CN106011132A

CN106011132A - 一种高通量提取玉米或萝卜基因组dna的方法

Info

Publication number: CN106011132A
Application number: CN201610672468.4A
Authority: CN
Inventors: 陈发波; 袁亮
Original assignee: Yangtze Normal University; Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Yangtze Normal University; Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2016-10-12

Abstract

本发明公开了一种高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，先批量地获取待检测的玉米或萝卜的叶片样品，然后分别加入碱液，在高温条件下破坏掉植物叶片细胞壁和细胞膜，将DNA释放出来，然后加入酸性的中和提取液使之适合PCR扩增，再进行扩增反应后实现目标分子检测。本发明具有操作简单，利于人工操作，适合小型实验室开展，成本低廉，且处理效率高等优点。

Description

一种高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法

技术领域

本发明农植物育种DNA提取技术领域，具体涉及一种高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法。

背景技术

作物育种又称品种改良，是通过创造遗传变异、改良遗传特性，以培育优良动植物新品种，使其达到高产、稳产、优质、优良效果的技术。对发展畜牧业和种植业具有十分重要的意义。作物育种过程中，一般均需要使用到聚合酶链式反应技术实现分子标记，聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

以聚合酶链式反应为基础的玉米、萝卜分子标记辅助育种需要在大群体中鉴定含有目标性状（抗逆、优质）的单株或株系。在分子育种实践中，方法之一是研究人员将育种群体按单粒在苗床中发芽，幼苗移入田间种植之前完成对目标性状的分子鉴定。方法之二是直接对种子进行分子检测。尽管如此，研究人员通常会在一个育种世代对多个育种群体的数千份单株进行目标性状的分子鉴定。因此，快速获取数以千份能用于PCR扩增的DNA成为限制分子标记选择效率的因素之一。

目前，提取植物DNA常用的方法有CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法、SDS（十二烷基硫酸钠）法、DNA商业试剂盒等方法。

CTAB法和SDS法主要缺点是过程复杂、繁琐耗时。提取萝卜和玉米DNA需要8至10个步骤，每份样品需要在液氨中充分研磨，研磨的过程中样品之间难免会有交叉污染，随后需长时间震荡，反复离心、抽提和洗涤，最后干燥溶解。1个熟练的技术员1天最多能提取30份样品，这远不能满足分子标记辅助育种实践的需要。

DNA商业试剂盒主要缺点是价格昂贵，使用成本高。分子辅助选择应用于育种的主要优点能提高育种效率，降低育种成本。然而，利用商业试剂盒提取DNA进行分子检测将明显提高分子辅助选择的成本，从而增加了育种成本。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种针对玉米、萝卜DNA，操作简单，利于人工操作，成本低廉，且处理效率高的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

一种高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，先批量地获取待检测的玉米或萝卜的叶片样品，然后分别加入碱液，在高温条件下破坏掉植物叶片细胞壁和细胞膜，将DNA释放出来，然后加入酸性的中和提取液使之适合PCR扩增，再进行扩增反应后实现目标分子检测。

本方法，具体包括以下步骤：

a、将待检测的批量玉米或萝卜的种子单粒培养长出叶片；

b、按照30-60平方毫米对培养的各玉米或萝卜植株叶片进行取样，并放入到处理用孔板各小孔中；

c、制备缓冲液A和缓冲液B，缓冲液A为0.1mol/L NaOH与2% Tween20等体积混合得到，缓冲液B：0.1mol/L Tris-HCl与0.002 mol/L EDTA等体积混合得到；向处理用孔板各小孔中加入500ul缓冲液A后，将处理用孔板加热一段时间；

d、再在处理用孔板各小孔中加入500ul缓冲液B，震荡一段时间，使得液体充分混合，释放出DNA；

e、将PCR反应体系分装入反应用孔板各小孔中，对应移取步骤d中震荡后的处理用孔板各小孔内液体进入到反应用孔板各小孔中，进行扩增反应，然后实现目标性状分子检测。

本方法的主要原理是碱性、高温的条件会破坏植物叶片细胞壁和细胞膜，从而将DNA释放出来，然后用酸中和提取液使之适合PCR扩增。浓度在2%以内的Tween20既能破解细胞膜释放DNA，又不会抑制PCR扩增反应。故本方法不需要对样品进行研磨和预处理，针对小型实验室的现实需求，通过高通量低成本的核酸提取，在不需用机械手的条件下，能实现满足育种需求的高通量目标性状的分子检测。

作为优化，a步骤中，将待检测的批量玉米或萝卜的种子单粒分别放入到育种用孔板各小孔中，在光照培养箱中培养长出叶片；育种用孔板优选采用96孔板。这样可以保证批量处理的效率。

b步骤中，优选采用植物叶片取样器进行取样，且处理用孔板优选采用96孔PCR板保证效率。

c步骤中，缓冲液调配可以采用以下方法：

（1）100mM NaOH：将0.2 g NaOH 溶解于双纯水中，定容为50 ml；

（2）2% Tween20：取5 g 20% Tween20 溶于50 ml的双纯水；

（3）100mM Tris-HCl：取0.605 g Tris-HCl 溶于双纯水中，调节PH=8，定容为50ml；

（4）2mM EDTA：取 0.037 g EDTA溶于双纯水中，调节PH=8，定容为50ml；

（5）缓冲液A：0.1mol/L NaOH与2% Tween20等体积混合，现配现用；

（6）缓冲液B：0.1mol/L Tris-HCl与0.002 mol/L EDTA等体积混合。

采用上述方法，方便实施调配，非常利于小型实验室环境中实施制备。

c步骤中，优选采用量程1000ul的12通道移液枪加入缓冲液A，以方便操作并提高效率；其中加热目的为利用碱性、高温的条件破坏植物叶片细胞壁和细胞膜，从而将DNA释放出来，优选采用热循环仪中， 95℃加热10min，可以恰好达成该效果又不至于破坏掉DNA。

d步骤中，采用在震荡器上震荡5min，使缓冲液A和缓冲液B充分混合；以保证混合充分，DNA能够充分释放到溶液中。

e步骤中，反应用孔板优选采用96孔PCR板保证效率；液体移取优选采用量程1000ul的12通道移液枪，以方便操作并提高效率；还可以进一步在PCR反应体系中加入0.1%牛血清白蛋白（BSA）和1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）能有效降低抑制因子的作用，提高检测效果。

本方法具有以下特点：1、最重要的优点是高通量和成本低。利用该方法提取DNA，1个研究人员1天能够处理2000多个样品，提取1个DNA的成本约是0.05美元。比CTAB和SDS法省时，比试剂盒廉价。2、需要的叶片量少。约为30-60mm²的叶片提取的DNA足够100次PCR扩增反应。3、在具有上述优点的同时，该方法提取的DNA能够在4℃下稳定保存1个月，-20℃下稳定保存3个月。4、用该方法提取DNA，以此作为模板进行PCR扩增反应，在不需机械手操作的情况下，能够实现分子检测的程序化和标准化。因此，应用该方法提取DNA非常适合于小型实验室开展分子标记辅助选择工作。

综上所述，本发明具有操作简单，利于人工操作，适合小型实验室开展，成本低廉，且处理效率高等优点。

附图说明

图1为萝卜试验验证时取萝卜DNA提取样液进行琼脂糖凝胶电泳检测，不同萝卜叶片取量的提取液检测的结果示意图。

图2为萝卜试验验证时取萝卜DNA提取样液进行琼脂糖凝胶电泳检测，取样量为5mg的萝卜DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图。

图3为萝卜试验验证时萝卜DNA提取液PCR产物检测图。

图4为玉米试验验证时取玉米DNA提取样液进行琼脂糖凝胶电泳检测，不同玉米叶片取量的提取液检测的结果示意图。

图5为玉米试验验证时取玉米DNA提取样液进行琼脂糖凝胶电泳检测，取样量为10mg的玉米DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图。

图6为玉米试验验证时玉米DNA提取液琼脂糖电泳检测图。

具体实施方式

下面结合附图和最优实施方式对本发明作进一步的详细说明。

最优实施方式：一种高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，具体包括以下步骤：

a、将待检测的批量玉米或萝卜的种子单粒培养长出叶片；

本实施方式中，a步骤中，将待检测的批量玉米或萝卜的种子单粒分别放入到育种用孔板各小孔中，在光照培养箱中培养长出叶片；育种用孔板采用96孔板。b步骤中，采用植物叶片取样器进行取样，且处理用孔板采用96孔PCR板。c步骤中，缓冲液调配可以采用以下方法：

（1）100mM NaOH：将0.2 g NaOH 溶解于双纯水中，定容为50 ml；

（2）2% Tween20：取5 g 20% Tween20 溶于50 ml的双纯水；

（5）缓冲液A：0.1mol/L NaOH与2% Tween20等体积混合，现配现用；

（6）缓冲液B：0.1mol/L Tris-HCl与0.002 mol/L EDTA等体积混合。

本实施方式c步骤中，采用量程1000ul的12通道移液枪加入缓冲液A。采用热循环仪 95℃加热10min。d步骤中，采用在震荡器上震荡5min，使缓冲液A和缓冲液B充分混合。e步骤中，反应用孔板采用96孔PCR板，液体移取优选采用量程1000ul的12通道移液枪。同时在PCR反应体系中加入0.1%牛血清白蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮。

下面，分别针对萝卜种子和玉米种子，以上述具体实施方式操作步骤为基础，采用以下试验验证本发明效果。

一、萝卜试验验证。

萝卜DNA的提取与检测。

1、将萝卜种子放入培养箱中发芽，叶片取样梯度预设为2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、50 mg。

2、按具体实施方式中的操作步骤完成DNA提取。

3、DNA检测：取萝卜DNA提取样液进行琼脂糖凝胶电泳检测。如图1所示为不同萝卜叶片取量的提取液检测图，图中：M表示DNAmarker；；1～10点样孔均是相同体积的不同取样量的DNA提取液，从左至右依次为50 mg、40 mg、35 mg、30 mg、25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5mg、2 mg的萝卜叶片取量的DNA提取液。由图1可知：叶片取样量多少不影响提取液中DNA的浓度。

图2为取样量为5mg的萝卜DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图，图中：M表示marker；1～13点样孔依次为提取液6.0 μl、5.75 μl、5.5 μl、5.25 μl、5.0 μl、4.75 μl、4.5 μl、4.25 μl、4.0 μl、3.75 μl、3.50 μl、3.25 μl、3.0 μl。由图可知：利用本方法能提取萝卜DNA，提取液中含有释放的DNA，DNA的浓度随着检测的提取液体积增大而提高。

4、以该DNA为模板的PCR扩增反应。

PCR反应体系（25 μl）： 12.5 μl 2×Taq Master Mix，ITSR上、下引物（10 nmol/ml）各1 μl，DNA提取液3μl ，Nase Free Water 7.5 μl。

PCR反应程序：

5、进行扩增反应电泳检测，如图3所示，为萝卜DNA提取液PCR产物检测图，图中：M表示marker； 1-5依次为叶片取样量 5 mg； 10 mg；15 mg ；20 mg； 25 mg ；所用引物为ITSR，其扩增的条带预期在750bp。由图3可知：所有取量的DNA提取液都能扩增出预期产物，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳效果与叶片取样量的多少无关。将该方法得到的DNA提取液作为PCR模板，能够扩增出预期条带，证明了该方法在萝卜分子检测中的可行性。

二、玉米试验验证。

玉米DNA的提取与检测。

1、将玉米种子放入培养箱中发芽，叶片取样梯度预设为2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、50 mg。

2、按具体实施方式中的操作步骤完成DNA提取。

3、DNA检测：取玉米DNA提取样液进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果参见图4，图4为不同叶片取量提取出DNA琼脂糖凝胶电泳图。图中：M表示DNA marker；1～10点样孔均是相同体积不同取样量的DNA提取液。从左至右依次为2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30mg、35 mg、40 mg、50 mg的不同玉米叶片取量的DNA提取液。由图4可知：所有叶片取量DNA提取液均能检测出DNA。且可以看出10 mg叶片的提取液DNA浓度最高。图5为取样量为10mg的玉米DNA提取液琼脂糖凝胶电泳图。图中： M表示DNAmarker； 1-6依次为提取液5 μl，4.5 μl，4 μl，3.5 μl，3 μl，2.5 μl，7—溴酚蓝。由图5可知：移取4 μl DNA提取液进行检测效果最好。

4、以该DNA为模板的PCR扩增反应。

PCR反应体系（25 μl）： 12.5μl 2×Taq Master Mix，ITSR上、下引物（10 nmol/ml）各0.5 μl， DNA为1 μl，Nase Free Water 10.5 μl 。

PCR反应程序：

5、扩增反应电泳检测。图6为玉米DNA提取液琼脂糖电泳检测图；图中：M表示DNAmarker；1～10依次为叶片取样量2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、50 mg。所用引物为ITSR，其扩增出条带预期在750bp。由图6可知：所有取量的DNA提取液都能扩增出预期产物，样品取量为2 mg、5 mg、10 mg也能扩增出产物，但是没有达到预期效果。可以看出玉米的PCR扩增与叶片取样量相关，而在叶片取样量逐渐增大到一定程度时对PCR反应的影响不大。玉米提取DNA的叶片质量最好在10 mg～30 mg之间。

试验总结：综上，利用该方法能从玉米、萝卜中提取DNA，且提取的DNA能够满足PCR扩增反应的要求，小型实验室使用该方法，能够实现高通量与低成本。

Claims

1.一种高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，先批量地获取待检测的玉米或萝卜的叶片样品，然后分别加入碱液，在高温条件下破坏掉植物叶片细胞壁和细胞膜，将DNA释放出来，然后加入酸性的中和提取液使之适合PCR扩增，再进行扩增反应后实现目标分子检测。

2.如权利要求1所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a、将待检测的批量玉米或萝卜的种子单粒培养长出叶片；

3.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，a步骤中，将待检测的批量玉米或萝卜的种子单粒分别放入到育种用孔板各小孔中，在光照培养箱中培养长出叶片；育种用孔板采用96孔板。

4.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，b步骤中，采用植物叶片取样器进行取样，且处理用孔板采用96孔PCR板。

5.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，c步骤中，缓冲液调配可以采用以下方法：

（1）100mM NaOH：将0.2 g NaOH 溶解于双纯水中，定容为50 ml；

（2）2% Tween20：取5 g 20% Tween20 溶于50 ml的双纯水；

（5）缓冲液A：0.1mol/L NaOH与2% Tween20等体积混合，现配现用；

（6）缓冲液B：0.1mol/L Tris-HCl与0.002 mol/L EDTA等体积混合。

6.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，c步骤中，采用量程1000ul的12通道移液枪加入缓冲液A。

7.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，c步骤中，采用热循环仪 95℃加热10min。

8.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，d步骤中，采用在震荡器上震荡5min，使缓冲液A和缓冲液B充分混合。

9.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，e步骤中，反应用孔板采用96孔PCR板，液体移取优选采用量程1000ul的12通道移液枪。

10.如权利要求2所述的高通量提取玉米或萝卜基因组DNA的方法，其特征在于，e步骤中，在PCR反应体系中加入0.1%牛血清白蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮。