CN108251556A - 快速检测呼吸道b、c、e种人腺病毒dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，本发明的有益效果在于：本发明同时检测B、C、E三种人腺病毒DNA，其中B种人腺病毒包括3、7、16、21、50、66、11、14、34、35、55共11个血清型，C种人腺病毒包括1,2,5,6,57共5个血清型，E种人腺病毒包括4型1个血清型。试剂检测下限低至2Copies/PCR，定量线性范围：102～108Copies/ml,灵敏度100.0％(270/270),特异性99.8％(2881/2888)；符合率99.8％(3151/3158)；从样品处理到报告结果≤1.2小时；本发明简便、快速、灵敏度高、特异性好、成本低，特别适用于致呼吸道感染的B、C、E种人腺病毒精准诊断，为早期精准治疗赢得时间。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，尤其涉及一种快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法。
【背景技术】
腺病毒流行广泛，传播快，近年来在多个国家和地区时有爆发和流行，严重威胁到社会公共卫生安全。人腺病毒(Human mastadenoviruses,HAdV)可以感染多种粘膜组织，如胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及眼角结膜等，导致自限性的粘膜感染甚至严重的致死性感染(Robinson,2011；2013a；Lenaerts,2008)。腺病毒感染还和肥胖症相关(Arnold,2010；Atkinson,2005；Dhurandhar,2000；董瑞,2013)。各个年龄段人群均能被腺病毒感染，其中易感人群多为婴幼儿和免疫功能受损的患者(如骨髓移植、人类免疫缺陷病毒感染和先天性免疫缺陷综合症)，常可引起严重甚至致死性感染(Stercz,2012)；军队中腺病毒是致发热性呼吸道疾病的重要病原体。HAdV暴发感染多发生在幼儿园、新兵营等封闭或拥挤的场所，大规模流行中其所致的病死率较高，甚至未经治疗的重症HAdV肺炎或弥散性疾病的死亡率可能超过50％。近年来，越来越多新的HAdV型别被发现，目前HAdV已有68个基因组型别。其中人B组腺病毒是致急性呼吸道感染(ARI)的重要病原体，传染性强，常导致爆发流行，在国内外多有报道，国内流行毒株主要型别为3型和7型，近年人14型和新出现的55型有多次爆发流行报道，其高致病力引起人们更多关注。
腺病毒的宿主非常广，包括哺乳动物猪、犬、牛、马、蝙蝠和猴、树鼩等，禽类鸡、鸭等，及冷血动物青蛙、蛇等，并在鲟鱼中也有发现。根据国际病毒分类委员会2014的报告，腺病毒科包括哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)、禽类腺病毒(Aviadenovirus)、感染两栖类的Siadenovirus、感染爬行类的Atadenovirus和感染鱼类的Ichtadenovirus五个属，其中哺乳动物腺病毒属目前发现有25个种，包括人腺病毒7个种(species A-G)。根据文献报道和GenBank数据显示已经有7种68个腺病毒型别(表1)。
表1人腺病毒的分类a
目前上市的商品试剂和/或公布的检测方法(CN 101107366 A、CN 103725800 A、CN 103993102 A、CN 104131006 A等)大部分是检测全部腺病毒的筛查试剂或方法。中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所公布(CN 105586439 A)的检测试剂虽可检测B、E种人腺病毒，但缺少C种腺病毒，且不是荧光定量的方法。这些试剂或方法均不能精准检测致呼吸道感染的B、C、E种人腺病毒，可能造成漏诊或误诊。
【发明内容】
本发明目的在于解决基于以上原因，在精准医学日益发展的当下，现有发明或试剂已无法满足需求，发明新的能实现精准诊断的方法或试剂迫在眉前的不足而提供的一种新型快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，包括如下步骤：
(1)临床呼吸道样本采集和选取
咽拭子样本采用一次性咽拭子刷取鼻咽部上皮细胞，洗脱于1.0ml样本保存液中备用，共收集临床样本3435例；
(2)人腺病毒核酸提取与纯化
采用商品化磁珠法咽拭子核酸提取试剂盒提取和纯化所有样本人腺病毒核酸，所有操作严格按说明书进行；
(3)人腺病毒核酸筛查
采用两种商品化人腺病毒核酸检测试剂盒筛查所有样本人腺病毒核酸，所有操作和结果判断严格按说明书进行；
(4)质控/内标质粒构建
用软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；
(5)B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记
从数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，用软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针；
(6)4重qPCR体系优化、扩增及结果判断
优化4重qPCR反应体系，化学修饰热启动DNA聚合酶，加无菌双蒸水；qPCR扩增两步法，选择FAM、VIC、ROX、CY5，4通道于退火阶段探测荧光，以扩增曲线呈“S”形，CT值≤35，扩增曲线与基线夹角≥30°判为阳性，否则判为阴性；
(7)PCR产物测序：人腺病毒核酸筛查阳性的PCR产物采用克隆测序，PCR产物测序采用上下游引物双向测序；
(8)检测下限与定量范围试验
取2、3、4型人腺病毒培养液提取病毒核酸，用数字PCR系统定量后，将病毒核酸调成约1.0×108Copies/ml，10倍连续稀释成7个梯度浓度，按步骤(6)所述方法和标准上机扩增45个循环，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以扩增效率在0.95～1.05、相关系数>0.98、截距在3.1～3.5的最大与最小稀释度作为定量范围；
(9)真阳性、假阳性、真阴性、假阴性判断
真阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；假阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；真阴性：①本方法及人腺病毒核酸筛查均阴性；②本方法阴性，人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；假阴性：人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；
(10)试剂指标计算：
灵敏度计算：灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性)×100％；
特异性计算：特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性)×100％；
漏诊率计算：漏诊率＝(1-灵敏度)×100％；
误诊率计算：误诊率＝(1-特异性)×100％；
符合率计算：符合率＝(真阳性数+真阴性数)÷检测总数×100％。
进一步地，所述步骤(4)中用DNAMN软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；其序列如下：
TTCCGCCCACGGGTAGAGACAAACCGACTTAATTGTCATAGATGCTAATGTTCCTGCCTAACCTGGACAATTATTCCTTCCACGGTTGGTGGATGCAAGTTCATGAACGTTGGTACTCCCCAGAGCAGACGAATAGAGCCTGTAGTCGTTGATGAACCAATAGCTGGAGGACGATAGTGGGCGCCTGGACGTCGATTATCACCCGCTATGAGCTGACGGTGAGCTGGTTACAGCCTATGCATCGCGCCCTAGGACGATTAACGTTATTACACGCGGTTTGGTTGAGCTGTCCCGCAGCGGGTAGTGCCAGCAGACGACAGACTAGATATTTGCTAGTCTCAAGAGTCTGGAAGGATCCGTCAGCATCCTCGCATCAAGCAAGCAGCATTAGACAGCCCAGTACGACACCAAGACGAAGGCGTCCGAGCGTATAGCATTCTCTAGAGCCCGCTAAGGCACTTTTCTGGTCTATTTGAAACTACGACCGGGGCGTTTGGCTGGGCATCACCTAAGTGACAAACAGAATGGCTCACCAGTCCTCCTCCCTGGTAAAAGTGCTAACGAATTTCGCTTAGAAGTGACGGTCATGCGGAAACCTAAACGAGCCAATGGTCTTACGATCCCTTTTGGAGCCTATGTTCGCCTAATGGTGGACTCGATGGCTGTACCGATCAAAGCTTAGGAATTAGACCACACGGTAAACAAGATCGAGAACAGGCCAACTATGGACTGGCAATTGGCGTGGGTAACAATTGGAGCTTCTAGAGTTAGAAGCGCATGGTGTTTCTCGAGGACCGGTCTCACAATTTGAAGACGACGTCGCGCCAAGGTCCCACTTCAACCTTTCCGGGACTGTATTACATATAATAACACCCTATTCATGCTCGAAAGACCTGAGACTCGTCTATCGGTTTCGGCACCCCTTCCCGGGGCAAATATCCCAGCTGTGCTGGTACTCCACCCGAGCAACTACATCATATTGTCTTGACTCGGCTGCACT。
进一步地，所述步骤(5)中B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记从NCBI Genebank数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，其中B种人腺病毒包括：3、7、16、21、50、66、11、14、34、35、55共11个血清型，每型下载10条共110条；C种人腺病毒包括1,2,5,6,57共5个血清型，每型下载20条共100条；E种人腺病毒包括4型1个血清型共100条；用DNAMAN软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针表格：
进一步地，所述步骤(6)优化4重qPCR反应体系为10×Buffer5.0ul、dNTP MIX(10mM each)1.0ul、B、C、E种人腺病毒及质控/内标质粒引物(10μM)1.0-2.5ul、B、C、E种人腺病毒及质控/内标质粒探针(10μM)0.5ul、化学修饰热启动DNA聚合酶(1U/ul)2.0ul、100Copies/ul质控/内标质粒0.1ul，模板20.0μL，加无菌双蒸水至总体积50.0ul。
进一步地，所述步骤(5)或步骤(6)中所述人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含B种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
B种人腺病毒上游引物：CACATGGGAGCCAGGAGT
B种人腺病毒下游引物：RAACATGGCCAGATCGCAC
B种人腺病毒探针：TCTGTCCGAGGTCCTGACGGTT。
进一步地，所述步骤(5)或步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含C种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
C种人腺病毒上游引物：CAACCCCTTTTCTGGACCTC
C种人腺病毒下游引物：CAGTTGCTCTGCCTCTCCA
C种人腺病毒探针：CATTCAGTCGTAGCCGTCCGC。
进一步地，所述步骤(5)或步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含E种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
E种人腺病毒上游引物：CCTGCATGAAAGTCTTTGTTGTC
E种人腺病毒下游引物：GTGAAGGTCAGAGACTGGTTG
E种人腺病毒探针：CTGAGATCAGCGACTACTCCGGAC。
进一步地，所述步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含质控/内标质粒引物和探针，其序列如下：
质控/内标质粒上游引物：GCTAGTCTCAAGAGTCTGGAAG
质控/内标质粒下游引物：ACGCCTTCGTCTTGGTGTC
质控/内标质粒探针：CCGTCAGCATCCTCGCATCAAGCA。
本发明的有益效果在于：
(1)本专利同时检测B、C、E三种人腺病毒DNA，其中B种人腺病毒包括3、7、16、21、50、66、11、14、34、35、55共11个血清型，C种人腺病毒包括1,2,5,6,57共5个血清型，E种人腺病毒包括4型1个血清型；
(2)试剂检测下限低至2Copies/PCR，定量线性范围：102～108Copies/ml,灵敏度100.0％(270/270),特异性99.8％(2881/2888)；符合率99.8％(3151/3158)；从样品处理到报告结果≤1.2小时；
(3)本专利简便、快速、灵敏度高、特异性好、成本低，特别适用于致呼吸道感染的B、C、E种人腺病毒精准诊断，为早期精准治疗赢得时间。
【附图说明】
图1为本发明快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法以B种2型人腺病毒递度浓度模板扩增曲线图；
图2为本发明以270例人腺病毒真阳性样本检测表。
【具体实施方式】
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步描述：
如图1、图2所示，一种快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，包括如下步骤：
(1)临床呼吸道样本采集和选取
咽拭子样本采用一次性咽拭子刷取鼻咽部上皮细胞，洗脱于1.0ml样本保存液中备用，共收集临床样本3435例；
(2)人腺病毒核酸提取与纯化
采用商品化磁珠法咽拭子核酸提取试剂盒提取和纯化所有样本人腺病毒核酸，所有操作严格按说明书进行；
(3)人腺病毒核酸筛查
采用两种商品化人腺病毒核酸检测试剂盒筛查所有样本人腺病毒核酸，所有操作和结果判断严格按说明书进行；
(5)质控/内标质粒构建
用软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；
(5)B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记
从数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，用软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针；
(6)4重qPCR体系优化、扩增及结果判断
优化4重qPCR反应体系，化学修饰热启动DNA聚合酶，加无菌双蒸水；qPCR扩增两步法，选择FAM、VIC、ROX、CY5，4通道于退火阶段探测荧光，以扩增曲线呈“S”形，CT值≤35，扩增曲线与基线夹角≥30°判为阳性，否则判为阴性；
(7)PCR产物测序：人腺病毒核酸筛查阳性的PCR产物采用克隆测序，PCR产物测序采用上下游引物双向测序；
(8)检测下限与定量范围试验
取2、3、4型人腺病毒培养液提取病毒核酸，用数字PCR系统定量后，将病毒核酸调成约1.0×108Copies/ml，10倍连续稀释成7个梯度浓度，按步骤(6)所述方法和标准上机扩增45个循环，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以扩增效率在0.95～1.05、相关系数>0.98、截距在3.1～3.5的最大与最小稀释度作为定量范围；
(9)真阳性、假阳性、真阴性、假阴性判断
真阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；假阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；真阴性：①本方法及人腺病毒核酸筛查均阴性；②本方法阴性，人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；假阴性：人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；
(10)试剂指标计算：
灵敏度计算：灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性)×100％；
特异性计算：特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性)×100％；
漏诊率计算：漏诊率＝(1-灵敏度)×100％；
误诊率计算：误诊率＝(1-特异性)×100％；
符合率计算：符合率＝(真阳性数+真阴性数)÷检测总数×100％。
优先地，所述步骤(4)中用DNAMN软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；其序列如下：
TTCCGCCCACGGGTAGAGACAAACCGACTTAATTGTCATAGATGCTAATGTTCCTGCCTAACCTGGACAATTATTCCTTCCACGGTTGGTGGATGCAAGTTCATGAACGTTGGTACTCCCCAGAGCAGACGAATAGAGCCTGTAGTCGTTGATGAACCAATAGCTGGAGGACGATAGTGGGCGCCTGGACGTCGATTATCACCCGCTATGAGCTGACGGTGAGCTGGTTACAGCCTATGCATCGCGCCCTAGGACGATTAACGTTATTACACGCGGTTTGGTTGAGCTGTCCCGCAGCGGGTAGTGCCAGCAGACGACAGACTAGATATTTGCTAGTCTCAAGAGTCTGGAAGGATCCGTCAGCATCCTCGCATCAAGCAAGCAGCATTAGACAGCCCAGTACGACACCAAGACGAAGGCGTCCGAGCGTATAGCATTCTCTAGAGCCCGCTAAGGCACTTTTCTGGTCTATTTGAAACTACGACCGGGGCGTTTGGCTGGGCATCACCTAAGTGACAAACAGAATGGCTCACCAGTCCTCCTCCCTGGTAAAAGTGCTAACGAATTTCGCTTAGAAGTGACGGTCATGCGGAAACCTAAACGAGCCAATGGTCTTACGATCCCTTTTGGAGCCTATGTTCGCCTAATGGTGGACTCGATGGCTGTACCGATCAAAGCTTAGGAATTAGACCACACGGTAAACAAGATCGAGAACAGGCCAACTATGGACTGGCAATTGGCGTGGGTAACAATTGGAGCTTCTAGAGTTAGAAGCGCATGGTGTTTCTCGAGGACCGGTCTCACAATTTGAAGACGACGTCGCGCCAAGGTCCCACTTCAACCTTTCCGGGACTGTATTACATATAATAACACCCTATTCATGCTCGAAAGACCTGAGACTCGTCTATCGGTTTCGGCACCCCTTCCCGGGGCAAATATCCCAGCTGTGCTGGTACTCCACCCGAGCAACTACATCATATTGTCTTGACTCGGCTGCACT。
优先地，所述步骤(5)中B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记从NCBI Genebank数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，其中B种人腺病毒包括：3、7、16、21、50、66、11、14、34、35、55共11个血清型，每型下载10条共110条；C种人腺病毒包括1,2,5,6,57共5个血清型，每型下载20条共100条；E种人腺病毒包括4型1个血清型共100条；用DNAMAN软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针表格：
优先地，所述步骤(6)优化4重qPCR反应体系为10×Buffer5.0ul、dNTP MIX(10mMeach)1.0ul、B、C、E种人腺病毒及质控/内标质粒引物(10μM)1.0-2.5ul、B、C、E种人腺病毒及质控/内标质粒探针(10μM)0.5ul、化学修饰热启动DNA聚合酶(1U/ul)2.0ul、100Copies/ul质控/内标质粒0.1ul，模板20.0μL，加无菌双蒸水至总体积50.0ul。
优先地，所述步骤(5)或步骤(6)中所述人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含B种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
B种人腺病毒上游引物：CACATGGGAGCCAGGAGT
B种人腺病毒下游引物：RAACATGGCCAGATCGCAC
B种人腺病毒探针：TCTGTCCGAGGTCCTGACGGTT。
优先地，所述步骤(5)或步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含C种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
C种人腺病毒上游引物：CAACCCCTTTTCTGGACCTC
C种人腺病毒下游引物：CAGTTGCTCTGCCTCTCCA
C种人腺病毒探针：CATTCAGTCGTAGCCGTCCGC。
优先地，所述步骤(5)或步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含E种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
E种人腺病毒上游引物：CCTGCATGAAAGTCTTTGTTGTC
E种人腺病毒下游引物：GTGAAGGTCAGAGACTGGTTG
E种人腺病毒探针：CTGAGATCAGCGACTACTCCGGAC。
优先地，所述步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含质控/内标质粒引物和探针，其序列如下：
质控/内标质粒上游引物：GCTAGTCTCAAGAGTCTGGAAG
质控/内标质粒下游引物：ACGCCTTCGTCTTGGTGTC
质控/内标质粒探针：CCGTCAGCATCCTCGCATCAAGCA。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (8)
1.一种快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)临床呼吸道样本采集和选取
咽拭子样本采用一次性咽拭子刷取鼻咽部上皮细胞，洗脱于1.0ml样本保存液中备用，共收集临床样本若干份；
(2)人腺病毒核酸提取与纯化
采用商品化磁珠法咽拭子核酸提取试剂盒提取和纯化所有样本人腺病毒核酸，所有操作严格按说明书进行；
(3)人腺病毒核酸筛查
采用两种商品化人腺病毒核酸检测试剂盒筛查所有样本人腺病毒核酸，所有操作和结果判断严格按说明书进行；
(4)质控/内标质粒构建
用软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；
(5)B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记
从数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，用软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针；
(6)4重qPCR体系优化、扩增及结果判断
优化4重qPCR反应体系，化学修饰热启动DNA聚合酶，加无菌双蒸水；qPCR扩增两步法，选择FAM、VIC、ROX、CY5，4通道于退火阶段探测荧光，以扩增曲线呈“S”形，CT值≤35，扩增曲线与基线夹角≥30°判为阳性，否则判为阴性；
(7)PCR产物测序：人腺病毒核酸筛查阳性的PCR产物采用克隆测序，PCR产物测序采用上下游引物双向测序；
(8)检测下限与定量范围试验
取2、3、4型人腺病毒培养液提取病毒核酸，用数字PCR系统定量后，将病毒核酸调成约1.0×108Copies/ml，10倍连续稀释成7个梯度浓度，按步骤(6)所述方法和标准上机扩增45个循环，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以扩增效率在0.95～1.05、相关系数>0.98、截距在3.1～3.5的最大与最小稀释度作为定量范围；
(9)真阳性、假阳性、真阴性、假阴性判断
真阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；假阳性：经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；真阴性：①本方法及人腺病毒核酸筛查均阴性；②本方法阴性，人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性<70％；假阴性：人腺病毒核酸筛查阳性，经测序比对后，与人腺病毒同源性≥70％；
(10)试剂指标计算：
灵敏度计算：灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性)×100％；
特异性计算：特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性)×100％；
漏诊率计算：漏诊率＝(1-灵敏度)×100％；
误诊率计算：误诊率＝(1-特异性)×100％；
符合率计算：符合率＝(真阳性数+真阴性数)÷检测总数×100％。
2.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(4)中用DNAMN软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；其序列如下：
TTCCGCCCACGGGTAGAGACAAACCGACTTAATTGTCATAGATGCTAATGTTCCTGCCTAACCTGGACAATTATTCCTTCCACGGTTGGTGGATGCAAGTTCATGAACGTTGGTACTCCCCAGAGCAGACGAATAGAGCCTGTAGTCGTTGATGAACCAATAGCTGGAGGACGATAGTGGGCGCCTGGACGTCGATTATCACCCGCTATGAGCTGACGGTGAGCTGGTTACAGCCTATGCATCGCGCCCTAGGACGATTAACGTTATTACACGCGGTTTGGTTGAGCTGTCCCGCAGCGGGTAGTGCCAGCAGACGACAGACTAGATATTTGCTAGTCTCAAGAGTCTGGAAGGATCCGTCAGCATCCTCGCATCAAGCAAGCAGCATTAGACAGCCCAGTACGACACCAAGACGAAGGCGTCCGAGCGTATAGCATTCTCTAGAGCCCGCTAAGGCACTTTTCTGGTCTATTTGAAACTACGACCGGGGCGTTTGGCTGGGCATCACCTAAGTGACAAACAGAATGGCTCACCAGTCCTCCTCCCTGGTAAAAGTGCTAACGAATTTCGCTTAGAAGTGACGGTCATGCGGAAACCTAAACGAGCCAATGGTCTTACGATCCCTTTTGGAGCCTATGTTCGCCTAATGGTGGACTCGATGGCTGTACCGATCAAAGCTTAGGAATTAGACCACACGGTAAACAAGATCGAGAACAGGCCAACTATGGACTGGCAATTGGCGTGGGTAACAATTGGAGCTTCTAGAGTTAGAAGCGCATGGTGTTTCTCGAGGACCGGTCTCACAATTTGAAGACGACGTCGCGCCAAGGTCCCACTTCAACCTTTCCGGGACTGTATTACATATAATAACACCCTATTCATGCTCGAAAGACCTGAGACTCGTCTATCGGTTTCGGCACCCCTTCCCGGGGCAAATATCCCAGCTGTGCTGGTACTCCACCCGAGCAACTACATCATATTGTCTTGACTCGGCTGCACT。
3.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)中B、C、E种人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探针设计与合成标记从NCBI Genebank数据库中，分别下载B、C、E种人腺病毒E3基因序列，其中B种人腺病毒包括：3、7、16、21、50、66、11、14、34、35、55共11个血清型，每型下载10条共110条；C种人腺病毒包括1,2,5,6,57共5个血清型，每型下载20条共100条；E种人腺病毒包括4型1个血清型共100条；用DNAMAN软件分别比对B、C、E种人腺病毒E3基因序列，找出各种人腺病毒的保守区；根据比对结果避开变异区或突变点后，用Primer 5分别设计B、C、E种人腺病毒E3基因及质控/内标质粒引物和探针表格：
4.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(6)优化4重qPCR反应体系为10×Buffer5.0ul、dNTP MIX(10mM each)1.0ul、B、C、E种人腺病毒及质控/内标质粒引物(10μM)1.0-2.5ul、B、C、E种人腺病毒及质控/内标质粒探针(10μM)0.5ul、化学修饰热启动DNA聚合酶(1U/ul)2.0ul、100Copies/ul质控/内标质粒0.1ul，模板20.0μL，加无菌双蒸水至总体积50.0ul。
5.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)或步骤(6)中所述人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含B种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
B种人腺病毒上游引物：CACATGGGAGCCAGGAGT
B种人腺病毒下游引物：RAACATGGCCAGATCGCAC
B种人腺病毒探针：TCTGTCCGAGGTCCTGACGGTT。
6.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)或步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含C种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
C种人腺病毒上游引物：CAACCCCTTTTCTGGACCTC
C种人腺病毒下游引物：CAGTTGCTCTGCCTCTCCA
C种人腺病毒探针：CATTCAGTCGTAGCCGTCCGC。
7.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)或步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含E种人腺病毒检测引物和探针，其序列如下：
E种人腺病毒上游引物：CCTGCATGAAAGTCTTTGTTGTC
E种人腺病毒下游引物：GTGAAGGTCAGAGACTGGTTG
E种人腺病毒探针：CTGAGATCAGCGACTACTCCGGAC。
8.根据权利要求1所述的快速检测呼吸道B、C、E种人腺病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤(6)中人腺病毒DNA4重qPCR反应体系包含质控/内标质粒引物和探针，其序列如下：
质控/内标质粒上游引物：GCTAGTCTCAAGAGTCTGGAAG
质控/内标质粒下游引物：ACGCCTTCGTCTTGGTGTC
质控/内标质粒探针：CCGTCAGCATCCTCGCATCAAGCA。
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