TW201439112A

TW201439112A - 用於結核分枝桿菌之基因型鑑定的引子、單核苷酸多態性標記及方法

Info

Publication number: TW201439112A
Application number: TW102143044A
Authority: TW
Inventors: Shih-Feng Tsai; Chien-Hsing Lin; Horng-Yunn Dou
Original assignee: Nat Health Research Institutes
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2014-10-16
Also published as: MX2015006656A; WO2014082055A2; ZA201503831B; CN104995314A; WO2014082055A3; PH12015501176B1; US11293067B2; PH12015501176A1; TWI647236B; US20180208974A1; US20140162260A1

Abstract

本發明係提供一種用於結核分枝桿菌(M.tuberculosis)之基因型鑑定之引子組，其係選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之一種或多種；亦提供一種用於結核分枝桿菌之基因型鑑定之延伸引子，其係選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之一種或多種。本發明亦提供結核分枝桿菌之單核苷酸多態性標記之組合。本發明進一步提供一種基因型鑑定結核分枝桿菌之方法及套組。

Description

用於結核分枝桿菌之基因型鑑定的引子、單核苷酸多態性標記及方法

本發明係關於引子、SNP標記及檢測結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之方法，尤其是M.tuberculosis之基因型鑑定。

結核病(TB)為全球性的健康議題。世界衛生組織(WHO)已確認結核病為流行病之一，並評估全球約三分之一的人口曾被結核分枝桿菌(M.tuberculosis(MTB))所感染。流行病學研究已證實，不同基因型之MTB可能於不同地區盛行，且基因型分佈係與族群遷徙相關。MTB基因歧異性是否會影響人類疾病之臨床狀況仍未有定論。

MTB菌株H37Rv之完整基因體已於1988年公開，其長度約4Mb，並包含約4000個基因。MTB可被分類為6個主要菌株及15個次要菌株。基因變異係影響MTB之傳播、毒性、抗生素抗藥性及其他特性，因此，用以區分不同MTB分離株之分子技術之發展亦為流行病學之重要關注焦點。

已發展出聚焦於產生親源分析資訊數據之基因型鑑定方法，以調查不同來源之複數臨床樣本。近來，常使用兩種基因型鑑定方法進行結核病傳播之研究(van Deutekom H.et al.,J Clin Microbiol 2005,43(9)：4473-4479)。間格區寡核苷酸分型(spoligotyping)係基於直接重複(DR) 位點之多態性，其由以非重複性間隔序列分開之36-bp之DR重複所組成。其為以PCR為基礎之反雜交技術進行MTB基因型鑑定。攜帶式數據格式可使實驗室之間之比對更易於進行。自公開時日起，基於間格區寡核苷酸分型簽名配對之菌株品系鑑定之免費取得資料庫已被建立(Brudey K et al.,BMC Microbiol 2006,6：23)。其他用於MTB菌株分型之分子技術則以分枝桿菌散置重複單元(MIRU)之不同數量縱列重複(VNTRs)為基礎(Mazars E.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 2001,98(4)：1901-1906；Comas I.et al.,PLoS One 2009,4(11)：e7815；Supply P.et al.,Mol Microbiol 2000,36(3)：762-771)。此方法係基於在該12、15或24個所選MIRU位點中分別所觀察到的重複片段之數目，並以PCR為基礎之方法決定。

然而，習知MTB基因型鑑定方法仍有缺點，包含DNA樣本需求量大、耗時、敏感性及專一性不足、無法對特定菌株進行基因分型。因此，仍須改善MTB基因型鑑定之方法。

本發明係提供一種用於結核分枝桿菌(M.tuberculosis)之基因型鑑定之引子組(primer set)，其係選自由引子組1至25所成群組之一種或多種。

本發明係提供一種用於結核分枝桿菌之基因型鑑定之延伸引子(extension primer)，其係選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之一種或多種。

本發明亦提供一種結核分枝桿菌之單核苷酸多態性標記(single-nucleotide polymorphism marker(SNP))之組合，係選自由SEQ ID No. 76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"、以及SEQ ID No.100之位置301之"C"所成群組之一種或多種。

本發明亦提供一種結核分枝桿菌基因型鑑定之方法，包括取得一檢體；以選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之一種或多種引子組進行擴增(amplify)，並獲得至少一種第一DNA片段；以所得第一DNA片段為模板，並以選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之一種或多種延伸引子進行擴增，並獲得至少一種第二DNA片段；以及，以質譜儀檢測該第二DNA片段。

於其他實施例中，本發明亦提供一種用於結核分枝桿菌基因型鑑定之套組，包括選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之至少一引子組，及選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之至少一延伸引子。

第1圖係選擇品系專一性DNA標記之整體流程圖。

第2圖係顯示MTB基因體中SNP標記之連鎖不平衡。該LD區塊係以Haploview軟體所製作，且區塊之顏色碼係依循Haploview之標準顏色表，藍色表示|D'|=1且LOD<2，鮮紅色表示|D'|=1且LOD2。

第3圖係顯示使用菌株專一性SNP標記之MTB分離株之親源分析。藉由Phylip軟體使用110-SNP數據(A)與25-tagSNP數據(B)以計算奈氏距離，並以鄰聚法建構親源樹。第3圖亦顯示MTB染色體上之SNP位置：110-SNP(C)及25-tagSNP(D)。

第4圖係顯示用於菌株分類之專一性標記鑑定結果。藉由組合間格區寡核苷酸分型及SNP基因型鑑定數據，以確認於51個摩登型北京株、25個荷蘭株、11個東非-印度株、10個原始型北京株、7個T型株及3個拉丁美洲-地中海株之110個SNP之對偶基因之頻率。

第5圖係顯示以四種品系專一性SNP標記為基礎之決定性親源樹。32個品系專一性SNP中的4個具有100%之變異對偶基因之頻率，可用於將81個臨床分離株分類為原始型北京株(Ba)、摩登型北京株(Bm)、東非-印度株(EAI)及拉丁美洲-地中海株(LAM)之品系。

第6圖係顯示歐美品系之高基因歧異度。(A)使用4,419個全基因體SNP標記之歐美菌株之親源分析，以Phylip軟體(鄰聚法)計算奈氏距離而建構親源樹。(B)歐美菌株之主成分分析(PCA)，將4,419個全基因體SNP標記之基因型數據轉換成數值，接著以PCA法使用SAS編程分析該14個歐美臨床分離株及H37Rv標準菌株。

第7圖係顯示以156個結核分枝桿菌分離株之24-MIRU-VNTR基因分型為基礎之最小生成樹。該等圓圈代表以24-MIRU-VNTR基因型分類之不同類型，且依據間格區寡核苷酸分型之分類上色。圓圈尺寸代表特定基因型之分離株之數目(：表示無法以間格區寡核苷酸分型者)。

第8圖係顯示歐美品系之新穎假設性次型之定義，使用4,419個全基因體SNP標記之歐美菌株之親源分析，以Phylip軟體(鄰聚法)計算奈氏距離而建構親源樹。

第9圖係顯示新穎假設性歐美次型中之高度基因同型接合子。14個歐美菌株(7個荷蘭株及7個T型株)以454或HiSeq2000定序儀進行基因體定序，且基於親源樹(第8圖)，該等菌株有兩個主要分群(分別為6個EuAm1次型及7個EuAm2次型)。81個EuAm1-專一性之SNP及133個EuAm2-專一性之SNP，具有變異對偶基因頻率=100%。

第10圖係顯示該等PCR引子、延伸引子、25個tagSNP之位置及對應之對偶基因，及該多重反應編排。

第11圖係顯示本發明與習知基因型鑑定方法之比較。

於本發明中，用於M.tuberculosis基因型鑑定之引子組係選自由引子組1-25所成群組之一種或多種，各引子組係包含一前置引子(forward primer)與一反置引子(reverse primer)。該等引子組1-25如下所示：引子組1：ACGTTGGATGTTCTGGACGACCTGTCCTAC(SEQ ID No.1)及ACGTTGGATGAGCTGCGCCAAGGTTCGTG(SEQ ID No.2)；引子組2：ACGTTGGATGTTGTAGCTGCCCAAATTGCC(SEQ ID No.3)及ACGTTGGATGGGCTTCAATCTCGGCTTGG(SEQ ID No.4)；引子組3：ACGTTGGATGTATTCAACACCGGCATCGGG(SEQ ID No.5)及ACGTTGGATGTCGCCTGGTCGTGGAAGAAC(SEQ ID No.6)；引子組4：ACGTTGGATGATCGGACAGCAGAAGGCAC(SEQ ID No.7)及ACGTTGGATGACTCCCGCGGAACGTGGTG(SEQ ID No.8)；引子組5：ACGTTGGATGCAACACCGGCAACTTCAAC(SEQ ID No.9)及ACGTTGGATGAATTAGCGTCTCCTCCGTTG(SEQ ID No.10)；引子組6：ACGTTGGATGTCGAACCCGCCGACAAATG(SEQ ID No.11)及ACGTTGGATGTCGATTGGTCGCATGCACTG(SEQ ID No.12)；引子組7：ACGTTGGATGAAACCTCGGCATAGGGATCG(SEQ ID No.13)ACGTTGGATGTCGACAGGACTATTGGTAGC及(SEQ ID No.14)；引子組8：ACGTTGGATGAAGACGACGGGCCGGATATG(SEQ ID No.15)及ACGTTGGATGCGTCAAGAGCTTCCCAAATC(SEQ ID No.16)；引子組9：ACGTTGGATGCATCCGGGAACACCGTAAAC(SEQ ID No.17)及ACGTTGGATGATCACCTTCTTATCGGGTGG(SEQ ID No.18)；引子組10：ACGTTGGATGCCTGGATTTCAGATATTGCC(SEQ ID No.19)及ACGTTGGATGTGGCCAGCCCTAGCAAGTC(SEQ ID No.20)；引子組11：ACGTTGGATGAGAACAAACGCGGGATTCAC(SEQ ID No.21)及ACGTTGGATGTCTCCCGGAGATCACCATTC(SEQ ID No.22)；引子組12：ACGTTGGATGGTTGTTTTTGGCCGGGCAG(SEQ ID No.23)及ACGTTGGATGATCGAGCAGACTCAGCGCTT(SEQ ID No.24)；引子組13：ACGTTGGATGTGCTACCGCCAATGTTCAAC(SEQ ID No.25)及ACGTTGGATGATGGCGTTGACATAACTCGG(SEQ ID No.26)；引子組14：ACGTTGGATGATAGCAAGCACGATTGCGAC(SEQ ID No.27)及ACGTTGGATGACCCCCCGCTGAGGGCGTA(SEQ ID No.28)；引子組15：ACGTTGGATGGATTCGATTGGGGAAACGGC(SEQ ID No.29)及ACGTTGGATGTTCCACATTGGTGATCAGCG(SEQ ID No.30)；引子組16：ACGTTGGATGCAAACGGCGTCACTTTGGTC(SEQ ID No.31)及ACGTTGGATGTGAAATGTGGGCCCAAGACG(SEQ ID No.32)；引子組17：ACGTTGGATGCGATTTCGATCGGGATGTTG(SEQ ID No.33)及ACGTTGGATGCAATCACGATCCCCTCAATC(SEQ ID No.34)；引子組18：ACGTTGGATGAGGCAAAGGAAAATCGACCG(SEQ ID No.35)及ACGTTGGATGTTGACAAACTGAAACACCGC(SEQ ID No.36)；引子組19：ACGTTGGATGACAACCGGCCGCAGCGTTT(SEQ ID No.37)及ACGTTGGATGAAGAACACCGAAAGTGGCTG(SEQ ID No.38)；引子組20：ACGTTGGATGTGCATTGGCCACTAAAGCTC(SEQ ID No.39)及ACGTTGGATGTCGATGACTATCTGCGGATG(SEQ ID No.40)；引子組21：ACGTTGGATGACCCATTTGCCGAACGTGTC(SEQ ID No.41)及ACGTTGGATGTGCTTGGCGACTTTGTGCAG(SEQ ID No.42)；引子組22：ACGTTGGATGAGCGTGAAGAAGACGACGA(SEQ ID No.43)及ACGTTGGATGGTCTGTTGTCATTACGGGAG(SEQ ID No.44)；引子組23：ACGTTGGATGACATCAGGTGATGGTCATGC(SEQ ID No.45)及ACGTTGGATGCGAAGGGAACAATGGATGTG(SEQ ID No.46)；引子組24：ACGTTGGATGTATGCCAACCGATTTGCCTG(SEQ ID No.47)及ACGTTGGATGACATATTGTCCACCGCGTAG(SEQ ID No.48)；及引子組25：ACGTTGGATGTCTTGGCAGCGGCATGGAC(SEQ ID No.49)及ACGTTGGATGCCGAATTTCCAGTCTCACAG(SEQ ID No.50)。

該引子組可應用於聚合酶連鎖反應，以擴增含有M.tuberculosis之單核苷酸多態性標記(SNP)之DNA片段。該等引子組可單獨使用或組合使用。於一些實施例中，該引子組之組合可同時置於一試管中進行PCR。於一些實施例中，可同時使用選自引子組1-12之任意之組合。於一些實施例中，可同時使用選自引子組13-22之任意之組合。於一些實施例中，可同時使用選自引子組23-25之任意之組合。

於本發明中，用於M.tuberculosis基因型鑑定之延伸引子，係選自SEQ ID Nos.51-75。該等延伸引子係如下所列：GACCTGTCCTACGAACCGGTGATGG(SEQ ID No.51)，CGTTGCCCACGTTGTTGGCG(SEQ ID No.52)，CACCGGCCAACGTCTCGGGCATG(SEQ ID No.53)，CCCCCGACCGGCCGTTCTTCG(SEQ ID No.54)，TTCAACGGCGGCATCAT(SEQ ID No.55)，GCCGAAACAAGATTTGC(SEQ ID No.56)，CCTTCTGCGTCTCCAAT(SEQ ID No.57)，GATATGGGGCCGCGGAT(SEQ ID No.58)，ACCGTAAACGGGCCTAACCCTCC(SEQ ID No.59)，TTGGGGCTGGGAACTGGG(SEQ ID No.60)， ATTCACGTGAAAACCCTCG(SEQ ID No.61)，AGCTCAGCGCGCGGCTGGTGT(SEQ ID No.62)，CAAAATACGGCGATCATCATGGG(SEQ ID No.63)，CCACCAGTACTTGCCGC(SEQ ID No.64)，ATCGGGGTGACGATGAG(SEQ ID No.65)，GCCGAGGAGCCCGCGTAACCGT(SEQ ID No.66)，TGTTGATCGGCCCGAGGC(SEQ ID No.67)，GCGGGCGTGGAACGCTGGTC(SEQ ID No.68)，AGCGTTTCCAGGTCACCGCA(SEQ ID No.69)，CCAGAGCGCAACAACAA(SEQ ID No.70)，CACGCTGGCATCAAGTTC(SEQ ID No.71)，GAAGACGACGAGGACGACTGGG(SEQ ID No.72)，GACGATTCCGGGCATGCG(SEQ ID No.73)，TGCCTGCCTGGTATGAC(SEQ ID No.74)，及GGCATGGACGGGATCGG(SEQ ID No.75)。

於一實施例中，該延伸引子可應用於聚合酶連鎖反應，以擴增具有M.tuberculosis之單核苷酸多態性標記(SNP)為終端核苷酸之DNA片段。該等引子可單獨使用或組合使用。於一些實施例中，該等引子之組合可同時置於一試管中進行PCR。

於本發明中，M.tuberculosis之單核苷酸多態性標記係選自：SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置 301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"、以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。詳細序列資訊如下所述。

SEQ ID No.76： SEQ ID No.77： SEQ ID No.78： SEQ ID No.79： SEQ ID No.80： SEQ ID No.81： SEQ ID No.82： SEQ ID No.83： SEQ ID No.84： SEQ ID No.85： SEQ ID No.86： SEQ ID No.87： SEQ ID No.88： SEQ ID No.89： SEQ ID No.90： SEQ ID No.91： SEQ ID No.92： SEQ ID No.93： SEQ ID No.94： SEQ ID No.95： SEQ ID No.96： SEQ ID No.97： SEQ ID No.98： SEQ ID No.99： SEQ ID No.100：

前述M.tuberculosis之單核苷酸多態性標記(SNP)係分別對應於：標準菌株之基因體位置128290之"T"；標準菌株之基因體位置178812之"A"；標準菌株之基因體位置243118之"A"；標準菌株之基因體位置374353之"G"；標準菌株之基因體位置375095之"G"；標準菌株之基因體位置430332之"G"；標準菌株之基因體位置756840之"C"；標準菌株之基因體位置848652之"G"；標準菌株之基因體位置991896之"C"；標準菌株之基因體位置996219之"A"；標準菌株之基因體位置1300047之"A"；標準菌株之基因體位置1810066之"A"；標準菌株之基因體位置1932201之"G"；標準菌株之基因體位置2008738之"A"；標準菌株之基因體位置2165256之"G"；標準菌株之基因體位置2165554之"G"；標準菌株之基因體位置3078579之"A"；標準菌株之基因體位置3157993之"C"；標準菌株之基因體位置3426415之"C"；標準菌株之基因體位置3734189之"T"；標準菌株之基因體位置3797876之"T"；標準菌株之基因體位置3859376之"T"；標準菌株之基因體位置4061113之"T"；標準菌株之基因體位置4221423之"T"；以及標準菌株之基因體位置4352162之"C"。

於本發明中，該標準菌株為M.tuberculosis H37Rv，具有完整基因體序列，編號NC_000962.2。前述基因體序列為公開資訊，已公開於美國國家生物技術資訊中心(NCBI))，可於網址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/57116681？report=fasta查得，該基因體序列標題為"gi57116681/ref.NC_000962.2/Mycobacterium tuberculosis H37Rv chromosome,complete genome"。

表1顯示本發明之SNP標記之詳細資訊。於表1中，「H37Rv基因體位置」指示了各SNP標記於標準菌株染色體上的位置，「參考對偶基因(reference allele)」指示了存在於M.tuberculosis H37Rv菌株中的核苷酸，而「變異對偶基因(variant allele)」則為本發明之SNP標記。

於一些實施例中，不同基因型之M.tuberculosis可具有SNP標記之不同組合。較佳地，該SNP標記之組合係包含至少2種標記，例如3 種、5種、7種、10種、15種、20種、或25種標記。然而，於一些實施例中，前述SNP標記亦可單獨使用。

本發明亦提供一種基因型鑑定結核分枝桿菌(M.tuberculosis)之方法，係包括：取得一檢體；以選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之一種或多種引子組進行擴增，並獲得至少一種第一DNA片段；以所得第一DNA片段為模板，並以選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之一種或多種延伸引子進行擴增，並獲得至少一種第二DNA片段；以及，以質譜儀檢測該第二DNA片段。

於一些實施例中，該方法可進一步包括：以選自表1之單核苷酸多態性標記為基礎，分析該質譜儀數據。

於一較佳實施例中，該質譜儀為基質輔助雷射脫附飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)。

可應用於本方法之檢體之實例包含，但不限於，細菌培養物、鼻涕、痰、唾液、血液、組織或器官切片、活檢(biopsy)等。

本發明進一步提供一種用於結核分枝桿菌(M.tuberculosis)之基因型鑑定之套組，係包括：選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之至少一引子組，及選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之至少一延伸引子。於一些實施例中，該套組可進一步包括以單核苷酸多態性標記為基礎之M.tuberculosis基因型之資料庫，較佳係以表1所示之單核苷酸多態性標記為基礎者。

實施例

為了研究結核菌(MTB)之傳播、毒性、抗生素抗藥性及其他特性，本發明人利用次世代DNA定序技術(next-generation DNA sequencers，購自Roche 454/Illumina GAIIx))將分離自台灣族群之六個菌株之基因體進行定序。以該比較基因體分析為基礎，與標準菌株H37Rv進行比對，於PE/PPE及非-PE/PPE基因家族中分別發現了60個與141個菌株專一性之單核苷酸多態性(SNP)標記。於本發明中，種系專一性(lineage specific)單核苷酸多態性標記係用作標記，以設計出一種新穎的菌株分類架構，並進行該親源分析(phylogenetic analyses)。並將本發明之基因型鑑定方法與現行標準測試、針對156株結核菌群(MTBC)分離株具專一性之間格區寡核苷酸分型(spoligotyping)圖譜進行比較。

材料與方法

細菌菌株及分子分型

MTB分離菌株係由台灣五個綜合醫院(位於四個不同區域)之分枝桿菌實驗室於2004年至2007年間所收集，詳言之，該等菌株收集自台北三軍總醫院(北區)、門諾醫院(東區)、灣橋榮民醫院(中區)、台南胸腔醫院(南區)及高雄榮民總醫院(南區)。用於本發明之細菌菌株，如文獻所載，在台灣MTB多樣性上具有代表性(參考文獻：Chang JR et al.,Clin Microbiol Infect 2011,17(9)：1391-1396；Dou HY et al.,BMC Infect Dis 2008,8：170；Dou HY et al.,Infect Genet Evol 2008,8(3)：323-330；Dou HY et al.,J Microbiol Methods 2009,77(1)：127-129)。以國際標準流程進行間格區寡核苷酸分型及MIRU-VNTR基因型分析。該156株分離株(包括Beijing、EAI、Haarlem、LAM、 T、MANU、及其他未分類菌株)全部均具有所有基因分型數據，能夠用於後續分析。

MTB菌株之基因體定序

六株MTB菌株：W6、M3、M7、A27、A18及M24分別屬於下列基因群：摩登型北京株(modern Beijing)、荷蘭株(Haarlem)、拉丁美洲-地中海株(Latin-American Mediterranean(LAM))、T型株、東非-印度株(EAI)、及原始型北京株(ancient Beijing)。它們代表分離自三個不同台灣族群之臨床菌株之主要類型，並以454焦磷酸定序法進行全基因體定序(參考文獻：Margulies M et al.,Nature 2005,437(7057)：376-380)。利用基因體定序儀(型號：Genome Sequencer 20(GS-20)或Genome Sequencer FLX(GS-FLX)，購自454 Life Sciences,Roche)及500-800鹼基對之散彈槍基因庫(shotgun library)對各菌株以14-28倍定序深度進行TB菌株定序。

以Nextera DNA樣本製備套組(購自Illumina,CA,USA)製備六個MTB荷蘭株及六個T型株之臨床分離株之DNA基因庫，使用HiSeq2000定序儀於流通槽之一通道中進行多重定序(2x100bp)。進行去多重(de-multiplex)程序後，各樣本之平均序列大小為3.38Gb，且與H37Rv標準序列進行圖譜比對(mapping)時，該等樣本之深度範圍為568至1068倍，因此，該等樣本之標準覆蓋度為99.44%至99.82%。

與H37Rv標準序列之圖譜比對

將來自各菌株之454定序原始數據(sff files)收集至一特定資料夾作為讀取來源，以與標準菌株H37Rv之基因體進行調校(align)。H37Rv 基因體序列及已經註釋之基因資訊均可由NCBI ftp位置下載，微生物基因體組裝/註釋計畫(Microbial Genome Assembly/Annotation Projects)，網址為ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/Mycobacterium_tuberculosis_H37Rv_uid57777/。軟體(454 GS Reference Mapper(Roche)software(version 2.3))係用以將454讀取物與該標準序列進行圖譜比對，詳細資訊如表2所示；並於該六個MTB臨床菌株與標準序列之間分別產生高信賴度變異。

具菌株專一性之SNP的選擇

係以包含「高信賴度」變異，以及，具有(a)顯示該等變異、(b)在該變異之兩側均具有至少五個鹼基、(c)於該讀取中具有少數其他分離之序列變異、及(d)於順向具有至少一校准點(aligned)且於反向具有至少一校准點之至少三個非二重複讀取之結果為基礎。另外，只有在所有六個菌株中具有至少三個被涵蓋之讀取，且該變異率高於或等於80%之該等變異點被視為有效。以自製底稿(home-made scripts)將全部六個菌株之圖譜比對結果合併，並將該等有效變異置入MySQL資料庫中進行進一步分析。選擇具菌株專一性(僅見於單一菌株中)的SNP，並分成兩類：PE/PPE蛋白質家族及非PE/PPE。依據該變異之位置，它們可與該編碼序列為同義(synonymous)或非同義。且於非PE/PPE組中，該等變異亦可座落於非編碼序列，此為基因間區域(intergenic region)。為了以MassARRAY分析儀(購自Sequenom)進一步確認，係以各變異點之全深度及變異深度均高於15且變異頻率必須高於90%之標準，以減少該變異之數量。

對於Illumina HiSeq2000定序數據之SNP叫喚(SNP calling)，係以軟體(CLC Genomics Workbench software，購自Aarhus,Denmark)及默認參數分析各樣本之輿圖比對序列數據。並應用額外濾器以鑑定出具有高於30倍深度及>95%變異頻率之高度信賴之SNP。

以MassArray系統為基礎之SNP基因型鑑定

以軟體(MassArray Assay Design 3.1 software，購自Sequenom,San Diego,CA)設計出60個PE/PPE及60個任選非PE/PPE之SNP之PCR及延伸引子，其中五個因序列艱困而被排除。PCR係於384孔平盤中，以每孔體積5ul、1pmol之對應引子、5ng之基因體DNA、及試劑(HotStar reaction Mix，購自Qiagen)進行。每樣本需要三孔。PCR條件如下：94℃為15分鐘(min)，接著為94℃(20秒(s))、56℃(30s)、72℃(60s)之40個週期，及最終延伸為72℃達3min。於引子延伸流程中，各樣本係以94℃變性，接著為94℃(5s)、52℃(5s)、72℃(5s)之40個週期。以MassARRAY質譜儀(購自Sequenom) 擷取由時間解析光譜所得之質譜，各光譜接著以軟體(SpectroTYPER software，購自Sequenom)分析以進行基因型叫喚。於該基因型全像分析後，五個SNP之串聯圖樣(clustering patterns)無法用於正確執行基因型叫喚，且最終以110個SNP(57個PE/PPE及53個非PE/PPE)之數據進行後續分析。

連鎖不平衡及親源分析

如第2圖所示，以haploview軟體為基礎，使用Lewontin D’測量以評估該連鎖不平衡(LD)之標記間係數。以額外嚴格標準，即各對標記之間為r2=1，從110個SNP中選出25個tagSNP。以SNP數據應用Phylip軟體計算奈氏距離(Nei’s distance)，接著以鄰聚法建構親源樹。

結果

六株MTB臨床分離株之基因體定序

選擇品系專一性DNA標記之整體方案係如第1圖之流程圖所示。基於本發明人先前對於台灣MTB菌株之研究(參考文獻Dou,et al)，本案選擇代表性菌株進行全基因體定序。該等細菌之起始分組係以間格區寡核苷酸分型及MIRU為基礎，並考量該等感染MTB之患者之族群背景。本案採用454技術以全基因體散彈槍法產生高覆蓋度序列。將該代表性菌株之基因體序列與該標準菌株比較，以產生各分離株之變異序列。以總數120個的SNP形成一基因型鑑定平台，用以調查150個額外的臨床分離株，該等分離株已利用間格區寡核苷酸分型及MIRU兩者鑑定過。在親源分析及決定樹之分析後，將該等156個分離株(6+150)以所選標記分群。為了改善該基因型鑑定平台並擴展所選品系專一性SNP之基礎，將無法以最小化之SNP標記組分類者進一步定序。接著將該定序數據用於比較性分析，以將該流程精細化。為了獲得來自當地族群之代表性MTB菌株之基因體內容，且解析它們與標準菌株H37Rv之相異處，本案以454平台對六個分離株進行全基因體散彈槍定序。將三個分離株W6、M3、M7藉由454 GS20定序儀以96鹼基對之平均讀取長度進行定序。以建構之該定序技術，將另外三個分離株A27、A18、M24藉由454 FLX定序儀以較長的平均讀取長度227鹼基對及較少回合的定序實驗進行定序。該等定序深度於454 GS20數據中為約14X~23X，而於454 FLX數據中為約16X~28X。

該圖譜比對結果摘要如表3。六個分離株均得到至少95.8%之可比對讀取點，覆蓋該標準序列之97%以上。以454 GS20定序之三個分離株之片段重疊(contig)總數為214~305，而以454 FLX定序之三者則為290~299。以454 GS20定序之三個分離株之較大片段重疊(>=1,000bp)之數量為134~158，而以454 FLX定序之三者則為196~200，表示以454 FLX定序之三個分離株之較大片段重疊比率較高。於該六個分離株中，較大片段重疊之Phred分數40以上(Q40Bases)之鹼基質量為99.48%至99.95%，表示該定序質量夠高。

表3、六株MTB臨床分離株之基因體定序及比對結果

該等MTB臨床分離株之基因變異

由該六個分離株之圖譜比對結果，共取得9,003個高信賴度(HC)變異(關於HC變異之定義，請參方法章節)，包括單核苷酸多態性(SNP)、多核苷酸多態性(MNP)、插入及缺失(INDEL)。以至少一個分離株具有超過80%之變異頻率，且依標準序列位置將該等變異進行排列後，共有3,819個標準位置，為該六個分離株均有至少三個讀點涵蓋該位置。為了簡化，選擇僅包含SNP之3,582個標準位置進行下列分析(其他27個位置為INDEL且210個位置為MNP)。

於該等3,582個SNP中，404個SNP共存於所有六個分離株中，且各有13、19、232、538個SNP共存於其中五個、四個、三個及兩個分離株中(詳見表4)。最多數SNP為2,376個菌株專一性者(HC變異僅存在於該六個菌株中的一個)，並以其作為尋找品系專一性SNP之候選者。依照該等候選SNP座落於編碼區或非編碼區而分為三種主要類型：PE/PPE基因家族、非PE/PPE基因家族、及基因間SNP(如表2所示)。針對位於編碼區之該等SNP，除了M7分離株以外，非同義SNP相較於同義SNP似乎具有同等或更多數量。且，該兩種新穎基因家族PE/PPE之存在係包括約10%之TB基因體之編碼能力，因此PE/PPE家族中的SNP數量一般會大幅少於位於其他非PE/PPE基因家組中者。A18(屬於EAI品系)的專一性SNP數量，係高於其他五個分離株4~10倍，推測該品系可能具有較高突變率，可快速適應其宿主環境之改變。

156個M.tuberculosis臨床分離株之SNP基因型鑑定

為了進行156個臨床分離株之SNP鑑定以進行親源分析，選出具有高信賴度分數之120個品系專一性SNP進行引子設計，以進行Sequenom MassArray分析。該120個品系專一性SNP係由六個品系樣本中不均等選出，如表5所示，此係因在該等樣本之間的品系專一性SNP總數不同所致。將該120個品系專一性SNP分成兩類：[5]PE/PPE基因家族中的60個SNP全部；[8]60 of非PE/PPE基因家族的1,215個非同義SNP中的60個(詳如表6所示)。120個SNP中有5個，因為GC含量過高及/或引子雙聚物，而無法於Sequenom基質輔助雷射脫附飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)系統中設計引子。120個SNP中的115個被設計成10個多重反應，並於156個臨床M.tuberculosis分離株中進行基因型鑑定。其中五個SNP因叫喚率低(<95%)及串聯圖譜差而被排除，其餘110個SNP則用於後續分析。與Sequenom及454定序數據比較，偽陽性及偽陰性率均為0%，且於156個樣本中之該110個SNP各自的平均叫喚率為97%。基於連鎖不平衡分析，於該等SNP及MTB基因體之間具有很強的關連性，如第2圖所示。該110個品系專一性SNP係以25 tagSNP且r2=1進行完全標籤(tag)。

MTB分離株之親源及分群分析

為了追蹤156個臨床分離株之間的關係，以110-SNP或25-tagSNP資訊為基礎而建構親源樹，如第3(A)及3(B)圖所示。該110-SNP及該25-tagSNP之位置係如第3(C)及3(D)圖所示。雖然於此兩種親源樹所用標記總數量並不相同，但25-tagSNP之親源樹的型態與110-SNP之親源樹相同，表示該25個tagSNP足以代表菌株之間的基因差異。以間格區寡核苷酸分型之初步品系資訊為基礎，10個原始型北京株(ancient Beijing)、51個摩登型北京株(modern Beijing)、11個東非-印度株(EAI)、及3個拉丁美洲-地中海株(LAM)被分群至兩種親源樹中的相對應位置。另外，6個無法以間格區寡核苷酸分型之分離株，依據親源樹之節點，則應歸屬於摩登型北京株(n=2)、EAI(n=2)及LAM(n=2)品系。

組合間格區寡核苷酸分型及SNP基因型鑑定數據，可確認於51個摩登型北京株、25個荷蘭株、11個東非-印度株、10個原始型北京株、7個T型株及3個拉丁美洲-地中海株之110個SNP之對偶基因之頻率，如第4圖所示。該110個SNP均於該等菌株中為品系專一性，且於對應品系中展現多態性。重要的是，32個SNP變異係於MTB品系中為一致(表5)；7個SNP於原始型北京株中具有100%之變異對偶基因頻率而為品系專一性、3個於摩登型北京株中、19個於EAI中、且3個於LAM中。該32個SNP分別可用於代表原始型北京株、摩登型北京株、EAI及LAM之MTB品系，可以四種品系專一性SNP標記為基礎，建構出決定性親源樹(第5圖)。以該決定性親源樹為基礎，107個以間格區寡核苷酸分型之分離株中的75個(70%)可被正確地分類至該相對應之品系，且49個無法以間格區寡核苷酸分型之分離株中的6個(10.1%)可被分類至已知的品系。

107個以間格區寡核苷酸分型之分離株中的32個(30%)，以該25個tagSNP僅能勉強分類，且此種分離株均歸屬於歐美品系(以間格區寡核苷酸分型數據，分別分類為25個荷蘭株及7個T型株)。推測於荷蘭株或T型株中存在間格區寡核苷酸分型之高基因異型接合子，造成荷蘭株及T型株於決定性親源樹上(第5圖)無法區分。為了探究歐美品系之基因歧異度，以全基因體定序鑑定六個荷蘭株及六個T型株之基因圖譜。於該十二個歐美菌株中，發現了4,419個SNP(表7)。組合M3、A27(454定序數據)及前述12個樣本(HiSeq2000定序數據)之SNP資訊以建構親源樹及進行主成分分析，並發現以間格區寡核苷酸分型為相同之菌株無法進行良好的分群(第7圖)。重要的是，被用以鑑定品系專一性SNP及建構決定性親源樹之M3及A27分離株(第6圖)，被分為相同的一群；但部分荷蘭株及T型株則與M3及A27不同，決定性親源樹無法區分對此兩種次型。另外，親源樹有兩個主要分群(第8圖)，於此稱為EuAm1次型及EuAm2次型。基於新提出之EuAm次型之假設性定義，於各EuAm次型中具有高同型接合子，如第9圖所示；且僅需要兩個SNP即可將歐美菌株分類為兩種假設性次型。

以25個tagSNP進行MTB之基因型鑑定

如上所述，該25個tagSNP可良好的代表菌株之間的基因變異。以軟體(MassArray Assay Design 3.1 software，購自Sequenom,San Diego,CA)設計出25個tagSNP之PCR引子及延伸引子。第10圖顯示前述PCR引子、延伸引子、25個tagSNP之位置及對應之對偶基因。PCR係於384孔平盤中，以每孔體積5ul、1pmol之對應引子、5ng之基因體DNA、及試劑(HotStar reaction Mix，購自Qiagen)進行。每樣本需要三孔。PCR條件如下：94℃為15分鐘(min)，接著為94℃(20秒(s))、56℃(30s)、72℃(60s)之40個週期，及最終延伸為72℃達3min。於引子延伸流程中，各樣本係以94℃變性，接著為94℃(5s)、52℃(5s)、72℃(5s)之40個週期。以MassARRAY質譜儀(購自Sequenom)擷取由時間解析光譜所得之質譜，各光譜接著以軟體(Sequenom TYPER software，購自Sequenom)分析以進行SNP基因型叫喚。

討論

結核病在台灣及全世界仍為一主要公共衛生議題。在過去幾年間，用於分子流行病學研究之基因型鑑定方法之發展有助於瞭解MTB在人類族群的傳播。菌株分類至次品系(sub-lineage)係提供MTB菌株之基因變異之表型結果之觀點。MTB菌株之親源分析亦提供對於MTB演化及不同演化分枝存在的新觀點。由公共健康觀點，決定MTB臨床分離株之基因變異最理想的方法應為簡單、可負擔、具有迅速的周轉時間、且結果應能轉換成易於在實驗室之間分享之格式。本發明設計出品系專一性標記之選擇流程，藉由基因體定序、比較性分析、及以DNA質譜法進行基因型鑑定，以及，亦驗證了此種新穎分類方式之實用性及正確性。由於其實驗室操作迅速容易，且資料格式簡單而易於交換及比較，本發明之流程具有成為新標準方法之潛力。對於有效率之感染控制政策，本發明確實有價值。

雖然間格區寡核苷酸分型分析為一直接明確之技術，但其較IS6110 RFLP具有較低之鑑別率，且其為一繁瑣耗時之流程。即使以間格區寡核苷酸分型為基礎之菌株分類於約90%的案例中可將MTBC菌株歸類至正確的親源品系，但對於部分菌株仍無法進行分類，且本研究中顯示也可能分類錯誤(第7圖)。MIRU-VNTR位置之分析為可重複及高敏感性，且其提供了較間格區寡核苷酸分型更佳的方案。然而，依其脈絡，此種方式之鑑別性可能低於或等於IS6110 RFLP。菌株專一性SNP分型可提供精確的以序列為基礎的資訊，且可被自動化，以供分子流行病學及親源分析之大型研究。間格區寡核苷酸分型及MIRU分型之組合可被視為TB菌基因型鑑定之最省成本之方法。然而，間格區寡核苷酸分型對於約20-40%之菌株仍無法分類，且沒有填補該缺點之方案。所提出之MIRU-VNTR分型方法無法有效地區分包括多株北京型株之M.tuberculosis菌株。故，於北京型菌株盛行之地區，可能無法將此分型方法應用於主要流行病學研究。在不進行RFLP分析下，以VNTR作為例行性流行病學工具時，加入數個VNTR位置為必要。

欲瞭解傳播動態，對於M.tuberculosis分離株之額外基因型鑑定為必須。對於傳播動態及加強典型流行病學模式，基因資訊能協助決定精確的量化測量。評估種間基因關連性之能力係提供一種有力方式以解決多數流行病學議題，如：追蹤傳播鏈、決定感染源、由復發或治療失敗之再活化及再感染區分近期傳播、檢測實驗室交叉污染、監測特定基因型菌株(包含具特定流行病學重要性者)之地理分佈及散佈、或研究M.tuberculosis.之演化。

所提出之品系專一性DNA標記之選擇之流程(第1圖)為一有效且具邏輯性之方式，將MTB分離株區分為基因型次型。重要的是，本發明之流程亦可應用至微生物計畫之其他方面，如搜尋不同臨床分離株之高保留性區段(domain)以發展疫苗。

第11圖顯示本發明與習知基因型鑑定方法之比較。對於本發明之25-tagSNP之基因型鑑定方法，檢測所需樣本可低至20ng之用於PCR之DNA樣本。基於MALDI-TOF技術，序列檢測之專一性及敏感性幾乎能達到100%；然而，基於習知PCR為基礎之間格區寡核苷酸分型及MIRU則否。藉由使用本發明之25-tagSNP之基因型鑑定方法，192個樣本之檢測可於48小時之內完成。據此，本發明之25-tagSNP之基因型鑑定方法之優點包括優異的專一性及敏感性、較低的樣本要求、可快速且大量檢測。

上述特定實施例之內容係為了詳細說明本發明，然而，該等實施例係僅用於說明，並非意欲限制本發明。熟習本領域之技藝者可理解，在不悖離後附申請專利範圍所界定之範疇下針對本發明所進行之各種變化或修改係落入本發明之一部分。

<110> 財團法人國家衛生研究院

<120> 用於結核分枝桿菌之基因型鑑定的引子、單核？酸多態性標記及方法

<140> TW 102143044

<141> 2013-11-26

<150> US 61/730,033

<151> 2012-11-26

<160> 100

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組1：順向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組1：反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組2：順向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組2：反向引子

<400> 4

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組3：順向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組3：反向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組3：順向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組4：反向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組5：順向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組5：反向引子

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組6：順向引子

<400> 11

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組6：反向引子

<400> 12

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組7：順向引子

<400> 13

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組7：反向引子

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組8：順向引子

<400> 15

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組8：反向引子

<400> 16

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組9：順向引子

<400> 17

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組9：反向引子

<400> 18

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組10：順向引子

<400> 19

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組10：反向引子

<400> 20

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組11：順向引子

<400> 21

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組11：反向引子

<400> 22

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組12：順向引子

<400> 23

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組12：反向引子

<400> 24

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組13：順向引子

<400> 25

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組13：反向引子

<400> 26

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組14：順向引子

<400> 27

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組14：反向引子

<400> 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組15：順向引子

<400> 29

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組15：反向引子

<400> 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組16：順向引子

<400> 31

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組16：反向引子

<400> 32

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組17：順向引子

<400> 33

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組17：反向引子

<400> 34

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組18：順向引子

<400> 35

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組18：反向引子

<400> 36

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組19：順向引子

<400> 37

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組19：反向引子

<400> 38

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組20：順向引子

<400> 39

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組20：反向引子

<400> 40

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組21：順向引子

<400> 41

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組21：反向引子

<400> 42

<210> 43

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組22：順向引子

<400> 43

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組22：反向引子

<400> 44

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組23：順向引子

<400> 45

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組23：反向引子

<400> 46

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組24：順向引子

<400> 47

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組24：反向引子

<400> 48

<210> 49

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 引子組25：順向引子

<400> 49

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 引子組25：反向引子

<400> 50

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> 延伸引子

<400> 51

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 延伸引子

<400> 52

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> 延伸引子

<400> 53

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 延伸引子

<400> 54

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 55

<210> 56

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 56

<210> 57

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 57

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 58

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> 延伸引子

<400> 59

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 延伸引子

<400> 60

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 延伸引子

<400> 61

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 延伸引子

<400> 62

<210> 63

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> 延伸引子

<400> 63

<210> 64

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 64

<210> 65

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 65

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 延伸引子

<400> 66

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 延伸引子

<400> 67

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 延伸引子

<400> 68

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 延伸引子

<400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 70

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 延伸引子

<400> 71

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 延伸引子

<400> 72

<210> 73

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 延伸引子

<400> 73

<210> 74

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 74

<210> 75

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 延伸引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> 延伸引子

<400> 75

<210> 76

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 76

<210> 77

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 77

<210> 78

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 78

<210> 79

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 79

<210> 80

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 80

<210> 81

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 81

<210> 82

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 82

<210> 83

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 83

<210> 84

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 84

<210> 85

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 85

<210> 86

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 86

<210> 87

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 87

<210> 88

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 88

<210> 89

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 89

<210> 90

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 90

<210> 91

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 91

<210> 92

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 92

<210> 93

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 93

<210> 94

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 94

<210> 95

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 95

<210> 96

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 96

<210> 97

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 97

<210> 98

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 98

<210> 99

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 99

<210> 100

<211> 601

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> variation

<222> (301)..(301)

<223> 單核？酸多態性標記

<400> 100

Claims

一種用於結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之基因型鑑定之引子組，係選自由下列所成群組之一種或多種：引子組1：ACGTTGGATGTTCTGGACGACCTGTCCTAC(SEQ ID No.1)及ACGTTGGATGAGCTGCGCCAAGGTTCGTG(SEQ ID No.2)；引子組2：ACGTTGGATGTTGTAGCTGCCCAAATTGCC(SEQ ID No.3)及ACGTTGGATGGGCTTCAATCTCGGCTTGG(SEQ ID No.4)；引子組3：ACGTTGGATGTATTCAACACCGGCATCGGG(SEQ ID No.5)及ACGTTGGATGTCGCCTGGTCGTGGAAGAAC(SEQ ID No.6)；引子組4：ACGTTGGATGATCGGACAGCAGAAGGCAC(SEQ ID No.7)及ACGTTGGATGACTCCCGCGGAACGTGGTG(SEQ ID No.8)；引子組5：ACGTTGGATGCAACACCGGCAACTTCAAC(SEQ ID No.9)及ACGTTGGATGAATTAGCGTCTCCTCCGTTG(SEQ ID No.10)；引子組6：ACGTTGGATGTCGAACCCGCCGACAAATG(SEQ ID No.11)及ACGTTGGATGTCGATTGGTCGCATGCACTG(SEQ ID No.12)；引子組7：ACGTTGGATGAAACCTCGGCATAGGGATCG(SEQ ID No.13)ACGTTGGATGTCGACAGGACTATTGGTAGC及(SEQ ID No.14)；引子組8：ACGTTGGATGAAGACGACGGGCCGGATATG(SEQ ID No.15)及ACGTTGGATGCGTCAAGAGCTTCCCAAATC(SEQ ID No.16)；引子組9：ACGTTGGATGCATCCGGGAACACCGTAAAC(SEQ ID No. 17)及ACGTTGGATGATCACCTTCTTATCGGGTGG(SEQ ID No.18)；引子組10：ACGTTGGATGCCTGGATTTCAGATATTGCC(SEQ ID No.19)及ACGTTGGATGTGGCCAGCCCTAGCAAGTC(SEQ ID No.20)；引子組11：ACGTTGGATGAGAACAAACGCGGGATTCAC(SEQ ID No.21)及ACGTTGGATGTCTCCCGGAGATCACCATTC(SEQ ID No.22)；引子組12：ACGTTGGATGGTTGTTTTTGGCCGGGCAG(SEQ ID No.23)及ACGTTGGATGATCGAGCAGACTCAGCGCTT(SEQ ID No.24)；引子組13：ACGTTGGATGTGCTACCGCCAATGTTCAAC(SEQ ID No.25)及ACGTTGGATGATGGCGTTGACATAACTCGG(SEQ ID No.26)；引子組14：ACGTTGGATGATAGCAAGCACGATTGCGAC(SEQ ID No.27)及ACGTTGGATGACCCCCCGCTGAGGGCGTA(SEQ ID No.28)；引子組15：ACGTTGGATGGATTCGATTGGGGAAACGGC(SEQ ID No.29)及ACGTTGGATGTTCCACATTGGTGATCAGCG(SEQ ID No.30)；引子組16：ACGTTGGATGCAAACGGCGTCACTTTGGTC(SEQ ID No.31)及ACGTTGGATGTGAAATGTGGGCCCAAGACG(SEQ ID No.32)；引子組17：ACGTTGGATGCGATTTCGATCGGGATGTTG(SEQ ID No.33)及ACGTTGGATGCAATCACGATCCCCTCAATC(SEQ ID No. 34)；引子組18：ACGTTGGATGAGGCAAAGGAAAATCGACCG(SEQ ID No.35)及ACGTTGGATGTTGACAAACTGAAACACCGC(SEQ ID No.36)；引子組19：ACGTTGGATGACAACCGGCCGCAGCGTTT(SEQ ID No.37)及ACGTTGGATGAAGAACACCGAAAGTGGCTG(SEQ ID No.38)；引子組20：ACGTTGGATGTGCATTGGCCACTAAAGCTC(SEQ ID No.39)及ACGTTGGATGTCGATGACTATCTGCGGATG(SEQ ID No.40)；引子組21：ACGTTGGATGACCCATTTGCCGAACGTGTC(SEQ ID No.41)及ACGTTGGATGTGCTTGGCGACTTTGTGCAG(SEQ ID No.42)；引子組22：ACGTTGGATGAGCGTGAAGAAGACGACGA(SEQ ID No.43)及ACGTTGGATGGTCTGTTGTCATTACGGGAG(SEQ ID No.44)；引子組23：ACGTTGGATGACATCAGGTGATGGTCATGC(SEQ ID No.45)及ACGTTGGATGCGAAGGGAACAATGGATGTG(SEQ ID No.46)；引子組24：ACGTTGGATGTATGCCAACCGATTTGCCTG(SEQ ID No.47)及ACGTTGGATGACATATTGTCCACCGCGTAG(SEQ ID No.48)；及引子組25：ACGTTGGATGTCTTGGCAGCGGCATGGAC(SEQ ID No.49)及ACGTTGGATGCCGAATTTCCAGTCTCACAG(SEQ ID No.50)。
如申請專利範圍第1項之引子組，其係用於聚合酶連鎖反應，以擴增含有結核分枝桿菌之單核苷酸多態性標記(SNP)之DNA片段。
一種用於結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之基因型鑑定之延伸引子，係選自由下列所成群組之一種或多種：GACCTGTCCTACGAACCGGTGATGG(SEQ ID No.51)、CGTTGCCCACGTTGTTGGCG(SEQ ID No.52)、CACCGGCCAACGTCTCGGGCATG(SEQ ID No.53)、CCCCCGACCGGCCGTTCTTCG(SEQ ID No.54)、TTCAACGGCGGCATCAT(SEQ ID No.55)、GCCGAAACAAGATTTGC(SEQ ID No.56)、CCTTCTGCGTCTCCAAT(SEQ ID No.57)、GATATGGGGCCGCGGAT(SEQ ID No.58)、ACCGTAAACGGGCCTAACCCTCC(SEQ ID No.59)、TTGGGGCTGGGAACTGGG(SEQ ID No.60)、ATTCACGTGAAAACCCTCG(SEQ ID No.61)、、AGCTCAGCGCGCGGCTGGTGT(SEQ ID No.62)、CAAAATACGGCGATCATCATGGG(SEQ ID No.63)、CCACCAGTACTTGCCGC(SEQ ID No.64)、ATCGGGGTGACGATGAG(SEQ ID No.65)、 GCCGAGGAGCCCGCGTAACCGT(SEQ ID No.66)、TGTTGATCGGCCCGAGGC(SEQ ID No.67)、GCGGGCGTGGAACGCTGGTC(SEQ ID No.68)、AGCGTTTCCAGGTCACCGCA(SEQ ID No.69)、CCAGAGCGCAACAACAA(SEQ ID No.70)、CACGCTGGCATCAAGTTC(SEQ ID No.71)、、GAAGACGACGAGGACGACTGGG(SEQ ID No.72)、GACGATTCCGGGCATGCG(SEQ ID No.73)、TGCCTGCCTGGTATGAC(SEQ ID No.74)、以及GGCATGGACGGGATCGG(SEQ ID No.75)。
如申請專利範圍第3項之延伸引子，其係用於聚合酶連鎖反應，以擴增具有結核分枝桿菌之單核苷酸多態性標記(SNP)為終端核苷酸之一DNA片段。
一種結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之單核苷酸多態性標記之組合，係選自由SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"、以及SEQ ID No.100之位置301之"C"所成群組之一種或多種。
一種基因型鑑定結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之方法，係包括：取得一檢體；以選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之一種或多種引子組進行擴增，並獲得至少一種第一DNA片段；以所得第一DNA片段為模板，並以選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之一種或多種延伸引子進行擴增，並獲得至少一種第二DNA片段；以及，以質譜儀檢測該第二DNA片段。
如申請專利範圍第6項之方法，進一步包括：以單核苷酸多態性標記為基礎，分析該質譜儀數據；該單核苷酸多態性標記係選自由下列結核分枝桿菌之單核苷酸多態性標記所成群組之一種或多種之組合：SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、 SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"、以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。
如申請專利範圍第6項之方法，其中，該質譜儀係基質輔助雷射脫附飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)。
如申請專利範圍第6項之方法，其中，該檢體係細菌培養物、鼻涕、痰、唾液、血液、組織或器官切片、及/或活檢。
一種用於結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之基因型鑑定之套組，係包括：選自由引子組1至25(SEQ ID Nos.1至50)所成群組之至少一引子組，及選自由SEQ ID Nos.51至75所成群組之至少一延伸引子。
如申請專利範圍第10項之套組，其進一步包括：以單核苷酸多態性標記為基礎之結核分枝桿菌基因型之資料庫。
如申請專利範圍第11項之套組，其中，該單核苷酸多態性標記係選自由下列結核分枝桿菌之單核苷酸多態性標記所成群組之一種或多種之組合：SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"、以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。