CN110184266A

CN110184266A - 柑橘叶片dna快速提取方法及其在柑橘黄龙病检测中的应用

Info

Publication number: CN110184266A
Application number: CN201910477013.0A
Authority: CN
Inventors: 关巍; 李智鹏; 黄洋; 王铁霖; 杨玉文; 赵廷昌
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN110184266B

Abstract

本发明涉及柑橘病害检测，具体涉及一种柑橘叶片DNA快速提取方法及其在柑橘黄龙病高通量分子检测中的应用。DNA快速提取方法包括：将来自待测柑橘植株的柑橘叶片的叶柄和叶中脉切碎，每30mg样品加入40μL裂解液，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s，然后加入4倍裂解液体积的0.1mol/L，pH＝8的Tris‑HCL，涡旋震荡10～15s后，离心取上清，即得DNA溶液；所述裂解液的配方为：0.5mol/L NaOH，1％TritonX‑100。该方法与qPCR的结合可实现对柑橘黄龙病的高通量快速分子检测，为黄龙病的大规模精确化诊断提供了有利工具。

Description

柑橘叶片DNA快速提取方法及其在柑橘黄龙病检测中的应用

技术领域

本发明涉及柑橘病害检测，具体涉及一种柑橘叶片DNA快速提取方法及其在柑橘黄龙病高通量分子检测中的应用。

背景技术

柑橘黄龙病是柑橘上的毁灭性病害，在世界主要柑橘产区均有发生(Zhong etal.,2015)。柑橘黄龙病的病原菌为候选菌属韧皮部杆菌亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus)，非洲种(CandidatusLiberibacterafricanus)和美洲种(CandidatusLiberibacteramericanus)。目前在世界范围内为害面积最广的是亚洲种(Las)(Gottwald et al，2010)。罹病柑橘树在5～8年后即无法产果。柑橘黄龙病尚无有效的治疗方法，目前普遍实施的是清除病树、杀灭介体昆虫和种植无毒苗木的方法来防治该病害。因此，快速精确地检测黄龙病菌成为了黄龙病防治的关键环节。

由于黄龙病菌尚不能人工培养，所以对该病菌的检测主要使用血清学和分子检测技术。目前，在柑橘黄龙病的检测中应用最广泛的分子检测技术包括常规PCR和实时荧光定量PCR 等(Ghosh et al,2018)。柑橘样品在进行分子检测前，需要对样品进行处理，提取DNA。目前比较常用的前处理方法是使用传统的CTAB法、SDS法和商品试剂盒提取植物样品的DNA。 CTAB和SDS方法在处理样品时需要将柑橘叶片或叶片中脉置于研钵中，加入液氮研磨，再进行抽提蛋白质、沉淀DNA、乙醇洗涤等步骤，整个提取过程步骤繁琐、时间长，一般需要 5h以上才能获得DNA，而且后续对研钵的清洗也十分耗费人工和时间，在处理大量样品时效率不高。商品试剂盒除成本高以外，还存在不同批次间效果不稳定、步骤繁琐、通量低等问题。碱裂解法在柑橘黄龙病分子检测上具有局限性，柑橘样品在经NaOH处理后直接用于 LAMP反应，结果均无扩增，只有稀释50倍后才可消除抑制(钱文娟，2018)，这样就降低了检测的精度，且LAMP方法不能定量分析样品中病原菌含量。

因此，需要开发一种简便、快速、经济、适于高通量操作和定量分析的柑橘样品DNA提取方法。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明开发了一种DNA快速提取的方法，并针对柑橘样品进行了优化。将该方法与qPCR结合，实现了对柑橘黄龙病的高通量快速分子检测，为黄龙病的大规模精确化诊断提供了有利工具。

本发明请求保护的技术方案如下：

柑橘叶片的基因组DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：将来自待测柑橘植株的柑橘叶片的叶柄和叶中脉切碎，每30mg样品加入40μL裂解液，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s，然后加入4倍裂解液体积的0.1mol/L，pH＝8的Tris-HCL，涡旋震荡10～15s后，离心取上清，即得DNA溶液；

所述裂解液的配方为：0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100；或0.5mol/L NaOH，1％SDS， 1％TritonX-100；或0.5mol/L NaOH，1％PVP40，1％TritonX-100。

上述提取方法中，所述裂解液的配方为：0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100。

上述提取方法中，使用96孔板作为容器进行DNA提取，每孔放置一个样品。

柑橘黄龙病的高通量快速分子检测方法，其特征在于，使用任一上述方法提取待测柑橘植株的叶柄和叶中脉的基因组DNA，取DNA溶液作为模板，针对柑橘黄龙病进行PCR检测。

上述检测方法中，所述PCR检测是指TaqMan实时荧光定量PCR。

上述检测方法中，所述TaqMan实时荧光定量PCR使用如下核苷酸序列所示的引物和探针检测柑橘黄龙病病原菌：

正向引物HLBas：5’-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3’；

反向引物HLBr：5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’；

探针HLBp：5’-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’；

其中，探针HLBp的5’端带有第一荧光基团，3’端带有可淬灭所述第一荧光基团的荧光的第一淬灭基团。

上述检测方法中，所述第一荧光基团为FAM，所述第一淬灭基团为BHQ-1。

上述检测方法中，所述TaqMan实时荧光定量PCR还使用如下核苷酸序列所示的引物和探针检测植物细胞色素氧化酶：

正向引物COX-F：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’；

反向引物COX-R：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’；

探针COXp：5’-ATCCAGATGCTTACGCTGGA-3’；

其中，探针COXp的5’端带有第二荧光基团，3’端带有可淬灭所述第二荧光基团的荧光的第二淬灭基团；所述第一荧光基团和所述第二荧光基团不同。

上述检测方法中，所述第二荧光基团为VIC，所述第二淬灭基团为TAMRA。

上述检测方法中，所述PCR的反应体系为：2×Taq PCR Mastermix 10μL，HLBas 1μL， HLBr 1μL，HLBp 0.8μL，COX-F 1μL，COX-R 1μL，COXp 0.8μL，DEPC H₂O 3.4μL，模板DNA1μL；反应程序为：95℃变性20s；95℃1s，58℃40s，40个循环。

本发明提供的柑橘基因组DNA快速提取方法，操作简便易行，只需将柑橘叶片上的叶柄和叶中脉切碎并放入容器中，无需研磨，直接加入裂解液，涡旋震荡后95℃水浴，然后加入中和剂，涡旋震荡后，离心吸取上清。整个操作过程仅需15分钟。

本发明的DNA快速提取方法，可使用96孔板作为样品裂解和破碎的载体，进行高通量检测。将柑橘叶片的中脉切碎后放入96孔微孔板中，再加入裂解液进行处理，最多可同时处理96个样品，显著缩短了样品处理时间。同时，96孔板为一次性使用，不需要花费时间进行清洗。

为了筛选适合快速提取柑橘DNA的裂解试剂，本发明研究了不同提取缓冲液配方的提取效果，并使用植物细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,Cox)作为内参，与黄龙病菌16S rDNA目标序列Las一起组成多重qPCR检测方法，对提取物中的黄龙病菌进行检测，进而评价每种配方的提取效果。结果表明，使用不同DNA裂解液所得的Ct值存在差异，裂解液配方为0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100时既获得了最佳提取效果(表3)，又节约了试剂成本和DNA提取时间。

本发明使用TaqMan qPCR检测柑橘基因组DNA提取效果，结果表明本发明的DNA快速提取方法优于商品化试剂盒，并且提取的DNA溶液未发现PCR抑制作用，说明本发明的DNA快速提取方法适用于柑橘黄龙病的分子检测，且较NaOH+LAMP的方法具有可定量的优势。本发明提供的柑橘黄龙病的高通量快速分子检测方法，灵敏度可达到6.67fg/μL。

本发明提供的柑橘基因组DNA快速提取方法，具有以下优点：

第一，药剂组成简单且成本低：裂解液仅使用NaOH和TritonX-100两种药剂，配方极简，价格便宜。

第二，操作简单，提取时间短：与传统的CTAB法和广泛用于各种试剂盒的硅胶柱吸附法相比，本发明的提取方法操作步骤少，省去了样品研磨和研钵清洗的时间，DNA提取速度快，不需要大型仪器，实现了高通量的样品处理效果，适用于柑橘黄龙病的检疫和监测研究。

第三，等量样品所能提取出的Las基因比试剂盒更多，说明提取过程中损耗的Las基因少，在定量实验上更为准确。

附图说明

图1.本发明的典型实施例中柑橘黄龙病高通量快速分子检测方法的流程图。

图2.使用不同的方法提取的DNA进行柑橘黄龙病菌检测的qPCR扩增曲线；

其中，1为使用方法6提取的DNA进行Cox qPCR检测的结果，2为使用方法7提取的DNA进行Cox qPCR检测的结果，3为使用方法8提取的DNA进行Cox qPCR检测的结果；4为使用方法6提取的DNA进行Las qPCR检测的结果，5为使用方法7提取的DNA进行 Las qPCR检测的结果，6为使用方法8提取的DNA进行Las qPCR检测的结果。

图3.使用商品试剂盒提取的DNA进行柑橘黄龙病菌检测的qPCR扩增曲线；

其中，a为使用试剂盒A提取的DNA进行Cox qPCR检测的结果，b为使用试剂盒B提取的DNA进行Cox qPCR检测的结果，c为使用试剂盒A提取的DNA进行Las qPCR检测的结果，d为使用试剂盒B提取的DNA进行Las qPCR检测的结果；试剂盒A为磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，试剂盒B为Multisource Genomic DNA Miniprep Kit。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，以下实施例仅用于解释本发明而不代表对本发明范围的限制。

柑橘样品：健康柑橘叶片采自江西赣州的健康柑橘植株，患病柑橘叶片采自江西赣州寻乌县脐橙果园柑橘黄龙病患病柑橘植株。

实验仪器

移液枪购自北京吉尔森科技有限公司；Applied Biosystems QuantStudio 6flex real-time PCR仪、核酸蛋白分析仪购自Thermo Fisher Scientific Inc.；pH计购自Sartorius Co.Ltd；MP FastPrep-24 5G研磨仪购自MP Biomedicals Co.,Ltd；旋涡震荡仪购自WiseMix Co.,Ltd；水浴锅购自Julabo Co.Ltd。

实验试剂和耗材

无水乙醇、NaOH购自国药集团化学试剂有限公司；

Tris-HCL、SDS购自Sigama-Aldrich公司；

Triton X-100、PVP 40(聚乙烯吡咯烷酮40)、Tween 20购自北京江晨生物科技公司；

DNase/RNase-Free/water(DEPC水)、Proteinase K购自北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司；Proteinase K为粉末，配制成浓度为20mg/mL的工作液；

EDTA购自美国Amersco公司；

2×Taq PCR MastermixKT201-03、磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司；

Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，AxyPrep^TMPlasmidMiniprep Kit购自 Axygen公司；

1.5mL 96孔微孔板购自北京广达恒益科技公司。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的仪器和耗材，均为本领域常规仪器和耗材，可商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册 (Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或参考制造厂商提供的方法。

实施例1.柑橘样品总DNA提取及黄龙病菌的检测

1.柑橘样品总DNA提取

(1)商品试剂盒提取方法：将患病柑橘叶片的叶柄和叶中脉切下，切碎后每个样品称取 0.1g，置于MPMaxtrixA裂解管中，加入商品试剂盒提供的缓冲液，在MP Fastprep 5G上进行研磨后，分别使用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，以及MultisourceGenomic DNA Miniprep Kit，按照试剂盒说明书记载的方法进行DNA提取。

(2)本发明的提取方法：将患病柑橘叶片的叶柄和叶中脉切碎，每个样品称取30mg，放入96孔板中，每孔放置一个样品。为筛选最佳提取条件，共设置以下10种方法，每种方法设置3个重复。

方法1-8：分别加入表1中配方1-8所示的裂解液，每孔加入40μL，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s。然后加入160μL的中和剂Tris-HCL(0.1mol/L，pH＝8)，涡旋震荡10～ 15s后，使用微孔板离心机在2500rpm/min下离心5s。分别吸取每个样品的上清，转移至新的96孔板中，得到柑橘样品总DNA溶液。

方法9：加入表1中配方4所示的裂解液，每孔加入40μL，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s。加入10μL 20mg/mL Proteinase K，65℃孵育10min。然后加入150μL中和剂 Tris-HCL(0.1mol/L，pH＝8)。涡旋震荡10～15s后，使用微孔板离心机在2500rpm/min下离心5s。分别吸取每个样品的上清，转移至新的96孔板中，得到柑橘样品总DNA溶液。

方法10：加入表1中配方4所示的裂解液，每孔加入40μL，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s。65℃孵育10min。然后加入150μL中和剂Tris-HCL(0.1mol/L，pH＝8)。涡旋震荡10～15s后，使用微孔板离心机在2500rpm/min下离心5s。分别吸取每个样品的上清，转移至新的96孔板中，得到柑橘样品总DNA溶液。

表1.DNA提取试剂配方的组分

注：使用蒸馏水分别配制含有表中不同组分的裂解液，“+”代表配方中含有该组分。各组分在裂解液中的终浓度为：NaOH 0.5mol/L，SDS 1％(w/v，g/mL)，PVP40 1％(w/v，g/mL)，EDTA 0.5mol/L， TritonX-100 1％(w/v，g/mL)，Tween 20 1％(w/v，g/mL)。每40μL裂解液中Proteinase K的添加量为0.2mg。Tris-HCL的浓度为0.1mol/L，pH＝8。

2.柑橘样品中黄龙病菌的检测

使用Li et al.,2006报道的HLBasrp的方法进行柑橘样品中黄龙病菌含量的测定，引物和探针的序列如表2所示。其中，COX-F、COX-R、COXp用于检测内参基因——植物细胞色素氧化酶基因(cytochrome oxidase,Cox，GenBank登录号为CX297817)；HLBas、HLBr、HLBp用于检测黄龙病菌16S rDNA目标序列Las(GenBank登录号为L22532)。

委托北京六合华大基因科技有限公司合成表2中的引物和探针，以步骤1获得的柑橘样品总DNA为模板，按照如下反应体系和反应程序进行PCR。

PCR反应总体系20μL，包括2×Taq PCR Mastermix(KT201-03)10μL，HLBas 1μL，HLBr 1μL，HLBp 0.8μL，COX-F 1μL，COX-R 1μL，COXp 0.8μL，DEPC H₂O 3.4μL，模板DNA 1μL。

PCR反应程序：95℃变性20s；95℃1s，58℃40s，40个循环。

每个DNA样品做3个重复，将每个样品重复间的Ct平均值作为评价DNA提取效果的标准。

表2引物和探针序列

注：FAM为荧光基团，英文名6-carboxy-fluorescein，中文名为6-羧基荧光素，荧光颜色为蓝色；VIC 为荧光基团，荧光颜色为绿色；BHQ-1(Black Hole Quencher-1)和TAMRA为淬灭基团。

结果如表3所示，通过对各提取方法的qPCR检测结果进行分析，发现使用方法1、2、3、 4、9、10提取的柑橘DNA样品，检测出目标DNA中Cox和Las的Ct值显著低于其他方法和商品化试剂盒，具有较好的检测灵敏度。从配方药剂成本与提取时间角度考虑，方法2、3 和4使用的裂解液成分较其他方法多，方法9和10需孵育10min，耗时较其他方法长。

从qPCR检测结果可以看出，方法5提取的DNA在Cox和Las目标的检测中均无扩增。如图2所示，方法6、7和8提取的DNA对Las目标的检测效果显著差于其他方法；方法6 和8提取的DNA对Cox的扩增情况也较其他方法差；方法7提取的DNA虽然对Cox的检测效果与其他方法相近，但是对Las的检测效果较差，故方法6、7和8均不适用于柑橘黄龙病菌检测中植物样品DNA的提取。

使用商品试剂盒Multisource Genomic DNA Miniprep Kit和磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒提取的DNA样品中均可检出Las和Cox(表3，图3)。

以上结果表明，方法1为最优方法，即：将柑橘叶片的叶柄和叶中脉切碎后，每30mg加入含有0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100的裂解液40μL，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s后，然后加入4倍裂解液体积的0.1mol/L，pH＝8的Tris-HCl进行中和，涡旋震荡10～15s，最后离心取上清。方法1与本研究中使用的Axygen公司和天根公司的基因组DNA提取试剂盒相比，样品用量更少，操作更加简单，提取效果更优，并且成本大大降低。

表3不同方法提取的DNA的qPCR检测结果

3.本发明的DNA提取方法对TaqManqPCR敏感性的影响

委托北京六合华大基因科技有限公司将HLBas/HLBr扩增片段连接至pUC57-simple载体，得到载体pUC57-Las。将该载体转入大肠杆菌DH5α中，于LB培养基中37℃培养12h 后收集菌体，使用AxyPrep^TMPlasmid Miniprep Kit按照说明书中的步骤提取质粒，测定浓度后置于-20℃冰箱备用。

使用上述方法1对健康柑橘叶片进行DNA提取，获得DNA提取液。用DNA提取液和DEPC来分别稀释质粒pUC57-Las，初始浓度为66.7ng/μL，稀释11个浓度梯度10^-1、10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11，然后用表2中的引物和探针HLBas、 HLBr、HLBp进行qPCR检测，PCR反应体系和反应程序同上，结果如下表4所示。

表4检测在不同溶液中Las的Ct值

注：“NA”表示没有扩增(Not Amplified)，“-”表示未做t检验。

结果显示，在稀稀释到10^-1至10^-6倍时，DNA提取液与DECP水中检测到的Las目标DNA的Ct值无显著差异，说明DNA提取液对TaqMan qPCR无影响。当稀释到10^-8及之后 DEPC水稀释的质粒已经无法检测到Las目标片段的扩增，而DNA提取液稀释的模板还能检测到Las片段，此时Las片段的Ct值均高于35，对检测结果没有影响。由此可以得出，DNA 提取液对qPCR不存在影响，用本发明的方法1提取柑橘样品的总DNA并结合TaqMan技术检测黄龙病菌的灵敏度可达到6.67fg/μL。

参考文献

Li,W.,Hartung,J.S.,and Levy,L.Quantitative real-time PCR fordetection and identification of CandidatusLiberibacter species associatedwith citrus huanglongbing[J].Journal of Microbiological Methods,2006,66,104–115.

Zhong,Y.,Cheng,C.,Jiang,N.,Jiang,B.,Zhang,Y.,Wu,B.,et al.(2015).Comparative Transcriptome and iTRAQ Proteome Analyses of Citrus RootResponses to CandidatusLiberibacterasiaticus Infection[J].PLOS ONE,2015,10,e0126973.

Gottwald T R.Current epidemiological understanding of citrusHuanglongbing[J].Annual Review of Phytopathology,2010,48(48):119-139.

钱文娟.基于核酸扩增技术的柑橘黄龙病检测方法研究[D].浙江大学,2018.

黄伟锋,洪添胜,吴伟斌,等.柑橘黄龙病检测方法研究进展[J].广东农业科学,2012,39(16):60-64。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 柑橘叶片DNA快速提取方法及其在柑橘黄龙病检测中的应用

<130> P180860/ZWB

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HLBas

<400> 1

tcgagcgcgt atgcaatacg 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HLBr

<400> 2

gcgttatccc gtagaaaaag gtag 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HLBp

<400> 3

agacgggtga gtaacgcg 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-F

<400> 4

gtatgccacg tcgcattcca ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-R

<400> 5

gccaaaactg ctaagggcat tc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COXp

<400> 6

atccagatgc ttacgctgga 20

Claims

1.柑橘叶片的基因组DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：将来自待测柑橘植株的柑橘叶片的叶柄和叶中脉切碎，每30mg样品加入40μL裂解液，涡旋震荡10～15s后，95℃水浴15s，然后加入4倍裂解液体积的0.1mol/L，pH＝8的Tris-HCL，涡旋震荡10～15s后，离心取上清，即得DNA溶液；

所述裂解液的配方为：0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100；或0.5mol/L NaOH，1％SDS，1％TritonX-100；或0.5mol/L NaOH，1％PVP40，1％TritonX-100。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液的配方为：0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用96孔板作为容器进行DNA提取，每孔放置一个样品。

4.柑橘黄龙病的高通量快速分子检测方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一所述的方法提取待测柑橘植株的叶柄和叶中脉的基因组DNA，取DNA溶液作为模板，针对柑橘黄龙病进行PCR检测。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR检测是指TaqMan实时荧光定量PCR。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述TaqMan实时荧光定量PCR使用如下核苷酸序列所示的引物和探针检测柑橘黄龙病病原菌：

正向引物HLBas：5’-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3’；

反向引物HLBr：5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’；

探针HLBp：5’-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM，所述第一淬灭基团为BHQ-1。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述TaqMan实时荧光定量PCR还使用如下核苷酸序列所示的引物和探针检测植物细胞色素氧化酶：

正向引物COX-F：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’；

反向引物COX-R：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’；

探针COXp：5’-ATCCAGATGCTTACGCTGGA-3’；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二荧光基团为VIC，所述第二淬灭基团为TAMRA。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：2×Taq PCRMastermix 10μL，HLBas 1μL，HLBr 1μL，HLBp 0.8μL，COX-F 1μL，COX-R 1μL，COXp 0.8μL，DEPC H₂O 3.4μL，模板DNA 1μL；反应程序为：95℃变性20s；95℃1s，58℃40s，40个循环。