CN105579589A - 用于分析靶标的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可以使用结合核酸分子容易地分析靶标的新方法以及用于在该方法中使用的分析试剂盒。本发明的分析方法包括：使得与所述靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标的复合物的复合物形成步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中的至少一个释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶进行反应的酶处理步骤；检测所述酶反应的检测步骤；和根据检测所述酶反应的结果分析已经形成了所述复合物的所述靶标的分析步骤。

Description

用于分析靶标的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于分析靶标的方法和试剂盒。
背景技术
近年来，已经尝试使用包括与靶标特异性结合的结合核酸分子(所谓的“适体(aptamer)”)在内的传感器代替与靶标特异性结合的抗体进行靶标检测。作为这样的传感器，例如，已经报道了被配置为使得具有催化氧化还原反应能力的DNA(在下文中被称为“DNA酶”)与结合核酸分子连接从而检验靶标与结合核酸分子的结合的传感器(非专利文献1)。在这种传感器中，在不存在靶标的情况下发生结合核酸分子和DNA酶的自结合，由此抑制了DNA酶的催化能力(OFF)。另一方面，在靶标的存在下，自结合通过靶标与适体的接触而释放，由此活化了DNA酶的催化能力(ON)。因此，如果靶标存在，其催化能力被活化的DNA酶引起氧化还原反应，从而可以通过测量反应来间接地分析靶标。
然而，取决于存在或不存在靶标，上述传感器需要对在传感器中使用的DNA酶的催化能力的ON-OFF控制。此外，为了进一步提高在使用传感器的分析中的分析灵敏度，例如，需要使用展现出更强催化能力的DNA酶。
使用结合核酸分子(适体)的ELAA(酶联适体测定(Enzyme-linkedAptamerAssay))是例如使用以生物素标记的结合核酸分子的方法。在这种方法中，与链霉抗生物素蛋白融合的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，与生物素标记的核酸分子结合，并且通过检测酶的底物来分析靶标与结合核酸分子的结合。然而，在ELAA中，结合核酸分子的标记是必需的，并且为了提高分析灵敏度，例如需要改善各种条件设置。
如上所述，在使用上述传感器的情况下，需要使各种改进从而进行更可靠的分析。
这些情况下，存在对能够使用结合核酸分子容易地检测靶标并且还能够容易地提高分析灵敏度的方法的需求。
引用清单
非专利文献
[非专利文献1]CarstenTeller等人，Anal.Chem.2009，81，pp.9114-9119
发明概述
本发明要解决的问题
考虑到前述内容，本发明的目的是提供可以使用结合核酸分子容易地分析靶标的新方法以及用于在该方法中使用的分析试剂盒。
解决问题的手段
本发明提供用于分析靶标的分析方法，其包括：使得与所述靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标的复合物的复合物形成步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中的至少一个释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶进行反应的酶处理步骤；检测所述酶反应的检测步骤；和根据检测所述酶反应的结果分析已经形成了所述复合物的所述靶标的分析步骤。
本发明还提供用于在根据本发明的分析方法中使用的分析试剂盒，其包括：与靶标结合的结合核酸分子；核酸酶；和以核酸单体为底物的酶。
本发明的效果
根据本发明的分析方法，可以通过下列方式容易地检测靶标：形成靶标和结合核酸分子的复合物，将核酸单体从复合物级分或非复合物级分释放，以及进行与作为底物的释放的核酸单体的酶反应。根据这种方法，例如，不必如上文所述的那样使DNA酶与适体连接，从而取决于存在或不存在靶标的对DNA酶的催化能力的ON-OFF控制也不是必需的。此外，根据本发明的分析试剂盒，能够容易地进行本发明的分析方法。因为本发明涉及使用适体的靶标检测方法，可以认为，例如，本发明是用于各种领域(如临床医疗实践、食品和环境)中的研究和试验的非常有用的技术。
附图简述
[图1]图1是示出本发明的分析方法的一个实例的示意图。
[图2]图2是示出本发明的分析方法的另一个实例的示意图。
[图3]图3是示出本发明的分析方法的又一个实例的示意图。
[图4]图4是示出本发明的分析方法的此外另一个实例的示意图。
[图5]图5是显示实施例1中发光量的图表。
[图6]图6是显示实施例2中发光量的图表。
[图7]图7是显示实施例3中发光量的图表。
[用于实施本发明的方式]
如上所述，本发明的分析方法是用于分析靶标的分析方法，其包括：使得与所述靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标的复合物的复合物形成步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中的至少一个释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶进行反应的酶处理步骤；检测所述酶反应的检测步骤；和根据检测所述酶反应的结果分析已经形成了所述复合物的所述靶标的分析步骤。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，其还包括，在所述复合物形成步骤之后的将所述复合物级分和所述非复合物级分与用于所述复合物形成的反应体系分离的分离步骤。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述分离步骤中，通过使得用于所述复合物形成的所述反应体系与固定的结合物质彼此接触以将所述复合物与所述结合物质结合，而将所述复合物级分和所述非复合物级分分离，并且所述结合物质是与靶标结合的结合物质。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述分离步骤中，在所述复合物已经与所述结合物质结合之后，洗涤所述固定的结合物质以移除未反应的结合核酸分子。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物级分进行所述核酸酶处理将所述核酸单体从所述复合物释放。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述核酸酶处理步骤中，对所述非复合物级分进行所述核酸酶处理将所述核酸单体从未反应的结合核酸分子释放。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子包含添加到其上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子负载在载体上。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述载体还包含添加到其上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从未反应的结合核酸分子释放。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列；在所述复合物形成步骤中，使得所述杂交体和所述样品彼此接触以形成在所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标的复合物并且将所述单链核酸分子从所述杂交体释放；并且在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从所述释放的单链核酸分子释放。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子负载在载体上并且是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列；在所述复合物形成步骤中，使得所述杂交体和所述样品彼此接触以形成在所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标的复合物并且将所述单链核酸分子从所述杂交体释放；并且在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从所述释放的单链核酸分子释放。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，其还包括，在所述复合物形成步骤之后的将所述释放的单链核酸分子与所述复合物形成步骤中的反应体系分离的分离步骤，并且在所述核酸酶处理步骤中，对所述分离的单链核酸分子进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从所述单链核酸分子释放。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述核酸酶是以所述单链核酸分子为底物的核酸酶。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述核酸酶是核酸外切酶。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，作为所述酶的底物的所述核酸单体是腺苷核苷酸，其可以是，例如，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述酶是具有荧光素酶活性的蛋白质，并且其具体实例是荧光素酶。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述酶处理步骤中，所述酶反应在试剂的存在下进行，并且
所述试剂是使得信号通过与以所述核酸单体为底物的酶反应而产生的试剂，或者是使得信号通过与以所述核酸单体为底物的酶反应而消失的试剂。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，在所述检测步骤中，检测到通过所述酶反应产生的信号或通过所述酶反应导致消失的信号。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述信号是光信号和电信号中的至少一种。
本发明的分析方法可以被配置为使得：例如，所述载体是珠或平板。
本发明的分析试剂盒是，例如，用于在根据本发明的分析方法中使用的分析试剂盒，其包括：与靶标结合的结合核酸分子；核酸酶；和以核酸单体为底物的酶。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子包含添加到其上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子负载在载体上。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述载体还包含添加到其上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，并且通过与所述靶标接触，所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标形成复合物并且释放所述单链核酸分子。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述核酸酶是以所述单链核酸分子为底物的核酸酶。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述结合核酸分子负载在载体上并且是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，并且通过与所述靶标接触，所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标形成复合物并且释放所述单链核酸分子。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述核酸酶是核酸外切酶。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，作为所述酶的底物的所述核酸单体是腺苷核苷酸，其可以是，例如，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述酶是具有荧光素酶活性的蛋白质，并且其具体实例是荧光素酶。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，其还包括试剂，并且所述试剂是使得信号通过与以所述单体为底物的酶反应而产生的试剂，或者是使得信号通过与以所述单体为底物的酶反应而消失的试剂。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述信号是光信号和电信号中的至少一种。
本发明的分析试剂盒可以被配置为使得：例如，所述载体是珠或平板。
(靶标分析方法)
如上所述，本发明的靶标分析方法是用于分析靶标的分析方法，其包括：使得与所述靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标的复合物的复合物形成步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中的至少一个释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶进行反应的酶处理步骤；检测所述酶反应的检测步骤；和根据检测所述酶反应的结果分析已经形成了所述复合物的所述靶标的分析步骤。在本发明中，术语“分析”是包括，例如定量分析、半定量分析和定性分析的概念。
在复合物形成步骤中，对结合核酸分子没有特别地限定，只要其与靶标结合即可。例如，结合核酸分子也被称为适体。
对靶标没有特别地限定，并且可以选择任何靶标。那么，取决于所选择的靶标，可以使用与靶标结合的结合核酸分子。靶标的实例包括微生物、病毒、低分子量化合物、食物变应原、农药和真菌毒素。
例如，结合核酸分子可以是单链或双链，并且优选是单链。对结合核酸分子的长度没有特别地限定。其下限是，例如，碱基长度为18、20、或24，并且其上限是，例如，碱基长度为120、60、或26。
在复合物形成步骤中，对样品没有特别地限定。例如，样品可以是含有靶标的样品或者对于其来说不知道存在或不存在靶标的样品。优选地，例如，样品是液体样品。
在核酸酶处理步骤中，例如，可以仅对复合物级分进行核酸酶处理，可以仅对非复合物级分进行核酸酶处理，或者可以对复合物形成步骤中的反应体系(即，含有复合物级分和非复合物级分的混合体系)进行核酸酶处理。
在仅对复合物级分或仅对非复合物级分进行核酸酶处理的情况下，优选的是，本发明包括在所述复合物形成步骤之后且在核酸酶处理步骤之前的将所述复合物级分和所述非复合物级分与用于所述复合物形成的反应体系分离的分离步骤。
对用于将复合物级分和非复合物级分分离的方法没有特别地限定。例如，通过将复合物与一个或多个载体结合并且通过收集所述一个或多个载体来收集复合物级分，可以将复合物级分和非复合物级分分离。例如，载体和复合物可以彼此直接结合，或者它们可以彼此间接结合。在前一种情况中，例如，可以使用适用于事先负载结合核酸分子的一个或多个载体。在这种情况下，形成了负载在一个或多个载体上的结合核酸分子和靶标的复合物，由此可以将复合物与一个或多个载体直接结合。在后一种情况中，例如，可以使用负载与靶标结合的结合物质的一个或多个载体。在这种情况下，形成了靶标和结合核酸分子的复合物，并且复合物中的结合核酸分子与负载在一个或多个载体上的结合物质结合，由此可以将复合物与一个或多个载体经由结合物质间接结合。
对载体没有特别地限定，并且其可以是，例如，珠或容器如平板。对结合物质没有特别地限定，并且其实例包括结合核酸分子和针对上述结合核酸分子的抗体。
当使用载体时，对用于将复合物级分和非复合物级分分离的方法没有特别地限定，并且其实例包括固液分离。当使用容器作为载体时，通过从容器收集液体级分，可以提供容器中的剩余级分作为复合物级分并且可以提供收集的液体级分作为非复合物级分。当使用珠作为载体时，通过将反应体系分离为固体级分和液体级分，可以提供前者作为复合物级分并且可以提供后者作为非复合物级分。例如，可以过滤、离心、静置等实现固体级分和液体级分的分离。
在本发明包括分离步骤并且对复合物级分进行核酸酶处理的情况下，本发明还可以包括，例如，在分离步骤和核酸酶处理步骤之间的洗涤复合物级分的步骤。通过洗涤复合物级分，例如，可以抑制被未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子污染，由此具有更高准确性的分析成为可能。
在核酸酶处理步骤中，对核酸酶没有特别地限定，只要其是将核酸单体从多核苷酸释放的酶即可。例如，核酸酶优选是将核酸单体从多核苷酸的末端释放的核酸外切酶。核酸单体的释放可以多核苷酸的3’端或5’端开始。核酸外切酶的实例包括蛇毒核酸酶、脾磷酸二酯酶、RNA酶H、BAL31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VII和λ核酸外切酶。核酸酶可以是，例如，作用于RNA的核糖核酸酶、作用于DNA的脱氧核糖核酸酶、或作用于RNA和DNA二者的核酸酶。
对要被核酸酶切割的核酸单体没有特别地限定，并且其可以是，例如核苷酸残基。核苷酸残基中的糖残基可以是，例如核糖残基或脱氧核糖残基。当糖残基是核糖残基时，核苷酸残基是核糖核苷酸残基。当糖残基是脱氧核糖残基时，核苷酸残基是脱氧核糖核苷酸残基。对核苷酸残基中的碱基没有特别地限定，并且其实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。对核苷酸残基中的磷酸基团没有特别地限定，并且其可以是，例如单磷酸或二磷酸。核酸单体的具体实例包括AMP和脱氧-AMP(dAMP)。
在酶处理步骤中，对酶没有特别地限定，只要其是催化与作为底物的核酸单体的反应的蛋白质即可。对酶没有特别地限定，并且其可以是，例如，具有荧光素酶活性的蛋白质，并且优选荧光素酶。
例如，根据核酸酶处理步骤中要切割的核酸单体的类型，可以适当地设定酶。
例如，在酶处理步骤中，酶反应可以在试剂的存在下进行。试剂可以是，例如，使得信号通过与作为底物的核酸单体的酶反应而产生的试剂，或者是使得信号通过与作为底物的核酸单体的酶反应而消失的试剂。例如，信号可以是光信号或电信号。
对进行核酸酶处理步骤和酶处理步骤的顺序没有特别地限定。酶处理步骤可以在核酸酶处理步骤之后进行，或者两个步骤可以同时进行。
例如，优选的是，本发明的分析方法还包括将核酸酶处理步骤中切割的核酸单体转化为在其中磷酸基团为三磷酸的核苷酸。例如，具体地，当在核酸酶处理步骤中具有单磷酸或二磷酸的核苷酸作为核酸单体被切割时，在转化处理步骤中将核酸单体转化为具有三磷酸的核苷酸。当分析方法还包括转化处理步骤时，可以进一步提高灵敏度。
在转化处理步骤中，使用例如用于将具有单磷酸或二磷酸的核苷酸转化为具有三磷酸的核苷酸的转化酶，可以实现向具有三磷酸的核苷酸的转化。对转化酶没有特别地限定，并且其实例包括丙酮酸正磷酸双激酶。
当在转化处理步骤中将核酸单体转化为具有三磷酸的核苷酸时，优选的是使用在酶处理步骤中具有三磷酸的核苷酸为底物的酶。作为具有三磷酸的核苷酸为底物的酶，例如，可以使用荧光素酶等。
对进行核酸酶处理步骤、转化处理步骤和酶处理步骤的顺序没有特别地限定。它们可以按此顺序进行；核酸酶处理步骤和转化处理步骤可以同时进行；转化处理步骤和酶处理步骤可以同时进行；或这三个步骤可以同时进行。
在检测步骤中，对由酶引起的酶反应的检测没有特别地限定。可以通过，例如，直接或间接检测由酶反应引起的底物的减少，完成检测。间接检测是，例如，对由酶反应产生的信号的检测。作为具体实例，信号可以是，例如通过酶反应由试剂产生的信号。例如，信号可以是光信号或电信号。
光信号可以是，例如，如发光、荧光、显色等的信号。例如，可以通过发光、荧光、显色等的视觉观察来检测光信号。备选地，可以通过光学方法检测发光强度、荧光强度、吸光度、反射率等作为信号。
例如，电信号可以是电流等。例如，可以通过电学方法检测电信号。
分析步骤是根据检测步骤中检测酶反应的结果分析复合物级分中含有的靶标的步骤。检测酶反应的结果可以是，例如，检测针对复合物级分进行的酶反应、针对非复合物级分进行的酶反应、或针对复合物形成步骤中的反应体系(即，含有复合物级分和非复合物级分的混合体系)进行的酶反应的结果。
以下将参照作为具体实例的下列实施方案描述本发明的分析方法：其中将复合物级分和非复合物级分分离的实施方案1，其中不将两种组分分离的实施方案2，以及其中使用各自由结合核酸分子和包含与结合核酸分子互补的序列的单链核酸分子组成的杂交体的实施方案3。然而，应指出的是，本发明决不限于这些示例性实施方案。除非另外说明，每个实施方案中的描述也适用于其他实施方案。
(1)实施方案1
如上所述，本发明的实施方案1涉及一个方面，其中在复合物形成步骤之后，将复合物级分和非复合物级分与复合物形成步骤中的反应体系分离。例如，可以给出以下要描述的实施方案1A、1B和1C作为实例。
首先，本发明的实施方案1A涉及一个方面，其中对复合物级分进行核酸酶处理。具体地，实施方案1A的分析方法包括：使得与靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成结合核酸分子与样品中靶标的复合物的复合物形成步骤；将复合物级分和非复合物级分与用于复合物形成的反应体系分离的分离步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤；检测酶反应的检测步骤；和根据检测酶反应的结果分析已经形成了复合物的靶标的分析步骤。
在实施方案1A中，将复合物级分和非复合物级分分离。因此，在核酸酶处理步骤中，将核酸单体从复合物中的结合核酸分子释放，并且在酶处理步骤中，引起了以释放的核酸单体作为底物的酶反应。因此，在检测步骤中检测酶反应的结果相当于检测复合物的结果，并且因此间接表明了检测复合物中含有的靶标的结果。
在实施方案1A中，作为结合核酸分子，优选使用已经向其添加了多核苷酸(在下文中也被称为“添加多核苷酸”)的结合核酸分子。例如，通过使用已经向其添加了多核苷酸的结合核酸分子，可以增加从复合物中的结合核酸分子释放的核酸单体的数量。因为释放的核酸单体充当酶处理步骤中的底物，在释放的核酸单体的数量增加时可以进一步提高检测灵敏度。
对添加至结合核酸分子的多核苷酸没有特别地限定。添加多核苷酸的长度的下限是，例如，0个碱基、10个碱基、或20个碱基，并且其上限是，例如，1000个碱基、200个碱基、或20个碱基。
对构成添加多核苷酸的核酸单体的类型没有特别地限定，并且例如，其可以根据将要在酶处理步骤中使用的酶的底物特异性适当地确定。例如，在添加多核苷酸中，核酸单体经由磷酸二酯键彼此连接。例如，核酸单体是核苷酸残基。核苷酸残基中的糖残基可以是，例如核糖残基或脱氧核糖残基。当糖残基是核糖残基时，核苷酸残基是核糖核苷酸残基。当糖残基是脱氧核糖残基时，核苷酸残基是脱氧核糖核苷酸残基。对核苷酸残基中的碱基没有特别地限定，并且其实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。对核苷酸残基中的磷酸基团没有特别地限定，并且其可以是，例如单磷酸、二磷酸、或三磷酸。核酸单体的具体实例包括AMP和脱氧-AMP(dAMP)。例如，添加多核苷酸可以由一种类型或两种以上类型的核苷酸残基构成。具体地，优选的是，添加多核苷酸由AMP和脱氧-AMP(dAMP)中的至少一种构成。更优选的是，添加多核苷酸由选自AMP和脱氧-AMP(dAMP)的一种类型的核苷酸残基构成。
例如，可以将添加多核苷酸添加至结合核酸分子的3’端或5’端。例如，可以根据核酸酶的性质适当地确定在结合核酸分子中添加添加多核苷酸的位置。在核酸酶将核酸单体从5’端向3’端释放的情况下，例如，优选将添加多核苷酸添加至结合核酸分子的5’端。在核酸酶将核酸单体从3’端向5’端释放的情况下，例如，优选将添加多核苷酸添加至结合核酸分子的3’端。
就实施方案1A而言，将参照图1描述在其中使用各自具有向其添加的添加多核苷酸的结合核酸分子的实例。图1是显示本发明的实施方案1A的概要的示意图，并且(A)至(D)示出了相应步骤。要指出的是，图1是示意图，并且例如，条件如靶标、结合核酸分子、添加多核苷酸等的尺寸不限于图1中所示的那些。
首先，在复合物形成步骤中，如在图1中的(A)中所示，使含有靶标11的样品与各自具有添加多核苷酸13的结合核酸分子12接触。作为结果，如在图1中的(B)中所示，在复合物形成步骤中的反应溶液中，由在样品中的靶标11和各自具有添加多核苷酸13的结合核酸分子12形成复合物。此时，未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子12还存在于反应溶液中。
之后，在分离步骤中，如在图1中的(C)中所示，使反应溶液与固定在载体14上的结合物质15接触。结合物质15是与靶标11结合的物质。因此，如在图1中的(C)中所示，反应溶液中含有的复合物经由靶标11和结合物质15之间的结合与载体14结合。此时，未反应的结合核酸分子12不与载体14结合，并且它们以游离状态存在于反应溶液中。
接下来，处理反应溶液从而分离结合有复合物的载体14以及除载体14外的级分。具体地，例如，将液体级分从载体14移除。之后，通过将核酸酶加入至载体14来进行核酸酶处理。通过核酸酶处理，如在图1中的(D)中左边所示，将与载体14结合的复合物中的添加多核苷酸13降解，由此切割核酸单体13’。
之后，利用以核酸单体为底物的酶处理从添加多核苷酸13切割的核酸单体13’，并且检测酶反应。因此，可以分析样品中的靶标。
接下来，本发明的实施方案1B涉及一个方面，其中对非复合物级分进行核酸酶处理。具体地，实施方案1B的分析方法包括：使得与靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成结合核酸分子与样品中靶标的复合物的复合物形成步骤；将复合物级分和非复合物级分与用于复合物形成的反应体系分离的分离步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从非复合物级分释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤；检测酶反应的检测步骤；和根据检测酶反应的结果分析已经形成了复合物的靶标的分析步骤。
可以以与实施方案1A的分析方法相同的方式进行实施方案1B的分析方法，不同之处在于：可以或可以不将添加多核苷酸添加至结合核酸分子；并且用酶处理通过用核酸酶处理非复合物级分释放的核酸单体，并且检测该酶反应。就实施方案1B的分析方法而言，可以参考以上与实施方案1A相关的描述。
在实施方案1B中，非复合物级分含有未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子。因此，通过用核酸酶处理未反应的结合核酸分子并且检测通过该核酸酶处理释放的核酸单体，可以分析未反应的结合核酸分子。如果可以分析未反应的结合核酸分子，则还可以根据分析结果分析参与复合物形成的结合核酸分子。因此，作为结果，可以分析已经形成了复合物的靶标。
在实施方案1B中，作为结合核酸分子，优选使用各自具有向其添加的添加多核苷酸的结合核酸分子。通过添加多核苷酸，例如，可以增加从复合物中的结合核酸分子释放的核酸单体的数量。因为释放的核酸单体充当酶处理步骤中的底物，在释放的核酸单体的数量增加时可以进一步提高检测灵敏度。对添加多核苷酸的条件没有特别地限定，并且可以参考在与实施方案1A相关的描述中给出的其实例。
如实施方案1A的情况中一样，还可以参照图1描述实施方案1B。以与在实施方案1A中相同的方式将复合物级分和非复合物级分分离。如在图1中的(D)中右边所示，之后，通过用核酸酶处理非复合物级分，将核酸单体13’从未反应的核酸分子12中的添加多核苷酸13切割。之后，以与在实施方案1A中相同的方式用酶处理这些核酸单体13’，并且检测酶反应。因此，可以间接分析样品中的靶标。
就实施方案1A和1B而言，图1示出了其中结合核酸分子12具有添加多核苷酸13的实例。然而，实施方案1B不限于这种说明性实例。例如，结合核酸分子12可以是不具有添加多核苷酸13的核酸分子。
接下来，本发明的实施方案1C涉及一个方面，其中使用负载在一个或多个载体上的结合核酸分子作为结合核酸分子。例如，其他构造与实施方案1A和1B中的那些相同。
在实施方案1C中，对负载在载体上的结合核酸分子的数量没有特别地限定。载体可以负载一个结合核酸分子，或者可以负载两个以上结合核酸分子。优选地，载体负载多个结合核酸分子，因为可以增加通过核酸酶处理释放的核酸单体的量。
例如，载体可以仅负载一个或多个结合核酸分子，或者还可以负载一个或多个多核苷酸，因为可以增加通过核酸酶处理释放的核酸单体的量。对多核苷酸没有特别地限定，并且其实例包括在实施方案1A中作为多核苷酸的实例给出的那些。
对载体没有特别地限定，并且其实例包括上述载体。其中，珠是优选的。
就实施方案1C而言，将参照图2描述在其中使用负载在载体上的结合核酸分子的实例。图2是显示本发明的实施方案1C的概要的示意图，并且(A)至(D)示出了相应步骤。要指出的是，图2是示意图，并且例如，条件如靶标、结合核酸分子、添加多核苷酸等的尺寸不限于图2中所示的那些。
如在图2中的(A)中所示，在实施方案1C中，在复合物形成步骤中，使含有靶标11的样品与载体20接触。载体20中的每一个负载多个结合核酸分子12和多个多核苷酸13。作为结果，如在图2中的(B)中所示，在复合物形成步骤中的反应溶液中，样品中的靶标11与负载在载体20上的结合核酸分子12形成复合物。此时，未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子12还存在于反应溶液中。随后的工艺与在实施方案中1A和1B中的那些相同。
如在图2中所示，载体20中的每一个负载多个结合核酸分子12和多个多核苷酸13。因此，例如，可以通过与在实施方案1A中一样用核酸酶处理复合物级分或者与在实施方案1B中一样用核酸酶处理非复合物级分将大量的核酸单体释放。因此，具有较高灵敏度的分析成为可能。
(2)实施方案2
如上所述，本发明的实施方案2涉及一个方面，其中在复合物形成步骤之后不将复合物级分和非复合物级分分离，并且对复合物形成步骤中的反应体系进行核酸酶处理。
也就是说，实施方案2的分析方法包括：使得与靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成结合核酸分子与样品中靶标的复合物的复合物形成步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从用于复合物形成的反应体系释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤；检测酶反应的检测步骤；和根据检测酶反应的结果分析已经形成了复合物的靶标的分析步骤。
在实施方案2中，针对其中存在复合物和未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子的反应体系进行核酸酶处理。如果结合核酸分子与靶标形成复合物，则复合物中的结合核酸分子变得不易于因物理阻隔而被核酸酶降解。因此，在反应体系的核酸酶处理中，未通过核酸酶将核酸单体从与靶标结合的结合核酸分子释放，并且仅从未参与复合物形成的未反应的结合核酸分子释放核酸单体。因此，在实施方案2中，不必分离复合物级分和非复合物级分。通过仅从未反应的结合核酸分子释放核酸单体并且检测释放的核酸单体，可以分析未反应的结合核酸分子。如果可以分析未反应的结合核酸分子，则还可以根据分析结果分析参与复合物形成的结合核酸分子。因此，作为结果，可以分析已经形成了复合物的靶标。
在本实施方案中，优选使用不具有添加多核苷酸的结合核酸分子。在使用各自具有添加多核苷酸的结合核酸分子的情况下，对添加多核苷酸的长度没有特别地限定，并且其上限是，例如，5个碱基、3个碱基、或1碱基。
(3)实施方案3
如上所述，本发明的实施方案3涉及一个方面，其中使用各自由结合核酸分子和包含与结合核酸分子互补的序列的单链核酸分子组成的杂交体。例如，给出以下要描述的实施方案3A和3B作为实例。
首先，本发明的实施方案3A涉及一个方面，其中如上所述，结合核酸分子各自是与包含与结合核酸分子互补的序列的单链核酸分子的杂交体的形式的。具体地，实施方案3A的分析方法包括：使得杂交体和样品彼此接触以形成杂交体中的结合核酸分子和样品中的靶标的复合物并且将单链核酸分子从杂交体释放的复合物形成步骤；通过核酸酶处理将核酸单体从用于复合物形成的反应体系释放的核酸酶处理步骤；使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤；检测酶反应的检测步骤；和根据检测酶反应的结果分析已经形成了复合物的靶标的分析步骤。
在实施方案3A中，通过在核酸酶处理步骤中使用单链核酸是底物的核酸酶，可以将核酸单体从释放自杂交体的单链核酸分子释放，而不从复合物释放核酸单体。之后，通过用核酸酶处理释放的单链核酸分子并且检测通过该核酸酶处理释放的核酸单体，可以分析从杂交体释放的单链核酸分子。如果可以分析释放的单链核酸分子，则还可以根据分析结果分析参与复合物形成的结合核酸分子。因此，作为结果，可以分析已经形成了复合物的靶标。
对于单链核酸分子来说，仅需要单链核酸分子具有与结合核酸分子互补的序列并且可以与结合核酸分子杂交。对单链核酸分子的长度没有特别地限定，并且其可以根据结合核酸分子适当地设定。对结合核酸分子的长度和单链核酸分子的长度之间的比率没有特别地限定。例如，单链核酸分子可以具有相当于结合核酸分子的长度的1/1至1/1000的长度。单链核酸分子可以与结合核酸分子中的任何区域结合。
如上所述，在实施方案3中使用的核酸酶可以是单链核酸是底物的核酸酶。
就实施方案3A而言，将参照图3描述在其中使用各自由结合核酸分子和单链核酸分子组成的杂交体的实例。图3是示出本发明的实施方案3的概要的示意图。要指出的是，图3是示意图，并且例如，条件如靶标、结合核酸分子、单链核酸分子等的尺寸不限于图3中所示的那些。
在实施方案3A中，在复合物形成步骤中，如在在图3中的(A)中所示，使含有靶标11的样品与各自由结合核酸分子12和单链核酸分子30组成的杂交体接触。作为结果，如在图3中的(B)中所示，在复合物形成步骤中的反应溶液中，杂交体中的结合核酸分子12与样品中的靶标11结合，由此释放杂交体中的单链核酸分子30。之后，用核酸酶单链核酸是底物的核酸酶处理含有复合物和释放的单链核酸分子30的反应溶液，由此，如在图3中的(C)中所示，未将核酸单体从复合物释放并且仅从单链核酸分子30切割核酸单体30’。之后，用酶处理从单链核酸分子30释放的核酸单体30’，并且检测酶反应。因此，可以检测释放的单链核酸分子30，由此可以间接分析样品中的靶标。
接下来，实施方案3B涉及一个方面，其中将杂交体负载在一个或多个载体上。实施方案3B的分析方法与实施方案3A的分析方法相同，不同之处在于：使用负载在一个或多个载体上的杂交体；在复合物形成步骤之后，将含有一个或多个载体的固体级分和液体级分分离；和对液体级分进行核苷酸处理和酶处理。
在实施方案3B中，固体级分，即含有载体的级分，含有具有在其上负载的、与靶标结合以形成复合物的结合核酸分子的载体以及具有在其上负载的、不与靶标结合的结合核酸分子的未反应的载体。另一方面，液体级分含有释放的单链核酸分子。因此，通过用核酸酶处理液体级分以释放核酸单体，用酶处理释放的核酸单体，并且检测酶反应，可以分析从杂交体释放的单链核酸分子。如果可以分析释放的单链核酸分子，则还可以根据分析结果分析参与复合物形成的结合核酸分子。因此，作为结果，可以分析已经形成了复合物的靶标。
就实施方案3B而言，将参照图4描述在其中使用负载各自由结合核酸分子和单链核酸分子组成的杂交体的载体的实例。图4是示出本发明的实施方案3B的概要的示意图。要指出的是，图4是示意图，并且例如，条件如靶标、结合核酸分子、单链核酸分子等的尺寸不限于图4中所示的那些。
在实施方案3B中，在复合物形成步骤中，如在在图4中的(A)中所示，使含有靶标11的样品与各自负载结合核酸分子12和单链核酸分子30的杂交体的载体20接触。作为结果，如在图4中的(B)中所示，在复合物形成步骤中的反应溶液中，杂交体中的结合核酸分子12与样品中的靶标11结合，由此释放杂交体中的单链核酸分子30。接下来，将反应溶液分离为含有载体20的固体级分和含有释放的单链核酸分子30的液体级分。之后，用核酸酶处理释放的单链核酸分子30，由此，如在图4中的(D)中所示，从单链核酸分子30切割核酸单体30’。之后，用酶处理从单链核酸分子30释放的核酸单体30’，并且检测酶反应。因此，可以检测释放的单链核酸分子30，由此可以间接分析样品中的靶标。
(靶标分析试剂盒)
本发明的靶标分析试剂盒是用于在根据本发明的分析方法中使用的分析试剂盒，其包括：与靶标结合的结合核酸分子；核酸酶；和以核酸单体为底物的酶。根据本发明的分析试剂盒，能够容易地进行本发明的分析方法。就本发明的分析试剂盒而言，可以参考以上与本发明的分析方法相关的描述。
实施例
接下来，将描述本发明的实施例。然而，应指出的是，本发明决不受以下实施例限制。除非另外说明，根据其规程使用可商购的试剂。
[实施例1]
通过核酸酶处理将核酸单体从核酸分子释放，并且使用荧光素酶检测释放的核酸单体。
作为核酸分子，使用由以下SEQIDNO：1(N30-079)的碱基序列组成的DNA。
N30-079(SEQIDNO：1)
5’-GGATTGAACGCCGCCCTTATAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATCAGGTCCAGTGCTCTCGTATAG-3’
以下表1中所示的比例将核酸分子和DNA核酸内切酶(商品名BAL31核酸酶，TAKARA)混合在一起。将混合物在30℃温育30分钟，从而将核酸单体从核酸分子释放。
[表1]
(核酸酶处理条件)
用超纯水稀释核酸酶处理之后的反应溶液以得到预定的稀释因子(101倍、102倍、103倍、104倍、或105倍)。因此，制备稀释样品。之后，将稀释样品中的每一个供给至AMP试验试剂盒(商品名：Pen，KikkomanCorporation)，并且使用测量设备(商品名：LumitesterPD-20，KikkomanCorporation)测量稀释样品的相对光单位。作为阴性对照，除了未用核酸酶处理1μmol/LN30-079之外，以相同方式测量相对光单位。此外，作为对照，除了使用2×BAL缓冲液代替核酸分子之外，以相同方式测量相对光单位(N＝3)。
在图5中示出了得到的结果。图5是示出相对光单位的图表。在图5中，横轴表示样品的类型，并且纵轴表示相对光单位。图表中所示的数值表示相应样品的相对光单位。如可以从图5中看到的，在阴性对照和对照中，没有测量到发光。相比之下，在稀释样品中，当使用任何浓度的核酸分子时，测量到强的发光。根据这些结果，发现，可以通过经由核酸酶处理将核酸单体从核酸分子释放并且使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应来测量发光。
[实施例2]
通过使得核酸酶和荧光素酶共同存在，同时进行核酸单体从核酸分子的释放和释放的核酸单体的检测。
除了将DNA核酸内切酶的量设定为1单位之外，通过以上述表1中所示的相同的比例混合N30-079和上述DNA核酸内切酶来制备样品。接下来，将样品供给至AMP试验试剂盒，并且使其静置20分钟。之后，使用上述测量设备，每隔15秒测量样品的相对光单位。
在图6中示出了得到的结果。图6是示出相对光单位的图表。在图6中，横轴表示反应时间，并且纵轴表示相对光单位。要指出的是，反应时间表示从将样品添加至AMP试验试剂盒开始流逝的时间周期。如可以从图6中看到的，在任何反应时间下均测量到强的发光。根据这些结果，发现，即使在同时进行核酸酶处理步骤和酶处理步骤时，也可以检测核酸分子。
[实施例3]
形成了与流感病毒中血凝素(HA)结合的结合核酸分子(适体)和HA的复合物，并且通过核酸酶处理将核酸单体从复合物释放。之后，使用荧光素酶检测释放的核酸单体。
作为与流感病毒中HA结合的适体(RHA0006)，使用由以下SEQIDNO：2的碱基序列组成的DNA。调整适体从而使其包含向其3’端添加的24聚体聚(dA)。接下来，将适体添加至100nmol/L的浓度的TBS缓冲液。TBS缓冲液的组成是50mmol/LTris-HCl、100mmol/LNaCl、5mmol/LKCl、1mmol/LMgCl2和0.05％20，并且TBS缓冲液的pH为7.4。之后，将适体溶液在95℃热处理5分钟，并且进一步使其在冰上静置5分钟。
RHA0006(SEQIDNO：2)
5’-GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’
接下来，作为HA，使用源自流感病毒(H5N1)的HA。用TBS缓冲液稀释HA，从而得到预定的HA浓度(0、101、102、103、104、或105pmol/L)。因此，制备稀释样品。
将稀释样品中的每一个添加至96孔板(商品名：平板，由Nunc制造)以使得每个孔含有100μL的稀释样品，并且将稀释样品在4℃在16小时内吸附至孔。用200μL的TBS缓冲液将孔洗涤三次。之后，将200μL的无蛋白质(TBS)封闭缓冲液(由Pierce制造)添加至孔中，并且将混合物在室温下温育1小时。在温育之后，将100μL静置后的适体溶液添加至孔中，并且将混合物在室温下温育30分钟。之后，用200μL的TBS缓冲液将孔洗涤三次。
接下来，将BAL31核酸酶添加至平板以使得每个孔含有20μL(3单位/孔)的BAL31核酸酶，并且将混合物在室温下温育20分钟。在温育之后，将孔中的溶液添加至AMP试验试剂盒，并且以与在实施例1中相同的方式测量相对光单位(N＝3)。
在图7中示出了得到的结果。图7是示出相对光单位的图表。在图7中，横轴表示稀释样品中的HA浓度，并且纵轴表示相对光单位。如可以从图7中看到的，当使用HA浓度为0pmol/L的稀释样品时，未测量到发光。相比之下，当任何HA浓度时，测量到发光。根据这些结果，发现，可以通过用核酸酶处理结合核酸分子和靶标的复合物的级分以将核酸单体从核酸分子释放并且使释放的核酸单体与以核酸单体为底物的酶反应来测量发光。
尽管以上已经参照示例性实施方案描述了本发明，本发明决不限于此。可以在本发明的构造和细节方面做出对本领域技术人员来说可以变得显而易见的各种变化和修改而不背离本发明的范围。
本申请基于并且要求来自2013年9月30日提交的日本专利申请号2013-205051的优先权的权益，其公开内容通过整体引用结合在本文中。
工业适用性
根据本发明，可以通过下列方式容易地检测靶标：形成靶标和结合核酸分子的复合物，将核酸单体从复合物级分或非复合物级分释放，以及进行与作为底物的释放的核酸单体的酶反应。根据这种方法，例如，不必如上文所述的那样使DNA酶与适体连接，从而取决于存在或不存在靶标的对DNA酶的催化能力的ON-OFF控制也不是必需的。此外，根据本发明的分析试剂盒，能够容易地进行本发明的分析方法。因为本发明涉及使用适体的靶标检测方法，可以认为，例如，本发明是用于各种领域(如临床医疗实践、食品和环境)中的研究和试验的非常有用的技术。

Claims (38)

1.一种用于分析靶标的分析方法，所述分析方法包括：
使得与所述靶标结合的结合核酸分子与样品彼此接触以形成所述结合核酸分子与所述样品中所述靶标的复合物的复合物形成步骤；
通过核酸酶处理将核酸单体从复合物级分和非复合物级分中的至少一个释放的核酸酶处理步骤；
使得释放的核酸单体与以所述核酸单体为底物的酶反应的酶处理步骤；
检测酶反应的检测步骤；和
根据检测所述酶反应的结果分析已经形成了所述复合物的所述靶标的分析步骤。
2.根据权利要求1所述的分析方法，所述分析方法还包括在所述复合物形成步骤之后将所述复合物级分和所述非复合物级分与用于所述复合物形成的反应体系分离的分离步骤。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其中
在所述分离步骤中，通过使得用于所述复合物形成的所述反应体系与固定的结合物质彼此接触以将所述复合物与所述结合物质结合，而将所述复合物级分和所述非复合物级分分离，并且
所述结合物质是与所述靶标结合的结合物质。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其中
在所述分离步骤中，在所述复合物已经与所述结合物质结合之后，洗涤所述固定的结合物质以移除未反应的结合核酸分子。
5.根据权利要求2所述的分析方法，其中
在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物级分进行所述核酸酶处理从而将所述核酸单体从所述复合物释放。
6.根据权利要求2所述的分析方法，其中
在所述核酸酶处理步骤中，对所述非复合物级分进行所述核酸酶处理从而将所述核酸单体从未反应的结合核酸分子释放。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分析方法，其中
所述结合核酸分子包含添加到其上的多核苷酸，并且
所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分析方法，其中
所述结合核酸分子负载在载体上。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其中
所述载体还包含添加到其上的多核苷酸，并且
所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
10.根据权利要求1所述的分析方法，其中
在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从未反应的结合核酸分子释放。
11.根据权利要求1所述的分析方法，其中
所述结合核酸分子是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，
在所述复合物形成步骤中，使得所述杂交体和所述样品彼此接触以形成在所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标的复合物并且将所述单链核酸分子从所述杂交体释放，并且
在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从所述释放的单链核酸分子释放。
12.根据权利要求1所述的分析方法，其中
所述结合核酸分子负载在载体上并且是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，
在所述复合物形成步骤中，使得所述杂交体和所述样品彼此接触以形成在所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标的复合物并且将所述单链核酸分子从所述杂交体释放，并且
在所述核酸酶处理步骤中，对所述复合物形成步骤中的反应体系进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从所述释放的单链核酸分子释放。
13.根据权利要求12所述的分析方法，所述分析方法还包括在所述复合物形成步骤之后将所述释放的单链核酸分子与所述复合物形成步骤中的反应体系分离的分离步骤，
其中，在所述核酸酶处理步骤中，对所述分离的单链核酸分子进行所述核酸酶处理以将所述核酸单体从所述单链核酸分子释放。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的分析方法，其中
所述核酸酶是以所述单链核酸分子为底物的核酸酶。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的分析方法，其中
所述核酸酶是核酸外切酶。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分析方法，其中
作为所述酶的底物的所述核酸单体是腺苷核苷酸。
17.根据权利要求16所述的分析方法，其中
所述腺苷核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的分析方法，其中
所述酶是具有荧光素酶活性的蛋白质。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的分析方法，其中
所述酶是荧光素酶。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的分析方法，其中
在所述酶处理步骤中，所述酶反应在试剂的存在下进行，并且
所述试剂是使得信号通过与以所述核酸单体为底物的酶反应而产生的试剂，或者是使得信号通过与以所述核酸单体为底物的酶反应而消失的试剂。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的分析方法，其中
在所述检测步骤中，检测到通过所述酶反应产生的信号或通过所述酶反应导致消失的信号。
22.根据权利要求20或21所述的分析方法，其中
所述信号是光信号和电信号中的至少一种。
23.根据权利要求8、9和12中任一项所述的分析方法，其中
所述载体是珠或平板。
24.一种分析试剂盒，所述分析试剂盒用于根据权利要求1至23中任一项所述的分析方法中使用，所述分析试剂盒包括：
与靶标结合的结合核酸分子；
核酸酶；和
以核酸单体为底物的酶。
25.根据权利要求24所述的分析试剂盒，其中
所述结合核酸分子包含添加到其上的多核苷酸，并且
所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
26.根据权利要求24或25所述的分析试剂盒，其中
所述结合核酸分子负载在载体上。
27.根据权利要求26所述的分析试剂盒，其中
所述载体还包含添加到其上的多核苷酸，并且
所述多核苷酸包含作为所述酶的底物的核酸单体。
28.根据权利要求24所述的分析试剂盒，其中
所述结合核酸分子是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，并且
通过与所述靶标接触，所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标形成复合物并且释放所述单链核酸分子。
29.根据权利要求28所述的分析试剂盒，其中
所述核酸酶是以所述单链核酸分子为底物的核酸酶。
30.根据权利要求24所述的分析试剂盒，其中
所述结合核酸分子负载在载体上并且是与单链核酸分子的杂交体的形式，所述单链核酸分子包含与所述结合核酸分子互补的序列，并且
通过与所述靶标接触，所述杂交体中的所述结合核酸分子与所述靶标形成复合物并且释放所述单链核酸分子。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的分析试剂盒，其中
所述核酸酶是核酸外切酶。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的分析试剂盒，其中
作为所述酶的底物的所述核酸单体是腺苷核苷酸。
33.根据权利要求32所述的分析试剂盒，其中
所述腺苷核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中的至少一种。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的分析试剂盒，其中
所述酶是具有荧光素酶活性的蛋白质。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的分析试剂盒，其中
所述酶是荧光素酶。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的分析试剂盒，所述分析试剂盒还包括试剂，其中
所述试剂是使得信号通过与以所述单体为底物的酶反应而产生的试剂，或者是使得信号通过与以所述单体为底物的酶反应而消失的试剂。
37.根据权利要求36所述的分析试剂盒，其中
所述信号是光信号和电信号中的至少一种。
38.根据权利要求26、27和30中任一项所述的分析试剂盒，其中
所述载体是珠或平板。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004053159A2 (en) * 2002-12-07 2004-06-24 Guoliang Fu Oligonucleotide guided analysis of gene expression
CN1653175A (zh) * 2002-02-26 2005-08-10 第三次浪潮技术公司 Rna检测酶
CN101072874A (zh) * 2004-10-05 2007-11-14 加州理工学院 适体调节的核酸及其应用
CN102918147A (zh) * 2010-05-25 2013-02-06 三星泰科威株式会社 改进的rna酶h和核酸扩增的检测

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846717A (en) * 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US6759226B1 (en) * 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
JP5101288B2 (ja) 2004-10-05 2012-12-19 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー アプタマー調節される核酸及びその利用
WO2006086669A2 (en) 2005-02-09 2006-08-17 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
GB0517005D0 (en) * 2005-08-19 2005-09-28 Enigma Diagnostics Ltd Analytical method and kit
AU2011319755B2 (en) * 2010-10-27 2017-02-23 President And Fellows Of Harvard College Compositions of toehold primer duplexes and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1653175A (zh) * 2002-02-26 2005-08-10 第三次浪潮技术公司 Rna检测酶
WO2004053159A2 (en) * 2002-12-07 2004-06-24 Guoliang Fu Oligonucleotide guided analysis of gene expression
CN101072874A (zh) * 2004-10-05 2007-11-14 加州理工学院 适体调节的核酸及其应用
CN102918147A (zh) * 2010-05-25 2013-02-06 三星泰科威株式会社 改进的rna酶h和核酸扩增的检测

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAKAKIBARA T ET AL.: "An Enzymatic Cycling Method Using Pyruvate Orthophosphate Dikinase and Firefly Luciferase for the Simultaneous Determination of ATP and AMP (RNA)", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *

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