CN113249519A - 一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法，其中，试剂盒包括DNA提取液、PCR反应液，其中PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、HAdV‑B3的引物序列、HAdV‑E4的引物序列、HAdV‑B11的引物序列、HAdV‑B14的引物序列、HAdV‑7的引物序列以及HAdV‑21的引物序列。本发明提供的试剂盒可用于检测和鉴定与流行病相关的HAdV(3、4、7、11、14和21型)血症，以促进临床对该疾病的及时诊断和治疗监测；本发明提供的腺病毒检测分型试剂盒还具有以下优点：提供扩增子污染风险低的封闭系统；快速，高通量样品测试；广泛应用的技术和可用的仪器；以及易于实施并整合到其他血液病原体的现有PCR检测面板中。

Description

一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及病毒分型领域，尤其涉及一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法。
背景技术
腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)是引起一些列疾病的常见病毒，它会引起感冒症状、发烧、咽喉痛、支气管炎、肺炎、腹泻和红眼病，免疫系统较弱或已有呼吸道或心脏病的人比其他人更容易患上腺病毒感染。
腺病毒经常感染儿童，主要引起呼吸道、眼部和肠胃道疾病。尽管大多数HAdV急性呼吸道疾病均为轻度且自限性，但已报道新生儿和婴儿，免疫缺陷者有潜在合并症以及其他情况下的可致严重感染甚至导致死亡。
HAdVs被分类在家庭内腺病毒科，属哺乳动物腺病毒，可进一步分为七种(A至G)和51个类型。临床症状，疾病严重程度和感染的流行病学模式通常取决于病毒种类或类型。HAdV呼吸道感染最常由B，C和E种病毒引起。C种病毒在儿科人群中普遍存在。B(主要是3、7、11、14和21型)和唯一的E类(4型)病毒已与影响儿童和成人的通常严重的呼吸道疾病流行有关，部分人群可出现病毒血症，引起严重的临床症状，继续相关诊断和治疗监测。
可以通过病毒分离，抗原检测，PCR和血清学来实现HAdV感染的实验室诊断。血清型鉴定通常通过用类型特异性超免疫动物抗血清进行血清中和和/或血凝抑制来进行。免疫分型方法可确定性地鉴定血清型，但费时，费力且仅限于拥有参考免疫试剂的少数实验室。各种分子的方法已被推进到扩充免疫分型，包括基因组的限制性分析，PCR-耦合微阵列，PCR片段长度分析，电喷雾电离质谱法，以及更常见的监测特异靶基因。尽管比免疫分型方法要先进，但这些方法需要专门的技术技能和设备，监测门槛比较高。
常规聚合酶链反应(PCR)，使用物种和型特异性引物测定法已被用于一些HAdVs描述了原因急性呼吸道感染，但目前所有的检测标本类型均为咽拭子，鼻咽拭子，痰液或者肺泡灌洗液等呼吸道样本，尚无针对无菌体液(主要是外周血)的腺病毒检测试剂。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法，旨在解决现有技术尚无针对外周血样本进行腺病毒检测分型的试剂盒的问题。
本发明的技术方案如下：
一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，其中，包括DNA提取液、PCR反应液，其中PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、HAdV-B3的引物序列、HAdV-E4的引物序列、HAdV-B7的引物序列、HAdV-B11的引物序列、HAdV-14的引物序列以及HAdV-21的引物序列。
所述用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，其中，所述HAdV-B3的引物序列如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2所示，所述HAdV-E4的引物序列如序列表SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4所示，所述HAdV-B7的引物序列如序列表SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6所示，所述HAdV-B11的引物序列如序列表SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:8所示，所述HAdV-14的引物序列如序列表SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:10所示，所述HAdV-21的引物序列如序列表SEQ IDNO:11至SEQ ID NO:12所示。
一种基于本发明试剂盒用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，其中，包括步骤：
采用DNA提取液对待测外周血样本进行DNA提取；
采用PCR反应液对提取的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
采用琼脂凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行电泳处理，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型。
所述用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，其中，采用PCR反应液对提取的DNA进行PCR扩增的步骤包括：
PCR反应条件为95℃5min，55℃1min，72℃1min，扩增30个循环，72℃延伸5min。
所述用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，其中，采用琼脂凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行电泳处理，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型的步骤包括：
配置1.5％浓度的琼脂糖凝胶；
在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过琼脂糖凝胶，将5μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，并点5μL Marker作为对照；
设置电泳条件为120V，通电进行电泳30min，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型。
有益效果：本发明提供的用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，可用于检测和鉴定与流行病相关的HAdV(3、4、7、11、14和21型)血症，以促进临床对该疾病的及时诊断和治疗监测。本发明提供的腺病毒检测分型试剂盒及检测分型方法具有以下优点：提供扩增子污染风险低的封闭系统；快速，高通量样品测试；广泛应用的技术和可用的仪器；以及易于实施并整合到其他血液病原体的现有PCR检测面板中。
附图说明
图1为本发明提供的一种用于外周血样本的腺病毒检测分型方法较佳实施例的流程图。
图2为测得样本的电泳图。
具体实施方式
本发明提供一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，其包括DNA提取液、PCR反应液，其中PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、HAdV-B3的引物序列、HAdV-E4的引物序列、HAdV-B7的引物序列、HAdV-B11的引物序列、HAdV-14的引物序列以及HAdV-21的引物序列。
本实施例提供的用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，可用于检测和鉴定与流行病相关的HAdV(3、4、7、11、14和21型)血症，以促进临床对该疾病的及时诊断和治疗监测。本实施例提供的腺病毒检测分型试剂盒具有以下优点：提供扩增子污染风险低的封闭系统；快速，高通量样品测试；广泛应用的技术和可用的仪器；以及易于实施并整合到其他血液病原体的现有PCR检测面板中。
在一些实施方式中，所述HAdV-B3的引物序列如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2所示，其中，序列表SEQ ID NO:1的核苷酸序列为5‘-CGTATCCATTTGTCCTTCCTAAT-3‘，序列表SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5‘-TAACATAGGATGTGCGACTATCT-3‘。该引物扩增后的序列片段为153bp。
在一些实施方式中，所述HAdV-E4的引物序列如序列表SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4所示，其中，序列表SEQ ID NO:3的核苷酸序列为5‘-ATGATAAAGGGAATATAAAGATTACCCTAA-3‘，序列表SEQ ID NO:4的核苷酸序列为5‘-GTACTACTGGTTCCGAACTC-3‘，该引物扩增后的序列片段为160bp。
在一些实施方式中，所述HAdV-B7的引物序列如序列表SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6所示，其中，序列表SEQ ID NO:5的核苷酸序列为5‘-CAAATATCAAGGCATTAAACCTAGAG-3‘，序列表SEQ ID NO:6的核苷酸序列为5‘-CATCTGGAAGGTACAAAGCC3‘，该引物扩增后的序列片段为158bp。
在一些实施方式中，所述HAdV-B11的引物序列如序列表SEQ ID NO:7至SEQ IDNO:8所示，其中，序列表SEQ ID NO:7的核苷酸序列为5‘-GTGGATTGCAGAAGGTGTA-3‘，序列表SEQ ID NO:8的核苷酸序列为5‘-TTACTTTCTTCATCTGAAACTTCCAA-3‘，该引物扩增后的序列片段为165bp。
在一些实施方式中，所述HAdV-14的引物序列如序列表SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:10所示，其中，序列表SEQ ID NO:9的核苷酸序列为5‘-GGGTTGAAACTACTGAAGAACG-3‘，序列表SEQ ID NO:10的核苷酸序列为5‘-CATCTGTATCAGTCCACGATT-3‘，该引物扩增后的序列片段为225bp。
在一些实施方式中，所述HAdV-21的引物序列如序列表SEQ ID NO:11至SEQ IDNO:12所示，其中，序列表SEQ ID NO:11的核苷酸序列为5‘-TTGGACAAGGAAATCTCTTTGC-3‘，序列表SEQ ID NO:12的核苷酸序列为5‘-GGAGCCACVGTGGGRTT-3‘，该引物扩增后的序列片段为201bp。
在一些实施方式中，所述用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒还包括无菌纯化水。
在一些实施方式中，还提供一种基于本发明试剂盒用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，如图1所示，其包括步骤：
S10、采用DNA提取液对待测外周血样本进行DNA提取；
S20、采用PCR反应液对提取的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
S30、采用琼脂凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行电泳处理，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型。
具体来讲，本实施例DNA的提取采取了特殊的保护措施以避免样品间的污染：使用不同的房间和专用设备进行DNA提取和处理；此外，对于PCR设置和分析，所有移液器吸头均具有用于气雾防护的过滤器。每个全血样品中一毫升用于提取DNA模板，根据制造商的规程，使用QIAamp DNA Blood Midi Kit(QIAGEN，中国上海)进行DNA提取，血样的所有血细胞比容均在正常范围内(男性0.40–0.50，女性0.37–0.45)，将所有提取的DNA悬浮于50μl无菌水中；最后，将提取的DNA保存在-70℃直到PCR检测；配置25ul反应混合液，其包括提取的样本DNA3ul，2x pcr Mix 12.5ul(Takara)，引物2ul，无菌纯化水8ul，PCR反应条件为95℃5min，55℃1min，72℃1min，扩增30个循环，72℃延伸5min；配置1.5％浓度的琼脂糖凝胶；在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过琼脂糖凝胶，将5μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，并点5μL Marker作为对照；设置电泳条件为120V，通电进行电泳30min，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型。图2为测得样本的电泳图，根据图2所示样本DNA条带的位置，可确认该样本的型号为HAdV-B7。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳市儿童医院
<120> 一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒及方法
<160> 12
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
cgtatccatt tgtccttcct aat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
taacatagga tgtgcgacta tct 23
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 3
atgataaagg gaatataaag attaccctaa 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 4
gtactactgg ttccgaactc 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 5
caaatatcaa ggcattaaac ctagag 26
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 6
catctggaag gtacaaagcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 7
gtggattgca gaaggtgta 20
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 8
ttactttctt catctgaaac ttccaa 26
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 9
gggttgaaac tactgaagaa cg 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 10
catctgtatc agtccacgat t 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 11
ttggacaagg aaatctcttt gc 22
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 12
ggagccacvg tgggrtt 17

Claims (5)

1.一种用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，其特征在于，包括DNA提取液、PCR反应液，其中PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、HAdV-B3的引物序列、HAdV-E4的引物序列、HAdV-B7的引物序列、HAdV-B11的引物序列、HAdV-14的引物序列以及HAdV-21的引物序列。
2.根据权利要求1所述用于外周血样本的腺病毒检测分型试剂盒，其特征在于，所述HAdV-B3的引物序列如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2所示，所述HAdV-E4的引物序列如序列表SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:4所示，所述HAdV-B7的引物序列如序列表SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6所示，所述HAdV-B11的引物序列如序列表SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:8所示，所述HAdV-14的引物序列如序列表SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:10所示，所述HAdV-21的引物序列如序列表SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:12所示。
3.一种基于权利要求1-2任一所述试剂盒用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，其特征在于，包括步骤：
采用DNA提取液对待测外周血样本进行DNA提取；
采用PCR反应液对提取的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
采用琼脂凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行电泳处理，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型。
4.根据权利要求3所述用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，其特征在于，采用PCR反应液对提取的DNA进行PCR扩增的步骤包括：
PCR反应条件为95℃5min，55℃1min，72℃1min，扩增30个循环，72℃延伸5min。
5.根据权利要求3所述用于外周血样本的腺病毒检测分型方法，其特征在于，采用琼脂凝胶电泳对所述PCR扩增产物进行电泳处理，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型的步骤包括：
配置1.5％浓度的琼脂糖凝胶；
在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过琼脂糖凝胶，将5μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，并点5μL Marker作为对照；
设置电泳条件为120V，通电进行电泳30min，在紫外检测仪下观察电泳结果并记录，根据电泳结果对待测外周血样本进行分型。
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