CN110373498A - 一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物lamp检测试剂盒与检测方法 - Google Patents
一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物lamp检测试剂盒与检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒与检测方法，其试剂盒包括1组特异性引物：SPLV‑lotusL，Prime Script™Reverse Transcriptase反转录酶、Oligo(dT)15 Primer、Ribonuclease Inhibitor抑制酶、dNTP、DNA Marker、pMD18‑T载体、RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、WarmStart®Colorimetric LAMP 2X Master Mix、WarmStart®LAMP Kit(DNA&RNA)。本发明在分子水平上为甘薯潜隐病毒莲藕分离物的检测提供了一种简单、快速、灵敏的方法，其敏感性和荧光定量RT‑PCR相当，具有替代PCR方法的可能性，适用于田间条件下检测莲藕中的甘薯潜隐病毒。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP的检测试剂盒与检测方法。
背景技术
莲藕(Nelumbo nucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，有三千多年的栽培历史，生产上可分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕富含淀粉、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，是我国南方地区的主要水生蔬菜，其栽培面积近40余万hm2。
甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus，SPLV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，是1979年在中国台湾的甘薯上首次发现的，其介体昆虫为蚜虫，可随薯苗营养繁殖体及薯块传播。甘薯潜隐病毒具有变种和多样性(比如甘薯潜隐病毒莲藕分离物(Sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus))，是本实验室前期在莲藕中发现的一种甘薯潜隐病毒新型分离物)。江苏省莲藕主产区SPLV-lotus感染越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势，因此脱毒莲藕种苗的应用迫在眉睫。
发明内容
本发明目的在于提供一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus环介导等温扩增的检测试剂盒与检测方法。
甘薯潜隐病毒莲藕分离物(Sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus)，是本实验室前期在莲藕中发现的一种甘薯潜隐病毒新型分离物。该分离物与SPLV甘薯分离物具有很大的遗传差异，核苷酸相似性在76.28％-76.60％之间，与最新的国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)制定的马铃薯Y病毒科病毒的分种标准相同，且该分离物与SPLV甘薯分离物有四个蛋白酶水解切隔识别位点存在差异，其编码的PIPO的长度差异较大。SPLV-lotus自然条件下能够侵染莲藕，并且能有效侵染豆科、藜科、葫芦科、茄科植物，但未见明显的症状表现。2016年，我们在江苏省莲藕产区首次发现SPLV-lotus，后续调查发现，SPLV-lotus在江苏省莲藕主产区发生越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势。因此，发展SPLV-lotus的精确检测鉴定技术迫在眉睫。LAMP技术是一种新型核酸扩增技术，应用范围广泛，以其特异性强、灵敏度高、扩增高效、快速，步骤简单、鉴定简便等优点逐渐受到青睐。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus环介导等温扩增的检测试剂盒，其特征在于包括针对SPLV-lotus CP基因设计的LAMP特异性引物组合物SPLV-lotusL，该LAMP特异性引物组合物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成；各引物序列具体如下：
F3：CCAATGGTACGAAGGAGTG；
B3：GCCGCAAAATCTATCAGTG；
FIP：CGATGCACCATACCACTAGCCAAGAATGCTTATGAAGTAGACG；
BIP：TCCCCGAACATAAATGGCGATTCAAAATCTATCAGTGGTTTGATTG。
所述试剂盒还包括Prime ScriptTM Reverse Transcriptase反转录酶、Oligo(dT)15Primer、Ribonuclease Inhibitor抑制酶、dNTP、DNA Marker、pMD18-T载体、RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、 Colorimetric LAMP 2X Master Mix、LAMP Kit(DNA&RNA)。
所述试剂盒还包括标准阳性模板(比如带有SPLV-lotus基因组序列的质粒)。
本发明还提供了一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus环介导等温扩增的检测方法，其包括以下步骤：
(1)采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总RNA；
(2)设计并合成引物包括：
F3：CCAATGGTACGAAGGAGTG；
B3：GCCGCAAAATCTATCAGTG；
FIP：CGATGCACCATACCACTAGCCAAGAATGCTTATGAAGTAGACG；
BIP：TCCCCGAACATAAATGGCGATTCAAAATCTATCAGTGGTTTGATTG；
(3)采用LAMP反应体系进行环介导等温扩增。
步骤(3)的LAMP反应体系中，反应时间优选为60min。优化反应时间的步骤：以SPLV-lotus阳性质粒为模板，分别设置反应时间为15、25、30、45、60、75min 6个梯度，利用SPLV-lotusL9引物在60℃条件下进行LAMP检测。
步骤(3)的LAMP反应体系中，反应温度优化为62℃。优化反应温度的步骤：在优化后的反应时间下，以SPLV-lotus阳性质粒为模板，分别设置反应温度分别为60～66℃恒温反应60min，筛选出最佳反应温度。
本发明还提供甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒在莲藕脱毒苗检测中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明方法与常规PCR相比，灵敏度相同，具有可视化的特点，且不需要特殊的仪器设备，适应于莲藕田间样品检测。本发明在分子水平上为甘薯潜隐病毒莲藕分离物的检测提供了一种快速、步骤简单、灵敏度高的试剂盒和检测方法，尤其适用于田间样品现场检测鉴定。
附图说明
图1 11对LAMP检测引物RT-PCR检测结果，1-11:LAMP检测引物SPLV-lotusL1-11；
图2 LAMP试剂盒检测引物结果，6-11:LAMP检测引物SPLV-lotusL6-11；
图3 LAMP反应时间的优化结果，M:DL2000DNA Marker 1-6:15、25、30、45、60、75min；
图4 LAMP反应温度优化结果，M:DL2000DNA Marker 1-7：59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；
图5 LAMP灵敏度试验结果，M:DL2000DNA Marker 1-9：7×109-7×101拷贝·μL-1浓度的质粒；
图6 LAMP显色反应结果，P:阳性对照N:阴性对照1、2:含有SPLV-lotus的莲藕样品。
具体实施方式
下述实施例是为说明本发明而进行的进一步详细描述，不构成对本发明的任何限制：
(1)引物设计与合成
根据病毒SPLV-lotus基因组序列(SEQ ID NO.45)，利用Primer Explorer V4设计11组LAMP引物，引物序列如下：
第一组引物SPLV-lotusL1：
1F3：AAGCCGATGAAACCATCCTC
1B3：TGGCAGACGAATTCTTGTGG
1FIP：CCTGGCTGGGTTGGTGTGTTACGAAGAAGAAGCAGGGCAC
1BIP：ACCCGCACATCAGAACATGACAAAGCGGGGTACCTGGAAG
第二组引物SPLV-lotusL2：
2F3：TTAAGTCTGGTGCAGCAC
2B3：TTCTCGATGCACCATACC
2FIP：TCCCTCGTGGATTTAGCATTCGCGATCACTTGTTAGTTTATAAGCC
2BIP：TCAGTTTAGCCAATGGTACGAAG-AGCCCATTCATCAGTATTGAC
第三组引物SPLV-lotusL3：
3F3：CACTTAACCTCGATCACTTG
3B3：ATTTATGTTCGGGGACGT
3FIP：GGCTAAACTGATCCCTCGTGGTTAGTTTATAAGCCCTCTCAACT
3BIP：ATGGTACGAAGGAGTGAAGAATGCCACCATACCACTAGCCCA
第四组引物SPLV-lotusL4：
4F3：ACGATTGGAACATTTCAGGTA
4B3：CATAAGCATTCTTCACTCCTT
4FIP：GATCGAGGTTAAGTGCTGCACGCAATACCCACAAAGATTCG
4BIP：TAAGCCCTCTCAACTTGACATTACCGTACCATTGGCTAAACTGA
第五组引物SPLV-lotusL5：
5F3：AGAATGCTTATGAAGTAGACGA
5B3：CGACATCACTAAAGTGTTTCA
5FIP：TGTTCGGGGACGTTCCATTCTGTCAATACTGATGAATGGGC
5BIP：TGGGTGATGATGGATGGAGATTGTCGAAATGTTGGTGCC
第六组引物SPLV-lotusL6：
6F3：TGGTACGAAGGAGTGAAGA
6B3：GCCGCAAAATCTATCAGTG
6FIP：TCGATGCACCATACCACTAGCATGAAGTAGACGACCAACAG
6BIP：GGAACGTCCCCGAACATAAATTTTGATTGGGTATGAAATCTGTG
第七组引物SPLV-lotusL7：
7F3：TGTTAGTTTATAAGCCCTCTCAA
7B3：AATCGCCATTTATGTTCGG
7FIP：TCACTCCTTCGTACCATTGGCCTTGACATTACGAATGCTAAATCC
7BIP：ATGCTTATGAAGTAGACGACCAACACGTTCCATTCTCGATGC
第八组引物SPLV-lotusL8：
8F3：ACGCGAATGTACACCACC
8B3：ACCTGGAAGGTTCCGAGG
8FIP：TCCTTCTGTGCCCTGCTTCTTCAAGCCGATGAAACCATCCTC
8BIP：ACCCAGCCAGGTCCATCAGATATGTCATGTTCTGATGTGCGG
第九组引物SPLV-lotusL9：
F3：CCAATGGTACGAAGGAGTG
B3：GCCGCAAAATCTATCAGTG
FIP：CGATGCACCATACCACTAGCCAAGAATGCTTATGAAGTAGACG
BIP：TCCCCGAACATAAATGGCGATTCAAAATCTATCAGTGGTTTGATTG
第十组引物SPLV-lotusL10：
10F3：TTCGATGAGGAGGACGCG
10B3：GTTCCGAGGGTGCCAGTA
10FIP：TCCTTCTGTGCCCTGCTTCTTCGTACACCACCAAGCCGATG
10BIP：ACCCAGCCAGGTCCATCAGATATGTCATGTTCTGATGTGCGG
第十一组引物SPLV-lotusL11：
11F3：GTCGTCTCTTTGGTTCATG
11B3：GCACCAAATCATCGTAACC
11FIP：GAGACTATCCGTTCCTTTTCAAGCTCTCACCAAGGGATCAAAC
11BIP：AATCCTTGAGTGGGATAGGGCCATGCTTCTACCATCGC
将设计好的11组LAMP检测引物的外引物F3、B3分别用PCR检测，以SPLV-lotus阳性质粒为模板，PCR检测结果如图1所示，引物SPLV-lotusL1～SPLV-lotusL5虽然扩增出了目的条带，但是有杂带且不清晰，SPLV-lotusL6～SPLV-lotusL11均扩增出了明亮清晰的单一条带，初步说明SPLV-lotusL6～SPLV-lotusL11特异性均良好，需再进行LAMP试剂盒的筛选。
将设计好的11组LAMP检测引物分别应用 LAMP试剂盒进行SPLV-lotus检测，以SPLV-lotus阳性质粒为模板，设定初步反应温度为60℃，反应时间为60min。反应结束后3μL产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，引物SPLV-lotusL6～SPLV-lotusL8均没有扩增出梯形条带，SPLV-lotusL10、SPLV-lotusL11虽然扩增出了条带，但是不够明亮清晰，故筛选SPLV-lotusL9引物作为本实验的最佳检测引物。
(2)总RNA提取
采用多糖多酚植物组织裂解法进行待测样品(莲藕脱毒苗)的总RNA提取。
(3)环介导等温扩增
反应体系如表1：
表1反应体系
其中模板RNA即待测样品(莲藕脱毒苗)的总RNA。进行LAMP反应，反应温度为62℃，反应时间为60min。
(4)优化反应时间
以SPLV-lotus阳性质粒为模板，分别设置反应时间为15、25、30、45、60、75min 6个梯度，利用SPLV-lotusL引物在60℃条件下进行LAMP检测，检测结果显示，在反应时间为15min和25min时，均为扩增出条带；30、45、60、75min均有条带扩增出，随着反应时间的增加，扩增条带逐渐明亮清晰，60min和75min没有明显差异(图3)，为节约试验时间，故选用60min为LAMP最优反应时间。
(5)优化反应温度
在优化后的反应时间下，以SPLV-lotus阳性质粒为模板，分别设置反应温度分别为60～66℃恒温反应60min，筛选出最佳反应温度。结果显示，在不同温度下均能形成梯形条带，60℃虽能扩增出条带，但是条带较暗不明显；61～65℃扩增效果较好，条带明亮；在66℃时出现了弥散和拖尾的现象(图4)。故本实验选用62℃作为LAMP反应的最优温度。
(6)灵敏度试验
在确认过最优反应时间和温度后，分别以10倍稀释的7×101-7×109拷贝·μL-1的SPLV-lotus阳性质粒为模板，利用SPLV-lotusL引物在62℃条件下恒温反应60min(图5)，结果显示，LAMP反应能检测出的最低浓度为7×103拷贝·μL-1，检测灵敏度与常规PCR相同。
(7)显色反应
采用染料法，由于本试验所用的LAMP试剂中本身就带有了pH指示剂，不需要另开盖向反应产物中加入染料。观察发现，阴性对照不发生反应呈粉红色，SPLV-lotus阳性质粒呈现黄色，感染SPLV-lotus的莲藕样品呈现出橙黄色(图6)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员对之可作一些修改或改进。但是，在不偏离本发明内涵的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒与检测方法
<130> xhx2019062602
<141> 2019-06-26
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaatggtac gaaggagtg 19
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gatcgaggtt aagtgctgca cgcaataccc acaaagattc g 41
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taagccctct caacttgaca ttaccgtacc attggctaaa ctga 44
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agaatgctta tgaagtagac ga 22
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tggtacgaag gagtgaaga 19
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gccgcaaaat ctatcagtg 19
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tcgatgcacc ataccactag catgaagtag acgaccaaca g 41
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acgcgaatgt acaccacc 18
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tccttctgtg ccctgcttct tcaagccgat gaaaccatcc tc 42
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acccagccag gtccatcaga tatgtcatgt tctgatgtgc gg 42
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tccttctgtg ccctgcttct tcgtacacca ccaagccgat g 41
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acccagccag gtccatcaga tatgtcatgt tctgatgtgc gg 42
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gtcgtctctt tggttcatg 19
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gcaccaaatc atcgtaacc 19
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aatccttgag tgggataggg ccatgcttct accatcgc 38
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<211> 10081
<212> DNA
<213> Sweet potato latent virus-lotus
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aaattaacaa aactcaatac aacaacagaa gaattaagca aacaaaacca atttctaatt 60
atcataaaca agtgaattct cggttctcga acaagttcag actcttcata attccatcat 120
atataattat cacaattatt acgatggcag ctgttatctt tggatctttt actgaaactc 180
cagttctgtt agactcggct aagataactc ctacaatcac gcggaagcga ttcgttgagg 240
agcgtatcat agtacgcgag aagaaagttt atggaaagtg tggagtttgt ggcgatgaga 300
tgccaacgaa gtccatgcta cgcaagcatc ttgcgttaaa gtgtgactat ctggcactat 360
cctcatccct tgagtatgag gatgttgaga aaatcatcac taaggtggtt gaggaggaag 420
tcccatttta tgatttcacg tggctccaac atcgcgtgtt ggacaaacca gctatcgatg 480
ttggtaagat caatacagcg atcatgccag cttttggcac catggaagtt attgaatcac 540
agcagcagga ttttattgaa attgacactg gtgtgattat aaagcccaaa gaatcttgtg 600
tatatcgggg accaccagtg ttcccaatat tggcaactaa ggtggacaag cgaactaaaa 660
tattagctca caatcttact agtgctgcaa agaacataat atctgaatat gatgctaggc 720
ttgagaaggc atttgcaacg cttgatgtgg ttgtgcaaaa agatgcggac aggaaagcta 780
ctatgaaggt agtgaagaag cgcaatggaa catgcatatt taggccctat aatactaggg 840
actatctgaa gatgcgtagg aaggagagag ctgcagcagc aaatgtggca tttgctaaac 900
aggccccaca cgttatcatc aagttgtcaa tggctggtgg gcccacacca tcagcgatgg 960
atcatgagat ggctaccaaa cgacctctta ataaaacgcc tagcatgaag aggcgatgtg 1020
tctgtaagcg tgtgacaatg gaagaaggaa aaatcgagga tctcatacat acgattggga 1080
ggatagcttc aaagaatcac cttcggttcg aaattgtggc cgggggaaaa cctacgactg 1140
gtaggtttaa gcaatttaat ggaaataacc atatgtttct tgatcttaag catatgaaag 1200
gcctaaggag gcgaatagac gttagtctta gtgatgcaaa ccagcagatc actacaaagc 1260
tggccaaagc tgtgaattat gaacgaagat ttgatactac gcatttttca tatggatcta 1320
gtggattagt tattaatcca tttaaatccg ttggaagaat gggtagggca agaggagagg 1380
tattcatagt gagagggcgg catgaaggaa agctatatga tgcgcgtcaa aaggtcactg 1440
aatctgtcat gttacatatg atgcattatg cagacacagc ccaaaagttt tggagaggtt 1500
ttgaaaaagt gttcctctcg aataggccag aagaaagatc acatacttgt gtggcagatt 1560
tggatgttgg taagtgtgga gaaattgcag cactaacatg tcaagcgata caaccatgtg 1620
ttaaaattac gtgtacgcaa tgtttcacac acttaaatgg attaagcgac agagcttata 1680
gggagttatt aaagagccaa gttttgaaga tagcacctca aattcgtgca cattacccag 1740
aattcgcatt tatggctgaa tttattgaga aatttgggcg aacagcgaca ttagctaatg 1800
ataattataa tgcgttctcg gaaagtcgcc gcttaattgg tgataggaat gaacaaccat 1860
tctcatcact taataagtta aataactacc tcataaaggg tgggaattta acaagcgatg 1920
aattctcaga tgcatctgat tgtcttagag agctggtgcg ataccataat aatagaacgg 1980
agaacataaa gaagggctcc ttggaacaat ttcgtaataa agtctcccag agaagtcatt 2040
tcaatgcatc actcatgtgt gataatcaac ttgataaaaa tggtaatttc atatggggtg 2100
agaggggata tcatgcaaaa cgattcttcg ccaattattt tgatatagtt gagccaaaag 2160
atgggtacac aaagtatatc catcgcaaaa atcctaatgg aagtcgtgaa ctcgccatta 2220
ataacctcat agtctccacg aactttgaaa gaatgaggga attaatggaa ggcatacctg 2280
tgaagaagca cccgttatcc aagcagtgtg tgagtatgcg aaatgggaat tttgtttatg 2340
tgtgctcctg tgtaacatta aatgatggac agccccaaga gtctgatttg aagctgccaa 2400
cgcgtaatca cttggtgatt ggaaatgcag gagatcctaa atatgttgat ttaccaacag 2460
aagtgagtga aaaactatat attgcaaagg agggtttctg ctacataaac atcttcctgg 2520
ccatgttagt aaatgtgaga gagtcagagg ctaaggattt cacgaaaaga gtgcgagata 2580
tagtagtcca aaaattagga aaatggccaa caatgataga tgtagctaca gcatgttgtt 2640
tgctcgctgt atttcatcca gaagtgcaag atgctgaatt gccacgaatc ctaattgatc 2700
acaccaccaa gacaatgcat gtgattgatt cttatggttc aaagaacact gggtatcaca 2760
ttctgaaggc taatacagtt agtcagctaa tgcaatttgc cagcgattca cttgattctg 2820
agatgaaatt ctatgttgtg ggtggacatg cgcacacttc atcctttgag agaacttcaa 2880
tcacaaccat aattaagggt gtatataaac cagctgtcat gcgagagatc cttgatacgg 2940
atccgtattt gctactgatg gctatcttgt ctccgactgt gctcagagca ctacacacta 3000
gtggatcact tgagcgagct cttgaatatt ggataagtag tgaccaagat gtggtaacaa 3060
ttataacact ggtgaagact ttagcacaaa aagtatcagt tgcaagaacc ttaaccacgc 3120
aaatgcaagt cgtgcaggat tatgctacgg agctaacggg ctacgttcac caaacaaagc 3180
gagtatcgat agcagcagtt gtggcattcc gtacgcttca gcatctgagt aataagcgca 3240
gcgctgatgg aatattgaca caacaagggt ttcaaaacac agtggagcgc gagactcttg 3300
aagcccttga gaaaaaatat gcgtgggagc taaagcagca gtggaacgct ttaagcttgt 3360
gtcaaaaatg ttactacaca ctacagtata tgaagcaatg caggcgatca cacgagtctg 3420
tagccagcgt gcgcaccaca gagcgcgtag aggcctttat cgcatatcca tctcagtgtt 3480
tggggagtgc aattgcaatc gcaaggcagt ctaaggagcg aattcaaagt gcattcgtgg 3540
aaggcaaact caaaataaag ctctttttgt ttgataaagc actaactgtt atgcgatttg 3600
gaataccaga tgtggtaagg ttggctaata tccttattgt gattactata ctgtatggag 3660
tctcatccag attgcggcgt ctattgcaag atcacctcaa ataccgtgcg ttatacatgc 3720
aagagactga tgataaggat tttgccaggt tgcaggatat atatgtggag tgtattggta 3780
cggatggaac tctaccaaca gttggggagt ttttaaaagc tgtcaatatt aaagcaccag 3840
aattaaatga gtatgcgttg gaaacaactg catttgctag tgataatgtt gtgcatcagg 3900
cgaagagccc aaccgaggca aaatatgaga ggatcatagc aatggttgct ttgtttatga 3960
tggcctttga tacagagagg agtgattgtg tgtataagat tctgaacaag ctgagaacac 4020
tcacgaacat tgcgcaacaa gatgtgcatc atcaaagttt ggatgatatc aaagatgagt 4080
ttagtgaaaa acagatgact attgattttg aacttgattc agatacacaa agtccaagtt 4140
ctttaacgga tgtgacattt gccaaatggt ggtcaaacca actggcaatg aacaatgtta 4200
ttccacacta caggactgag ggtcatttta tggagttcac acgagcaaat gcctctgcag 4260
tagctcatga gatcgccata ggacagcata atgacatttt aattagaggt gcagttggat 4320
ctggaaagtc gacgggtttg ccatttaatt tgatgcgcaa gggagcagta ttgttaatag 4380
aacccacaag gccactagca gagaatgtgt gcaaacagct gagaggagat ccttttaatt 4440
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tgacaagtgg gtatgcatta cattaccttg cgaataatgt acattgtata gccaattatc 4560
aatttattat ctttgacgag tgtcatgtaa atgacgcagc agctatggct tttagatgct 4620
tgctacatgg acatgcattc gctggaaaga ttctcaaagt gtcagcaaca ccaccaggtc 4680
gagaggttga attcaccaca cagcatccag tgaaagtttt agttgaggaa tcaatttcat 4740
ttaatgactt tgttgctgca caaggaacag gacaaaatgc tgatgtgatt gtgaggggtg 4800
acaatatatt ggtgtatgta gctagttata atgaagttga tattctaagt aagctcttac 4860
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caccatattt aataaacgca gttttacaac tgcgtttgca tttcatggag gattgggata 8280
taggtgaaca aatgctgaaa aatttatata cggagattgt ctacactccg atcttgacac 8340
ctcatggtac aattgtcaaa aagcacaaag gaaacaacag cggacaacct tctactgtcg 8400
tggataatac attgatggtt atactggcta tgtattattc attgcatgca gaaggctact 8460
cagctgaata tgctgaaagt gtttgtaagt tctttgtgaa tggagatgat ttactaatcg 8520
cagtacaccc gcaacatgag tctatcttgg ataaactgca gacacacttc aagtgcttgg 8580
gattgaagta cacatttgat aatagacatg atgataaaac atctctctgg tttatgtcgc 8640
accaaggaat caaaagggat ggaattttta ttcctaaact ggaaaaggaa cgaattgtat 8700
caatccttga gtgggacaga tcaagagaac caatccatcg aatggaggca atatgtgctg 8760
caatggtcga ggcatggggc tatgatgact tggtgtatga gatcagaaaa ttctataagt 8820
ggatgttgga gcaagctccg tactcagatc ttgcgaagaa tggaggagca ccatacattg 8880
ctgaagtcgc gctgagaaga ctatacacat ctattatacc ggaacagtct gaattggaac 8940
aatatctagc agcgattatg gaggaaccag attttgatga agaagaaatt ggtgttcatc 9000
atcaagctgc tgacgatgaa ctagatgctg gtaagatgaa tgtaaagaaa caacaaggaa 9060
ctggcgaggc aggtcaacca tccgcaacac caccacagtc aaatgctaag gacaaaggca 9120
aagaggttgt atcagcacaa gggagtggga tcatcaataa accagagctg gaccgagata 9180
taaatactgg tacaattgga acatttcagg tacctcggtt gcgtgcgata cccacaaaga 9240
tccgactacc aataattaag tccggagcag cacttaatct cgatcatttg ttagtttata 9300
agccctctca acttgacatt acaaacgcta aatccacaag ggatcagttt agccaatggt 9360
atgaaggagt gaagaatgct tatgaagtag atgaccaaca gatgtcaata ctaatgaatg 9420
ggctagtggt atggtgcatc gagaatggaa catccccgaa tataaatggt gattgggtga 9480
tgatggatgg agacacacag atttcatatc caatcaaacc actgatagat tttgcggcac 9540
caacatttcg acaaatcatg aaacatttta gtgatgtcgc agaggcctac atacagatgc 9600
gtaatgcaga acaaccgtac atgccaaggt acggtttaca gcgtaacttg acagacatgt 9660
ccttggcacg atatgctttc gatttctatg aagttacatc aaggacacct attcgtgcca 9720
aggaagctca ctttcagatg aaagctgcag cacttacaaa tacacatcat cggctgttcg 9780
gtttggatgg aaatgtctca actaatcaag agaatactga acggcatacc gcaactgatg 9840
tggatcggaa catacacaca ctacttggaa tgcgtggcat tcattagtgt gtatgcttat 9900
ctataaagtt atttatattt atgtatgtat gttcgtcgaa ggggaatcta cttgtggagc 9960
gttgtgaggg tgtccctcga gtgaaacatt tagtgtgatc ctttccgtta tatttcaaga 10020
aatttatgat attagtgagg cactgcctcc attcataaac tttttgcttt ataccagaga 10080
c 10081
Claims (7)
1.一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒，其特征在于包括针对SPLV-lotusCP基因设计的LAMP特异性引物组合物SPLV-lotusL，该LAMP特异性引物组合物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成；各引物序列具体如下：
F3：5’-CCAATGGTACGAAGGAGTG-3’；
B3：5’-GCCGCAAAATCTATCAGTG-3’；
FIP：5’-CGATGCACCATACCACTAGCCAAGAATGCTTATGAAGTAGACG-3’；
BIP：5’-TCCCCGAACATAAATGGCGATTCAAAATCTATCAGTGGTTTGATTG-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Prime Script™Reverse Transcriptase反转录酶、Oligo (dT)15 Primer、Ribonuclease Inhibitor抑制酶、dNTP、DNA Marker、pMD18-T载体、RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、WarmStart®Colorimetric LAMP 2X Master Mix、WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
4.一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus的LAMP检测方法，其包括以下步骤：
（1）采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总RNA；
（2）构建阳性质粒标准品；
（3）设计并筛选引物；引物包括：
F3：5’-CCAATGGTACGAAGGAGTG-3’；
B3：5’-GCCGCAAAATCTATCAGTG-3’；
FIP：5’-CGATGCACCATACCACTAGCCAAGAATGCTTATGAAGTAGACG-3’；
BIP：5’-TCCCCGAACATAAATGGCGATTCAAAATCTATCAGTGGTTTGATTG-3’；
（4）采用LAMP反应体系进行环介导等温扩增。
5.根据权利要求4所述的一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus环介导等温扩增的检测方法，其特征在于，步骤（4）的LAMP反应体系中，反应时间为60 min。
6.根据权利要求4所述的一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus环介导等温扩增的检测方法，其特征在于，步骤（4）的LAMP反应体系中，反应温度为62℃。
7.权利要求1-3任意一项所述的甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒在莲藕脱毒苗检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910564909.2A CN110373498A (zh) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | 一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物lamp检测试剂盒与检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201910564909.2A CN110373498A (zh) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | 一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物lamp检测试剂盒与检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110373498A true CN110373498A (zh) | 2019-10-25 |
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Family Applications (1)
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| CN201910564909.2A Pending CN110373498A (zh) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | 一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物lamp检测试剂盒与检测方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112680463A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-04-20 | 江苏省农业科学院 | 一种野豌豆潜隐病毒的cp基因及其应用 |
| CN114606229A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-06-10 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 山药潜隐病毒的rt-lamp检测引物组及检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107385108A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-24 | 扬州大学 | 莲藕中一种新马铃薯y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测方法 |
-
2019
- 2019-06-27 CN CN201910564909.2A patent/CN110373498A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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| CN107385108A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-24 | 扬州大学 | 莲藕中一种新马铃薯y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测方法 |
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| 刘娴: "莲藕中一种马铃薯Y病毒属病毒的鉴定与全序列分析", 《万方学位论文数据库》 * |
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| CN114606229B (zh) * | 2022-03-22 | 2024-04-12 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 山药潜隐病毒的rt-lamp检测引物组及检测方法 |
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