CN101955989A

CN101955989A - 基于hrm基因分型技术的集成化基因检测方法

Info

Publication number: CN101955989A
Application number: CN2010101342188A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 秦勇; 陈菲; 时凯
Original assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Current assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Priority date: 2010-03-29
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明公开了一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，其特征在于所述方法包含以下步骤：(1)针对待检目的基因的至少两个靶向区域或若干个目的基因的靶向区域的连续核苷酸序列设计筛选适合的引物对；(2)提取样本DNA，利用步骤(1)筛选的若干基因扩增引物，利用集成化反应程序进行基因扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的所有目的基因或单个目的基因的若干个突变位点同时检测。该方法应用带HRM模块的荧光定量PCR仪分析，参照阴性对照，即可完成对样本多种基因型的判断，可以用于联合筛查。

Description

基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及肿瘤诊断中间信息相关的基因的快速检测，一次完成多个基因多个位点信息的快速检测。也涉及到大量基因信息的检测为相关肿瘤的预查和监控带来了方便。

背景技术

HRM技术是high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。HRM技术对DNA样本的质量要求很高，所以常用于研究细胞体系的研究。

HRM技术应用于基因突变检测依据于饱和性荧光染料的，根据荧光信号强度的微妙变化来判断基因类别，故HRM技术有着很高的灵敏度和准确度。

基因指导下个体化疗与个体化分子靶向治疗是近年兴起的一种肿瘤药物治疗选择方式，目的是提高肿瘤药物治疗的精确性，减少预期无效的治疗。美国食品和药品管理局(FDA)明确支持应用靶向药物前进行如EGFR、K-ras、B-raf等基因突变检测，以决定对应药物是否有效，而先前欧洲药品管理局(EMEA)已经宣布了这个决定。作为世界上最权威和最严格的药品审批机构，FDA这个决定无疑标志着“个性化治疗的时代”的来临。

靶向治疗药物与基因信息相关性如下：

(1)《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：通常如EGFR 19外显子和21外显子突变或缺失的患者对这些药物治疗有效，无突变者预后不良。《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/Erlotinib)进行分子靶向治疗。

NSCLC患者使用易瑞沙或特罗凯时，应同时检测EGFR和K-ras突变。

(2)K-ras是公认的癌基因，参与表皮生长因子受体(EGFR)信号传导过程，与EGFR抑制剂类靶向药物的疗效密切相关。《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》明确指出：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；二是只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的治疗。

(3)B-raf基因的突变检测可协助医生筛选西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)等药物治疗的有效人群。建议B-raf野生型患者接受该类EGFR抑制剂的治疗。

(4)其他相关基因等。

以上基因的检测都是常规必检的，甚至有时需要联合检测，例如对于非小细胞肺癌相关基因的检测，需要同时检测EGFR和KRAS基因的序列信息；对于结直肠癌，需要同时检测KRAS和BRAF基因的序列信息。以往常规检测方法只能一对一的进行检测，严重影响操作时效性，所以对于多个基因多个位点的同时检测已是很有必要，以便更快速的提供出待检基因的位点信息，而且大量基因集成化检测便于筛查相关肿瘤基因，为预查和监控带来了方便。

目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，以及存在第一轮酶切不完全导致的假阳性

DNA直接测序的原理是：DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序可使用美国PE ABI公司已生产出310型等DNA测序仪，ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3′末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

该方法存在以下缺点在于花费昂贵，所以对一些较大的，外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变；另外不适用于临床对大量的标本进行检测，而且多基因多位点的检测需要的多次反应来完成。DNA直接测序也不能被当成是突变检测的金标准，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。

所以为了提高检测效率和准确性，开发一种集成化检测方法是很有必要的，这样就可以在很短的时间内完成多基因多位点多样本的快速检测，以快速的操作方法获得需要的基因信息，以满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求，也通过集成化检测满足相关肿瘤诊断的筛查工作，为相关肿瘤的预判提供了一个依据。

发明内容

本发明主要目的在于提供一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，该方法高通量，快速便捷，可以多个基因同时检测，解决了不同基因分批操作的麻烦；应用本发明的集成化程序后可以一次性完成对多个基因信息进行全面的扫描。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，其特征在于所述方法包含以下步骤：

(1)针对待检目的基因的至少两个靶向区域或若干个目的基因的靶向区域的连续核苷酸序列设计筛选适合的引物对；

(2)提取样本DNA，利用步骤(1)筛选的若干基因扩增引物，利用集成化反应程序进行基因扩增；

(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的所有目的基因或单个目的基因的若干个突变位点同时检测。

优选的，所述目的基因选自EGFR，KRAS，BRAF，C-KIT，PI3K和PDGFRA的一种或一种以上；所述引物对含有目的基因靶向序列中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列。

优选的，所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液终浓度1～5×；

dNTPs 0.1～1mM；

引物序列终浓度为0.1～1μM；

模板DNA 0.05～2ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～0.10U/μL；

MgCl₂ 终浓度为1～5mM；

荧光染料 1～3×。

优选的，所述用于集成化检测的PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液终浓度1～3×；

dNTPs 0.1～0.5mM；

引物序列终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA 0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～0.10U/μL；

MgCl₂ 终浓度为1～3mM；

荧光染料 1～2×。

优选的，所述荧光染料选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LC

PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

优选的，所述集成化反应程序包括集成在一起形成程序化操作的进行基因扩增的PCR扩增程序和进行突变位点检测的产物熔解程序。

优选的，所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40-55个循环；所述进行突变位点检测的产物熔解程序中进行产物溶解检测的条件为92～97℃变性1分钟；40℃复性1分钟；然后初始熔解温度60～65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25～45次每秒；然后40℃进行冷却10秒。

优选的，所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；所述进行突变位点检测的产物熔解程序中进行产物溶解检测的条件为95℃变性1分钟；40℃复性1分钟；然后初始熔解温度65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒；然后40℃进行冷却10秒。

优选的，所述方法具体按照如下步骤进行：

A1、设计所有待检目的基因靶向区域连续核苷酸序列，筛选适合的引物对；

A2、根据引物条件预选PCR条件，筛选最优PCR扩增条件，锁定扩增条件之后，再用设定的扩增条件筛选设计的引物；

A3、提取样本DNA，利用步骤A2筛选出来的若干基因扩增引物，集体加样后上机后，利用集成化反应条件进行基因扩增；

A4、根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的目的基因进行突变位点检测。

优选的，所述模板DNA从选自外周血血浆、外周血血清、体液、腔道的脱落物、病变组织样本中提取。

本发明中，用于特异性扩增目的基因靶向序列的引物对含有目的基因靶向序列中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列；所述集成化检测条件包含PCR扩增条件和产物熔解条件。

本发明进行集成化检测基因突变方法研究时，按照PCR反应程序的预选范围，优化基因扩增程序的确定，产物熔解条件预选范围以及优化条件的筛选这些程序得到本发明。

所述PCR反应程序预选范围选自以下设置程序：

经过若干对引物对摸索实验后最中优化程序设置如下：

产物熔解条件预选范围选自以下设置程序：

所述优化熔解分型设置是经过阳性DNA梯度试验筛选的，所述阳性DNA为明确的突变DNA模板，优化熔解条件设置如下：

所述的集成化反应条件如下：

所述基因靶向区域设计引物符合优化集成化反应条件。本发明集成化基因检测整体操作过程，其特征为所述操作过程包括以下步骤：

设计所有待检目的基因靶向区域连续核苷酸序列，筛选适合的引物对，所述引物设计要按一定要求设计。根据引物条件预选PCR条件，筛选最优PCR扩增条件，锁定扩增条件之后，再用设定的扩增条件筛选设计的引物。提取样本DNA，利用筛选出来的若干基因扩增引物，集体加样后上机后，利用集成化反应条件进行基因扩增。根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的目的基因进行突变位点检测。模板DNA从选自外周血(含血浆、血清)、体液、腔道的脱落物、病变组织等样本中提取。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

利用优化的集成化反应条件，可以同时检测多个基因多个位点的序列信息，达到省时省力的目的。加上采用新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析(High ResolutionMelting Analysis，HRM)，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用带HRM模块的荧光定量PCR仪分析，参照阴性对照，即可完成对样本多种基因型的判断，可以用于联合筛查。本发明是应用HRM技术进行集成化基因检测的方法应用，所述的检测方法包含了若干基因的若干引物对，所述引物对可以在相同的集成化条件下进行反应，结合HRM技术无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，即可完成对样品基因型的判断，从而简便快速的为相关癌症的用药提供指导意见，而且目前许多癌症相关基因较多，集成化的检测为所有的肿瘤检测和用药提供了更快的速度，体现了时效性，为治疗提供了先机，对于许多癌症的相关基因较多较杂的情况，集成化检测可以更为方便的为基因筛查服务，为肿瘤的预查和监控提供了一个依据。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；

图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；

图3为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；

图4为本发明实施例肿瘤组织DNA的电泳图；

图5为本发明实施例石蜡组织DNA的电泳图；

图6为本发明实施例血浆、血清DNA扩增产物的电泳图；

图7为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图；

图8为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；

图9为本发明实施例不同MgCl₂终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图和荧光循环次数曲线；图9A为KRAS-EXON2的荧光次数优化曲线；图9B为KRAS-EXON2的溶解曲线；图9C为KRAS-EXON3的溶解曲线；图9D为KRAS-EXON3的荧光次数优化曲线；

图10为本发明实施例不同MgCl₂终浓度进行PCR条件优化时得到的PCR产物电泳图；所述图9、10以BRAF基因为例；

图11为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；图11A～E分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片、外周血血清的溶解曲线图；

图12为本发明实施例不同突变率的灵敏度实验的熔解曲线分型图；

图13为本发明实施例大样本进行准确度验证的熔解曲线分型图；

图14为本发明应用例正常人血液标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；

图15为本发明应用例结肠患者血液标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；

图16为本发明应用例结肠患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。

图17为本发明应用例结肠患者血清标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

一种HRM基因分型技术集成化检测方法，包括的特异性扩增目的基因靶向序列的若干个引物对，所述目的基因含有EGFR，KRAS，BRAF，C-KIT，PI3K和PDGFRA等，所述引物对为目的基因靶向区域至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列。严格控制摸索的PCR反应条件，所述扩增条件包括模板的处理，加样的试剂成分，各个成分的反应浓度以及PCR上机扩增和熔解的温度条件。

所述连续核苷酸序列选自以下的正反核苷酸序列为选自SEQ ID No：3～22序列之一的核苷酸序列。所述引物对的引物为SEQ ID No：3～22序列之一的正向引物或反向引物。所述PCR反应还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液终浓度1～5×；

dNTPs 0.1～1mM；

引物序列终浓度为0.1～1μM；

模板DNA 0.05～2ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～0.10U/μL；

MgCl₂ 终浓度为1～5mM；

荧光染料 1～3×。

优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液终浓度1～5×；

dNTPs 0.1～0.5mM；

引物序列终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA 0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～0.10U/μL；

MgCl₂ 终浓度为1～3mM；

荧光染料 1～2×。

所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

优选的，所述PCR扩增条件选自：

优选的，所述集成化体系反应条件：

本发明应用的另一目的在于提供一种检测目的基因位点突变的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取含有目的基因的靶向序列区域中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；所选引物符合集成化反应条件；

(2)提取的核酸作为模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中目的基因进行PCR扩增；

(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的KRAS基因进行突变位点检测。

本发明应用的操作中先进行PCR扩增，然后对扩增产物进行HRM检测突变点；本发明的PCR引物，为化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端5-23个序列的模板，以及与之配对的反向序列，可以是下表序列：(以KRAS基因为例，其序列如SEQ IDNo：23所示)

更为优选的，可以是下表序列：

所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgCl2、Taq酶、DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括三羟甲基氨基甲烷盐(Tris·Cl)，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；酸碱度(pH值)8.0-9.0(20℃)。所述的PCR缓冲液，，包括10x缓冲液，终浓度15mM的氯化镁，终pH 8.7。所述的dNTP混合液，包括10mMdATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。所述的荧光染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYTO 9染料。所述的MgCl₂为10-30mM MgCl₂。所述的MgCl₂为25mM MgCl₂。

所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP，延伸速率2-4kb/min at 72℃，存储缓冲液10-40mM Tris·cl，50-200mM氯化钾(KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2.0％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0％(V/V)吐温20(Tween 20)，30-70％(v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer)：pH 7.0-10.0(20℃)

所述的存储缓冲液，包括终浓度为20mM Tris·cl、100mM KCL、1mM DTT、0.1mM EDTA、0.5％(V/V)Nonidet P-40、0.5％(V/V)Tween 20、50％glycerol(v/v)。稳定剂的终pH值为9.0。

所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。

所述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、粪便、病变组织、肿瘤组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。

在进行检测时按以下集成化程序进行PCR扩增以及熔解曲线分析：

用本发明应用相关的的试剂盒，以及制备的DNA模板，根据本发明所述的反应条件，在荧光定量PCR仪上进行序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，得到分型的图谱。所述的荧光定量PCR仪，包括LightCycler480(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI 7500 FAST(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、ABI 7900 HT FAST(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、QiagenRotor-Gene 6000(德国Qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner(美国Idaho公司，爱达荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入MIX，进行PCR反应，即可区分野生型与突变型。

本发明应用对样本进行检测可以提供肿瘤诊断的中间信息，所述的肿瘤，包括结肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。

以下对本发明的一些专用术语进行解释说明：

在本发明应用中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。

引物设计一般遵循以下原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15～30碱基之间。④G+C含量在40％～60％之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。进行引物设计的软件有Primer 5，BeaconDesigner 7。

本发明引物进行筛选，确定引物片段大小，最后确定最佳引物为18-28bp大小的引物。本发明的引物采用亚磷酰胺三酯法进行合成；其原理是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。具体包括以下步骤：

1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引物。

实施例1引物的验证及筛选(以KRAS为例)

以KRAS基因为例，按照KRAS基因第二外显子和第三外显子的序列，进行引物设计。对引物的不同序列长度进行扩增比较，筛选特异性好的引物。

引物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性结果如下表和图1所示：

引物大小(bp)	5-9	13-16	18-23	24-28	30-37	39-45
							特异性	特异性很差	特异性差	特异性好	特异性较好	特异性差	特异性很差

图1a为5-9bp的引物PCR扩增的电泳图，图1b为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图1c为18-23bp的引物PCR扩增的电泳图，图1d为24-28bp的引物PCR扩增的电泳图，图1e为30-37bp的引物PCR扩增的电泳图，图1f为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。由下表或图1可知，最佳引物为18-28bp大小的引物。

引物由上海英潍捷基公司按照亚磷酰胺三酯法负责合成。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行引物验证，得到电泳图如图2所示。图2a为获得的Kras-exon2-F电泳图；图2b为获得的Kras-exon2-R电泳图；图2c为获得的Kras-exon3-F电泳图；图2d为获得的Kras-exon3-R电泳图。(以KRAS为例)

实施例2阴性对照DNA的提取

采样：

1、抽取正常人外周血2.5ml于枸橼酸钠(1∶9)抗凝管中。

2、抗凝管中的血8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。

3、血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)。

DNA的提取按照如下步骤进行：取正常人的混匀的抗凝全血2ml，然后使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。使用Nano 1000定量仪定量，测定DNA浓度。

阴性对照DNA符合以下条件时可以视为合格：1、符合OD值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0之间；2、电泳条带主条带清晰(上样6ul，1.0％琼脂糖凝胶，120V电压，25分钟)；3、测序鉴定KRAS基因外显子2、3无任何异常突变存在。测序结果如图3所示。

实施例3肿瘤组织DNA的提取

样本采集按照如下步骤进行：取新鲜组织块50～100mg以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5cm以下，放入装有1.5ml体积RNAlater的冻存管中，充分混匀(30分钟内完成)。室温下放置1-2小时，4℃冰箱过夜，第二天转至-20℃长期保存。

DNA提取按照如下步骤进行：使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGENBIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。然后进行DNA纯化、检测。若提取的DNA，OD值不在A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0，标准范围内，则需要进行DNA纯化步骤。

DNA纯化按照如下进行：加入等体积的氯仿-异戊醇(25∶1)，向下翻转离心管5min以充分混匀，13000rpm离心10min小心吸出上清液至另一1.5ml离心管；加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇匀，沉淀DNA13000rpm离心3min，轻轻倒去上清液，加入70％乙醇洗一次，13000rpm，离心3min，去上清液，倒置5-10min(倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA充分溶解。

对提取的DNA进行检测时，需测定所提取的DNA在A260/280/230上的吸光度，符合OD值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0之间。其步骤可以是：将提取的DNA稀释到10ng/ul；电泳鉴定主条带清晰(上样6ul，1.0％琼脂糖凝胶，120V电压，25分钟)电泳图如图4所示：若符合以上条件，将DNA-20℃保存，留待作为PCR反应的模板DNA。

实施例4血液中血浆DNA的提取

先进行血液采样，抽取病人外周血2.5ml于枸橼酸纳(1∶9)抗凝管中。抗凝管中的血8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。

然后进行DNA提取，可以按照如下步骤：将抗凝血8000rpm离心5min，吸出上层的血浆，用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。样本PCR产物电泳图如图6所示，单一条带。

实施例5血液中血清DNA的提取

抽取病人外周血1-2ml至无抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。

然后进行DNA提取，可以按照如下步骤：血清用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

实施例6石蜡切片组织DNA的提取

刮削5-10μm厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。用二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit(德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。石蜡DNA电泳图如图5所示。

实施例7血浆、血清PCR扩增预实验

利用例4、5提取的血浆、血清DNA进行PCR预实验，按实施例7摸好的实验条件进行实验，产物电泳图如图6所示。

实施例8PCR和HRM集成化条件的优化

1)酶的选择确定

用不同厂家的酶进行实验比较，选择活性比较高的酶。本发明实验后其酶活性如下表和图7所示，最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活性最高。

酶的类 HotStarTaq酶 FastStartTaq酶 Taq CE DNA KAPA2G快速热启

型 ① ② Polymerase③ 动DNA聚合酶④

活性活性好活性好活性较好活性较差

2)荧光染料选择的确定

本发明人通过用不同厂家的酶进行实验，选择结合效果好的染料，这些荧光染料的实验结果如下表和图8所示，最后确定使用的最佳染料为Eva Green和LC Green。

SYBRGreen Flamingo

荧光染料 Eva Green① LC Green② DAPI④

③ ⑤

结合效果不

结合效结合效果不

结合效果结合效果好结合效果好好，且会抑制

果不好好

PCR反应

3)PCR条件的确定(以BRAF为例)

PCR条件优化在退火温度、MgCl₂浓度两方面进行调整和优化，其中分别对BRAF-463和BRAF-1799的PCR条件进行摸索和优化，确定PCR最佳条件为退火温度为60℃，MgCl₂终浓度为2.5mM。PCR条件优化试验的结果如下：

PCR条件 MgCl₂终浓度

1.0mM 1.5mM 2.0mM 2.5mM 3.0mM 3.5Mm

退火温度 55℃ 无扩增有非特有非特有非特有非特有非特

异性条异性条异性条异性条异性条

带带带带带

58℃ 无扩增二聚体二聚体二聚体二聚体二聚体

产生产生产生产生产生

60℃ 无扩增扩增效扩增正扩增正二聚体二聚体

率低常常产生产生

如图9和图10所示为进行PCR条件优化筛选时的溶解曲线图和PCR产物电泳图。图9A为KRAS-EXON2的荧光次数优化曲线；图9B为KRAS-EXON2的溶解曲线；图9C为KRAS-EXON3的溶解曲线；图9D为KRAS-EXON3的荧光次数优化曲线，图10为进行PCR条件优化筛选时的PCR产物电泳图。其中箭头1、2分别对应KRAS-EXON2、3PCR产物电泳结果。

4)HRM条件的确定

HRM条件的优化主要在溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面进行优化调整。起始温度选择60℃、65℃、70℃三个条件，检测荧光次数(次)选择10、40、100次/秒三种。其结果如下：

最后确定的最佳条件是：

5)联合其他多个基因如：EGFR、KRAS、BRAF等最终确定集成化反应条件：

6)DNA模板的确定

分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片等样本中进行检测模板DNA，经实验证实：外周血(血清、血浆)、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。实验结果如图11所示，图11A～E分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片、外周血血清的检测结果。

模板DNA来源外周血(血浆) 外周血(血清) 口腔拭子组织石蜡切片

检测效果可以检测可以检测可以检测可以检测可以检测

实施例9灵敏度实验

通过在野生型样本中参入突变型样本，按以下比例进行参入，野生型∶突变型：100∶0、100∶1、100∶5、100∶10、100∶15。利用上面优化的条件进行检测：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl₂)	2.0
MgCl₂	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

HRM技术检测突变的灵敏度可以达到1％如图12所示。与其他检测突变的方法相比较，可以看出HRM技术检测突变的灵敏度很高，见下表。经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1％。其他检测方法对照文献Mutation Research 635(2007)105-117的检测方法灵敏度数据，如下表所示，本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1％。

实施例10石蜡标本检测的精确度实验

随机选取40个石蜡标本，用实施例6的方法提取石蜡标本DNA，利用上面优化的条件进行检测：

PCR反应体系：

PCR和HRM反应条件：

结果EGFR-19有8例样本检测有分型，结果如图13。测序有9例突变，测序比较一致性89％，HRM技术检测突变的准确度达89％，如下表。

样本编号	HRM	测序	样本编号	HRM	测序
						1	未分型	正常	21	未分型	正常
2	未分型	正常	22	未分型	正常
						3	未分型	正常	23	未分型	正常
4	未分型	正常	24	分型	突变
						5	未分型	正常	25	分型	突变
6	未分型	正常	26	未分型	正常

7	未分型	正常	27	未分型	正常
						8	未分型	正常	28	未分型	正常
9	未分型	正常	29	未分型	正常
						10	未分型	正常	30	未分型	正常
11	分型	突变	31	未分型	正常
						12	分型	突变	32	分型	突变
13	分型	突变	33	未分型	正常
						14	未分型	正常	34	未分型	正常
15	未分型	正常	35	未分型	正常
						16	未分型	正常	36	未分型	正常
17	未分型	正常	37	未分型	正常
						18	未分型	突变	38	未分型	正常
19	分型	突变	39	未分型	正常
						20	未分型	正常	40	分型	突变

应用例1结肠癌患者外周血血浆的基因扫描(以KRAS为例)

用实施例1～10获得的材料和优化的条件对正常人和结肠癌患者进行基因扫描，其过程如下：

取结肠癌患者和正常人的外周血2ml各20例，提取DNA作为模板。

使用仪器：LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。

2、用Qiagen Blood Mini kit(德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明提取DNA。

引物序列：

PCR反应体系：

PCR和HRM反应条件：

结果：

图14为20例正常人血液中KRAS基因突变检测结果，其中，图14A、14B为结肠癌患者血液中KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变检测结果；图15为20例结肠癌患者的血液中KRAS基因突变检测结果，其中图15A、15B为结肠癌患者血液中KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变检测结果；在正常人群中，未筛查出有突变的基因存在；在结肠癌患者中，有六列是检测出有KRAS-EXON2突变，有一列是同时检测出KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变的，其余13列样本未检测出突变，突变的检出率在35％，符合国内外研究报道的结肠癌患者中KRAS基因突变的几率。

应用例2结肠癌患者石蜡标本的基因扫描(以KRAS为例)

对30例结肠癌患者石蜡切片中KRAS基因进行突变检测，取结肠癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。

使用仪器：LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、刮削5-10μm厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。

2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit(德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA。

引物序列：

PCR反应体系：

PCR和HRM反应条件：

如图16A、16B为结肠癌患者血液中KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变检测结果，在结肠癌患者石蜡切片提取的DNA检测中，有11例是检测出有KRAS-EXON2突变，1例有KRAS-EXON3突变的，其余18列样本未检测出突变，突变的检出率在40％，符合国内外研究报道的结肠癌患者中KRAS基因突变的几率。

应用例3结肠癌患者外周血血清的基因扫描(以KRAS为例)

使用仪器：LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。

引物序列：

PCR反应体系：

PCR和HRM反应条件：

结果：

图14为20例正常人血液中KRAS基因突变检测结果，图14A、14B为正常人血液中KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变检测图；图17A、17B为结肠癌患者血液中KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变检测结果；在正常人群中，未筛查出有突变的基因存在；在结肠癌患者中，有六列是检测出有KRAS-EXON2突变，有一列是同时检测出KRAS-EXON2和KRAS-EXON3突变的，其余13列样本未检测出突变，突变的检出率在35％，符合国内外研究报道的结肠癌患者中KRAS基因突变的几率。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州工业园区为真生物医药科技有限公司

<120>基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法

<130>

<160>23

<170>PATENTIN VERSION 3.5

<210>1

<211>111

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>1

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga g 111

<210>2

<211>179

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>2

gattcctaca ggaagcaagt agtaattgat ggagaaacct gtctcttgga tattctcgac 60

acagcaggtc aagaggagta cagtgcaatg agggaccagt acatgaggac tggggagggc 120

tttctttgtg tatttgccat aaataatact aaatcatttg aagatattca ccattatag 179

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>引物

<400>3

tttttattat aaggcctgct gaaaatgact gaatataaac t 41

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>引物

<400>4

taaaacaaga tttacctcta ttgttggatc atattcgtcc a 41

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>引物

<400>5

atgtgtgaca tgttctaata tagtcacatt 30

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>引物

<400>6

gatcatattc gtccacaaaa tgattctgaa t 31

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>引物

<400>7

gtgtattaac cttatgtgtg acatgttcta ata 33

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>引物

<400>8

gattctgaat tagctgtatc gtcaaggcac tct 33

<210>9

<211>47

<212>DNA

<213>引物

<400>9

tataacacct tttttgaagt aaaaggtgca ctgtaataat ccagact 47

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>引物

<400>10

ttaaacccac ctataatggt gaatatcttc aaatgattta gtatt 45

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>引物

<400>11

ctcaggattc ctacaggaag caagtagtaa ttga 34

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>引物

<400>12

agaagtttac taaatcataa taaataccgt tta 33

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>引物

<400>13

agtaattgat ggagaaacct gtctcttgga 30

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>14

gccctcccca gtcctcatgt actggtcc 28

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>15

ttataaggcc tgctgaaaat gactgaa 27

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>16

tgaattagct gtatcgtcaa ggcact 26

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>17

gactgtgttt ctcccttctc 20

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>18

tgtactggtc cctcattgc 19

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>19

gctgaaaatg actgaatata aact 24

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>引物

<400>20

ttacctctat tgttggatca tattcgtcca 30

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>21

ctgctgaaaa tgactgaata taaact 26

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>22

taaaacaaga tttacctcta ttgttgga 28

<210>23

<211>5312

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>23

ggccgcggcg gcggaggcag cagcggcggc ggcagtggcg gcggcgaagg tggcggcggc 60

tcggccagta ctcccggccc ccgccatttc ggactgggag cgagcgcggc gcaggcactg 120

aaggcggcgg cggggccaga ggctcagcgg ctcccaggtg cgggagagag gcctgctgaa 180

aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga gtgccttgac 240

gatacagcta attcagaatc attttgtgga cgaatatgat ccaacaatag aggattccta 300

caggaagcaa gtagtaattg atggagaaac ctgtctcttg gatattctcg acacagcagg 360

tcaagaggag tacagtgcaa tgagggacca gtacatgagg actggggagg gctttctttg 420

tgtatttgcc ataaataata ctaaatcatt tgaagatatt caccattata gagaacaaat 480

taaaagagtt aaggactctg aagatgtacc tatggtccta gtaggaaata aatgtgattt 540

gccttctaga acagtagaca caaaacaggc tcaggactta gcaagaagtt atggaattcc 600

ttttattgaa acatcagcaa agacaagaca gggtgttgat gatgccttct atacattagt 660

tcgagaaatt cgaaaacata aagaaaagat gagcaaagat ggtaaaaaga agaaaaagaa 720

gtcaaagaca aagtgtgtaa ttatgtaaat acaatttgta cttttttctt aaggcatact 780

agtacaagtg gtaatttttg tacattacac taaattatta gcatttgttt tagcattacc 840

taattttttt cctgctccat gcagactgtt agcttttacc ttaaatgctt attttaaaat 900

gacagtggaa gttttttttt cctctaagtg ccagtattcc cagagttttg gtttttgaac 960

tagcaatgcc tgtgaaaaag aaactgaata cctaagattt ctgtcttggg gtttttggtg 1020

catgcagttg attacttctt atttttctta ccaattgtga atgttggtgt gaaacaaatt 1080

aatgaagctt ttgaatcatc cctattctgt gttttatcta gtcacataaa tggattaatt 1140

actaatttca gttgagacct tctaattggt ttttactgaa acattgaggg aacacaaatt 1200

tatgggcttc ctgatgatga ttcttctagg catcatgtcc tatagtttgt catccctgat 1260

gaatgtaaag ttacactgtt cacaaaggtt ttgtctcctt tccactgcta ttagtcatgg 1320

tcactctccc caaaatatta tattttttct ataaaaagaa aaaaatggaa aaaaattaca 1380

aggcaatgga aactattata aggccatttc cttttcacat tagataaatt actataaaga 1440

ctcctaatag cttttcctgt taaggcagac ccagtatgaa atggggatta ttatagcaac 1500

cattttgggg ctatatttac atgctactaa atttttataa taattgaaaa gattttaaca 1560

agtataaaaa attctcatag gaattaaatg tagtctccct gtgtcagact gctctttcat 1620

agtataactt taaatctttt cttcaacttg agtctttgaa gatagtttta attctgcttg 1680

tgacattaaa agattatttg ggccagttat agcttattag gtgttgaaga gaccaaggtt 1740

gcaaggccag gccctgtgtg aacctttgag ctttcataga gagtttcaca gcatggactg 1800

tgtccccacg gtcatccagt gttgtcatgc attggttagt caaaatgggg agggactagg 1860

gcagtttgga tagctcaaca agatacaatc tcactctgtg gtggtcctgc tgacaaatca 1920

agagcattgc ttttgtttct taagaaaaca aactcttttt taaaaattac ttttaaatat 1980

taactcaaaa gttgagattt tggggtggtg gtgtgccaag acattaattt tttttttaaa 2040

caatgaagtg aaaaagtttt acaatctcta ggtttggcta gttctcttaa cactggttaa 2100

attaacattg cataaacact tttcaagtct gatccatatt taataatgct ttaaaataaa 2160

aataaaaaca atccttttga taaatttaaa atgttactta ttttaaaata aatgaagtga 2220

gatggcatgg tgaggtgaaa gtatcactgg actaggaaga aggtgactta ggttctagat 2280

aggtgtcttt taggactctg attttgagga catcacttac tatccatttc ttcatgttaa 2340

aagaagtcat ctcaaactct tagttttttt tttttacaac tatgtaattt atattccatt 2400

tacataagga tacacttatt tgtcaagctc agcacaatct gtaaattttt aacctatgtt 2460

acaccatctt cagtgccagt cttgggcaaa attgtgcaag aggtgaagtt tatatttgaa 2520

tatccattct cgttttagga ctcttcttcc atattagtgt catcttgcct ccctaccttc 2580

cacatgcccc atgacttgat gcagttttaa tacttgtaat tcccctaacc ataagattta 2640

ctgctgctgt ggatatctcc atgaagtttt cccactgagt cacatcagaa atgccctaca 2700

tcttatttcc tcagggctca agagaatctg acagatacca taaagggatt tgacctaatc 2760

actaattttc aggtggtggc tgatgctttg aacatctctt tgctgcccaa tccattagcg 2820

acagtaggat ttttcaaacc tggtatgaat agacagaacc ctatccagtg gaaggagaat 2880

ttaataaaga tagtgctgaa agaattcctt aggtaatcta taactaggac tactcctggt 2940

aacagtaata cattccattg ttttagtaac cagaaatctt catgcaatga aaaatacttt 3000

aattcatgaa gcttactttt tttttttggt gtcagagtct cgctcttgtc acccaggctg 3060

gaatgcagtg gcgccatctc agctcactgc aacctccatc tcccaggttc aagcgattct 3120

cgtgcctcgg cctcctgagt agctgggatt acaggcgtgt gccactacac tcaactaatt 3180

tttgtatttt taggagagac ggggtttcac cctgttggcc aggctggtct cgaactcctg 3240

acctcaagtg attcacccac cttggcctca taaacctgtt ttgcagaact catttattca 3300

gcaaatattt attgagtgcc taccagatgc cagtcaccgc acaaggcact gggtatatgg 3360

tatccccaaa caagagacat aatcccggtc cttaggtagt gctagtgtgg tctgtaatat 3420

cttactaagg cctttggtat acgacccaga gataacacga tgcgtatttt agttttgcaa 3480

agaaggggtt tggtctctgt gccagctcta taattgtttt gctacgattc cactgaaact 3540

cttcgatcaa gctactttat gtaaatcact tcattgtttt aaaggaataa acttgattat 3600

attgtttttt tatttggcat aactgtgatt cttttaggac aattactgta cacattaagg 3660

tgtatgtcag atattcatat tgacccaaat gtgtaatatt ccagttttct ctgcataagt 3720

aattaaaata tacttaaaaa ttaatagttt tatctgggta caaataaaca ggtgcctgaa 3780

ctagttcaca gacaaggaaa cttctatgta aaaatcacta tgatttctga attgctatgt 3840

gaaactacag atctttggaa cactgtttag gtagggtgtt aagacttaca cagtacctcg 3900

tttctacaca gagaaagaaa tggccatact tcaggaactg cagtgcttat gaggggatat 3960

ttaggcctct tgaatttttg atgtagatgg gcattttttt aaggtagtgg ttaattacct 4020

ttatgtgaac tttgaatggt ttaacaaaag atttgttttt gtagagattt taaaggggga 4080

gaattctaga aataaatgtt acctaattat tacagcctta aagacaaaaa tccttgttga 4140

agttttttta aaaaaagcta aattacatag acttaggcat taacatgttt gtggaagaat 4200

atagcagacg tatattgtat catttgagtg aatgttccca agtaggcatt ctaggctcta 4260

tttaactgag tcacactgca taggaattta gaacctaact tttataggtt atcaaaactg 4320

ttgtcaccat tgcacaattt tgtcctaata tatacataga aactttgtgg ggcatgttaa 4380

gttacagttt gcacaagttc atctcatttg tattccattg attttttttt tcttctaaac 4440

attttttctt caaacagtat ataacttttt ttaggggatt tttttttaga cagcaaaaac 4500

tatctgaaga tttccatttg tcaaaaagta atgatttctt gataattgtg tagtaatgtt 4560

ttttagaacc cagcagttac cttaaagctg aatttatatt tagtaacttc tgtgttaata 4620

ctggatagca tgaattctgc attgagaaac tgaatagctg tcataaaatg aaactttctt 4680

tctaaagaaa gatactcaca tgagttcttg aagaatagtc ataactagat taagatctgt 4740

gttttagttt aatagtttga agtgcctgtt tgggataatg ataggtaatt tagatgaatt 4800

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Claims

1.一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，其特征在于所述方法包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因选自EGFR，KRAS，BRAF，C-KIT，PI3K和PDGFRA的一种或一种以上；所述引物对含有目的基因靶向序列中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液终浓度1～5×；

dNTPs 0.1～1mM；

引物序列终浓度为0.1～1μM；

模板DNA 0.05～2ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～0.10U/μL；

MgCl₂ 终浓度为1～5mM；

荧光染料 1～3×。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述用于集成化检测的PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液终浓度1～3×；

dNTPs 0.1～0.5mM；

引物序列终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA 0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～0.10U/μL；

MgCl₂ 终浓度为1～3mM；

荧光染料 1～2×。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述荧光染料选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LC

PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mMdTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述集成化反应程序包括集成在一起形成程序化操作的进行基因扩增的PCR扩增程序和进行突变位点检测的产物熔解程序。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40-55个循环；所述进行突变位点检测的产物熔解程序中进行产物溶解检测的条件为92～97℃变性1分钟；40℃复性1分钟；然后初始熔解温度60～65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25～45次每秒；然后40℃进行冷却10秒。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；所述进行突变位点检测的产物熔解程序中进行产物溶解检测的条件为95℃变性1分钟；40℃复性1分钟；然后初始熔解温度65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒；然后40℃进行冷却10秒。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法具体按照如下步骤进行：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述模板DNA从选自外周血血浆、外周血血清、体液、腔道的脱落物、病变组织样本中提取。