CN116083610B - 一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用。本发明基于柑橘黄龙病菌中多拷贝的噬菌体CLasMV1与CLas的同源基因位点设计了特异性实时荧光PCR引物GP04‑F/GP04‑R，当黄龙病样本中含有CLasMV1噬菌体时，本发明GP04‑F/GP04‑R引物能显著提高黄龙病菌的检测灵敏性，同时也可用于不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病菌检测。同时本发明还提供了包含GP04‑F/GP04‑R引物的双重实时荧光PCR引物，在CLas低浓度的条件下使用该双重引物同时检测能显著提高检测的灵敏性，为实验室检测CLas提供了进一步的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物病理分子诊断技术领域，更具体地，涉及一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用。
背景技术
柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘生产中最具毁灭性的病害之一，严重威胁着柑橘产业的健康发展。早在1919年，Reinking对华南地区的主要经济作物病害调查时就发现并记录了柑橘黄龙病的黄化斑驳症状。最初黄龙病在我国广东、福建、广西三省发现黄龙病猖獗危害，其后陆续蔓延至四川、江西、云南等地，直至20世纪80年代我国的浙江、贵州、湖南等11个柑橘种植区都相继受害。目前柑橘黄龙病已在世界范围内的50多个国家和地区蔓延和为害。
柑橘植株在生长中的各个时期都可以感染黄龙病，但染病后症状和受危害的严重程度因植株抗病性、生长时期、环境条件等各不相同。发病植株的典型症状为新叶均匀黄化或呈缺锌状，老叶斑驳，并且部分叶片发育畸形，呈凹凸不平或卷曲状。发病植株开花早、花细小畸形、易脱落，发病后期树根基本腐烂，木质部常变黝黑与皮部分离。病果体积小、形状不对称、味道淡。沙糖桔等柑橘品种病果成熟时着色常从茎端开始，形成“红鼻子果”的症状，而橙类等易出现“青果”，成熟时期较健康植株早但易脱落。
我国的柑橘黄龙病由α-变形菌纲的韧皮部杆菌属亚洲种(“CandidatusLiberibacter asiaticus”，CLas)所引起，CLas分布范围最广、危害最重，是在中国流行的最主要的病原种。
在缺乏有效治疗方法和优良抗病品种的情况下，感染黄龙病植株的早期检测和检疫、清除传染源和传播媒介是防止病菌入侵无病柑橘产区的重要管理策略。然而黄龙病症状复杂，进行田间诊断时易于与缺素和柑橘衰退病等病症混淆。利用指示植物、电镜观察、血清学检测等方法也可以起到一定程度的鉴别作用，但各有缺陷，比如检测耗时较长、对检测样品有限制、容易漏检、检出率较低、试剂仪器昂贵等。尽管黄龙病属于系统侵染性病害，但CLas在植株体内各个部位的浓度并不相同，分布不均和含量偏低导致柑橘黄龙病早期诊断检测的准确性和可靠性较低。HLB的潜伏期较长，结合低滴度和最初模糊的症状，使得在柑橘黄龙病大流行的早期阶段检测非常困难。目前有关黄龙病的检测主要依赖于分子检测，其中以实时荧光定量PCR检测最为常用。检测靶标主要为CLas基因组上的多拷贝保守基因，如16S rRNA基因、nrdB基因等，然而检测灵敏度低，无法适用于果树感染黄龙病初期病原“Ca.Liberibacterspp”浓度较低的情况，实际应用效果不理想。因此需要开发出更高灵敏度的检测方法来更早发现感染柑橘黄龙病的植株，以及时挖出病株清除传染源或采取其他防治措施。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物。本发明基于CLasMV1噬菌体与CLas同源基因设计引物GP04-F/GP04-R，同时使用双重引物GP04-F/GP04-R和CLas-4G/HLBr进一步完善和提高了检测的灵敏度，可在果树感染黄龙病初期病原“Ca.Liberibacter spp.”浓度较低的阶段进行初步诊断，以及时挖出病株清除传染源或采取其他防治措施。
本发明的第二个目的在于提供所述基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病检测引物的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物，包括引物对GP04-F/GP04-R，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明基于柑橘黄龙病菌中多拷贝的噬菌体CLasMV1与CLas的同源基因位点(ORF4，其序列如SEQ ID NO.5所示)设计特异性Real-time PCR引物，从而建立较为完善的高灵敏分子检测体系。当黄龙病样本中含有CLasMV1噬菌体时，本发明GP04-F/GP04-R引物能显著提高黄龙病菌的检测灵敏性，同时也可用于不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病菌检测。
优选地，还包括引物对CLas-4G/HLBr，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.3～4所示。当在CLas低浓度的条件下使用双重引物同时检测能显著提高检测的灵敏性，为实验室检测CLas提供了进一步的技术支持。
本发明还提供上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。
本发明还提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种的检测方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物进行单重或双重实时荧光PCR反应，若实时荧光定量PCR检测得到的Ct值大于32则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若Ct值小于32则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种。
优选地，所述步骤S2所述单重实时荧光PCR反应的扩增体系为：ddH2O 8.0μL，Supermix 10.0μL，10μmol/L GP04-F 0.5μL，10μmol/L GP04-R 0.5μL，DNA模板1.0μL，共20μL；双重实时荧光PCR反应的扩增体系为：ddH2O 7.0μL，Supermix 10.0μL，10μmol/L CLas-4G 0.5μL，10μmol/L HLBr 0.5μL，10μmol/L GP04-F 0.5μL，10μmol/L GP04-R 0.5μL，DNA模板1.0μL，共20μL。
优选地，步骤S2所述单重或双重实时荧光PCR反应的反应条件为：95℃，3min；95℃10s，60℃30s，40个循环；在每个循环的60℃结束时进行荧光信号读取。
本发明还提供上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物在制备柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物。
优选地，所述试剂盒还包括实时荧光PCR反应所需试剂。
本发明还提供上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。
由于CLasMV1噬菌体在柑橘黄龙病菌中的高拷贝数和该类型噬菌体在地域上分布广泛等特点，使用大量田间样品对该体系进行验证后发现，本发明的单重或双重实时荧光PCR引物对于同时含有CLasMV1和黄龙病菌样本的检测灵敏性显著提升，同时也适用于不含有CLasMV1的黄龙病菌样本检测。因此，本发明为黄龙病分子检测提供了新的靶标位点，也为黄龙病早期检测提供了技术支撑。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于柑橘黄龙病菌中多拷贝的噬菌体CLasMV1与CLas的同源基因位点设计了特异性实时荧光PCR引物GP04-F/GP04-R，当黄龙病样本中含有CLasMV1噬菌体时，本发明GP04-F/GP04-R引物能显著提高黄龙病菌的检测灵敏性，同时也可用于不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病菌检测。同时本发明还提供了包含GP04-F/GP04-R引物的双重实时荧光PCR引物，所述双重引物在检测含有或不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病样本时，都能显著提高检测的灵敏性，适用于CLas低浓度条件，即果树感染黄龙病初期病原“Ca.Liberibacterspp”浓度较低的阶段，为实验室检测CLas提供了进一步的技术支持。
附图说明
图1为不同引物对CLas+CLasMV1+DNA样品的检测灵敏性(条形框里的数字代表平均值与标准误)。
图2为不同引物Real-time PCR扩增曲线与溶解曲线，a图为三种引物的qPCR扩增曲线；b图为CLas-4G/HLBr引物的qPCR熔解曲线；c图为RNRf/RNRr引物的熔解曲线；d图为GP04f/GP04r引物的熔解曲线。
图3为高分辨率下CLas-4G/HLBr&GP04f/r双重引物的qPCR熔解曲线(每个循环升温0.1℃)。
图4为CLas4G/HLBr引物、RNRf/RNRr引物和CLas4G/HLBr+GP04f/GP04r双重引物的检测敏感性比较(条形框里的数字代表平均值与标准误)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1黄龙病菌检测引物设计
噬菌体CLasMV1为发明人前期发现的黄龙病菌噬菌体(Zhang,L.,Li,Z.,Bao,M.,Li,T.,Fang,F.,Zheng,Y.,Liu,Y.,Chen,J.,Deng,X.,Zheng,Z.(2021).A NovelMicroviridae Phage(CLasMV1)From“Candidatus Liberibacter asiaticus”.Frontiersin microbiology,12.)。
将CLasMV1噬菌体基因组与黄龙病菌染色体基因组比对后，获得同源基因区域，然后基于噬菌体CLasMV1基因组和CLas共有的同源基因ORF4(其序列如SEQ ID NO.5所示)设计引物，使用Primer 3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)针对同源基因区域设计引物，引物Tm值为60℃左右，经筛选得到1对引物GP04-F/GP04-R(表1)。并且将引物序列通过NCBI web BLASTn(expect threshold＝10，word size＝16)与NCBI Nucleotide Database比对以评估引物的特异性，然后用于下一步Real-time PCR。
表1GP04f/GP04r引物信息表
实验例2引物灵敏性评估
1、方法
从中国广东、广西、福建、江西等4个省份采集具有典型斑驳症状的柑橘叶片样品，每个样品取自1株病树的同1发病枝条，每株树取一个样品提取DNA，作为后续CLas分子检测的候选样本。同时采集健康柑橘叶片作为阴性对照DNA样品来源。
将实施例1筛选得到的GP04-F/GP04-R与常用引物检测效果进行对比：所用样品采自中国广东、广西、福建、江西等四个省份，包括含有CLasMV1噬菌体的256个黄龙病菌(CLas+CLasMV1+)样品、不含有噬菌体的83个黄龙病菌(CLas+CLasMV1-)样品与健康柑橘样品。采用基于3个拷贝的16s rRNA基因的CLas-4G/HLBr(F：5’-AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3’(SEQ IDNO.3))/R：5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’(SEQ ID NO.4))、基于5个拷贝的nrdB基因的引物RNRf/RNRr(F：5’-CATGCTCCATGAAGCTACCC-3’/R：5’-GGAGCATTTAACCCCACGAA)和基于CLas与CLasMV1噬菌体的同源基因引物GP04-F/GP04-R(GP04f/GP04r)进行比较分析。
进行Real-time PCR检测，采用SYBR Green方法，GP04f/GP04r反应体系共20μL，扩增体系如表2所示。体系的配制及后续操作均在冰盒上进行。反应条件为：95℃，3min；(95℃，10s；60℃，30s)40个循环，在每个循环的60℃结束时进行荧光信号读取。每次反应包括阴性、阳性和清水对照。
表2SYBR Green扩增体系
CLas-4G/HLBr与RNRf/RNRr的反应体系和反应条件与上述GP04f/GP04r反应体系相同。
2、结果
通过与CLas-4G/HLBr及RNRf/RNRr进行灵敏性分析发现，在256个含有CLasMV1的黄龙病菌样本中，GP04f/GP04r检测得到的Ct值要低于CLas-4G/HLBr(p<0.001)和RNRf/RNRr(p>0.05)(图1)，并且经过换算可得出GP04f/GP04r引物的检测灵敏性比CLas-4G/HLBr引物高3.18倍，比RNRf/RNRr引物高1.35倍。说明当黄龙病样本中含有CLasMV1噬菌体时，GP04f/GP04r引物能显著提高黄龙病菌的检测灵敏性。而在89个不含CLasMV1的黄龙病菌样本中，GP04f/GP04r检测得到的Ct值要比CLas-4G/HLBr和RNRf/RNRr引物分别高1.59(±1.13)和2.62(±1.29)，说明当黄龙病样本中不含有CLasMV1噬菌体时，GP04f/GP04r引物检测灵敏性要低于CLas-4G/HLBr和RNRf/RNRr引物，但依然可以用于检测。
实验例3两对引物同时检测效果评估
1、方法
提取采集自广东、广西、云南、湖南、贵州、海南等省份的246份柑橘样品DNA进行SYBR Green Real-time PCR检测。
按照实施例2中的反应体系和反应条件，使用CLas-4G/HLBr引物、RNRf/RNRr引物和GP04f/GP04r进行Real-time PCR检测，同时使用两对引物CLas-4G/HLBr和GP04f/r进行双重Real-time PCR检测。SYBR Green实时荧光PCR双重引物扩增体系如表3所示，反应条件同实施例2。在反应条件后加上溶解曲线，溶解曲线的常规程序为：95℃，2min；40℃，2min；65℃～95℃每5s升温0.5℃采集荧光信号。熔解曲线的高分辨率程序为95℃，2min；40℃2min；75℃～90℃每5s升温0.1℃并采集荧光信号。使用Bio-Rad CFX Manager绘制双重qPCR的扩增曲线和熔解曲线。
表3SYBR Green实时荧光PCR双重引物扩增体系
敏感性增加值(R)：通过ΔCt方法计算，即相对于CLas-4G/HLBr引物来说，GP04f/GP04r引物的灵敏性增加值的计算方法为：ΔCt＝Ct(GP04f/GP04r)-Ct(CLas-4G/HLBr)。
将实时荧光定量RCP检测得到的Ct值大于32的检测样品视为阴性样品，Ct值小于32的检测样视为阳性样品。
2、结果
使用常规引物检测，CLas-4G/HLBr引物、RNRf/RNRr引物和GP04f/GP04r引物的qPCR扩增得到的产物熔解曲线如图2所示，CLas-4G/HLBr引物的扩增产物Tm值为82.0～82.75℃，GP04f/GP04r引物的扩增产物Tm值为79.85～80.30℃。采用CLas-4G/HLBf/r和GP04f/r双重引物检测，扩增产物熔解曲线如图3所示，出现了两个峰值，分别为79.85℃和82.75℃，说明CLas-4G/HLBr和GP04f/GP04r引物的同时使用并未出现非特异性扩增。
如图4所示，在含有CLasMV1噬菌体的黄龙病菌和不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病菌两组样品中，经过换算(引物敏感性增加值R通过ΔCt法进行计算。即R＝2-ΔCt)得出：使用CLas-4G/HLBr和GP04f/r双重引物检测的灵敏性比使用CLas-4G/HLBr引物分别高30倍和5倍、比使用RNRf/RNRr引物分别高10倍和2倍。因此，不论是否含有CLasMV1噬菌体，使用双重引物进行实时荧光定量PCR检测的效果都有了显著提升。
实验例4
1、方法
使用梯度稀释样本为模板进行比较系统评估不同引物的检测灵敏性，分别在CLas+CLasMV1+组和CLas+CLasMV1-组中选取经CLas-4G/HLBr引物检测Ct值较低的DNA样本，以10倍的比例进行稀释，共稀释8个梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，单独使用CLas-4G/HLBr引物、RNRf/RNRr引物与同时使用CLas-4G/HLBr和GP04f/GP04r两对引物进行Real-time PCR的检测。
2、结果
结果如表4所示，在CLas+CLasMV1+组中，同时使用引物CLas-4G/HLBr和引物GP04f/r检测终点达10-8(2.5拷贝/μL)，比引物CLas-4G/HLBr(250拷贝/μL)和引物RNRf/r(25拷贝/μL)的检测终点要高。在CLas+CLasMV1-的一组中，同一稀释条件下引物CLas-4G/HLBr和引物GP04f/r检测得到的ΔCt值相差不大，引物RNRf/r的检测终点与前两者相比最高。同时使用引物CLas-4G/HLBr和引物GP04f/r相较于引物CLas-4G/HLBr(660拷贝/μL)和引物RNRf/r(660拷贝/μL)，在高稀释度的条件下仍将检测终点提高了2个数量级，达6.6拷贝/μL。因此所述双重引物4G/HLBr+GP04f/r无论在检测含有或不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病待测样本时，都能显著提高检测的灵敏性，适用于CLas低浓度条件，即果树感染黄龙病初期病原“Ca.Liberibacterspp”浓度较低的阶段，为实验室检测CLas提供了进一步的技术支持。
表4不同引物在不同DNA样本和模板浓度下的Ct值
注：N/A表示在实时荧光PCR检测过程中无扩增。
Claims (9)
1.一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物，其特征在于，包括双重引物对GP04-F/GP04-R和CLas-4G/HLBr；GP04-F/GP04-R的上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，CLas-4G/HLBr的上下游引物序列依次如SEQ ID NO.3～4所示。
2.权利要求1所述柑橘黄龙病菌检测引物在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。
3.一种柑橘黄龙病菌亚洲种的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用权利要求1所述柑橘黄龙病菌检测引物进行双重实时荧光PCR反应，若实时荧光PCR检测得到的Ct值大于32则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若Ct值小于32则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种。
4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述步骤S2所述双重实时荧光PCR反应的扩增体系为：ddH2O 7.0 μL，Supermix 10.0 μL，10 μmol/ L CLas-4G 0.5 μL，10 μmol/L HLBr 0.5 μL，10 μmol/ L GP04-F 0.5 μL，10 μmol/ L GP04-R 0.5μL，DNA模板 1.0μL，共20 μL。
5.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤S2所述双重实时荧光PCR反应的反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；在每个循环的60℃结束时进行荧光信号读取。
6.权利要求1所述柑橘黄龙病菌检测引物在制备柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒中的应用。
7.一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述柑橘黄龙病菌检测引物。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光PCR反应所需试剂。
9.权利要求7或8所述试剂盒在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。
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