CN109504804A

CN109504804A - 一种检测3型人腺病毒的rpa方法、其专用引物和探针及用途

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Publication number: CN109504804A
Application number: CN201811397254.6A
Authority: CN
Inventors: 李越希; 齐永; 李晓玲; 李佳萌; 饶继先; 沈万鹏; 王长军; 曾雯雯; 刘苏云
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2019-03-22

Abstract

本发明提供了用于检测3型人腺病毒的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在3型人腺病毒检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针是基于3型人腺病毒hexon基因保守序列设计的，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明将新型恒温扩增技术RPA应用于3型人腺病毒的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。本发明建立的检测方法灵敏度高，检测限可达10¹拷贝/反应；特异性强，与其他病原体无交叉反应；检测速度快，反应时间仅需20 min；操作简便，适合现场检测。

Description

一种检测3型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途

技术领域

本发明一种检测3型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途属于生物技术领域，涉及3型人腺病毒（human adenovirus，HAdV）的分子生物学，涉及一种检测3型人腺病毒的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增（Recombinase PolymeraseAmplification，RPA）技术快速检测3型人腺病毒的方法、其专用引物和探针及其用途。

背景技术

3型人腺病毒（HAdV3）引起的疾病主要有急性呼吸道疾病、小儿腹泻和咽结合膜热等，在流行早期，传染性强，流行强度大，传播范围广，同时由于对该病认识不足，防护意识较差，短时间内会导致该病的发病率迅速增加。及早发现疫情对于疾病的防治和疫情的控制具有重要意义。

近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展， RPA技术被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25- 43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。

发明内容

本发明一种检测3型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测3型人腺病毒的特异性引物和探针，以及一种快速、简便、特异性好的3型人腺病毒的检测方法。

因此本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，第一个目的是提供用于检测3型人腺病毒的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据3型人腺病毒六邻体蛋白（hexon）基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了3型人腺病毒hexon基因的保守区，此区域为3型人腺病毒基因组（GenBank：DQ086466.1）位于第18418至21252核苷酸位点的一段序列，含有2835个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从SEQ ID NO.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物F3和反向引物R1，分别位于基因组第18759至18788核苷酸位点和第18992至19011核苷酸位点，分别具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。

SEQ ID NO.1：

ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTCAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAATTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGCCTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAAGACAATACCTACTCTTACAAAGTTCGCTACACGCTGGCTGTAGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTCGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCCTAAGGGCGCGCCCAATACATCTCAGTGGATAGTTACAACAAATGGGGACAATGCAGTAACTACCACCACAAACACATTTGGCATTGCTTCCATGAAGGGAGACAATATTACTAAAGAAGGTTTGCAAATTGGGAAAGACATTACCACTACTGAAGGAGAAGAAAAGCCCATTTATGCCGATAAAACATATCAGCCAGAGCCTCAAGTTGGAGAAGAATCATGGACTGATACTGATGGAACAAATGAAAAGTTTGGTGGAAGAGCCCTTAAACCAGCTACCAACATGAAGCCATGCTACGGGTCTTTTGCAAGACCTACAAACATAAAAGGGGGCCAAGCTAAAAACAGAAAAGTAAAACCAACAACCGAAGGAGGGGTTGAAACTGAGGAACCAGATATTGATATGGAATTTTTCGATGGTAGAGATGCTGTTGCAGGAGCTTTAGCGCCTGAAATTGTGCTTTATACGGAAAATGTAAATTTGGAAACTCCAGACAGTCATGTGGTATATAAACCAGAAACGTCTAATAACTCTCATGCAAATTTGGGTCAACAAGCCATGCCTAACAGACCCAATTACATTGGCTTCAGGGATAACTTCGTAGGCCTAATGTACTACAACAGTACTGGAAATATGGGAGTTTTGGCTGGCCAAGCATCACAACTGAATGCAGTGGTTGACTTGCAGGACAGAAATACTGAACTGTCATATCAGCTTTTGCTTGATTCTCTGGGAGACAGAACCAGATACTTCAGCATGTGGAATCAGGCTGTGGACAGTTACGATCCCGATGTTCGCATTATTGAAAATCATGGCATCGAGGATGAACTGCCTAATTACTGTTTTCCTCTGAATGGCATAGGACCAGGGCACACATATCAAGGCATTAAAGTTAAAACCGATGACACTAATGGATGGGAAAAAGATGCTAATGTTGCTCCAGCTAATGAAATAACCATAGGCAACAACCTGGCTATGGAAATTAATATCCAAGCTAACCTTTGGAGAAGTTTTCTGTACTCTAATGTGGCTTTGTACCTTCCAGATGTTTACAAGTACACGCCACCTAACATTACTTTGCCCACTAACACCAACACCTATGAGTACATGAACGGGCGAGTGGTATCCCCATCCCTGGTTGATTCATACATCAACATTGGCGCCAGGTGGTCTCTTGACCCAATGGACAATGTGAATCCATTCAACCACCACCGCAATGCTGGTCTGCGCTACAGGTCCATGCTTCTGGGAAATGGTCGTTATGTGCCTTTCCACATACAAGTGCCTCAGAAATTCTTTGCTGTCAAGAACCTACTTCTTCTACCTGGCTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGAAAGGATGTGAACATGGTCCTGCAAAGTTCCCTTGGAAATGACCTCAGAACGGATGGTGCTACCATAAGTTTCACCAGCATCAATCTCTATGCCACCTTCTTCCCCATGGCTCACAACACAGCTTCCACCCTTGAAGCCATGCTGCGCAACGATACCAATGATCAGTCATTTAACGACTACCTCTCTGCAGCTAACATGCTTTACCCCATTCCTGCCAATGCAACCAACATTCCAATTTCCATCCCATCTCGCAACTGGGCAGCCTTCAGGGGCTGGTCCTTCACCAGACTCAAAACCAAGGAGACTCCATCTCTTGGATCAGGGTTCGATCCCTACTTCGTATATTCTGGATCTATTCCCTACCTGGATGGCACCTTTTACCTTAACCACACTTTCAAGAAGGTCTCCATCATGTTTGACTCCTCAGTCAGCTGGCCTGGCAATGACAGGCTGTTGAGTCCAAATGAGTTTGAAATCAAGCGCACTGTGGACGGGGAAGGATACAACGTGGCACAATGCAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTTCAGATGCTTGCCAATTACAACATTGGCTACCAGGGCTTTTACATCCCTGAGGGATACAAGGATCGCATGTACTCCTTTTTCAGAAACTTCCAGCCTATGAGCAGGCAGGTGGTTGATGAGGTTAATTACACTGACTACAAAGCCGTCACCTTACCATACCAACACAACAACTCTGGCTTTGTAGGGTACCTTGCACCTACTATGAGACAAGGGGAACCTTACCCAGCCAATTATCCATACCCGCTCATCGGAACTACTGCCGTTAAGAGTGTCACCCAGAAAAAGTTCCTGTGCGACAGGACCATGTGGCGCATTCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGGGCCCTTACCGACCTGGGACAGAACATGCTCTATGCCAACTCAGCCCATGCGCTGGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGATGAGCCCACCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAGTCTTCGACGTGGTCAGAGTGCACCAGCCACACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACACCGTTCTCGGCCGGCAACGCCACCACATAA

SEQ ID NO.2：5’ GCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACT 3’

SEQ ID NO.3：5’ TTCTTCTCCAACTTGAGGCTCTGGCTGATA 3’

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，第二个目的是提供用于检测3型人腺病毒的探针。所述探针是根据3型人腺病毒hexon基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了3型人腺病毒hexon基因的保守区，此区域含有2949个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从SEQ ID NO.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针位于基因组第18823至18867核苷酸位点，具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换为一个四氢呋喃（THF）。

SEQ ID NO.4：

5’ ATAGTTACAACGAATCGAGACAATGCAGTAACTAC[THF]ACCACAAACA3’

所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。

所述探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）组成。

所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，第三个目的是提供了用于3型人腺病毒快速检测的RPA检测方法，所述方法采用上述的RPA引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条进行可视化判断。

本发明所述的检测3型人腺病毒的RPA方法，包括以下步骤：

（1）以待测样品基因组DNA为模板，在所述引物组和探针的标记下进行RPA反应；

（2）进行结果判断，具体为用侧向层析核酸检测试纸条对步骤1）得到的RPA产物进行检测，如果检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；如果检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；如果质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。

优选地，本发明所述的方法，具体步骤如下：

（1）扩增试剂准备和加样：将10 μmol/L正向引物2.1 μL、10 μmol/L反向引物2.1 μL、10 μmol/L探针0.6 μL、待测样品1 μL、无DNase和RNase水12.2 μL和缓冲液29.5 μL组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp^® nfo反应管中。然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上；

（2）扩增：将反应管盖内的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后，在37℃条件下扩增20 min，在反应4 min时，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增；

（3）结果判断：将反应管放入内含侧向层析检测试纸条的一次性核酸检测装置中对RPA产物进行检测，检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。

所述的一种用于检测3型人腺病毒的RPA方法中用于50 μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10 μmol/L，反向引物的浓度为10 μmol/L，所述的探针的浓度为2.5 μmol/L，镁离子浓度为280 μmol/L，模板加样量为1 μL。将2.1 μL正向引物、2.1 μL反向引物、0.6 μL探针、1 μL样品、12.2 μL无DNase和RNase水和29.5 μL缓冲液组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上, 将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37 ℃扩增20 min，在反应4 min后，将反应管取出充分混匀，放回反应装置中继续扩增。使用侧向层析检测试纸条进行检测，试纸条显色时间控制在3 - 5 min。

所述的专用引物和所述的探针用于检测3型人腺病毒。

本发明检测3型人腺病毒的原理是采用RPA技术，对3型人腺病毒的特异性保守靶序列，即3型人腺病毒hexon基因的保守序列进行检测，该序列可作为3型人腺病毒的标志基因之一。

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，节约了3型人腺病毒的检测时间，检测可在37℃下20 min内完成扩增，整个检测过程可在1小时内完成，与常规PCR和实时荧光定量PCR需要数小时相比极大地缩短了检测时间。

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，降低了反应温度，RPA只需要恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于荧光定量PCR的60 - 95℃以及LAMP的63℃。

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，且样品不需要进行复杂反应。

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，灵敏性高，特异性强，可用于现场或即时检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示RPA检测体系最优引物组合筛选中不同引物组合的检测结果。每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图2为确定检测3型人腺病毒RPA检测方法的最佳反向引物和探针组合浓度。设定反向引物的浓度梯度为10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L，探针的浓度为10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L，将三种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成9组组合，组合编号见表3，每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图3为确定检测3型人腺病毒RPA检测方法的最佳扩增时间。设定扩增时间为5min、10 min、15 min、20 min，并设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图4为检测3型人腺病毒RPA方法的灵敏度，对阳性质粒进行定量后进行十倍倍比稀释，获得浓度为10¹⁰-10⁰拷贝/μL的质粒DNA，作为后续模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图5为检测3型人腺病毒 RPA方法的的特异性，分别以HAdV3、HAdV7、HAdV11、HAdV21阳性质粒、鹦鹉热衣原体、金黄色葡萄球菌、贝氏柯克斯体、猪链球菌、大肠杆菌等病原体DNA及健康者DNA的样本为模板进行试验，试验结果如图所示。

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook 等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用RPA引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所有序列测定工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：3型人腺病毒RPA检测引物和探针的设计及筛选

（1）引物和探针的设计

发明人通过文献检索，分析确定本发明使用3型人腺病毒hexon基因中的特异性序列为目标基因。从NCBI数据库中获得已知的模板基因序列，即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司对上述序列进行合成，作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、反应体系的优化等过程中作为模板使用。根据RPA引物及探针设计原则，设计3对引物及1条探针，如表1所示。

表1引物及探针序列

（2）引物筛选

人工合成含有3型人腺病毒hexon基因的SEQ ID NO.1所示的序列的阳性质粒，以此质粒为模板，将引物与探针进行全面组合成9组引物组合，组合编号如表2所示。9组引物组合分别进行在37℃条件下进行RPA扩增，以侧向层析核酸检测试纸条检测线显色情况为指标，筛选出在37℃条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续RPA检测的评价和应用。

筛选用的50 μL的RPA反应体系如下：将10 μmol/L正向引物2.1 μL、10 μmol/L反向引物2.1 μL、10 μmol/L探针0.6 μL、待测样品1 μL、无DNase和RNase水12.2 μL和缓冲液29.5 μL组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp^® nfo反应管中，然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管盖的内壁上。考虑到RPA反应灵敏度较高，易出现假阳性，发明者设置了一组阴性对照，阴性对照使用空白质粒载体进行反应。扩增：将反应管盖上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20 min，在反应第4 min时，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。结果判断：将反应管放入内含侧向层析检测试纸条的一次性核酸检测装置中显色，进行可视化判别。每个反应设置一个复孔。

表2引物探针组合编号

9组引物组合的侧向层析核酸检测结果见图1。图1为检测时间为20 min时9组引物组合、阴性对照的侧向层析核酸检测试纸条的检测线和质控线的显示情况。

本发明检测3型人腺病毒的RPA方法，确定的引物组合包括：正向引物（F3）和反向引物（R1），共两条，分别具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列。

（3）探针的确定

表1列出的probe探针为本发明优选，探针的长度为45 bp，其中5’端至THF共有30 bp，3’端至THF共有15 bp。

探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）几部分组成。探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换为四氢呋喃（THF）。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。

实施例2：3型人腺病毒RPA反应体系、扩增和检测条件的优化

在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测是仍存在假阳性的情况，因此需对RPA反应体系、扩增和检测条件进行优化

（1）引物探针浓度

设定反向引物的浓度梯度为10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L，探针的浓度为10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L，将三种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成9组组合，每组组合均设置一组阴性对照。分别在37℃条件下进行RPA扩增，扩增完毕以侧向层析核酸检测试纸条检测线显色情况为指标。筛选出扩增效果最好，且不出现假阳性的组合。

表3 反向引物浓度和探针浓度组合编号

通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析（见图2），并考虑经济因素，本发明确定的反向引物的浓度为10 μmol/L、探针的浓度为2.5 μmol/L。

（2）RPA扩增时间的优化

在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测时仍存在假阳性的情况，因此需对RPA扩增时间进行优化。

50 μL的RPA反应体系如下：将10 μmol/L正向引物2.1 μL、10 μmol/L反向引物2.1μL、2.5 μmol/L探针0.6 μL、1×10⁴拷贝/μL模板1 μL、无DNase和RNase水12.2 μL和缓冲液29.5 μL组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp^® nfo反应管中。然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上。扩增：将反应管盖上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增5 min、10 min、15 min、20 min，均在反应4 min时，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。发明者设置了一组阴性对照，阴性对照以空白质粒载体为模板。结果判断：将反应管放入内含侧向层析检测试纸条的一次性核酸检测装置中显色，进行可视化判别。

通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析（见图3），扩增时间为20 min时的样品检测线显色清晰，达到试验要求，本发明确定的扩增时间为20 min。

综上，通过RPA扩增和检测条件进行优化，本发现确定在使用10 μmol/L的下游引物和2.5 μmol/L的探针扩增20 min，试纸条显色时间控制在3 - 5 min时，检测效果最好。

实施例3：3型人腺病毒RPA检测的检测限评价

将3型人腺病毒阳性质粒按十倍倍比稀释成10¹⁰ - 10⁰拷贝/μL等一系列不同浓度，各取10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁴、10³、10²、10¹ 拷贝/μL的阳性质粒1 μL分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的反应条件对上述不同拷贝数的模板进行RPA检测，观察RPA检测的检测限。

结果见图4，从10¹拷贝/μL开始以上样品均呈阳性，阴性对照呈阴性，说明本发明RPA检测方法的检测限为10¹拷贝/反应。

实施例4：3型人腺病毒RPA检测的特异性评价

特异性评价以HAdV7、HAdV11、HAdV21阳性质粒、鹦鹉热衣原体、金黄色葡萄球菌、贝氏柯克斯体、猪链球菌、大肠杆菌等病原体DNA及健康者DNA为对照，以确定本发明RPA检测方法的特异性。

分别以HAdV3、HAdV7、HAdV11、HAdV21阳性质粒、鹦鹉热衣原体、金黄色葡萄球菌、贝氏柯克斯体、猪链球菌、大肠杆菌等病原体DNA及健康者DNA为模板，采用如下反应体系：将10 μmol/L正向引物2.1 μL、10 μmol/L反向引物2.1 μL、10 μmol/L探针0.6 μL、待测样品1 μL、无DNase和RNase水12.2 μL和缓冲液29.5 μL组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp^® nfo反应管中。然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上。扩增：将反应管盖内上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20 min，在反应4 min时，将反应管取出充分混匀。结果判断：将反应管放入内含侧向层析检测试纸条的一次性核酸检测装置中进行可视化判别，检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。

结果见图5，HAdV7、HAdV11、HAdV21阳性质粒、鹦鹉热衣原体、金黄色葡萄球菌、贝氏柯克斯体、猪链球菌、大肠杆菌等病原体DNA及健康者DNA样本检测线未显色，呈阴性，只有HAdV3样本检测线显色，呈阳性，说明本发明RPA检测方法对3型人腺病毒有很强的特异性。

序列表

<110> 李越希

<120> 一种检测3型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2835

<212> DNA

<213> 3型人腺病毒特异性基因序列（位于全基因组18418-21252bp）(SIPOSequenceListing 1.0)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2835)

<400> 1

atggccaccc catcgatgat gccccaatgg gcatacatgc acatcgccgg acaggatgct 60

tcggagtacc tcagtccggg tctggtgcag ttcgcccgtg caacagacac ctacttcagt 120

atggggaaca aatttagaaa ccccacagtg gcgcccaccc acgatgtgac caccgaccgt 180

agccagcgcc tgatgctgcg cttcgtgccc gttgaccggg aagacaatac ctactcttac 240

aaagttcgct acacgctggc tgtaggcgac aacagagtgc ttgacatggc cagcacattc 300

tttgacattc ggggggtgct tgatagaggt cctagcttca agccatattc cggcacagct 360

tacaattcac tcgctcctaa gggcgcgccc aatacatctc agtggatagt tacaacaaat 420

ggggacaatg cagtaactac caccacaaac acatttggca ttgcttccat gaagggagac 480

aatattacta aagaaggttt gcaaattggg aaagacatta ccactactga aggagaagaa 540

aagcccattt atgccgataa aacatatcag ccagagcctc aagttggaga agaatcatgg 600

actgatactg atggaacaaa tgaaaagttt ggtggaagag cccttaaacc agctaccaac 660

atgaagccat gctacgggtc ttttgcaaga cctacaaaca taaaaggggg ccaagctaaa 720

aacagaaaag taaaaccaac aaccgaagga ggggttgaaa ctgaggaacc agatattgat 780

atggaatttt tcgatggtag agatgctgtt gcaggagctt tagcgcctga aattgtgctt 840

tatacggaaa atgtaaattt ggaaactcca gacagtcatg tggtatataa accagaaacg 900

tctaataact ctcatgcaaa tttgggtcaa caagccatgc ctaacagacc caattacatt 960

ggcttcaggg ataacttcgt aggcctaatg tactacaaca gtactggaaa tatgggagtt 1020

ttggctggcc aagcatcaca actgaatgca gtggttgact tgcaggacag aaatactgaa 1080

ctgtcatatc agcttttgct tgattctctg ggagacagaa ccagatactt cagcatgtgg 1140

aatcaggctg tggacagtta cgatcccgat gttcgcatta ttgaaaatca tggcatcgag 1200

gatgaactgc ctaattactg ttttcctctg aatggcatag gaccagggca cacatatcaa 1260

ggcattaaag ttaaaaccga tgacactaat ggatgggaaa aagatgctaa tgttgctcca 1320

gctaatgaaa taaccatagg caacaacctg gctatggaaa ttaatatcca agctaacctt 1380

tggagaagtt ttctgtactc taatgtggct ttgtaccttc cagatgttta caagtacacg 1440

ccacctaaca ttactttgcc cactaacacc aacacctatg agtacatgaa cgggcgagtg 1500

gtatccccat ccctggttga ttcatacatc aacattggcg ccaggtggtc tcttgaccca 1560

atggacaatg tgaatccatt caaccaccac cgcaatgctg gtctgcgcta caggtccatg 1620

cttctgggaa atggtcgtta tgtgcctttc cacatacaag tgcctcagaa attctttgct 1680

gtcaagaacc tacttcttct acctggctcc tacacctacg agtggaactt ccgaaaggat 1740

gtgaacatgg tcctgcaaag ttcccttgga aatgacctca gaacggatgg tgctaccata 1800

agtttcacca gcatcaatct ctatgccacc ttcttcccca tggctcacaa cacagcttcc 1860

acccttgaag ccatgctgcg caacgatacc aatgatcagt catttaacga ctacctctct 1920

gcagctaaca tgctttaccc cattcctgcc aatgcaacca acattccaat ttccatccca 1980

tctcgcaact gggcagcctt caggggctgg tccttcacca gactcaaaac caaggagact 2040

ccatctcttg gatcagggtt cgatccctac ttcgtatatt ctggatctat tccctacctg 2100

gatggcacct tttaccttaa ccacactttc aagaaggtct ccatcatgtt tgactcctca 2160

gtcagctggc ctggcaatga caggctgttg agtccaaatg agtttgaaat caagcgcact 2220

gtggacgggg aaggatacaa cgtggcacaa tgcaacatga ccaaagactg gttcctggtt 2280

cagatgcttg ccaattacaa cattggctac cagggctttt acatccctga gggatacaag 2340

gatcgcatgt actccttttt cagaaacttc cagcctatga gcaggcaggt ggttgatgag 2400

gttaattaca ctgactacaa agccgtcacc ttaccatacc aacacaacaa ctctggcttt 2460

gtagggtacc ttgcacctac tatgagacaa ggggaacctt acccagccaa ttatccatac 2520

ccgctcatcg gaactactgc cgttaagagt gtcacccaga aaaagttcct gtgcgacagg 2580

accatgtggc gcattccctt ctccagcaac ttcatgtcca tgggggccct taccgacctg 2640

ggacagaaca tgctctatgc caactcagcc catgcgctgg acatgacttt tgaggtggat 2700

cccatggatg agcccaccct gctttatctt cttttcgaag tcttcgacgt ggtcagagtg 2760

caccagccac accgcggcgt catcgaggcc gtctacctgc gcacaccgtt ctcggccggc 2820

aacgccacca cataa 2835

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 3型人腺病毒特异性基因序列内的正向引物F3（位于全基因组18759-18788bp）(SIPOSequenceListing 1.0)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<400> 2

gccatattcc ggcacagctt acaattcact 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 3型人腺病毒特异性基因序列内的反向引物R1（位于全基因组18992-19011bp）(SIPOSequenceListing 1.0)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 5’端标记生物素

<400> 3

ttcttctcca acttgaggct ctggctgata 30

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 3型人腺病毒特异性基因序列内的探针probe（位于全基因组18823-18867bp）(SIPOSequenceListing 1.0)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换成一个四氢呋喃（THF）

<400> 4

atagttacaa cgaatcgaga caatgcagta actacaccac aaaca 45

Claims

1.一种用于检测3型人腺病毒的RPA专用引物，是根据3型人腺病毒hexon基因保守序列设计的，所述3型人腺病毒hexon基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.1：

ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTCAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAATTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGCCTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAAGACAATACCTACTCTTACAAAGTTCGCTACACGCTGGCTGTAGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTCGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCCTAAGGGCGCGCCCAATACATCTCAGTGGATAGTTACAACAAATGGGGACAATGCAGTAACTACCACCACAAACACATTTGGCATTGCTTCCATGAAGGGAGACAATATTACTAAAGAAGGTTTGCAAATTGGGAAAGACATTACCACTACTGAAGGAGAAGAAAAGCCCATTTATGCCGATAAAACATATCAGCCAGAGCCTCAAGTTGGAGAAGAATCATGGACTGATACTGATGGAACAAATGAAAAGTTTGGTGGAAGAGCCCTTAAACCAGCTACCAACATGAAGCCATGCTACGGGTCTTTTGCAAGACCTACAAACATAAAAGGGGGCCAAGCTAAAAACAGAAAAGTAAAACCAACAACCGAAGGAGGGGTTGAAACTGAGGAACCAGATATTGATATGGAATTTTTCGATGGTAGAGATGCTGTTGCAGGAGCTTTAGCGCCTGAAATTGTGCTTTATACGGAAAATGTAAATTTGGAAACTCCAGACAGTCATGTGGTATATAAACCAGAAACGTCTAATAACTCTCATGCAAATTTGGGTCAACAAGCCATGCCTAACAGACCCAATTACATTGGCTTCAGGGATAACTTCGTAGGCCTAATGTACTACAACAGTACTGGAAATATGGGAGTTTTGGCTGGCCAAGCATCACAACTGAATGCAGTGGTTGACTTGCAGGACAGAAATACTGAACTGTCATATCAGCTTTTGCTTGATTCTCTGGGAGACAGAACCAGATACTTCAGCATGTGGAATCAGGCTGTGGACAGTTACGATCCCGATGTTCGCATTATTGAAAATCATGGCATCGAGGATGAACTGCCTAATTACTGTTTTCCTCTGAATGGCATAGGACCAGGGCACACATATCAAGGCATTAAAGTTAAAACCGATGACACTAATGGATGGGAAAAAGATGCTAATGTTGCTCCAGCTAATGAAATAACCATAGGCAACAACCTGGCTATGGAAATTAATATCCAAGCTAACCTTTGGAGAAGTTTTCTGTACTCTAATGTGGCTTTGTACCTTCCAGATGTTTACAAGTACACGCCACCTAACATTACTTTGCCCACTAACACCAACACCTATGAGTACATGAACGGGCGAGTGGTATCCCCATCCCTGGTTGATTCATACATCAACATTGGCGCCAGGTGGTCTCTTGACCCAATGGACAATGTGAATCCATTCAACCACCACCGCAATGCTGGTCTGCGCTACAGGTCCATGCTTCTGGGAAATGGTCGTTATGTGCCTTTCCACATACAAGTGCCTCAGAAATTCTTTGCTGTCAAGAACCTACTTCTTCTACCTGGCTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGAAAGGATGTGAACATGGTCCTGCAAAGTTCCCTTGGAAATGACCTCAGAACGGATGGTGCTACCATAAGTTTCACCAGCATCAATCTCTATGCCACCTTCTTCCCCATGGCTCACAACACAGCTTCCACCCTTGAAGCCATGCTGCGCAACGATACCAATGATCAGTCATTTAACGACTACCTCTCTGCAGCTAACATGCTTTACCCCATTCCTGCCAATGCAACCAACATTCCAATTTCCATCCCATCTCGCAACTGGGCAGCCTTCAGGGGCTGGTCCTTCACCAGACTCAAAACCAAGGAGACTCCATCTCTTGGATCAGGGTTCGATCCCTACTTCGTATATTCTGGATCTATTCCCTACCTGGATGGCACCTTTTACCTTAACCACACTTTCAAGAAGGTCTCCATCATGTTTGACTCCTCAGTCAGCTGGCCTGGCAATGACAGGCTGTTGAGTCCAAATGAGTTTGAAATCAAGCGCACTGTGGACGGGGAAGGATACAACGTGGCACAATGCAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTTCAGATGCTTGCCAATTACAACATTGGCTACCAGGGCTTTTACATCCCTGAGGGATACAAGGATCGCATGTACTCCTTTTTCAGAAACTTCCAGCCTATGAGCAGGCAGGTGGTTGATGAGGTTAATTACACTGACTACAAAGCCGTCACCTTACCATACCAACACAACAACTCTGGCTTTGTAGGGTACCTTGCACCTACTATGAGACAAGGGGAACCTTACCCAGCCAATTATCCATACCCGCTCATCGGAACTACTGCCGTTAAGAGTGTCACCCAGAAAAAGTTCCTGTGCGACAGGACCATGTGGCGCATTCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGGGCCCTTACCGACCTGGGACAGAACATGCTCTATGCCAACTCAGCCCATGCGCTGGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGATGAGCCCACCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAGTCTTCGACGTGGTCAGAGTGCACCAGCCACACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACACCGTTCTCGGCCGGCAACGCCACCACATAA。

2.根据权利要求1所述的用于检测3型人腺病毒的RPA专用引物，其特征在于：所述引物中的正向引物具有SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin）；

SEQ ID NO.2：5’ GCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACT 3’；

SEQ ID NO.3：5’ TTCTTCTCCAACTTGAGGCTCTGGCTGATA 3’ 。

3.一种用于检测据3型人腺病毒的RPA探针，其特征在于：是根据权利要求1中的3型人腺病毒hexon基因保守序列SEQ ID NO.1设计的，该探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）；

SEQ ID NO.4：

5’ ATAGTTACAACGAATCGAGACAATGCAGTAACTAC-[THF]-ACCACAAACA 3’。

4.根据权利要求3所述的用于检测据3型人腺病毒的RPA探针，其特征在于：所述探针由荧光素、5’端序列、碱基类似物四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团组成。

5.根据权利要求3所述的用于检测据3型人腺病毒的RPA探针，其特征在于：所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC的其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。

6.根据权利要求3所述的用于检测据3型人腺病毒的RPA探针，其特征在于：所述探针的长度为45 bp，其中5’端30 bp，3’端15 bp。

7.一种用于检测3型人腺病毒的RPA方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以待测样品基因组DNA为模板，在权利要求2所述的引物和/或权利要求3~ 6所述的探针标记下进行RPA反应；

（2）进行结果判断，具体为用上述侧向层析核酸检测试纸条对步骤（1）得到的RPA产物进行检测，如果检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；如果检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；如果质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。

8.根据权利要求7所述的一种用于检测3型人腺病毒的RPA方法，其特征在于，具体步骤如下：

扩增试剂准备和加样：将10 μmol/L正向引物2.1 μL、10 μmol/L反向引物2.1 μL、10 μmol/L探针0.6 μL、待测样品1 μL、无DNase和RNase水12.2 μL和缓冲液29.5 μL组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp^® nfo反应管中，然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上；

（3）结果判断：用侧向层析检测试纸条检测RPA产物，检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。

9.权利要求7所述的一种用于检测3型人腺病毒的RPA方法，其特征在于：所述方法中用于50 μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10 μmol/L，反向引物的浓度为10μmol/L，所述的探针的浓度为2.5 μmol/L，镁离子浓度为280 μmol/L，模板加样量为1 μL；将2.1 μL正向引物、2.1 μL反向引物、0.6 μL探针、1 μL样品、12.2 μL无DNase和RNase水和29.5 μL缓冲液组成预混液47.5μL，加到含有冻干酶粉的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上, 将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37 ℃扩增20 min，在反应4 min后，将反应管取出充分混匀，放回反应装置中继续扩增，使用侧向层析检测试纸条进行检测，试纸条显色时间控制在3 - 5 min。

10.权利要求2所述的专用引物和/或权利要求3~ 6所述的探针用于检测3型人腺病毒。