CN108949951A - 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒 - Google Patents

一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108949951A
CN108949951A CN201810480533.2A CN201810480533A CN108949951A CN 108949951 A CN108949951 A CN 108949951A CN 201810480533 A CN201810480533 A CN 201810480533A CN 108949951 A CN108949951 A CN 108949951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
dna
gene
primer
misc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810480533.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108949951B (zh
Inventor
袁慧军
谭博
程静
卜枫啸
卢宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of PLA Military Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of PLA Military Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of PLA Military Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of PLA Military Medical University
Priority to CN201810480533.2A priority Critical patent/CN108949951B/zh
Publication of CN108949951A publication Critical patent/CN108949951A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108949951B publication Critical patent/CN108949951B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法，试剂盒及其制备方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行Index PCR扩增；(4)对PCR扩展产物进行文库质控后，在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；(5)将测序的序列信息进行生物信息学分析得出基因变异数据。本发明还涉及有关的试剂盒。

Description

一种同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因诊断领域，尤其涉及一种无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法 和试剂盒。
背景技术
基因突变的检测对于可用于鉴别待测样本的基因型是野生型还是突变型。也可以用于检测待测个体的基因状态。比如是否含有导致某些疾病的基因突变。
许多种肿瘤检测，胎儿遗传状态检测都具有重要的价值。目前针对胎儿的基因突变筛查，主要基于SNP array等多个平台系统，对胎儿及父母进行全基因组SNP分析， 成本昂贵；而常规依赖聚合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，发生的碱基错误造 成测序噪声，因此常规文库捕获和高通量测序不能解决由扩增和测序造成的变异检测偏 差；而较新的循环单分子扩增和重测序技术(cSMART)技术受其环化文库效率和背靠背 引物位点的设计的影响。
孕妇外周血中胎儿来源的游离DNA的发现，为无创性检测胎儿遗传状态提供了可能。孕妇外周血cfDNA源于母亲和胎儿，胎儿游离DNA(cffDNA)来源于胎盘滋养层细胞，约占总cfDNA的10-20％，片段长度为140-180bp左右。将cffDNA从母亲来源的DNA 中鉴别出来仍然是目前的技术难点，特别是如何检测母血血浆中cffDNA所导致的等位基因比例不平衡。目前国际上对cffDNA的研究主要通过位点特异性PCR，MALDI-TOF 质谱法，数字PCR和高通量测序等。
目前主流的无创产前检测方法均基于胎儿变异位点检测和单体型检测：通过对母血 血浆中cfDNA进行位点检测，然后利用相对变异剂量(RMD)和相对单体型剂量(RHDO) 分析孕妇血浆中胎儿变异位点和单体型的相对含量。通过仅存在父亲中的SNP推导了父 源部分的胎儿基因组，母亲来源的胎儿基因组部分则使用父亲纯合但母亲杂合的SNP 进行推导。Papasavva等利用该方法对母血cfDNA进行分析，成功对其cffDNA基因型 和变异位点进行分析。因此利用对cffDNA中变异位点和单体型的检测，可有效地提高 胎儿致病基因的诊断准确度。
对于遗传性耳聋无创产前基因诊断的方法学研究，目前国际上仅有极少数报道。由于在耳聋热点变异中存在多个Indel变异位点，如GJB2(c.299delAT、c.235delC、 c.176_191del16)，不同的平台系统对其cfDNA检测仍然存在多种问题。
有必要针对开发一种更便捷和可靠的适合无创检测低拷贝数基因突变的技术。
发明内容
因此上述领域存在问题和需求，发明人研发了一种快速准确的单分子扩增技术，在常规的多重扩增基础上加入了UMI(Unique Molecular Identifier)分子标签，利 用UMI对二代测序数据进行降噪，从而准确地检测低拷贝数变异：具体方案如下：
一种检测基因突变的方法，包括步骤如下：
(1)以受试者血浆DNA为模板；
(2)进行PCR预扩增；
(3)对预扩增产物进行Index PCR二次扩增；
(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；
(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列；将原始模板序列与人类基因组比对，通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯 一的模板序列集合；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性；通 过计算突变序列与参照序列的比例统计出检测区域体细胞基因突变率；
其特征在于：
预扩增中采用的引物是多对引物的混合物，所述多对引物用于特异性扩增待测区域 中的不同亚目标区域；
所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基 因中的不同区域的DNA片段。
每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不 同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；
在所述Index PCR二次扩增中，所述二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头 序列、通用测序接头序列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一 段Index序；所述二次扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A 和所述接头序列B的全部或部分；所述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用 不同的Index序列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一Index序列。
上述方法，其特征在于：所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分子 标签序列长度为5-8bp
上述方法，其特征在于：在进行所述Index PCR扩增之前，对PCR预扩增所得DNA 进行磁珠纯化；
上述方法，其特征在于：在进行所述Index PCR扩增之后，对扩增所得DNA进行 磁珠纯化。
用于检测基因突变的试剂盒，其特征在于，包含用于特异性预扩增待测区域中的不 同亚目标区域的多个引物对；
所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；
同一来源的DNA片段中的UMI分子标签序列相同；而不同来源的DNA片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基 因中的不同位置区域。
上述试剂盒，其特征在于，还包含用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物， 所述二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序接头序列，其中一侧 引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所述二次扩增引物的正 向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列B的全部或部分；所 述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index序列，用于同一样本的 二次扩增引物采用同一Index序列。
上述试剂盒，其特征在于：所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分 子标签序列长度为5-7bp。
用于检测基因突变的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和/或组装具有以下序列特征的多个引物对，
所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；
同一来源的DNA片段中的UMI分子标签序列相同；而不同来源的DNA片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；
所述多个引物对用于特异性预扩增待测区域中的不同亚目标区域；所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基因中的不同位置区域。
上述制备方法，其特征在于，还包含合成和/或组装用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序 接头序列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所 述二次扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列 B的全部或部分；所述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index序 列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一Index序列。
上述制备方法，其特征在于：所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI 分子标签序列长度为5-7bp。
上述方法在GJB2基因突变和SLC26A4基因突变检测中的应用衍生出以下技术方案
一种无创检测GJB2和/或SLC26A4基因突变的方法，包括步骤如下：
(1)以受试者血浆DNA为模板；
(2)进行PCR预扩增；
(3)对预扩增产物进行Index PCR二次扩增；
(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；
(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列，将原始模板序列与人类基因组比对，通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯 一的模板序列集合；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性；通 过计算突变序列与参照序列的比例统计出检测区域体细胞基因突变率；
其特征在于：
预扩增中采用Seq ID No.1-46,89-91，94-96所示的引物构成的26对引物的混合物用于特异性扩增GJB2基因的不同亚目标区域；
预扩增中采用Seq ID No.47-88,92-93,97-98所示的引物构成的23对引物的混合物用于特异性扩增SLC26A4基因的不同亚目标区域；
或者，预扩增中采用Seq ID No.1-98所示的引物构成的49对引物的混合物用于同时特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的不同亚目标区域；从而同时检测GJB2基因和SLC26A4基因的变异；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基 因中的不同区域的DNA片段；
每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不 同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；
在所述Index PCR二次扩增中，采用Seq ID No.99和100所示的正反向引物。
上述方法，其特征在于：在进行所述Index PCR扩增之前，对PCR预扩增所得DNA 进行磁珠纯化；
上述方法，其特征在于：在进行所述Index PCR扩增之后，对扩增所得DNA进行 磁珠纯化。
用于无创检测GJB2和/或SLC26A4基因突变的试剂盒，其特征在于，
包括Seq ID No.1-46,89-91，94-96所示的引物构成的26对引物的混合物，用于特异性扩增GJB2基因的不同亚目标区域；
包括Seq ID No.47-88,92-93,97-98所示的引物构成的23对引物的混合物用于特异性扩增SLC26A4基因的不同亚目标区域；
或者，包括Seq ID No.1-98所示的引物构成的49对引物的混合物用于同时特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的不同亚目标区域；从而同时检测GJB2GJB2基因和 SLC26A4基因的变异。
上述试剂盒，其特征在于，还包含用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物， 所述二次扩增引物的正反向引物如Seq ID No.99和100所示。
用于检测GJB2基因突变的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和/或组装具有Seq ID No.1-46,89-91，94-96所示核苷酸序列的引物。
或用于检测SLC26A4基因突变的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和 /或组装具有Seq ID No.47-88,92-93,97-98所示核苷酸序列的引物。
或用于检测GJB2基因和SLC26A4基因突变的试剂盒的制备方法，其特征在于， 包括合成和/或组装具有Seq ID No.1-98所示核苷酸序列的引物。
上述制备方法，其特征在于，还包含合成和/或组装用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的正反向引物如Seq ID No.99和100所示。
根据本发明提供的基因突变检测方法，针对具体的待测基因，本领域技术人员可以根据选择的各个亚目标区域设计筛选扩增针对不同亚目标区域的特异性引物序列，使得这些引物对之间在同一反应中能够互相干扰最小，保证检测准确性和灵敏性。再根据 引物的一般设计规则设计或选择适合所有引物对的接头序列，为不同引物对设计UMI 分子标签序列，使得扩增同一来源的DNA片段的引物采用相同的UMI分子标签序列，而 扩增不同来源的DNA片段的引物之间的UMI分子，即可得到针对具体待测基因的预扩增 引物组。可用于孕妇外周血cfDNA检测胎儿的遗传状态，例如耳聋基因等单基因病，以 及通过肿瘤基因游离DNA基因癌症检测。
本发明的基因突变方法，通过引入UMI分子标签，通过生物信息分析将带有相同UMI序列的扩增测序产物进行合并，极大地降低了由DNA聚合酶扩增过程和二代测序过 程所引入的错误和假阳性率，通过降噪实现对低拷贝数变异进行准确检测。
实验例通过检测已知GJB2和SLC26A4突变位点，验证方法的可靠性。
附图说明
图1是本发明的原理示意图：
首先采用混合引物对血浆DNA进行预扩增，目的是扩增所需位点产物；
然后将预扩增产物DNA纯化，目的是去除体系中的酶和离子；
针对预扩增产物进行Index PCR二次扩增，制作成可用于高通量测序的文库；
最后对文库进行生物信息学分析得出基因突变数据。
图2.生物信息学分析过程示例
对带有相同分子标签的序列(即同一样本来源)进行组装成唯一的模板序列
具体实施方式
本发明的实施例中，提供了一种检测基因突变的方法，包括步骤如下：
一种检测基因突变的方法，包括步骤如下：
(1)以受试者血浆DNA为模板；
(2)进行PCR预扩增；
(3)对预扩增产物进行Index PCR二次扩增；
(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；
(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列；将原始模板序列与人类基因组比对，通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯 一的模板序列集合；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性；通 过计算突变序列与参照序列的比例统计出检测区域体细胞基因突变率；
其特征在于：
预扩增中采用的引物是多对引物的混合物，所述多对引物用于特异性扩增待测区域 中的不同亚目标区域；
所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基 因中的不同区域的DNA片段。
每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不 同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；
在所述Index PCR二次扩增中，所采用二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接 头序列、通用测序接头序列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含 一段Index序；所述二次扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列 A和所述接头序列B；所述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index 序列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一Index序列。
针对具体的待测基因，本领域技术人员可以根据选择的亚目标区域设计扩增该区域 的亚目标区域特异性引物序列，根据引物的一般设计规则设计或选择适合的接头序列，并为不同的引物对随机设计UMI分子标签序列，即可得到针对具体待测基因的预扩增引 物组。例如可用于孕妇外周血cfDNA检测胎儿的遗传状态，例如耳聋基因等单基因病， 以及通过肿瘤基因游离DNA基因癌症检测。
一些实施例中，所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分子标签序列 长度为5-8bp
一些实施例中，在进行所述Index PCR二次扩增之前，对PCR预扩增所得DNA进 行磁珠纯化；
一些实施例中，在进行所述Index PCR扩增之后，对扩增所得DNA进行磁珠纯化。
本发明的实施，还包括提供用于检测基因突变的试剂盒，其特征在于，包含用于特异性预扩增待测区域中的不同亚目标区域的多个引物对；
所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基 因中的不同位置区域；
每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不 同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同。
一些试剂盒中，还包含用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次 扩增引物从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序接头序列，其中一侧引物在接头 序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所述二次扩增引物的正向引物和反 向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列B；所述Index序列用于标示不 同样本，不同的样本采用不同的Index序列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一 Index序列。
正反向引物3’序列分别为接头序列A和接头序列B(二次扩增引物的5’端序列针对Illumina 测序仪的文库要求进行设计)
一些试剂盒中，优选所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分子标签 序列长度为5-7bp。
本发明的实施，还包括提供用于检测基因突变的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和/或组装具有以下序列特征的多个引物对，
所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；
所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基 因中的不同位置区域；
每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不 同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同。
在一些制备方案中，还包含合成和/或组装用于对所述预扩增产物进行扩增的二次 扩增引物，所采用二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序接头序 列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所述二次 扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列B；所 述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index序列，用于同一样本的 二次扩增引物采用同一Index序列。
在一些制备方案中，所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分子标签 序列长度为5-7bp。
应用实施例检测GJB2和SLC26A4基因突变
GJB2基因编码缝隙连接蛋白26，全长678bp，含两个外显子。其蛋白表达于内耳，对维持耳蜗内正常电位具有重要作用。其基因突变可导致常染色体隐性遗传性耳聋和常染色体显性遗传性耳聋，突变所致耳聋约占全部常染色体隐性遗传性耳聋的一半，占散 发病例中的60％。SLC26A4基因定位于染色体7q22.3上，全长2343bp。其编码蛋白pendrin 主要在内耳、甲状腺和肾脏中表达，其功能与氯离子和碳酸氢离子转运相关。SLC26A4 基因突变可导致Pendred综合征和DFNB4型非综合征性耳。Gao Z利用SNPscan技术对695 个中国耳聋患者筛查发现38.7％的耳聋患者是由于GJB2和SLC26A4基因变异所导致，并且 发现在这些基因中突变呈明显的奠基者效应，因此对这两个基因导致的遗传性耳聋研究 具有重要的临床意义。
因此，在临床上迫切需要一种快速，高效的检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法。本发明人在研究片段DNA的检测时，发现了一种新的DNA片段的检测方法，即通过对扩增 引物添加分子标签，然后对DNA片段进行扩增。在此基础上，结合第二代高通量测序技 术，特别根据GJB2和SLC26A4基因对该方法进行了改进，并特别根据GJB2和SLC26A4设计 了优选的引物，开发了一种通过血浆DNA对GJB2和SLC26A4基因的突变进行测序和分析的 方法以及其试剂盒。
对于遗传性耳聋无创产前基因诊断的方法学研究，目前国际上仅有极少数报道。由于在耳聋热点变异中存在多个Indel变异位点，如GJB2(c.299delAT、c.235delC、 c.176_191del16)，不同的平台系统对其cfDNA检测仍然存在多种问题。如基于SNP array等多个平台系统，对胎儿及父母进行全基因组SNP分析，成本昂贵；常规依赖聚 合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，将产生碱基错误的测序噪声，导致常规文库 捕获和高通量测序仍不能解决在变异中由扩增和测序造成偏差；较新的循环单分子扩增 和重测序技术(cSMART)技术受其环化文库效率和背靠背引物位点的设计的影响。本发 明的方法很好地解决了这一问题，在常规的多重扩增基础上加入了UMI(Unique Molecular Identifier)分子标签，利用UMI对二代测序数据进行降噪，从而对低拷贝 数变异进行检测。
通过检测GJB2和SLC26A4突变位点已知的模板验证方法的可靠性
细胞系DNA：将含有GJB2和SLC26A4基因热点变异的多个DNA样本(均来源于陆军军 医大学第一附属医院DNA样本库)超声破碎，回收166±10bp片断按预设比例 混入正常人血浆DNA得到突变比例已知的待测样品(根据阳性DNA浓度计算))：
该样品的GJB2基因热点突变比例预期如下
突变位点 预期突变比例
c.235delC 5.50％
c.299_300delAT 6.20％
c.176_191del16 9.30％
该样品的SLC26A4基因热点突变比例预期如下：
突变位点 预期突变比例
NM_000441:c.919-2A>G 2.70％
NM_000441:c.2168A>G 4.50％
测试本发明方法的灵敏性及稳定性。
预扩增引物MIX：将表1中的第一组中的引物或第二组中的引物，或第一和第二 组全部的引物序列加入1.5ml EP管中
表1预扩增引物组
Seq ID No.1-46,89-91，94-96所示的引物构成的26对引物的混合物，用于特异性扩增GJB2基因的不同亚目标区域的SNP位点和热点变异；
Seq ID No.47-88,92-93,97-98所示的引物构成的23对引物的混合物用于特异性扩增SLC26A4基因的不同亚目标区域的SNP位点和热点变异；
每条引物中的“NNNNNN”是一种合成的A/G/C/T随机序列，也就是UMI“uniquemolecular identifier”。每对引物中的UMI彼此不同。
附注：正向引物中的5’端序列“CCTACACGACGCTCTTCCGATCT”为接头序列A；反 向引物5’端序列“TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT”为接头序列B.3.PCR预扩增
制备如下的反应混合液
DNA 24.8ul
Buffer 10X 3ul
dNTP(2.5mM) 1ul
Primer Mix 1ul
Taq polymerase 0.2ul
30ul
PCR仪上反应：
在Beckman磁珠上纯化回收DNA样品，并在25μ1的无菌dH20或洗脱缓冲液中 洗脱。4.Index PCR扩增
表2index引物
99 Primer For： 5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGC-3
100 Index Primer Rev： 5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTTAATTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3
Primer F中5’端和Index Primer Rev 5’端序列为Illumina公司的公开通用测序接头；反向引物中“CTCTTAAT”为Index序列，用于区分不同样本，3’端序列“CCTACACGACGC”，Index Primer Rev 3’端“TCAGACGTGTGCT”为表1中引物的接头 A和接头B的5’端序列。
PCR仪上反应：
在Beckman磁珠上纯化回收DNA样品，并在25μ1的无菌dH20或洗脱缓冲液中 洗脱得到文库。
将制作好的文库通过Qubit检测浓度质控后，Illumina NextSeq进行150bp双 端测序(操作步骤依据Illumina公司操作说明进行操作)。
将高通量测序的序列依据重复区域拼接为一条序列，去除连接接头，将序列还原回原始模板序列，将模板比对到人类基因组(hg19)，通过比较模板序列的分子标签序列，统计出唯一的模板序列集合，如图2：对带有相同分子标签的序列进行组装成唯一的模 板序列。
利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性，通过计算突变序列与参照序列的比例统计检测区域体细胞突变。
传统不带分子标签的引物扩增后，测序并不能区分其相同来源的不同序列。我们通 过引入UMI分子标签，通过生物信息分析将带有相同来源UMI的序列进行合并，极大地降低了由DNA聚合酶扩增过程和二代测序过程所引入的错误，通过降噪我们可实现对低 拷贝数的变异进行准确检测。
针对GJB2基因热点突变位点检测结果如下：
突变位点 突变比例 检测结果
c.235delC 5.59％ 检出
c.299_300delAT 6.14％ 检出
c.176_191del16 9.44％ 检出
针对SLC26A4基因热点突变位点检测结果如下：
突变位点 突变比例 检测结果
NM_000441:c.919-2A>G 2.87％ 检出
NM_000441:c.2168A>G 4.56％ 检出
上表是两个基因低比例热点突变的检测结果，与预期结果相符。
同时，本发明的方法的检测结果与其他方法的检测结果也高度一致。说明本发明的方法能够准确检测低拷贝突变。
针对同样的样本，使用ddPCR法对其中的一个位点突变比例进行了检测，结果与本发明方法检测结果一致。但是ddPCR只能针对单个位点突变进行检测。
在一定条件下，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR扩增方法结合Sanger测序直接达到区分突变型和野生型基因的目的。该方法主要针对外周血样本。 采用PCR扩增结合针对已知位点检测外周血样本突变类型，然后用本发明方法进行血浆 模拟DNA检测。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳 实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120> 一种同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法和试剂盒
<130> P1830400CN-CN-LJY-CQ-LSH
<160> 100
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7999318_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna agtgacccgc tgtgcatgta t 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs4769954_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna caggagatgc aggcagtcaa c 51
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9509170_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng atcccatcag aaggaccctg t 51
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs1537788_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng agatgcttca aaatacagga atgg 54
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9552134_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gcagagatga aattgtactt gcag 54
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs12585595_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc cagccattct ctcccatgtt 50
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9509191_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gagctacaat cgaactcatc tttcc 55
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs11147616_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc tctgcttcag gggcttgttc t 51
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9552150_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc aggtaggacc caagatttgt gc 52
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9509098_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng gagaagatgc ctcctccatt c 51
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs870728_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng actgcctgac ccctccaac 49
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs35967187_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng agtgaccacc ctggcacata a 51
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2313485_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc catcagatgt ggcattcaga aa 52
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7327952_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna ccatcaccca tcacccctaa t 51
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs8000719_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 15
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng gttgtgacat aaacagggga ca 52
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9550644_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gctgggcagg atggagac 48
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs945368_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 17
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng atttttctgg gtccccaagc 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9506430_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc agactgctca agccctctcc 50
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6490533_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna ctctctgcgt gaggtgagtg g 51
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2872371_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc ggctctgtgc taggaaccag 50
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9552160_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt tggcacagat gcagacctct t 51
<210> 22
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9550642_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 22
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng gaaccttgag tactgggctg aa 52
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7988514_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 23
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ccctcaggtc ccatttagct c 51
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7999318_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 24
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng agagtggaga gggagctgag g 51
<210> 25
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs4769954_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 25
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng ggacaggaga ccctgtgttt t 51
<210> 26
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9509170_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 26
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng agtccccttc tccctgaggt t 51
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs1537788_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 27
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna aaacaaaata taagttttag gggctgaa 58
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9552134_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 28
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng gtcttttgtg ggggttgaga c 51
<210> 29
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs12585595_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 29
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc acagcagacc tcaacagaca gaa 53
<210> 30
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9509191_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 30
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng ccctacactt ccattcccat c 51
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs11147616_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 31
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc ctggccaaca accacca 47
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9552150_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt ttacaaatgc cagccaattc c 51
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9509098_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 33
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt ggttgtacgg gtattgcatg a 51
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs870728_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 34
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt gtaatcacta tagacagacc cttttcagc 59
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs35967187_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 35
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng cgagggaggt ctcggataag 50
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2313485_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt ttccccaact attccacagc a 51
<210> 37
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7327952_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 37
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng atcagcagtt gtcagaggct gt 52
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs8000719_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 38
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna aggaaaatgg tgcatgccta c 51
<210> 39
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9550644_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 39
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng cgccacttcc ctgttgaa 48
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs945368_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng gcataggtgg attgccaatt t 51
<210> 41
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9506430_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng aggttgctct aatcccacct ga 52
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6490533_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc tgcgtcaacg gctcctatg 49
<210> 43
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2872371_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc actggggaaa gggcaaatc 49
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9552160_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt ccaccaagag gaagaaaagg a 51
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs9550642_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 45
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt cagaggacag ttccctgttg g 51
<210> 46
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7988514_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc cttttctttt gggcacgttt t 51
<210> 47
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs28690459_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna caaaagcctt cttaagttta ggaaaca 57
<210> 48
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs73421853_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 48
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ggtttaaagg agtatctgga gtcaaa 56
<210> 49
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs17154507_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 49
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gacgttatca ggatacggct atct 54
<210> 50
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6944998_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 50
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc ctgggctcac ttgacacaaa c 51
<210> 51
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs10276013_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc cacctattag cttctaaaac aatgtaagg 59
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7805114_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 52
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna aaccagtcat gggccttagg a 51
<210> 53
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs10242548_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt ggttacaaac ataaccctgt tattgc 56
<210> 54
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6949189_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 54
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gcagacgggt ttgaaatttt g 51
<210> 55
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs1008707_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 55
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt cactcaactc ttaaaagaat cctacttga 59
<210> 56
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs78502829_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc atgacagcca ttctacagtt tatgc 55
<210> 57
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6466197_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 57
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna ttgtccccag gccaataaac t 51
<210> 58
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs10487275_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 58
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna gggacaggat ccagtagaaa gg 52
<210> 59
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs3823958_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 59
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc aaggtagcca gagaagggtg a 51
<210> 60
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6980029_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 60
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gcacttaaag gtagaggctc agaa 54
<210> 61
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs4730261_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 61
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc tctgaggatg gctatggctg t 51
<210> 62
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs57592817_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 62
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna ggctgccgta gatttggtct g 51
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2253856_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 63
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng tgagcccagt cccctgaa 48
<210> 64
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs982663_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 64
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnna gcattggctg agatccattg t 51
<210> 65
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6965933_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 65
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng ctgttatctg ttccaaccaa gga 53
<210> 66
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2712208_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 66
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng caggtcaaga caccaacaat ca 52
<210> 67
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs12534598_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 67
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt caacaactta aatgtacacg cacag 55
<210> 68
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs28690459_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 68
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt tgcctccagt tcactcctaa aag 53
<210> 69
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs73421853_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 69
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng ggggaaaata gacaagaaga agg 53
<210> 70
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs17154507_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 70
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna acatttatca gtagttccaa gccaact 57
<210> 71
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6944998_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 71
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc ccacagatgc acccaagat 49
<210> 72
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs10276013_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 72
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng gatggagtgt aatagtatgg gattatgg 58
<210> 73
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs7805114_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 73
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng ctagtccatc aacttgcctt ca 52
<210> 74
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs10242548_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 74
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc aatgggtcgc attagtcaaa ga 52
<210> 75
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6949189_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 75
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc ccttctccac cagactcaaa g 51
<210> 76
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs1008707_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 76
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt tgagcttgag cacattacca aaa 53
<210> 77
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs78502829_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 77
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna gggtccaggc tggctactct a 51
<210> 78
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6466197_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 78
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt gagtgttcag gttcaccaaa ttaca 55
<210> 79
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs10487275_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 79
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng gggagctttt tagggagagg a 51
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs3823958_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 80
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna aggggtggtc ttgctgacaa t 51
<210> 81
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6980029_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 81
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng cctttgttca gcttgtatcc atc 53
<210> 82
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs4730261_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 82
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna ggcagtgctt gggtatgagg 50
<210> 83
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs57592817_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 83
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt ccctaacact cagcacagtt gc 52
<210> 84
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2253856_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 84
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt catttttatc cactcctgca gtca 54
<210> 85
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs982663_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 85
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt cgttgtgtgg gaaatattct gg 52
<210> 86
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs6965933_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 86
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna acacccccaa accctaagac a 51
<210> 87
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs2712208_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 87
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc cacatcctgg aatcatttcc tc 52
<210> 88
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> rs12534598_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 88
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt ttggggactg gtacgaaagg t 51
<210> 89
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr13:20763486_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 89
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc tacttcccca tctcccaca 49
<210> 90
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr13:20763421_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 90
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc tcccccttga tgaacttcc 49
<210> 91
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr13:20763530_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 91
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gggagatggg gaagtagtg 49
<210> 92
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr7:107323898_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 92
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnc aaggaattat taaaaccaat gga 53
<210> 93
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr7:107350577_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 93
cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnt gtgatagaaa agctggagca a 51
<210> 94
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr13:20763486_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 94
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnc tacttcccca tctcccaca 49
<210> 95
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr13:20763421_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 95
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng ctcctagtgg ccatgcac 48
<210> 96
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr13:20763530_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 96
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnna gatgagcagg ccgacttt 48
<210> 97
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr7:107323898_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 97
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnnt tttccaggtt ggctccata 49
<210> 98
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> chr7:107350577_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 98
tcagacgtgt gctcttccga tctnnnnnng gttgaatatt taccgtttct aaaat 55
<210> 99
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer For
<400> 99
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg c 51
<210> 100
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Index Primer Rev
<400> 100
caagcagaag acggcatacg agatctctta attgactgga gttcagacgt gtgct 55

Claims (7)

1.用于同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的试剂盒，其特征在于，
包括Seq ID No.1-98所示的引物构成的49对引物的混合物用于同时特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的不同亚目标区域；从而同时检测GJB2GJB2基因和SLC26A4基因的变异。
2.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的正反向引物如Seq ID No.99和100所示。
3.权利要求1或2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和/或组装Seq IDNo.1-98所示核苷酸序列的引物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包含合成和/或组装用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的正反向引物如Seq ID No.99和100所示。
5.一种无创检测GJB2和/或SLC26A4基因突变的方法，包括步骤如下：
(1)以受试者血浆DNA为模板；
(2)进行PCR预扩增；
(3)对预扩增产物进行Index PCR二次扩增；
(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；
(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列，将原始模板序列与人类基因组比对，通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯一的模板序列集合；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性；通过计算突变序列与参照序列的比例统计出检测区域体细胞基因突变率；
其特征在于：
预扩增中采用Seq ID No.1-98所示的引物构成的49对引物的混合物用于同时特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的不同亚目标区域；从而同时检测GJB2GJB2基因和SLC26A4基因的变异；
所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基因中的不同区域的DNA片段；
每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；
在所述Index PCR二次扩增中，采用Seq ID No.99和100所示的正反向引物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在进行所述Index PCR扩增之前，对PCR预扩增所得DNA进行磁珠纯化。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在进行所述Index PCR扩增之后，对扩增所得DNA进行磁珠纯化。
CN201810480533.2A 2018-05-18 2018-05-18 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒 Expired - Fee Related CN108949951B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810480533.2A CN108949951B (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810480533.2A CN108949951B (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108949951A true CN108949951A (zh) 2018-12-07
CN108949951B CN108949951B (zh) 2022-01-28

Family

ID=64499860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810480533.2A Expired - Fee Related CN108949951B (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108949951B (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104131008A (zh) * 2014-07-24 2014-11-05 深圳华大基因医学有限公司 Dna标签、pcr引物及其应用
CN104232760A (zh) * 2014-08-26 2014-12-24 深圳华大基因医学有限公司 确定混合测序数据中读段的样本源的方法及装置
CN104561272A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 南京普东兴生物科技有限公司 一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物及其应用
CN105087756A (zh) * 2014-04-23 2015-11-25 北京贝瑞和康生物技术有限公司 一种无创检测胎儿耳聋致病基因突变的方法及试剂盒
CN105936940A (zh) * 2016-06-30 2016-09-14 上海凡迪生物科技有限公司 检测耳聋基因的核酸序列及其应用
WO2016176091A1 (en) * 2015-04-28 2016-11-03 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced dna fragments using redundant reads with unique molecular indices (umis)
CN106554955A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 大连晶泰生物技术有限公司 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
CN107190065A (zh) * 2017-06-06 2017-09-22 广州金域医学检验中心有限公司 检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂的应用
CN107287314A (zh) * 2017-07-07 2017-10-24 深圳华大智造科技有限公司 一种检测遗传性耳聋基因的建库试剂盒和应用
CN107916288A (zh) * 2017-12-16 2018-04-17 普瑞基准科技（北京）有限公司 一种ffpe组织样本的超低频建库方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087756A (zh) * 2014-04-23 2015-11-25 北京贝瑞和康生物技术有限公司 一种无创检测胎儿耳聋致病基因突变的方法及试剂盒
CN104131008A (zh) * 2014-07-24 2014-11-05 深圳华大基因医学有限公司 Dna标签、pcr引物及其应用
CN104232760A (zh) * 2014-08-26 2014-12-24 深圳华大基因医学有限公司 确定混合测序数据中读段的样本源的方法及装置
CN104561272A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 南京普东兴生物科技有限公司 一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物及其应用
WO2016176091A1 (en) * 2015-04-28 2016-11-03 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced dna fragments using redundant reads with unique molecular indices (umis)
CN105936940A (zh) * 2016-06-30 2016-09-14 上海凡迪生物科技有限公司 检测耳聋基因的核酸序列及其应用
CN106554955A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 大连晶泰生物技术有限公司 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
CN107190065A (zh) * 2017-06-06 2017-09-22 广州金域医学检验中心有限公司 检测22个位点耳聋基因多态性的SNaPshot试剂的应用
CN107287314A (zh) * 2017-07-07 2017-10-24 深圳华大智造科技有限公司 一种检测遗传性耳聋基因的建库试剂盒和应用
CN107916288A (zh) * 2017-12-16 2018-04-17 普瑞基准科技（北京）有限公司 一种ffpe组织样本的超低频建库方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
胡华梅等: "新生儿中常见的9个耳聋基因突变位点筛查分析", 《第三军医大学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108949951B (zh) 2022-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022089033A1 (zh) 检测基因突变及表达量的方法及装置
EP4300500A2 (en) Cell-free dna end characteristics
CN106591273B (zh) 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒
KR20210130269A (ko) 대규모 병렬 게놈 서열분석을 이용한 태아 염색체 이수성의 진단 방법
US20160108476A1 (en) Colorectal cancer markers
CN110628891B (zh) 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法
CN106554955B (zh) 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
Bacher et al. Mutational profiling in patients with MDS: ready for every-day use in the clinic?
WO2018147438A1 (ja) Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法
TW201439112A (zh) 用於結核分枝桿菌之基因型鑑定的引子、單核苷酸多態性標記及方法
CN107236037B (zh) 一种突变的msh6蛋白及其编码基因、应用
JP2024020392A (ja) 特定の遺伝子のｃｐｇメチル化変化を利用した肝癌診断用組成物およびその使用
CN108753934A (zh) 一种检测基因突变的方法、试剂盒及其制备方法
CA2901120C (en) Methods and kits for identifying and adjusting for bias in sequencing of polynucleotide samples
WO2023226939A1 (zh) 用于检测结直肠癌淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用
CN108642173A (zh) 一种无创检测slc26a4基因突变的方法和试剂盒
US10053737B2 (en) Methods and compositions for treating cancer by identifying one or more ERK mutations
CN108949951A (zh) 一种同时无创检测gjb2和slc26a4基因突变的方法和试剂盒
CN108841946A (zh) 一种无创检测gjb2基因突变的方法，试剂盒及其制备方法
CN108486230B (zh) 用于无创检测mitf基因突变的试剂盒及其制备方法
WO2020165184A1 (en) Method of determining the origin of nucleic acids in a mixed sample
CN108531583B (zh) 用于无创检测mitf基因突变的引物组合及检测方法
CN109457019B (zh) Kcnh2基因scd相关snp检测试剂盒及检测方法
WO2022188776A1 (zh) 可用于胃癌her2伴随诊断的基因甲基化标记物或其组合和应用
CN109280697A (zh) 利用孕妇血浆游离dna进行胎儿基因型鉴定的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220128