fraction of the complex can be collected and the fraction other than the complex can be separated.
  • the bond between the carrier and the complex may be, for example, a direct bond or an indirect bond.
  • the former can use, for example, the carrier on which the binding nucleic acid molecule is previously supported.
  • the complex can be directly bound to the carrier by forming a complex between the binding nucleic acid molecule supported on the carrier and the target.
  • the carrier carrying a binding substance that binds to the target can be used.
  • the target and the binding nucleic acid molecule form a complex, and the binding nucleic acid molecule in the complex is bound to the binding substance carried on the carrier, whereby the binding substance is bound to the carrier.
  • the complex can be indirectly bound via
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include containers such as beads and plates.
  • the binding substance is not particularly limited, and examples thereof include a binding nucleic acid molecule and an antibody against the binding nucleic acid molecule.
  • the method for separating the complex fraction from the other fractions is not particularly limited, and examples thereof include solid-liquid separation.
  • the carrier is the container
  • each remaining fraction in the container is divided into a fraction of the complex, and the collected liquid fraction other than the complex. It can be a fraction.
  • the reaction system is separated into a solid fraction and a liquid fraction, so that the former is a fraction of the complex and the latter is a fraction other than the complex. be able to.
  • Examples of the separation of the solid fraction and the liquid fraction include separation by filtration, centrifugation, and separation by standing.
  • the present invention further includes, for example, the fraction of the complex between the separation step and the nuclease treatment step.
  • a cleaning step may be included.
  • the nuclease is not particularly limited as long as it is an enzyme that liberates a nucleic acid monomer from a polynucleotide.
  • the nuclease is preferably, for example, an exonuclease that liberates a nucleic acid monomer from the end of the polynucleotide, and may be free from the 3 'end of the polynucleotide or free from the 5' end of the polynucleotide.
  • exonuclease examples include snake venom nuclease, spleen phosphodiesterase, RNase H, BAL31, Exonclease I, Exonclease III, Exonclease VII, ⁇ exonuclease and the like.
  • the nuclease may be, for example, a ribonuclease that acts on RNA, a deoxyribonuclease that acts on DNA, or a nuclease that acts on both.
  • the nucleic acid monomer cleaved by the nuclease is not particularly limited, and is, for example, a nucleotide residue.
  • the sugar residue in the nucleotide residue may be, for example, a ribose residue or a deoxyribose residue. In the former case, the nucleotide residue is a ribonucleotide residue, and in the latter case, the nucleotide residue is , A deoxyribonucleotide residue.
  • the base in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil and the like.
  • the phosphate group in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include monophosphate and diphosphate. Specific examples of the nucleic acid monomer include AMP and deoxyAMP (dAMP).
  • the enzyme is not particularly limited as long as it is a protein that catalyzes a reaction using the nucleic acid monomer as a substrate.
  • the enzyme is not particularly limited, and examples thereof include a protein having luciferase activity, and luciferase is preferable.
  • the enzyme can be appropriately set according to, for example, the type of nucleic acid monomer cut out in the nuclease treatment step.
  • the enzyme reaction may be performed in the presence of a reagent.
  • the reagent may be, for example, a reagent that generates a signal by an enzyme reaction using the nucleic acid monomer as a substrate, or a reagent that loses a signal by an enzyme reaction using the nucleic acid monomer as a substrate.
  • the signal may be, for example, an optical signal or an electrical signal.
  • the order of the nuclease treatment step and the enzyme treatment step is not particularly limited, and the enzyme treatment step may be performed after the nuclease treatment step, or both the steps may be performed simultaneously.
  • the analysis method of the present invention further includes, for example, a conversion treatment step of converting the nucleic acid monomer cut out in the nuclease treatment step into a nucleotide whose phosphate group is triphosphate.
  • a conversion treatment step of converting the nucleic acid monomer cut out in the nuclease treatment step into a nucleotide whose phosphate group is triphosphate.
  • the conversion treatment step when a monophosphate or diphosphate nucleotide is excised as the nucleic acid monomer in the nuclease treatment step, for example, in the conversion treatment step, the nucleic acid monomer is converted into a triphosphate nucleotide. To do.
  • the conversion processing step the sensitivity can be further improved.
  • a conversion enzyme that converts a monophosphate or diphosphate nucleotide into a triphosphate nucleotide can be used to convert the triphosphate into a nucleotide.
  • the converting enzyme is not particularly limited, and examples thereof include pyruvate phosphate dikinase.
  • the conversion treatment step when the nucleic acid monomer is converted into a triphosphate nucleotide, it is preferable to use an enzyme that uses the triphosphate nucleotide as a substrate in the enzyme treatment step.
  • an enzyme that uses the triphosphate nucleotide as a substrate for example, luciferase can be used.
  • the order of the nuclease treatment step, the conversion treatment step and the enzyme treatment step is not particularly limited, and may be performed in this order, or the nuclease treatment step and the conversion treatment step may be performed simultaneously.
  • the conversion treatment step and the enzyme treatment step may be performed simultaneously, or the three steps may be performed simultaneously.
  • detection of the enzyme reaction of the enzyme is not particularly limited.
  • the detection can be performed, for example, by directly or indirectly detecting a decrease in the substrate due to the enzyme reaction.
  • the latter is, for example, detection of a signal generated by the enzyme reaction.
  • a signal generated from the reagent by the enzyme reaction may be used.
  • the signal may be, for example, an optical signal or an electrical signal.
  • optical signal examples include signals such as light emission, fluorescence, and color development.
  • the optical signal may be detected, for example, by visual observation of light emission, fluorescence, color development, or the like, or may be detected by an optical technique using light emission intensity, fluorescence intensity, absorbance, reflectance, etc. as signals.
  • Examples of the electrical signal include current.
  • the electrical signal can be detected by, for example, an electrical technique.
  • the analysis step is a step of analyzing the target contained in the complex fraction from the detection result of the enzyme reaction in the detection step.
  • the detection result of the enzyme reaction may be, for example, a result of an enzyme reaction for a fraction of the complex, a result of an enzyme reaction for a fraction other than the complex, or a reaction system in the complex formation step ( That is, it may be the result of an enzymatic reaction on a mixed system of a fraction of the complex and a fraction other than the complex.
  • Embodiment 1 in which the fraction of the complex is separated from a fraction other than the complex, and Embodiment 2 in which the separation of the two fractions is not performed are described below.
  • Embodiment 3 using a hybrid-forming body of the binding nucleic acid molecule and a single-stranded nucleic acid molecule containing a complementary sequence to the binding nucleic acid molecule will be described. Note that the present invention is not limited to these embodiments. In addition, each embodiment can be used in other embodiments unless otherwise specified.
  • Embodiment 1 In the first embodiment of the present invention, as described above, after the complex formation step, a fraction of the complex and a fraction other than the complex are separated from the reaction system of the complex formation step. Yes, for example, the following embodiments 1A, 1B and 1C can be exemplified.
  • Embodiment 1A of the present invention is a form in which a fraction of the complex is subjected to nuclease treatment. Specifically, a bound nucleic acid molecule that binds to a target is brought into contact with a sample, and the bound nucleic acid molecule and the A complex forming step for forming a complex with a target in a sample; a separation step for separating a fraction of the complex and a fraction other than the complex from a reaction system for forming the complex; and the complex.
  • a nuclease treatment step for releasing a nucleic acid monomer from the fraction an enzyme treatment step for reacting the liberated nucleic acid monomer with an enzyme using a nucleic acid monomer as a substrate, a detection step for detecting the enzyme reaction, and the enzyme
  • the method includes an analysis step of analyzing a target on which the complex is formed based on a detection result of the reaction.
  • Embodiment 1A since the fraction of the complex and the fraction other than the complex are separated, in the nuclease treatment step, nucleic acid monomers are released from the binding nucleic acid molecules in the complex, In the enzyme treatment step, an enzyme reaction is performed using the liberated nucleic acid monomer as a substrate. For this reason, the detection result of the enzyme reaction in the detection step is the detection result of the complex, and indirectly the detection result of the target contained in the complex.
  • Embodiment 1A it is preferable to use a bound nucleic acid molecule to which a polynucleotide (hereinafter also referred to as an added polynucleotide) is added as the bound nucleic acid molecule.
  • a polynucleotide hereinafter also referred to as an added polynucleotide
  • the bound nucleic acid molecule to which the polynucleotide is added for example, the number of nucleic acid monomers released from the bound nucleic acid molecule in the complex can be increased. Since the released nucleic acid monomer becomes a substrate in the enzyme treatment step, the detection sensitivity can be further improved as the number of released nucleic acid monomers increases.
  • the polynucleotide added to the binding nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the lower limit of the length of the additional polynucleotide is, for example, 0 bases, 10 bases, 20 bases, and the upper limit is, for example, 1000 bases, 200 bases, 20 bases.
  • the type of nucleic acid monomer that constitutes the additional polynucleotide is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the substrate specificity of the enzyme used in the enzyme treatment step.
  • the nucleic acid monomers are linked by, for example, phosphodiester bonds.
  • the nucleic acid monomer is, for example, a nucleotide residue.
  • the sugar residue in the nucleotide residue may be, for example, a ribose residue or a deoxyribose residue. In the former case, the nucleotide residue is a ribonucleotide residue, and in the latter case, the nucleotide residue is , A deoxyribonucleotide residue.
  • the base in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil and the like.
  • the phosphate group in the nucleotide residue is not particularly limited, and may be, for example, monophosphate, diphosphate, or triphosphate.
  • Specific examples of the nucleic acid monomer include AMP and deoxyAMP (dAMP).
  • the nucleotide residue constituting the additional polynucleotide may be, for example, one type or two or more types. Above all, the additional polynucleotide is preferably composed of at least one of AMP and deoxyAMP (dAMP), more preferably composed of any one type of nucleotide residue.
  • the added polynucleotide may be added to the 3 ′ end of the binding nucleic acid molecule, or may be added to the 5 ′ end of the binding nucleic acid molecule, for example.
  • the position of addition in the binding nucleic acid molecule can be appropriately determined according to, for example, the characteristics of the nuclease.
  • the additional polynucleotide is preferably added to the 5 ′ end of the binding nucleic acid molecule.
  • the additional polynucleotide is preferably added to the 3 ′ end of the binding nucleic acid molecule.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an outline of Embodiment 1A of the present invention, and (A)-(D) show each step.
  • FIG. 1 is a schematic diagram, and for example, conditions such as the size of the target, the binding nucleic acid molecule, and the additional polynucleotide are not limited thereto.
  • the sample containing the target 11 is brought into contact with the bound nucleic acid molecule 12 to which the additional polynucleotide 13 has been added.
  • the target 11 in the sample and the bound nucleic acid molecule 12 to which the additional polynucleotide 13 is added form a complex.
  • unreacted binding nucleic acid molecules 12 not involved in the complex formation also coexist in the reaction solution.
  • the reaction solution is brought into contact with the binding substance 15 immobilized on the carrier 14.
  • the binding substance 15 is a substance that binds to the target 11.
  • the complex contained in the reaction solution is bound to the carrier 14 through the binding of the target 11 and the binding substance 15.
  • the unreacted binding nucleic acid molecule 12 is released in the reaction solution without binding to the carrier 14.
  • the carrier 14 to which the complex is bound is separated from other fractions. Specifically, for example, the liquid fraction is removed from the carrier 14. Then, nuclease is added to the carrier 14 to perform nuclease treatment. Thereby, as shown in the left diagram of FIG. 1D, the additional polynucleotide 13 in the complex bound to the carrier 14 is decomposed, and the nucleic acid monomer 13 'is cut out.
  • the nucleic acid monomer 13 'cut out from the additional polynucleotide 13 is treated with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate, and the enzyme reaction is detected. Thereby, the target in the sample can be analyzed.
  • Embodiment 1B of the present invention is a form in which a fraction other than the complex is subjected to nuclease treatment.
  • a bound nucleic acid molecule that binds to a target is brought into contact with a sample, and the bound nucleic acid molecule
  • a complex forming step for forming a complex with a target in the sample a separation step for separating a fraction of the complex and a fraction other than the complex from the reaction system for forming the complex
  • a nuclease treatment step for releasing a nucleic acid monomer from a fraction other than the body by a nuclease treatment, an enzyme treatment step for reacting the liberated nucleic acid monomer with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate, a detection step for detecting the enzyme reaction, and
  • the method includes an analysis step of analyzing the target that has formed the complex from the detection result of the enzyme reaction.
  • Embodiment 1B the addition of the additional polynucleotide to the binding nucleic acid molecule is optional, the fraction other than the complex is subjected to nuclease treatment, and the nucleic acid monomer thus released is subjected to enzyme treatment, and the enzyme Except for detecting the reaction, the reaction can be performed in the same manner as in Embodiment 1A, and the description of Embodiment 1A can be incorporated.
  • the fraction other than the complex includes the unreacted bound nucleic acid molecule that was not involved in the complex formation. Therefore, the unreacted bound nucleic acid molecule can be analyzed by subjecting the unreacted bound nucleic acid molecule to nuclease treatment and detecting the released nucleic acid monomer. If the unreacted bound nucleic acid molecule can be analyzed, the bound nucleic acid molecule involved in the complex formation can also be analyzed from the result, and as a result, the target that formed the complex can be analyzed.
  • Embodiment 1B it is preferable to use a binding nucleic acid molecule to which the additional polynucleotide is added as the binding nucleic acid molecule.
  • the polynucleotide for example, the number of nucleic acid monomers released from the binding nucleic acid molecule in the complex can be increased. Since the released nucleic acid monomer becomes a substrate in the enzyme treatment step, the detection sensitivity can be further improved as the number of released nucleic acid monomers increases.
  • the conditions for the additional polynucleotide are not particularly limited, and the example of Embodiment 1A can be used.
  • FIG. 1 can be referred to for the present embodiment 1B, similarly to the above-described embodiment 1A.
  • the fraction of the complex and the fraction other than the complex are separated.
  • the nucleic acid monomer is added from the added polynucleotide 13 added to the unreacted nucleic acid molecule 12. 13 'is cut out.
  • the nucleic acid monomer 13 ′ is treated with an enzyme in the same manner as in Embodiment 1A to detect the enzyme reaction. Thereby, the target in the sample can be analyzed indirectly.
  • FIG. 1 shows a binding nucleic acid molecule 12 to which an additional polynucleotide 13 is added.
  • Embodiment 1B is not limited to this, and for example, an additional polynucleotide 13 is added. It may be a bound nucleic acid molecule 12 that is not.
  • Embodiment 1C of the present invention is a form in which a bound nucleic acid molecule supported on a carrier is used as the bound nucleic acid molecule, and the other aspects are the same as, for example, Embodiments 1A and 1B.
  • the number of binding nucleic acid molecules carried on the carrier is not particularly limited, and may be one molecule or a plurality of molecules of two or more. Since the amount of nucleic acid monomer released by nuclease treatment can be increased, it is preferable that a plurality of the binding nucleic acid molecules are supported on the carrier.
  • the carrier may carry, for example, only a bound nucleic acid molecule or may further carry a polynucleotide because the amount of nucleic acid monomer released by nuclease treatment can be increased.
  • the polynucleotide is not particularly limited, and examples thereof include the polynucleotide shown in Embodiment 1A.
  • the carrier is not particularly limited and can be exemplified by the above-mentioned carriers, among which beads are preferable.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an outline of Embodiment 1C of the present invention, and (A)-(D) show each step.
  • FIG. 2 is a schematic diagram, and for example, conditions such as the size of the target, the binding nucleic acid molecule, and the additional polynucleotide are not limited thereto.
  • Embodiment 1C in the complex formation step, as shown in FIG. 2A, the sample including the target 11 and the carrier 20 are brought into contact with each other.
  • the carrier 20 carries a plurality of binding nucleic acid molecules 12 and a plurality of polynucleotides 13.
  • FIG. 2B in the reaction solution in the complex formation step, the target 11 in the sample and the bound nucleic acid molecule 12 carried by the carrier 20 form a complex.
  • unreacted binding nucleic acid molecules 12 not involved in the complex formation also coexist in the reaction solution.
  • the subsequent steps are the same as those in Embodiments 1A and 1B.
  • the carrier 20 carries a plurality of binding nucleic acid molecules 12 and a plurality of polynucleotides 13, for example, by nuclease treatment of the fraction of the complex in the embodiment 1A, Many nucleic acid monomers can also be released by nuclease treatment of fractions other than the complex in Embodiment 1B. For this reason, analysis with higher sensitivity becomes possible.
  • Embodiment 2 of the present invention relates to the reaction system of the complex formation step without separating the complex fraction and the fraction other than the complex after the complex formation step. In this form, nuclease treatment is applied.
  • a binding nucleic acid molecule that binds to a target is brought into contact with a sample to form a complex of the binding nucleic acid molecule and a target in the sample, and the reaction for forming the complex.
  • a nuclease treatment step for releasing a nucleic acid monomer from the system by a nuclease treatment an enzyme treatment step for reacting the liberated nucleic acid monomer with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate, a detection step for detecting the enzyme reaction, and the enzyme reaction And an analysis step of analyzing the target on which the complex is formed based on the detection result.
  • the nuclease treatment is performed on a reaction system in which the complex and the unreacted binding nucleic acid molecule not involved in the complex formation coexist.
  • the binding nucleic acid molecule and the target form a complex
  • the binding nucleic acid molecule in the complex is hardly decomposed by the nuclease due to a physical obstacle.
  • the nuclease treatment of the reaction system only the unreacted binding nucleic acid molecules that are not involved in the formation of the complex are not released from the binding nucleic acid molecules bound to the target by the nuclease.
  • Nucleic acid monomers are released from Therefore, in Embodiment 2, it is not necessary to separate a fraction of the complex from a fraction other than the complex. Further, the unreacted bound nucleic acid molecule can be analyzed by releasing the nucleic acid monomer only from the unreacted bound nucleic acid molecule and detecting the released nucleic acid monomer. If the unreacted bound nucleic acid molecule can be analyzed, the bound nucleic acid molecule involved in the complex formation can also be analyzed from the result, and as a result, the target that formed the complex can be analyzed.
  • the binding nucleic acid molecule to which the additional polynucleotide is not added it is preferable to use the binding nucleic acid molecule to which the additional polynucleotide is not added.
  • the length of the additional polynucleotide is not particularly limited, but the upper limit is, for example, 5 bases, 3 bases, or 1 base.
  • Embodiment 3 of the present invention is a mode in which a hybrid former of the binding nucleic acid molecule and a single-stranded nucleic acid molecule containing a complementary sequence to the binding nucleic acid molecule is used.
  • Forms 3A and 3B can be exemplified.
  • Embodiment 3A of the present invention is a form in which the binding nucleic acid molecule is a hybrid-formant with the single-stranded nucleic acid molecule containing a complementary sequence, specifically, the hybrid formation.
  • a complex is formed by bringing a body into contact with a sample, forming a complex between the binding nucleic acid molecule in the hybrid-forming body and a target in the sample, and releasing the single-stranded nucleic acid molecule from the hybrid-forming body.
  • a nuclease treatment step for releasing a nucleic acid monomer by nuclease treatment from the reaction system for forming the complex an enzyme treatment step for reacting the released nucleic acid monomer with an enzyme using the nucleic acid monomer as a substrate, and detecting the enzyme reaction A detection step, and an analysis step of analyzing the target that has formed the complex from the detection result of the enzyme reaction. And butterflies.
  • the nuclease having a single-stranded nucleic acid as a substrate is used, so that the nucleic acid monomer is not released from the complex and is released from the hybridized body.
  • the nucleic acid monomer can be released only from the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the released single-stranded nucleic acid molecule can be analyzed by subjecting the released single-stranded nucleic acid molecule to nuclease treatment and detecting the released nucleic acid monomer. If the released single-stranded nucleic acid molecule can be analyzed, the binding nucleic acid molecule involved in the complex formation can be analyzed from the result, and as a result, the target that has formed the complex can be analyzed.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may have a complementary sequence to the binding nucleic acid molecule and can hybridize to the binding nucleic acid molecule.
  • the length of the single-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited and can be appropriately set according to the binding nucleic acid molecule.
  • the ratio between the length of the binding nucleic acid molecule and the length of the single-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited and is not limited, and the single-stranded nucleic acid molecule is, for example, a fraction of the binding nucleic acid molecule. ⁇ 1 / 1,000.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may bind to any region of the binding nucleic acid molecule.
  • the nuclease used in the third embodiment may be a nuclease using a single-stranded nucleic acid as a substrate.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an outline of the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram, and for example, conditions such as the size of the target, the binding nucleic acid molecule, and the single-stranded nucleic acid molecule are not limited thereto.
  • Embodiment 3A in the complex formation step, as shown in FIG. 3A, the sample containing the target 11 is brought into contact with the hybrid formed body of the binding nucleic acid molecule 12 and the single-stranded nucleic acid molecule 30.
  • the bound nucleic acid molecule 12 in the hybrid form binds to the target 11 in the sample, and one in the hybrid form.
  • the double-stranded nucleic acid molecule 30 is released.
  • the reaction solution containing the complex and the released single-stranded nucleic acid 30 is treated with a nuclease using the single-stranded nucleic acid as a substrate, thereby removing the complex from the complex as shown in FIG. Does not release the nucleic acid monomer, and the nucleic acid monomer 30 ′ is cut out only from the single-stranded nucleic acid molecule 30. Then, the nucleic acid monomer 30 ′ released from the single-stranded nucleic acid molecule 30 is treated with an enzyme to detect an enzyme reaction. Thereby, the released single-stranded nucleic acid molecule 30 can be detected, and the target in the sample can be analyzed indirectly.
  • Embodiment 3B is a form in which the hybrid formed body is supported on a carrier.
  • This Embodiment 3B uses the hybrid-forming body supported on the carrier, and after the complex formation step, separates the solid fraction and the liquid fraction containing the carrier, and the liquid fraction The same as Embodiment 3A except that the nucleotide treatment and the enzyme treatment are performed.
  • the solid fraction that is, the fraction containing the carrier, includes a carrier in which a supported bound nucleic acid molecule is bound to a target to form a complex, and a supported bound nucleic acid molecule is a target. Unbound unreacted carrier, while the liquid fraction contains the released single-stranded nucleic acid molecule. For this reason, the single-stranded nucleic acid molecule released from the hybrid former can be analyzed by subjecting the liquid fraction to nuclease treatment to liberate nucleic acid monomers, to treat this with an enzyme, and to detect an enzymatic reaction. If the released single-stranded nucleic acid molecule can be analyzed, the binding nucleic acid molecule involved in the complex formation can be analyzed from the result, and as a result, the target that has formed the complex can be analyzed.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an outline of Embodiment 3B of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram, and the conditions such as the size of the target, the binding nucleic acid molecule, and the single-stranded nucleic acid molecule are not limited thereto.
  • Embodiment 3B in the complex formation step, as shown in FIG. 4A, the sample containing the target 11 is loaded with a carrier that carries a hybrid formed body of the binding nucleic acid molecule 12 and the single-stranded nucleic acid molecule 30. 20 is contacted.
  • the reaction solution in the complex formation step in the reaction solution in the complex formation step, the bound nucleic acid molecule 12 in the hybrid is bound to the target 11 in the sample and The double-stranded nucleic acid molecule 30 is released.
  • the reaction solution is separated into a solid fraction containing the carrier 20 and a liquid fraction containing the released single-stranded nucleic acid molecules 30.
  • the nucleic acid monomer 30 ′ is cut out from the single-stranded nucleic acid molecule 30 as shown in FIG. 4 (D). Then, the nucleic acid monomer 30 ′ released from the single-stranded nucleic acid molecule 30 is treated with an enzyme to detect an enzyme reaction. Thereby, the released single-stranded nucleic acid molecule 30 can be detected, and the target in the sample can be analyzed indirectly.
  • the target analysis kit of the present invention includes a binding nucleic acid molecule that binds to a target, a nuclease, and an enzyme that uses a nucleic acid monomer as a substrate, and is characterized by being used in the target analysis method of the present invention. According to the analysis kit of the present invention, the analysis method of the present invention can be easily performed. In addition, the description of the said analysis method of this invention can be used for the analysis kit of this invention.
  • Example 1 Nucleic acid monomer was released from the nucleic acid molecule by nuclease treatment, and the released nucleic acid monomer was detected with luciferase.
  • DNA (N30-079) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 below was used.
  • N30-079 (SEQ ID NO: 1) 5'-GGATTGAACGCCGCCCTTATAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATCAGGTCCAGTGCTCTCGTATAG-3 '
  • the nucleic acid molecule was released from the nucleic acid molecule by mixing the nucleic acid molecule and DNA endonuclease (trade name BAL31 Nuclease, manufactured by TAKARA) at the ratio shown in Table 1 and incubating at 30 ° C. for 30 minutes.
  • DNA endonuclease trade name BAL31 Nuclease, manufactured by TAKARA
  • FIG. 5 is a graph showing the relative light emission amount.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the relative light emission amount
  • the numerical value in the figure indicates the relative light emission amount of each sample.
  • no luminescence was measured in the negative control and the control.
  • strong luminescence was measured when any nucleic acid molecule was used. From these results, it was found that luminescence can be measured by releasing a nucleic acid monomer from a nucleic acid molecule by nuclease treatment and reacting with the enzyme using the released nucleic acid monomer as a substrate.
  • Example 2 By allowing the nuclease and luciferase to coexist, the release of the nucleic acid monomer from the nucleic acid molecule and the detection of the released nucleic acid monomer were simultaneously performed.
  • N30-079 and the DNA endonuclease were mixed at the same ratio as in Table 1 except that the DNA endonuclease was changed to 1 Unit, and used as a sample.
  • the sample was added to the AMP test kit and allowed to stand for 20 minutes. And using the said measuring apparatus, the relative light-emission quantity of the said sample was measured every 15 seconds.
  • FIG. 6 is a graph showing the relative light emission amount.
  • the horizontal axis represents the reaction time
  • the vertical axis represents the relative light emission amount.
  • the reaction time is based on the time when the sample is added to the AMP test kit.
  • strong luminescence was measured at any time. From these results, it was found that the nucleic acid molecule can be detected even if the nuclease treatment step and the enzyme treatment step are performed simultaneously.
  • Example 3 A complex of a bound nucleic acid molecule (aptamer) that binds to influenza virus hemagglutinin (HA) and HA was formed, nucleic acid monomer was released from the complex by nuclease treatment, and the released nucleic acid monomer was detected with luciferase.
  • aptamer a bound nucleic acid molecule that binds to influenza virus hemagglutinin (HA) and HA was formed, nucleic acid monomer was released from the complex by nuclease treatment, and the released nucleic acid monomer was detected with luciferase.
  • aptamer that binds to influenza virus HA
  • DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 was used.
  • the aptamer added poly dA having a length of 24 bases to the 3 ′ end.
  • the aptamer was mixed with a TBS buffer so as to be 100 nmol / L.
  • the composition of the TBS buffer was 50 mmol / L Tris-HCl, 100 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 , 0.05% Tween® 20, pH 7.4.
  • the said aptamer liquid was heat-processed for 5 minutes at 95 degree
  • RHA0006 (SEQ ID NO: 2) 5'-GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 '
  • influenza virus (H5N1) -derived HA was used as HA.
  • the HA was diluted with a TBS buffer so as to have a predetermined concentration (0, 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 or 10 5 pmol / L) to obtain a diluted sample.
  • a 96-well plate (trade name: Nunc-Immuno (registered trademark) plate, Maxisorp (registered trademark), Nunc), and allowed to adsorb at 4 ° C. for 16 hours.
  • the well was washed 3 times with 200 ⁇ L of the TBS buffer, and then 200 ⁇ L of Protein Free (TBS) Blocking Buffer (Pierce) was added and incubated at room temperature for 1 hour. After incubation, 100 ⁇ L of the aptamer solution after standing was added and incubated at room temperature for 30 minutes. The wells were washed 3 times with 200 ⁇ L of the TBS buffer.
  • TBS Protein Free
  • FIG. 7 is a graph showing the relative light emission amount.
  • the horizontal axis indicates the concentration of HA in the diluted sample
  • the vertical axis indicates the relative light emission amount.
  • luminescence was not measured in the diluted sample of 0 pmol / L, whereas luminescence was measured in any of the HA concentrations in the diluted sample. From these results, it is possible to measure luminescence by releasing nucleic acid monomers from nucleic acid molecules by a nuclease treatment from a fraction of the complex of bound nucleic acid molecules and targets, and reacting with the enzyme using the released nucleic acid monomers as a substrate. all right.
  • a complex of the target and the binding nucleic acid molecule is formed, the nucleic acid monomer from the fraction of the complex or a fraction other than the complex is liberated, and the liberated nucleic acid monomer is used as a substrate.
  • a target can be easily detected by performing an enzyme reaction. According to this method, for example, it is not necessary to link DNAzyme to an aptamer as described above, and therefore, it is not necessary to control ON / OFF of the catalytic ability of DNAzyme depending on the presence or absence of a target.
  • the analysis method of the present invention can be easily carried out. Since the present invention is a method for detecting a target using an aptamer, it can be said to be an extremely useful technique for research and examination in various fields such as clinical medicine, food, and environment.

Abstract

　結合核酸分子を使用して、容易にターゲットの分析を行える新たな方法およびそれに用いる分析キットを提供する。　本発明の分析方法は、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、 前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、 前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、 前記酵素反応を検出する検出工程、および、 前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含む。

Description

ターゲットの分析方法および分析キット
　本発明は、ターゲットの分析方法および分析キットに関する。
　ターゲットの検出において、近年、ターゲットに特異的に結合する抗体に代えて、ターゲットに特異的に結合する結合核酸分子（いわゆるアプタマー）を備えるセンサの利用が試みられている。前記センサとしては、例えば、前記結合核酸分子へのターゲットの結合を判断するために、前記結合核酸分子と、酸化還元反応の触媒能を示すＤＮＡ（以下、ＤＮＡｚｙｍｅという）とを連結したセンサが報告されている（非特許文献１）。このセンサは、ターゲット非存在下では、前記結合核酸分子とＤＮＡｚｙｍｅとが自己会合して、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を阻害され（ＯＦＦ）、ターゲット存在下では、ターゲットと前記アプタマーとの接触により、前記自己会合が解除され、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能が生起される（ＯＮ）。このため、ターゲットが存在すれば、触媒能が生起されたＤＮＡｚｙｍｅにより、酸化還元反応が生じるため、前記反応を測定することで、間接的にターゲットを分析できる。
　しかしながら、前記センサは、前記センサにおけるＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を、ターゲットの存在下およびターゲットの非存在下で、ＯＮ－ＯＦＦに制御する必要がある。また、前記センサを用いた分析において、分析感度をさらに向上させるには、例えば、より強い触媒能を示すＤＮＡｚｙｍｅを使用する必要がある。
　また、前記結合核酸分子（アプタマー）を使用するＥＬＡＡ（Enzyme‐linked　Aptamer　Assay）は、たとえばビオチンで標識した前記結合核酸分子を使用し、ストレプトアビジンを融合した西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を、前記ビオチン標識化核酸分子に結合させ、各酵素の基質を検出することで、前記結合核酸分子へのターゲットの結合を分析する方法である。しかしながら、前記結合核酸分子への標識化が必須であり、また、分析感度をさらに向上させるには、例えば、様々な条件設定改良が必要となる。
　このように、前記センサを使用する場合、さらに優れた形態とするには、様々な改良が必要となる。
　このため、前記結合核酸分子を用いて、容易にターゲットを検出でき、また、分析感度の向上も容易に実現できる方法の提供が求められている。
Carsten　Tellerら、Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　２００９，　８１，　９１１４－９１１９
　そこで、本発明は、結合核酸分子を使用して、容易にターゲットの分析を行える新たな方法およびそれに用いる分析キットを提供することを目的とする。
　本発明のターゲットの分析方法は、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
　本発明の分析キットは、ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、前記本発明のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする。
　本発明の分析方法によれば、前記ターゲットと前記結合核酸分子との複合体を形成させ、前記複合体の画分または前記複合体以外の画分からの核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素反応を行うことで、容易に、ターゲットを検出できる。この方法によれば、例えば、前述のようにアプタマーにＤＮＡｚｙｍｅを連結させる必要がなく、このため、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を、ターゲットの存否によってＯＮ－ＯＦＦ制御することも不要である。また、本発明の分析キットによれば、前記本発明の分析方法を容易に実施できる。本発明は、アプタマーを使用するターゲットの検出方法であるため、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
図１は、本発明の分析方法の一例を示す概略図である。 図２は、本発明の分析方法のその他の例を示す概略図である。 図３は、本発明の分析方法のその他の例を示す概略図である。 図４は、本発明の分析方法のその他の例を示す概略図である。 図５は、実施例１における発光量を示すグラフである。 図６は、実施例２における発光量を示すグラフである。 図７は、実施例３における発光量を示すグラフである。
　本発明の分析方法は、前述のように、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
　本発明の分析方法は、例えば、前記複合体形成工程の後、さらに、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程を有する。
　本発明の分析方法は、例えば、前記分離工程において、前記複合体形成の反応系と、固定化した結合物質とを接触させ、前記結合物質に前記複合体を結合させることで、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離し、前記結合物質が、前記ターゲットに結合する結合物質である。
　本発明の分析方法は、例えば、前記分離工程において、前記結合物質に前記複合体を結合させた後、前記固定化した結合物質を洗浄し、未反応の前記結合核酸分子を除去する。
　本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体画分をヌクレアーゼ処理し、前記複合体から前記核酸モノマーを遊離させる。
　本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体以外の画分をヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
　本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
　本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である。
　本発明の分析方法は、例えば、前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
　本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系を、ヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
　本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
　本発明の分析方法は、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリッド形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
　本発明の分析方法は、例えば、前記複合体形成工程後、さらに、前記複合体形成工程の反応系から、遊離された前記一本鎖核酸分子を分離する分離工程を有し、前記ヌクレアーゼ処理工程において、分離した前記一本鎖核酸分子をヌクレアーゼ処理し、前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる。
　本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである。
　本発明の分析方法は、例えば、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである。
　本発明の分析方法は、例えば、前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドであり、前記アデノシンヌクレオチドが、例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である。
　本発明の分析方法は、例えば、前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体例は、ルシフェラーゼである。
　本発明の分析方法は、例えば、前記酵素処理工程において、試薬の存在下、前記酵素反応を行い、前記試薬が、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である。
　本発明の分析方法は、例えば、前記検出工程において、前記酵素反応により生じるシグナル、または、前記酵素反応により消失するシグナルを検出する。
　本発明の分析方法は、例えば、前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である。
　本発明の分析方法は、例えば、前記担体が、ビーズまたはプレートである。
　本発明の分析キットは、例えば、ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、前記本発明のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする。
　本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
　本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である。
　本発明の分析キットは、例えば、前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである。
　本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する。
　本発明の分析キットは、例えば、前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである。
　本発明の分析キットは、例えば、前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する。
　本発明の分析キットは、例えば、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである。
　本発明の分析キットは、例えば、前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドであり、前記アデノシンヌクレオチドが、例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である。
　本発明の分析キットは、例えば、前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体例として、ルシフェラーゼである。
　本発明の分析キットは、例えば、さらに、試薬を含み、前記試薬が、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である。
　本発明の分析キットは、例えば、前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である。
　本発明の分析キットは、例えば、前記担体が、ビーズまたはプレートである。
＜ターゲットの分析方法＞
　本発明のターゲットの分析方法は、前述のように、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である。
　前記複合体形成工程において、前記結合核酸分子は、特に制限されず、ターゲットに結合する核酸分子であればよい。前記結合核酸分子は、例えば、アプタマーともいう。
　前記ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットが選択できる。そして、前記任意のターゲットに応じて、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を使用すればよい。前記ターゲットは、例えば、微生物、ウイルス、低分子化合物、食物アレルゲン、農薬、カビ毒等が例示できる。
　前記結合核酸分子は、例えば、一本鎖でもよいし二本鎖でもよく、好ましくは一本鎖である。前記結合核酸分子の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１８塩基長、２０塩基長、２４塩基長であり、上限は、例えば、１２０塩基長、６０塩基長、２６塩基長である。
　前記複合体形成工程において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料、ターゲットを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。
　前記ヌクレアーゼ処理工程は、例えば、前記複合体の画分のみにヌクレアーゼ処理を行ってもよいし、前記複合体以外の画分のみにヌクレアーゼ処理を行ってもよいし、前記複合体形成工程における反応系（すなわち、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分との混合系）にヌクレアーゼ処理を行ってもよい。
　前記複合体の画分のみ、または、前記複合体以外の画分のみにヌクレアーゼ処理を行う場合、本発明は、前記複合体形成工程の後、前記ヌクレアーゼ処理工程の前に、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離する分離工程を含むことが好ましい。
　前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離する方法は、特に制限されず、例えば、担体と複合体とを結合させ、前記担体の回収により、前記複合体の画分を回収し、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離することができる。前記担体と前記複合体との結合は、例えば、直接的な結合でもよいし、間接的な結合でもよい。前者は、例えば、予め前記結合核酸分子を担持させた前記担体を使用できる。この場合、前記担体に担持された前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成することにより、前記担体に、前記複合体を直接的に結合できる。また、後者は、例えば、前記ターゲットに結合する結合物質を担持させた前記担体が使用できる。この場合、前記ターゲットと前記結合核酸分子とが複合体を形成し、前記担体に担持された前記結合物質に、前記複合体における前記結合核酸分子が結合することにより、前記担体に、前記結合物質を介して、前記複合体を間接的に結合できる。
　前記担体は、特に制限されず、例えば、ビーズ、プレート等の容器等があげられる。前記結合物質は、特に制限されず、例えば、前記結合核酸分子に対する結合核酸分子、抗体等があげられる。
　前記担体を使用する場合、前記複合体の画分とそれ以外の画分との分離方法は、特に制限されず、例えば、固液分離があげられる。前記担体が前記容器の場合、前記容器内から、液体画分を採取することで、前記容器内の残存各分を、前記複合体の画分、採取した液体画分を、前記複合体以外の画分とすることができる。また、前記担体が前記ビーズの場合、前記反応系を固体画分と液体画分とに分離することで、前者を、前記複合体の画分、後者を、前記複合体以外の画分とすることができる。前記固体画分と前記液体画分との分離は、例えば、ろ過による分離、遠心分離、静置による分離等があげられる。
　本発明が前記分離工程を含み、前記複合体の画分についてヌクレアーゼ処理を行う場合、本発明は、例えば、さらに、前記分離工程と前記ヌクレアーゼ処理工程との間に、前記複合体の画分を洗浄する工程を含んでもよい。前記複合体の画分を洗浄することによって、例えば、複合体の形成に関与していない未反応の前記結合核酸分子の混入を抑制し、さらに精度に優れる分析が可能になる。
　前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記ヌクレアーゼは、特に制限されず、ポリヌクレオチドから核酸モノマーを遊離する酵素であればよい。前記ヌクレアーゼは、例えば、前記ポリヌクレオチドの末端から核酸モノマーを遊離するエキソヌクレアーゼが好ましく、前記ポリヌクレオチドの３’末端からの遊離でもよいし、前記ポリヌクレオチドの５’末端からの遊離でもよい。前記エキソヌクレアーゼとしては、例えば、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、ＲＮａｓｅ　Ｈ、ＢＡＬ３１、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　III、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　VII、λエキソヌクレアーゼ等があげられる。前記ヌクレアーゼは、例えば、ＲＮＡに作用するリボヌクレアーゼ、ＤＮＡに作用するデオキシリボヌクレアーゼ、両方に作用するヌクレアーゼのいずれでもよい。
　前記ヌクレアーゼによって切り出される核酸モノマーは、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における糖残基は、例えば、リボース残基でも、デオキシリボース残基でもよく、前者の場合、前記ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチド残基であり、後者の場合、前記ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等があげられる。また、前記ヌクレオチド残基におけるリン酸基は、特に制限されず、例えば、一リン酸でも、二リン酸があげられる。前記核酸モノマーの具体例としては、例えば、ＡＭＰ、デオキシＡＭＰ（ｄＡＭＰ）等があげられる。
　前記酵素処理工程において、前記酵素は、特に制限されず、前記核酸モノマーを基質とする反応を触媒するタンパク質であればよい。前記酵素は、特に制限されず、例えば、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質等があげられ、好ましくはルシフェラーゼである。
　前記酵素は、例えば、前記ヌクレアーゼ処理工程で切り出される核酸モノマーの種類に応じて、適宜設定できる。
　前記酵素処理工程は、例えば、試薬の存在下で、前記酵素反応を行ってもよい。前記試薬は、例えば、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬でもよいし、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬でもよい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルでもよいし、電気的シグナルでもよい。
　前記ヌクレアーゼ処理工程と前記酵素処理工程との順序は、特に制限されず、前記ヌクレアーゼ処理工程の後に前記酵素処理工程を行ってもよいし、前記両工程を同時に行ってもよい。
　また、本発明の分析方法は、例えば、さらに、前記ヌクレアーゼ処理工程で切り出された前記核酸モノマーについて、リン酸基が三リン酸であるヌクレオチドへの変換処理工程を含むことが好ましい。具体的には、前記ヌクレアーゼ処理工程で、一リン酸または二リン酸のヌクレオチドが前記核酸モノマーとして切り出された場合、例えば、前記変換処理工程において、前記核酸モノマーを、三リン酸のヌクレオチドに変換する。前記変換処理工程を含むことによって、さらに感度を向上できる。
　前記変換処理工程において、前記三リン酸のヌクレオチドへの変換は、例えば、一リン酸または二リン酸のヌクレオチドを三リン酸のヌクレオチドに変換する変換酵素が使用できる。前記変換酵素は、特に制限されず、例えば、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ等があげられる。
　前記変換処理工程において、前記核酸モノマーを三リン酸のヌクレオチドに変換した場合、前記酵素処理工程においては、前記三リン酸のヌクレオチドを基質とする酵素を使用することが好ましい。前記三リン酸のヌクレオチドを基質とする酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ等が使用できる。
　前記ヌクレアーゼ処理工程と前記変換処理工程と前記酵素処理工程との順序は、特に制限されず、この順序で行ってもよいし、前記ヌクレアーゼ処理工程と前記変換処理工程を同時に行ってもよいし、前記変換処理工程と前記酵素処理工程を同時に行ってもよいし、前記３工程を同時に行ってもよい。
　前記検出工程において、前記酵素の酵素反応の検出は、特に制限されない。前記検出は、例えば、前記酵素反応による前記基質の減少を、直接的または間接的に検出することで行うことができる。後者は、例えば、前記酵素反応により生じるシグナルの検出であり、具体例として、例えば、前記酵素反応により前記試薬から生じたシグナルでもよい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルでもよいし、電気的シグナルでもよい。
　前記光学的シグナルは、例えば、発光、蛍光、発色等のシグナルがあげられる。前記光学シグナルは、例えば、発光、蛍光、発色等を目視観察で検出してもよいし、発光強度、蛍光強度、吸光度、反射率等をシグナルとして、光学的手法で検出することもできる。
　前記電気的シグナルは、例えば、電流等があげられる。前記電気的シグナルは、例えば、電気的手法により検出できる。
　前記分析工程は、前記検出工程における前記酵素反応の検出結果から、前記複合体画分に含まれる前記ターゲットを分析する工程である。前記酵素反応の検出結果は、例えば、前記複合体の画分に対する酵素反応の結果でもよいし、前記複合体以外の画分に対する酵素反応の結果でもよいし、前記複合体形成工程における反応系（すなわち、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分との混合系）に対する酵素反応の結果でもよい。
　本発明の分析方法の具体例として、以下に、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分との分離を行う実施形態１と、前記２つの画分の分離を行わない実施形態２と、前記結合核酸分子と、前記結合核酸分子に対する相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体を使用する実施形態３をあげて説明する。なお、本発明は、これらの実施形態には制限されない。また、各実施形態は、特に示さない限り、他の実施形態にも援用できる。
（１）実施形態１
　本発明の実施形態１は、前述のように、前記複合体形成工程後、前記複合体形成工程の反応系から、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離する形態であり、例えば、以下の実施形態１Ａ、１Ｂおよび１Ｃが例示できる。
　まず、本発明の実施形態１Ａは、前記複合体の画分についてヌクレアーゼ処理を施す形態であり、具体的には、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程、前記複合体の画分から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
　本実施形態１Ａでは、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離していることから、前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体における前記結合核酸分子から核酸モノマーが遊離され、酵素処理工程において、前記遊離した前記核酸モノマーを基質として酵素反応が行われる。このため、前記検出工程における前記酵素反応の検出結果は、前記複合体の検出結果となり、間接的に、前記複合体に含まれるターゲットの検出結果となる。
　本実施形態１Ａにおいては、前記結合核酸分子として、ポリヌクレオチド（以下、付加ポリヌクレオチドともいう）が付加された結合核酸分子を使用することが好ましい。前記ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子を使用することにより、例えば、前記複合体における前記結合核酸分子から遊離される核酸モノマーの数を増加できる。前記遊離した核酸モノマーは、前記酵素処理工程における基質となるため、遊離される前記核酸モノマーの数の増加に伴って、検出感度をさらに向上できる。
　前記結合核酸分子に付加されたポリヌクレオチドは、特に制限されない。前記付加ポリヌクレオチドの長さは、下限が、例えば、０塩基、１０塩基、２０塩基であり、上限が、例えば、１０００塩基、２００塩基、２０塩基である。
　前記付加ポリヌクレオチドを構成する核酸モノマーの種類は、特に制限されず、例えば、前記酵素処理工程で使用する酵素の基質特異性に応じて、適宜決定できる。前記付加ポリヌクレオチドにおいて、前記核酸モノマーは、それぞれ、例えば、ホスホジエステル結合により連結されている。前記核酸モノマーは、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における糖残基は、例えば、リボース残基でも、デオキシリボース残基でもよく、前者の場合、前記ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチド残基であり、後者の場合、前記ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基における塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等があげられる。また、前記ヌクレオチド残基におけるリン酸基は、特に制限されず、例えば、一リン酸でも、二リン酸でも、三リン酸でもよい。前記核酸モノマーの具体例としては、例えば、ＡＭＰ、デオキシＡＭＰ（ｄＡＭＰ）等があげられる。前記付加ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。前記付加ポリヌクレオチドは、中でも、ＡＭＰおよびデオキシＡＭＰ（ｄＡＭＰ）の少なくとも一方から構成されていることが好ましく、より好ましくは、いずれか一種類のヌクレオチド残基から構成されている。
　前記付加ポリヌクレオチドは、例えば、前記結合核酸分子の３’末端に付加されてもよいし、前記結合核酸分子の５’末端に付加されてもよい。前記結合核酸分子における付加の位置は、例えば、前記ヌクレアーゼの特性に応じて適宜決定できる。前記ヌクレアーゼが、例えば、５’末端から３’末端の方向に、前記核酸モノマーを遊離していく場合、前記付加ポリヌクレオチドは、前記結合核酸分子の５’末端に付加されていることが好ましく、前記ヌクレアーゼが、例えば、３’末端から５’末端の方向に、前記核酸モノマーを遊離していく場合、前記付加ポリヌクレオチドは、前記結合核酸分子の３’末端に付加されていることが好ましい。
　本実施形態１Ａについて、図１を参照して、前記付加ポリヌクレオチドを付加した結合核酸分子を使用する例を説明する。図１は、本発明の実施形態１Ａの概略を示す模式図であり、（Ａ）－（Ｄ）は、各工程を示す。なお、図１は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記付加ポリヌクレオチドの大きさ等の条件は、これには制限されない。
　まず、前記複合体形成工程において、図１（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料と、付加ポリヌクレオチド１３が付加された結合核酸分子１２とを接触させる。これによって、図１（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記試料中のターゲット１１と、付加ポリヌクレオチド１３が付加された結合核酸分子１２とが、複合体を形成する。この際、前記複合体形成に関与しなかった未反応の結合核酸分子１２も、前記反応液に共存する。
　そして、前記分離工程において、図１（Ｃ）に示すように、前記反応液を、担体１４に固定化した結合物質１５と接触させる。結合物質１５は、ターゲット１１に結合する物質である。このため、図１（Ｃ）に示すように、前記反応液に含まれる前記複合体が、ターゲット１１と結合物質１５との結合を介して、担体１４に結合する。この際、前記未反応の結合核酸分子１２は、担体１４に結合することなく、前記反応液中で遊離状態となる。
　つぎに、前記反応液について、前記複合体が結合した担体１４と、それ以外の画分とを分離する。具体的には、例えば、担体１４から液体画分を除去する。そして、担体１４にヌクレアーゼを添加し、ヌクレアーゼ処理を行う。これによって、図１（Ｄ）の左図に示すように、担体１４に結合した前記複合体における付加ポリヌクレオチド１３が分解され、核酸モノマー１３’が切り出される。
　そして、付加ポリヌクレオチド１３から切り出された核酸モノマー１３’を、核酸モノマーを基質とする酵素で処理し、その酵素反応を検出する。これによって、前記試料中のターゲットを分析できる。
　つぎに、本発明の実施形態１Ｂは、前記複合体以外の画分についてヌクレアーゼ処理を施す形態であり、具体的に、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程、前記複合体以外の画分から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
　本実施形態１Ｂは、前記結合核酸分子への前記付加ポリヌクレオチドの付加が任意であり、前記複合体以外の画分についてヌクレアーゼ処理を行い、それにより遊離した核酸モノマーについて酵素処理を行い、前記酵素反応を検出する以外は、前記実施形態１Ａと同様にして行うことができ、前記実施形態１Ａの記載を援用できる。
　本実施形態１Ｂの場合、前記複合体以外の画分には、前記複合体形成に関与しなかった未反応の前記結合核酸分子が含まれる。したがって、この未反応の前記結合核酸分子をヌクレアーゼ処理し、それにより遊離した核酸モノマーを検出することで、未反応の前記結合核酸分子を分析できる。未反応の前記結合核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した前記結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
　本実施形態１Ｂは、前記結合核酸分子として、前記付加ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子を使用することが好ましい。前記ポリヌクレオチドが付加されていることにより、例えば、前記複合体における前記結合核酸分子から遊離される核酸モノマーの数を増加できる。前記遊離した核酸モノマーは、前記酵素処理工程における基質となるため、遊離される前記核酸モノマーの数の増加に伴って、検出感度をさらに向上できる。前記付加ポリヌクレオチドの条件は、特に制限されず、前記実施形態１Ａの例示を援用できる。
　本実施形態１Ｂは、前記実施形態１Ａと同様に、図１を参照できる。前記実施形態１Ａと同様にして、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分を分離する。そして、前記複合体以外の画分に対してヌクレアーゼ処理を行うことによって、図１（Ｄ）の右図に示すように、未反応の核酸分子１２に付加された付加ポリヌクレオチド１３から、核酸モノマー１３’が切り出される。そして、この核酸モノマー１３’を、前記実施形態１Ａと同様に、酵素処理し、その酵素反応を検出する。これによって、間接的に、前記試料中のターゲットを分析できる。
　前記実施形態１Ａおよび１Ｂについて、図１では、付加ポリヌクレオチド１３が付加された結合核酸分子１２を示したが、前記実施形態１Ｂは、これには制限されず、例えば、付加ポリヌクレオチド１３が付加されていない結合核酸分子１２であってもよい。
　つぎに、本発明の実施形態１Ｃは、前記結合核酸分子として、担体に担持された結合核酸分子を使用する形態であり、それ以外は、例えば、前記実施形態１Ａおよび１Ｂと同様である。
　本実施形態１Ｃにおいて、前記担体に担持される結合核酸分子の個数は、特に制限されず、１分子でもよいし、２分子以上の複数分子であってもよい。ヌクレアーゼ処理によって遊離される核酸モノマー量を増加できることから、前記担体には、複数分子の前記結合核酸分子が担持されていることが好ましい。
　前記担体は、例えば、結合核酸分子のみを担持してもよいし、ヌクレアーゼ処理によって遊離される核酸モノマー量を増加できることから、さらに、ポリヌクレオチドを担持してもよい。前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、前記実施形態１Ａに示すポリヌクレオチドが例示できる。
　前記担体は、特に制限されず、前述のような担体が例示でき、中でも、ビーズが好ましい。
　本実施形態１Ｃについて、図２を参照して、前記担体に担持された結合核酸分子を使用する例を説明する。図２は、本発明の実施形態１Ｃの概略を示す模式図であり、（Ａ）－（Ｄ）は、各工程を示す。なお、図２は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記付加ポリヌクレオチドの大きさ等の条件は、これには制限されない。
　本実施形態１Ｃでは、前記複合体形成工程において、図２（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料と、担体２０とを接触させる。担体２０は、複数の結合核酸分子１２および複数のポリヌクレオチド１３を担持している。これによって、図２（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記試料中のターゲット１１と、担体２０が担持する結合核酸分子１２とが、複合体を形成する。この際、前記複合体形成に関与しなかった未反応の結合核酸分子１２も、前記反応液に共存する。その後は、前記実施形態１Ａおよび１Ｂと同様である。
　図２に示すように、担体２０は、複数の結合核酸分子１２および複数のポリヌクレオチド１３を担持していることから、例えば、前記実施形態１Ａにおける前記複合体の画分のヌクレアーゼ処理によっても、前記実施形態１Ｂにおける前記複合体以外の画分のヌクレアーゼ処理によっても、多くの核酸モノマーを遊離できる。このため、より感度の高い分析が可能になる。
（２）実施形態２
　本発明の実施形態２は、前述のように、前記複合体形成工程後、前記複合体の画分と前記複合体以外の画分とを分離することなく、前記複合体形成工程の反応系についてヌクレアーゼ処理を施す形態である。
　すなわち、本実施形態２は、ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
　本実施形態２においては、前記複合体と、前記複合体形成に関与していない未反応の前記結合核酸分子とが共存する反応系について、前記ヌクレアーゼ処理を行う。しかしながら、前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成すると、前記複合体における前記結合核酸分子は、物理的障害が原因となり、前記ヌクレアーゼによって分解され難くなる。このため、前記反応系のヌクレアーゼ処理において、前記ヌクレアーゼによって、前記ターゲットに結合した前記結合核酸分子からは核酸モノマーが遊離せず、前記複合体形成に関与していない未反応の前記結合核酸分子のみから核酸モノマーが遊離する。したがって、本実施形態２では、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分との分離が不要である。また、未反応の前記結合核酸分子のみから核酸モノマーを遊離させ、前記遊離した核酸モノマーを検出することで、未反応の前記結合核酸分子を分析できる。未反応の前記結合核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した前記結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
　本実施形態においては、前記付加ポリヌクレオチドが付加されていない前記結合核酸分子を使用することが好ましい。前記付加ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子を使用する場合、前記付加ポリヌクレオチドの長さは、特に制限されないが、上限が、例えば、５塩基、３塩基、１塩基である。
（３）実施形態３
　本発明の実施形態３は、前述のように、前記結合核酸分子と、前記結合核酸分子に対する相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体を使用する形態であり、例えば、以下の実施形態３Ａおよび３Ｂが例示できる。
　まず、本発明の実施形態３Ａは、前述のように、前記結合核酸分子が、相補配列を含む前記一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体である形態であり、具体的には、前記ハイブリット形成体と試料とを接触させ、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリット形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させる複合体形成工程、前記複合体形成の反応系から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、前記酵素反応を検出する検出工程、および、前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とする。
　本実施形態３Ａでは、前記ヌクレアーゼ処理工程において、一本鎖の核酸を基質とするヌクレアーゼを使用することで、前記複合体からは核酸モノマーを遊離させることなく、前記ハイブリッド形成体より遊離した前記一本鎖核酸分子のみから、前記核酸モノマーを遊離することができる。そして、前記遊離した前記一本鎖核酸分子をヌクレアーゼ処理し、それにより遊離した核酸モノマーを検出することで、前記ハイブリット形成体から遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できる。遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した前記結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
　前記一本鎖核酸分子は、前記結合核酸分子に対する相補配列を有しており、前記結合核酸分子にハイブリダイズできればよい。前記一本鎖核酸分子の長さは、特に制限されず、前記結合核酸分子に応じて適宜設定できる。前記結合核酸分子の長さと前記一本鎖核酸分子の長さの比は、特に制限されず制限されず、前記一本鎖核酸分子は、前記結合核酸分子に対して、例えば、１分の１～１０００分の１である。前記一本鎖核酸分子は、前記結合核酸分子のいずれの領域に結合してもよい。
　本実施形態３で使用するヌクレアーゼは、前述のように、一本鎖の核酸を基質とするヌクレアーゼであればよい。
　本実施形態３Ａについて、図３を参照して、前記結合核酸分子と前記一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体を使用する例を説明する。図３は、本発明の実施形態３の概略を示す模式図である。なお、図３は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記一本鎖核酸分子の大きさ等の条件は、これには制限されない。
　本実施形態３Ａでは、前記複合体形成工程において、図３（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料を、結合核酸分子１２と一本鎖核酸分子３０とのハイブリット形成体と接触させる。これによって、図３（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記ハイブリッド形成体における結合核酸分子１２は、前記試料中のターゲット１１と結合し、前記ハイブリット形成体における一本鎖核酸分子３０は、遊離する。そして、前記複合体と遊離した一本鎖核酸３０とを含む前記反応液を、一本鎖核酸を基質とするヌクレアーゼで処理することによって、図３（Ｃ）に示すように、前記複合体からは核酸モノマーが遊離せず、一本鎖核酸分子３０のみから核酸モノマー３０’が切り出される。そして、一本鎖核酸分子３０から遊離した核酸モノマー３０’について、酵素処理し、酵素反応を検出する。これによって、遊離した一本鎖核酸分子３０を検出でき、間接的に、前記試料中のターゲットを分析できる。
　つぎに、本実施形態３Ｂは、前記ハイブリッド形成体が、担体に担持された形態である。本実施形態３Ｂは、前記担体に担持された前記ハイブリット形成体を使用し、前記複合体形成工程後に、前記担体を含む固体画分と液体画分とを分離し、前記液体画分について、前記ヌクレオチド処理および酵素処理を行う以外は、前記実施形態３Ａと同様である。
　本実施形態３Ｂにおいては、前記固体画分、すなわち、前記担体を含む画分には、担持した結合核酸分子がターゲットと結合して複合体を形成した担体と、担持した結合核酸分子がターゲットと結合していない未反応の担体とが含まれ、他方、液体画分には、遊離した前記一本鎖核酸分子が含まれる。このため、前記液体画分をヌクレアーゼ処理し、核酸モノマーを遊離させ、これを酵素処理して、酵素反応を検出することで、前記ハイブリット形成体から遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できる。遊離した前記一本鎖核酸分子を分析できれば、その結果から、前記複合体形成に関与した結合核酸分子も分析できるため、結果的に、前記複合体を形成したターゲットを分析できる。
　本実施形態３Ｂについて、図４を参照して、前記結合核酸分子と前記一本鎖核酸分子とのハイブリッド形成体を担持した担体を使用する例を説明する。図４は、本発明の実施形態３Ｂの概略を示す模式図である。なお、図４は、模式図であって、例えば、ターゲット、前記結合核酸分子および前記一本鎖核酸分子の大きさ等の条件は、これには制限されない。
　本実施形態３Ｂでは、前記複合体形成工程において、図４（Ａ）に示すように、ターゲット１１を含む試料を、結合核酸分子１２と一本鎖核酸分子３０とのハイブリット形成体を担持する担体２０と接触させる。これによって、図４（Ｂ）に示すように、前記複合体形成工程の反応液において、前記ハイブリッド形成体における結合核酸分子１２は、前記試料中のターゲット１１と結合し、前記ハイブリット形成体における一本鎖核酸分子３０は、遊離する。つぎに、前記反応液を、担体２０を含む固体画分と、遊離した一本鎖核酸分子３０を含む液体画分に分離する。そして、遊離した一本鎖核酸分子３０をヌクレアーゼで処理することによって、図４（Ｄ）に示すように、一本鎖核酸分子３０から核酸モノマー３０’が切り出される。そして、一本鎖核酸分子３０から遊離した核酸モノマー３０’について、酵素処理し、酵素反応を検出する。これによって、遊離した一本鎖核酸分子３０を検出でき、間接的に、前記試料中のターゲットを分析できる。
＜ターゲットの分析キット＞
　本発明のターゲットの分析キットは、ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、前記本発明のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析キットによれば、前記本発明の分析方法を容易に行うことができる。なお、本発明の分析キットは、前記本発明の分析方法の記載を援用できる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　ヌクレアーゼ処理によって核酸分子から核酸モノマーを遊離させ、前記遊離した核酸モノマーをルシフェラーゼで検出した。
　核酸分子として、下記配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ（Ｎ３０－０７９）を使用した。
Ｎ３０－０７９（配列番号１）
　5’－GGATTGAACGCCGCCCTTATAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATCAGGTCCAGTGCTCTCGTATAG－3’
　前記核酸分子とＤＮＡエンドヌクレアーゼ（商品名ＢＡＬ３１　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＫＡＲＡ社製）とを下記表１の割合で混合し、３０℃で３０分間インキュベートすることによって、前記核酸分子から核酸モノマーを遊離した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記ヌクレアーゼ処理後の反応液を、超純水で、所定倍率（１０１倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍または１０５倍）に希釈し、希釈試料を作製した。そして、前記希釈試料を、ＡＭＰ検査キット（商品名ルシパックペン、キッコーマン社製）に添加し、測定装置（商品名ルミテスターＰＤ－２０、キッコーマン社製）を用いて、前記希釈試料の相対的発光量を測定した。ネガティブコントロールは、１μｍｏｌ／ＬのＮ３０－０７９を前記ヌクレアーゼ処理しなかった以外は、同様にして相対的発光量を測定した。また、コントロールは、前記核酸分子に代えて、前記２×ＢＡＬ　Ｂｕｆｆｅｒを用いた以外は、同様にして相対的発光量を測定した（Ｎ＝３）。
　これらの結果を図５に示す。図５は、相対的発光量を示すグラフである。図５において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、相対的発光量を示し、図中の数値は、各サンプルの相対的発光量を示す。図５に示すように、ネガティブコントロールおよびコントロールでは、発光が測定されなかった。これに対し、前記希釈試料では、いずれの核酸分子を用いた場合においても、強い発光が測定された。これらの結果から、ヌクレアーゼ処理によって核酸分子から核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素と反応させることで、発光を測定できることがわかった。
［実施例２］
　ヌクレアーゼとルシフェラーゼとを共存させることによって、核酸分子からの核酸モノマーの遊離と前記遊離した核酸モノマーの検出とを同時に行った。
　Ｎ３０－０７９と前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとを、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを１Ｕｎｉｔとした以外は、前記表１と同様の割合で混合し、試料とした。つぎに、前記試料を前記ＡＭＰ検査キットに添加し、２０分間静置した。そして、前記測定装置を用いて、１５秒毎に、前記試料の相対的発光量を測定した。
　これらの結果を図６に示す。図６は、相対的発光量を示すグラフである。図６において、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、相対的発光量を示す。なお、前記反応時間は、前記試料を前記ＡＭＰ検査キットに添加した時を基準としている。図６に示すように、いずれの時間においても、強い発光が測定された。これらの結果から、ヌクレアーゼ処理工程と酵素処理工程とを同時に行っても、核酸分子を検出できることがわかった。
［実施例３］
　インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に結合する結合核酸分子（アプタマー）とＨＡとの複合体を形成し、ヌクレアーゼ処理によって前記複合体から核酸モノマーを遊離させ、前記遊離した核酸モノマーをルシフェラーゼで検出した。
　インフルエンザウイルスのＨＡに結合するアプタマー（ＲＨＡ０００６）として、下記配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡを使用した。前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリｄＡを付加した。つぎに、前記アプタマーを、１００ｎｍｏｌ／ＬとなるようにＴＢＳ緩衝液に混合した。前記ＴＢＳ緩衝液の組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）　２０、ｐＨ７．４とした。そして、前記アプタマー液を９５度で５分間熱処理し、さらに、５分間氷上で静置した。
ＲＨＡ０００６（配列番号２）
　5’－GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA－3’
　次に、ＨＡとして、インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）由来ＨＡを使用した。前記ＨＡを、ＴＢＳ緩衝液で、所定濃度（０、１０１、１０２、１０３、１０４または１０５ｐｍｏｌ／Ｌ）となるように希釈し、希釈試料とした。
　９６穴プレート（商品名　Nunc-Immuno（登録商標）　plate，　Maxisorp（登録商標）、Nunc社）に、前記希釈試料を、ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で１６時間吸着させた。前記ウェルを２００μＬの前記ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｒｅｅ（ＴＢＳ）　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を２００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記静置後のアプタマー液を１００μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。そして、前記ウェルを２００μＬの前記ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。
　次に、ＢＡＬ３１　Ｎｕｃｌｅａｓｅをウェルあたり２０μＬ（３Ｕｎｉｔｓ／ｗｅｌｌ）添加し、室温で２０分間インキュベートした。前記インキュベート後、前記ウェルの溶液をＡＭＰ検査キットに添加し、前記実施例１と同様に、相対的発光量を測定した（Ｎ＝３）。
　これらの結果を図７に示す。図７は、相対的発光量を示すグラフである。図７において、横軸は、前記希釈試料におけるＨＡの濃度を示し、縦軸は、相対的発光量を示す。図７に示すように、０ｐｍｏｌ／Ｌの希釈試料では、発光が測定されないのに対し、前記希釈試料では、いずれのＨＡ濃度においても、発光が測定された。これらの結果から、結合核酸分子とターゲットとの複合体の画分から、ヌクレアーゼ処理によって核酸分子から核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素と反応させることで、発光を測定できることがわかった。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１３年９月３０日に出願された日本出願特願２０１３－２０５０５１を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
　本発明によれば、前記ターゲットと前記結合核酸分子との複合体を形成させ、前記複合体の画分または前記複合体以外の画分からの核酸モノマーを遊離させ、遊離した核酸モノマーを基質とする酵素反応を行うことで、容易に、ターゲットを検出できる。この方法によれば、例えば、前述のようにアプタマーにＤＮＡｚｙｍｅを連結させる必要がなく、このため、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を、ターゲットの存否によってＯＮ－ＯＦＦ制御することも不要である。また、本発明の分析キットによれば、前記本発明の分析方法を容易に実施できる。本発明は、アプタマーを使用するターゲットの検出方法であるため、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。

Claims (38)

  1. ターゲットに結合する結合核酸分子と試料とを接触させ、前記結合核酸分子と前記試料中のターゲットとの複合体を形成する複合体形成工程、
    前記複合体の画分および前記複合体以外の画分の少なくとも一方から、ヌクレアーゼ処理により核酸モノマーを遊離させるヌクレアーゼ処理工程、
    前記遊離した核酸モノマーを、核酸モノマーを基質とする酵素と反応させる酵素処理工程、
    前記酵素反応を検出する検出工程、および、
    前記酵素反応の検出結果から、前記複合体を形成したターゲットを分析する分析工程を含むことを特徴とするターゲットの分析方法。
  2. 前記複合体形成工程の後、
    さらに、前記複合体形成の反応系から、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離する分離工程を有する、請求項１記載の分析方法。
  3. 前記分離工程において、前記複合体形成の反応系と、固定化した結合物質とを接触させ、前記結合物質に前記複合体を結合させることで、前記複合体の画分と、前記複合体以外の画分とを分離し、
    前記結合物質が、前記ターゲットに結合する結合物質である、請求項２記載の分析方法。
  4. 前記分離工程において、前記結合物質に前記複合体を結合させた後、前記固定化した結合物質を洗浄し、未反応の前記結合核酸分子を除去する、請求項３記載の分析方法。
  5. 前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体画分をヌクレアーゼ処理し、前記複合体から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項２記載の分析方法。
  6. 前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体以外の画分をヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項２記載の分析方法。
  7. 前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、
    前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
  8. 前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
  9. 前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、
    前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項８記載の分析方法。
  10. 前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系を、ヌクレアーゼ処理し、未反応の前記結合核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１記載の分析方法。
  11. 前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
    前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、
    前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１記載の分析方法。
  12. 前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
    前記複合体形成工程において、前記ハイブリッド形成体と前記試料とを接触させ、前記ハイブリッド形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとの複合体を形成し、且つ、前記ハイブリッド形成体から前記一本鎖核酸分子を遊離させ、
    前記ヌクレアーゼ処理工程において、前記複合体形成工程の反応系をヌクレアーゼ処理し、遊離した前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１記載の分析方法。
  13. 前記複合体形成工程後、さらに、前記複合体形成工程の反応系から、遊離された前記一本鎖核酸分子を分離する分離工程を有し、
    前記ヌクレアーゼ処理工程において、分離した前記一本鎖核酸分子をヌクレアーゼ処理し、前記一本鎖核酸分子から前記核酸モノマーを遊離させる、請求項１２記載の分析方法。
  14. 前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の分析方法。
  15. 前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分析方法。
  16. 前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分析方法。
  17. 前記アデノシンヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である、請求項１６記載の分析方法。
  18. 前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の分析方法。
  19. 前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の分析方法。
  20. 前記酵素処理工程において、試薬の存在下、前記酵素反応を行い、
    前記試薬が、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記核酸モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の分析方法。
  21. 前記検出工程において、前記酵素反応により生じるシグナル、または、前記酵素反応により消失するシグナルを検出する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の分析方法。
  22. 前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である、請求項２０または２１記載の分析方法。
  23. 前記担体が、ビーズまたはプレートである、請求項８、９および１２のいずれか一項に記載の分析方法。
  24. ターゲットに結合する結合核酸分子、ヌクレアーゼ、および、核酸モノマーを基質とする酵素を含み、請求項１から２３のいずれか一項に記載のターゲットの分析方法に使用することを特徴とする分析キット。
  25. 前記結合核酸分子が、ポリヌクレオチドが付加された結合核酸分子であり、前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項２４記載の分析キット。
  26. 前記結合核酸分子が、担体に担持された結合核酸分子である、請求項２４または２５記載の分析キット。
  27. 前記担体が、さらに、ポリヌクレオチドが付加された担体であり、
    前記ポリヌクレオチドが、前記酵素が基質とする核酸モノマーを含むポリヌクレオチドである、請求項２６記載の分析キット。
  28. 前記結合核酸分子が、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
    前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する、請求項２４記載の分析キット。
  29. 前記ヌクレアーゼが、一本鎖の核酸分子を基質とするヌクレアーゼである、請求項２８記載の分析キット。
  30. 前記結合核酸分子が、担体に担持され、且つ、相補配列を含む一本鎖核酸分子とのハイブリット形成体であり、
    前記ターゲットとの接触により、前記ハイブリット形成体における前記結合核酸分子と前記ターゲットとが複合体を形成し、且つ、前記一本鎖核酸分子を遊離する、請求項２４記載の分析キット。
  31. 前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の分析キット。
  32. 前記酵素の基質である核酸モノマーが、アデノシンヌクレオチドである、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の分析キット。
  33. 前記アデノシンヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一方である、請求項３２記載の分析キット。
  34. 前記酵素が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の分析キット。
  35. 前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項２４から３４のいずれか一項に記載の分析キット。
  36. さらに、試薬を含み、
    前記試薬が、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを生じる試薬、または、前記モノマーを基質とする酵素反応によりシグナルを消失する試薬である、請求項２４から３５のいずれか一項に記載の分析キット。
  37. 前記シグナルが、光学的シグナルおよび電気的シグナルの少なくとも一方である、請求項３６記載の分析キット。
  38. 前記担体が、ビーズまたはプレートである、請求項２６、２７および３０のいずれか一項に記載の分析キット。
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