CN111916151B - 一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法及应用。本申请的溯源检测方法包括，采用比对软件将待溯源对象基因片段序列比对排列到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中，并构建分子系统进化树；根据待溯源对象的基因片段序列在系统进化树上与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中已溯源的菌株序列的分支聚集结果，判断待溯源对象的溯源信息；苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件包含苜蓿黄萎病菌基因片段序列及各基因片段序列对应菌株的溯源信息。本申请方法，能对苜蓿黄萎病菌来源地、寄主等信息进行溯源；可用于苜蓿黄萎病菌进化规律研究；通过对病原菌来源地、寄主等信息进行溯源，为外来有害生物风险评估提供了参考依据，对海关执法也具有重要意义。

Description

一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法及应用
技术领域
本申请涉及苜蓿黄萎病菌检测领域，特别是涉及一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法及应用。
背景技术
苜蓿黄萎病菌学名：Verticillium albo-atrum Reinke&Berthold，属于无性型真菌(Anamorphic fungi)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢科(Moniliaceae)轮枝孢属(Verticillium)。
苜蓿是一种多年生开花植物，在其感染苜蓿黄萎病菌后会表现出黄化、矮缩、萎凋等症状；感染后第二年的产草量明显下降，统计显示产草量会降低15％～50％；感染第二年的后期至第三年初期，病株会陆续衰弱死亡，大大缩短了苜蓿的产草期。因此，苜蓿黄萎病菌会严重影响苜蓿产量，大大缩短苜蓿草地的使用寿命，影响苜蓿干草及种子的进出口。
苜蓿黄萎病菌传播途径很多，例如，带菌种子、带菌植物材料和昆虫等。其中，带菌种子是苜蓿黄萎病菌远程传播的重要载体，种子外部和内部都能带菌；并且，混杂在种子中的病残体也能带菌传病。带菌昆虫，例如豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、苜蓿象(Hyperapostica)、蝗虫和蕈蚊(Bradysia spp.)都是苜蓿黄萎病菌传播介体；加拿大苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)用苜蓿叶片筑巢也带菌，切叶蜂巢常由加拿大输往欧美，因而也是苜蓿黄萎病菌远距离传病的途径。此外，带菌的苜蓿草制品、晒制干草，以及苜蓿田作业的农业机械、卡车、混杂有其他寄主残屑的种子、牲畜食用病草后的粪便等都是苜蓿黄萎病菌传播的途径。
黄萎轮枝孢侵染苜蓿的菌系寄主较少，但是各地菌株的致病性不一致。目前，苜蓿黄萎病菌的检测主要是基于培养基的病菌形态学鉴定，对于苜蓿黄萎病菌的溯源检测并没有相关的研究和报道。根据国际植物保护公约的建议，在海关检验检疫的工作中，在对苜蓿黄萎病菌进行检测的同时，有必要检测其菌株来源；因此，亟需建立行之有效的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法及其应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法，包括比对排列步骤和溯源判断步骤；比对排列步骤包括，采用比对软件将待溯源对象的基因片段序列比对排列到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中，并采用系统进化树构建软件构建分子系统进化树；溯源判断步骤包括，根据待溯源对象的基因片段序列在系统进化树上与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中已溯源的菌株序列的分支聚集结果，判断待溯源对象的溯源信息；苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件包含苜蓿黄萎病菌的基因片段序列信息以及各基因片段序列对应的苜蓿黄萎病菌菌株的溯源信息。溯源信息主要包括来源地和寄主等信息。
其中，待溯源对象的基因片段序列是与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的菌株序列相同基因片段的序列。可以理解，具体采用待溯源对象怎样的基因片段序列进行溯源检测，是根据所构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件而定的，该苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中具体是什么类型的基因片段，就获取或测序待溯源对象相应的基因片段，例如本申请的一种实现方式中，苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件是由ITS序列构成的，因此，采用待溯源对象的ITS序列进行溯源检测。
需要说明的是，本申请率先提出了苜蓿黄萎病菌的溯源检测，研究并提供了相应的溯源检测方法；采用本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法，可以简单、方便、快速的获得检测对象的溯源信息，例如待测对象的来源地信息、寄主信息等。其中，苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件就是包含了现有所有苜蓿黄萎病菌的用于溯源检测的有效基因片段序列，以及各基因片段序列对应菌株的溯源信息的文件；该文件可以通过现有的统计分析软件获得。但是，为了确保苜蓿溯源检测的质量，本申请的优选方案中，对苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法进行了限定和说明，详见以下技术方案。
优选的，溯源判断步骤具体包括，如果待溯源对象的基因片段序列与已溯源的菌株序列聚为一支，且重复率为100％，即判定待溯源对象与已溯源的菌株具有相同的溯源信息；如果待溯源对象的基因片段序列未与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的任一已溯源的菌株序列聚为一支，则进一步进行网络进化分析；其中，网络进化分析包括，采用网络进化分析软件将待溯源对象的基因片段序列与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的所有已溯源的菌株序列一起进行网络构建；在构建的网络进化图中寻找待溯源对象的基因片段序列的进化分支起源点和方向，确认突变衍化历史；如果待溯源对象的基因片段序列所在的分支起源点具有其它已溯源的菌株序列的方向分支，并且这些其它已溯源的菌株序列的方向分支的溯源信息具有相关性，则判断待溯源对象的溯源信息与已溯源的菌株的溯源信息具有相关性；如果待溯源对象的基因片段序列所在的分支起源点没有其它方向分支，或各方向分支之间没有相关性，则无法判断待溯源对象的溯源信息。
优选的，溯源信息包括来源地信息和寄主信息。
需要说明的是，溯源信息的具体内容可以根据需求进行定义，也可以根据现有数据实际记录的信息进行设定，包括但不仅限于来源地信息和寄主信息。
优选的，比对软件为Mega软件。
优选的，系统进化树构建软件基于Neighbor-joining Tree构建分子系统进化树，Phylogeny Test选择Bootstrap 1000 replicates。
优选的，网络进化分析软件为DnaSP软件或Network软件。
优选的，本申请的溯源检测方法中，苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件采用以下方法构建获得，获取苜蓿黄萎病菌的所有核酸序列及其备注信息，根据核酸序列所在的基因片段进行分类，根据所有核酸序列分析各基因片段的种内遗传距离，结合种内遗传距离和核酸序列备注信息筛选用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段；对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的所有核酸序列进行聚类分析和筛选，选择有效的、具有种内差异的，且溯源信息完整的核酸序列组成待分析核酸序列库；对待分析核酸序列库中的所有核酸序列分别进行系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析；并对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的SNP位点进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析；根据分析结果，将待分析核酸序列库中的所有核酸序列按照溯源信息进行分类排列，即获得苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。
需要说明的是，本申请的关键在于将现有的遗传分析方法和数学运算方法应用到本申请中，从而构建出用于苜蓿黄萎病菌溯源检测的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件；因此，系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析、基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析都可以参考现有的分析方法或软件。其中，系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析三者是基于筛选的基因片段中具有完整的来源地和寄主等溯源信息的核酸序列进行的，作为构成苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的主要内容；基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析，是基于筛选的基因片段中的所有核酸序列进行的，用于验证和确保所构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的有效性。例如，本申请的一种实现方式中，系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析是基于最终筛选的具有完整溯源信息的13条ITS序列进行的；而基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析，则是基于36条ITS序列进行的。可以理解，在要求较低的情况下，可以仅仅通过系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析构建苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件，而不用进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析的验证；甚至在一些粗略的判断中可以仅仅通过系统进化分析、主成分分析和群体遗传结构分析中一种或两种方法构建苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件；当然，相应的所构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的准确性和有效性也可能难以保障。
本申请的另一面公开了一种用于苜蓿黄萎病菌溯源检测的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法包括，获取苜蓿黄萎病菌的所有核酸序列及其备注信息，根据核酸序列所在的基因片段进行分类，根据所有核酸序列分析各基因片段的种内遗传距离，结合种内遗传距离和核酸序列备注信息筛选用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段；对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的所有核酸序列进行聚类分析和筛选，选择有效的、具有种内差异的，且溯源信息完整的核酸序列组成待分析核酸序列库；对待分析核酸序列库中的所有核酸序列分别进行系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析；并对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的SNP位点进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析；根据分析结果，将待分析核酸序列库中的所有核酸序列按照溯源信息进行分类排列，即获得苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。
需要说明的是，本申请中主成分分析和群体遗传结构分析，是两种思路，在本申请的一种实现方式中两者的结果是一致的；由于现有技术中没有任何关于苜蓿黄萎病菌溯源的研究或报道，同时，也受限于材料数量有限，为了确保分析结果的有效性和准确性，以便能够真实的反应物种溯源信息，本申请创造性的采用了两种分析方法。并且，两种方法单独使用，任一种分析方法都会因为自身的局限性导致分析结果片面、不够准确；本申请创造性的将两者结合在一起使用，两者相互佐证，使得最终构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件更真实有效。同样的，基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析，也是为了保证制备的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的有效性，同时选择基因片段序列及其SNP位点进行生物信息分析，可以进一步提高制备方法的准确性和有效性。本申请的一种实现方式中，具体是分析了ITS片段和ITS片段中的SNP位点。
优选的，本申请的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法还包括，通过系统进化树分析和/或网络进化分析对已经制备的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件进行补充或完善，将新的溯源信息或新的菌株核酸序列补充到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中。
需要说明的是，随着苜蓿黄萎病菌检测和研究的发展，可能会发现新的苜蓿黄萎病菌菌株或者新的溯源信息，为了使所构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件能够更好的覆盖所有的苜蓿黄萎病菌，从而更好的进行溯源检测，本申请的优选制备方法中，还包括了将新的溯源信息或新的菌株核酸序列补充到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的步骤。可以理解，新的溯源信息或新的菌株核酸序列可以直接简单的放到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件；但是，为了使苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件更有序、规范，本申请优选的采用系统进化树分析或网络进化分析，或者两者同时使用，将新的溯源信息或新的菌株核酸序列有序的排列到相应的聚集分支或者进化分支起源点和方向上。
可以理解，本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法或者苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件制备方法，其全部或部分功能都可以通过硬件或计算机程序的方式实现。当通过硬件实现时，其硬件包括各个模块，分别用于实现本申请方法的各个步骤或操作。当通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，例如只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现本申请的方法。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现本申请的方法。当本申请的方法中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，然后在处理器执行存储器中的程序时，即可实现本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法或者苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件制备方法的全部或部分功能。
因此，本申请的再一面公开了一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测装置，其包括比对排列模块和溯源判断模块；比对排列模块，包括用于采用比对软件将待溯源对象的基因片段序列比对排列到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中，并采用系统进化树构建软件构建分子系统进化树；溯源判断模块，包括用于根据待溯源对象的基因片段序列在系统进化树上与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中已溯源的菌株序列的分支聚集结果，判断待溯源对象的溯源信息。
需要说明的是，本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测装置，实际上就是通过各个模块实现本申请苜蓿黄萎病菌溯源检测方法的各个步骤，以方便操作和苜蓿黄萎病菌的溯源检测。可以理解，在本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法中，通常涉及到各种软件，例如比对软件、系统进化树构建软件、网络进化分析软件等，本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测装置，将各软件的功能匹配到相应的模块上，直接输入待溯源对象的基因片段序列，就可以自动获得其溯源信息，无需手动操作各个步骤，大大提高了苜蓿黄萎病菌溯源检测的质量和效率。当然，本申请苜蓿黄萎病菌溯源检测装置的各个模块中设计到的参数设置可以参考本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法，或者根据需求参考现有的比对软件、系统进化树构建软件、网络进化分析软件，在此不作具体限定。
优选的，本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测装置还包括苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块；苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块，包括用于获取苜蓿黄萎病菌的所有核酸序列及其备注信息，根据核酸序列所在的基因片段进行分类，根据所有核酸序列分析各基因片段的种内遗传距离，结合种内遗传距离和核酸序列备注信息筛选用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段；对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的所有核酸序列进行聚类分析和筛选，选择有效的、具有种内差异的，且溯源信息完整的核酸序列组成待分析核酸序列库；对待分析核酸序列库中的所有核酸序列分别进行系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析；并对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的SNP位点进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析；根据分析结果，将待分析核酸序列库中的所有核酸序列按照溯源信息进行分类排列，即获得苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。
需要说明的是，对于苜蓿黄萎病菌溯源检测而言，只需要本申请的检测装置中存储有苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件或者可以通过其它方式读取或调用该溯源序列排列文件即可，无需苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块。但是，为了使本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测装置功能更完善，本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测装置还优选的包括苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块。可以理解，在进行苜蓿黄萎病菌溯源检测时，如果已经存在可用的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件，则无需使用苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块；如果苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件损坏或不可用，则需要使用苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块重新构建苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件；再根据所构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件，选取待溯源对象的基因片段序列进行苜蓿黄萎病菌溯源检测。
优选的，苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块，还包括用于通过系统进化树分析和网络进化分析对已经制备的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件进行补充或完善，将新的溯源信息或新的菌株核酸序列补充到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中。
本申请的再一面公开了一种用于苜蓿黄萎病菌溯源检测的装置，该装置包括存储器和处理器；存储器用于存储程序；处理器用于执行存储器存储的程序实现本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法或本申请的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法。
本申请的再一面公开了一种计算机可读存储介质，其包括存储于其中的程序，该程序能够被处理器执行实现本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法或本申请的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法。
本申请的有益效果在于：
本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法，能够对苜蓿黄萎病菌的来源地、寄主等信息进行溯源；可以用于苜蓿黄萎病菌的发生、传播历程研究，以及进化规律研究，对苜蓿黄萎病菌的基础研究具有重要意义；并且，通过对病原菌的来源地、寄主等信息进行溯源，为外来有害生物风险评估提供了参考依据，对海关执法也具有重要意义。
附图说明
图1是本申请实施例中ITS片段K2P遗传距离分布图；
图2是本申请实施例中ITS片段构建的系统进化关系图；
图3是本申请实施例中13个ITS样品的主成分分析结果图；
图4是本申请实施例中筛选的13个ITS样品分群数K value值图；
图5是本申请实施例中群体遗传结构分析的群体结构图，其中，从上至下K值依次为1、2、3、4、5；
图6是本申请实施例中36个样品的PCA聚类图；
图7是本申请实施例中36个样品的系统进化树分析结果图；
图8是本申请实施例中36个样品的另一种形式的系统进化树分析结果图；
图9是本申请实施例中36个样品分群数为1-3的群体结构图，图中每行代表所有个体对应一个分群值时的情况，例如K＝2是表示所有样品在分成两种遗传成分时的群体结构；
图10是本申请实施例中36个样品分群值从1-20的聚类情况，图中为每个K值对应的CV error值。
具体实施方式
分子溯源或称基因溯源在人类、植物、昆虫等方面都有相关研究或报道，但是，在植物病原真菌方面尚没有人提出过植物病原真菌的分子溯源概念，更没有任何研究或报道。本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法，通过苜蓿黄萎病菌的基因片段序列进行溯源检测，率先将分子溯源引入植物病原真菌的溯源检测中；并且，本申请借鉴现有的分子生态学的群体遗传分析软件和工具，创造性的将多个学科的思路和方法有机组合到本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法中，率先实现了苜蓿黄萎病菌的溯源检测。
本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法，满足了IPPC关于植物病原真菌溯源建议的特殊要求，是海关检验检疫的工作特色，采用本申请的溯源检测方法，对病原菌的来源地、寄主等信息进行掌握，为外来有害生物风险评估提供数据材料；同时，本申请溯源检测方法也能用于病原菌的进化规律研究；兼具基础研究和海关执法实际应用双重意义。本申请的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法填补了植物病理学在植物病原真菌分子溯源方面的空白。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备
1.数据来源与处理
本例从NCBI数据库和BOLD下载苜蓿黄萎病菌(Verticillium alba)的核酸序列，其中包括ITS、GPD、18S、28S、tubulin、cytb、EF-1α、NADH、tryptophan等基因片段的核酸序列总计10891条；其中NCBI数据库下载序列10864条，BOLD下载序列27条。
本例进一步使用MEGA软件对下载的序列根据基因分别进行校对，获得排列后文件；并对所有核酸序列进行序列数据整理，包括将核酸序列号、菌株名称、寄主、来源地、文献及作者等信息整理归类。
2.基因比较
2.1遗传距离分析
比较序列数据量、有效数据数量、种内遗传距离等参数。对各基因片段序列排列后，基于K2P-distance，比较种内遗传距离大小。结果如表1所示，遗传距离最大值、平均值大小依次为：EF-1α＞28S＞ITS＞Tubulin＞GPD。18S、cytb、NADH、tryptophan这四种基因片段由于序列信息较少，所以没有进行分析。
表1候选基因片段遗传距离分析
Figure BDA0002594157790000081
Figure BDA0002594157790000091
表1中，数据量是从NCBI下载的全部序列信息，有效数据量是指通过排列的方式对数据的有效性进行筛选后得出的有效数据数量。一般来说，从数据库下载的数据或者说上传者所上传的数据是没有经过筛选的，在选择应用时，首先需要对这些信息的质量、有效性进行评估，例如ITS序列，虽然从数据库下载获得了80条序列，但是，最终初步筛选后仅剩余48条有效数据。
根据表1的结果，结合可以利用的有效数据量等信息，主要是来源地、寄主等信息是否完整等，本例最终决定对ITS片段进行分析，即选择ITS片段作为溯源检测的基因片段。
单独统计ITS片段的遗传距离分布情况，结果如图1所示。图1中，横坐标为K2P遗传距离；图1的结果显示，ITS片段在0-0.005和0.035-0.045区间范围内分布。
2.2 ITS片段筛选
通过Alignment排列对核酸片段有效性、种内差异及溯源信息的完整性进行筛选；其中，溯源信息的完整性主要是指寄主和来源地信息是否完整。最终筛选获得寄主和来源地信息完整的13条有效ITS片段序列可用于后续的溯源分析。13条有效的待分析的ITS片段序列和物种信息如表2所示。
表2候选ITS片段序列和物种信息
简称 序列号 菌株号
canada1 AF108476.1 isolate UAMH 5393 alfalfa canada
canada2 AF364009.1 strain STR1 medicago sativa canada
canada3 AF364010.1 strain STR3 medicago sativa canada
canada4 AF364011.1 strain STR4 medicago sativa canada
canada5 AF364012.1 strain SWB medicago sativa canada
canada6 AF364008.1 strain KRS1 medicago canada
canada7 GQ495790.1 strain Ve002 medicago sativa canada
belgium1 AF364015.1 strain 1201 H.lupulus belgium
Norway1 AF364014.1 strain Va1 L.esculentum netherlands
Norway2 AF364016.1 strain 166 S.tuberosum netherlands
Iran1 AY536044.1 isolate Ir1 alfalfa Iran
Iran2 AY536045.1 isolate Ir2 alfalfa Iran
Iran3 AY536046.1 isolate Ir3 alfalfa Iran
2.3系统进化分析
以“2.2 ITS片段筛选”获得的13条ITS序列为分析对象，基于13条ITS序列的SNP，采用RAxML软件的maximum likelihood算法构建13个ITS序列样品的群体进化树，结果如图2所示。图2的结果显示，canada5、Iran3、Iran1、canada2、canada7、Iran2、canada3、canada1、canada6、canada4为一个近似组群；Norway2虽然与canada5等在一个簇中，但是与canada5等的进化关系较远，单独为一个组群；Norway1和belgium1为一个近似组群；因此，通过系统进化分析将13个ITS序列样品分为3个类群。
2.4主成分分析
主成分分析(PCA)是一种纯数学的运算方法，可以将多个相关变量经过线形转换选出较少个数的重要变量。
本例以“2.2ITS片段筛选”获得的13条ITS序列为分析对象，基于13条ITS序列的SNP，通过PLINK软件进行主成分分析(Principal components analysis，PCA)分析，得到13个ITS序列样品的主成分聚类情况。通过PCA分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。主成分分析结果如图3所示。图3的结果显示，13个ITS序列样品分为3个类群，该结果与“2.3系统进化分析”一致。
2.5群体遗传结构分析
群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。
本例以“2.2ITS片段筛选”获得的13条ITS序列为分析对象，首先，对13条ITS序列的SNP的紧密连锁的位点进行筛选，最终获得SNP。基于最终获得的SNP，通过ADMIXTURE软件，分析13个ITS序列样品的群体结构，分别假设13个样品的分群数(即K值)为1-5，进行聚类；并根据CV error(Cross validation error)最低点对应的K值来确定最佳分群数。结果如图4和图5所示。图4中横坐标为K值，纵坐标为CV error；图5中从上至下K值依次为1、2、3、4、5。图4的结果显示，K为3的时候CV error最小，即CV error最低点对应的K值确定最佳分群数为3，反映了所有13个ITS序列样品来自于3个原始的祖先。图5的结果显示，将13个ITS序列样品分为3个类群时，各样品之间具有较好的区分效果。
2.6 SNP群体遗传分析
本例根据从数据库下载获得了80条ITS序列，分析其SNP位点，进行SNP系统进化树分析和SNP群体遗传分析，以进一步确定和完善苜蓿黄萎病菌的类群，详细如下。
2.6.1 SNP calling
从80条ITS序列中，删除没有SNP位点或者SNP位点不明确的序列，获得60条ITS序列；然后，进一步从60条ITS序列中，删除一模一样的重复序列，得到40条ITS序列；考虑到ITS序列本身是相对保守的序列，如果序列差异太大，很有可能会是测序错误或其它原因导致的不真实信息，因此，再删除了4条序列差异较大的序列；最终用于分析的ITS序列为36条。36条ITS序列具体为：AB353342.1、KU057924.1、DQ266223.1、GQ495790.1、AF108476.1、X60705.1、KJ744367.1、AB458830.1、JQ629956.1、DQ825977.1、AF364015.1、AY555954.1、Z29509.1、AF364014.1、AY555953.1、FJ900212.1、GQ336791.1、GQ336790.1、Z29510.1、GU291258.1、AF364013.1、AF364010.1、Z29508.1、AY536046.1、AF364011.1、AY555955.1、JQ629951.1、AY536045.1、Z29523.1、KC592083.1、DQ825978.1、JQ629954.1、Z29524.1、FJ424082.1、JN187990.1、HE972035.1。
2.6.2 SNP检测和注释
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是基因组上多态性最高的遗传变异之一。本例采用NCBI在线分析软件、Mega或者DNAman对36条ITS序列进行SNP分析检测和注释，最终获得可以用于后续分析的16个SNP位点。
2.6.3 PCA分析
本例以“2.6.2SNP检测和注释”的36条ITS序列的16个SNP位点为分析对象，通过PLINK软件进行主成分分析(Principal components analysis，PCA)分析，得到36个ITS样品的主成分聚类情况，结果如图6所示。图6中，PC1代表第一主成分、PC2代表第二主成分、PC3代表第三主成分，一个点代表一个样品；一般来说，遗传关系较近的个体会聚集在一起。图6的结果显示，通过PCA分析将所有样品聚为三维，即所有样品分为3个类群，该结果与“2.3系统进化分析”和“2.4主成分分析”一致。
2.6.5系统进化树分析
本例以“2.6.2SNP检测和注释”的36条ITS序列的16个SNP位点为分析对象，通过RAxML软件的maximum likelihood算法构建36个ITS序列样品的群体进化树，结果如图7和图8所示。图7和图8都是系统进化树图，只是表达方式不同；图中每个分枝为一个样品，两个临近的分支的连接处成为节点，表示推断祖先的现存类群在树最基部的分支点称为根节，一个单一的共同祖先被定义为进化支或单源群。图7和图8的结果显示，所有36个ITS序列样品来自于3个原始的祖先，该结果与“2.5群体遗传结构分析”一致。
2.6.6群体结构分析
本例以“2.6.1SNP calling”获得的36条ITS序列为分析对象，首先，对36条ITS序列的SNP的紧密连锁的位点进行筛选，最终获得16个SNP位点。基于这些SNP位点，通过ADMIXTURE软件，分析36个ITS序列样品的群体结构，分别假设36个ITS序列样品的分群数(即K值)为1-20，进行聚类；并根据CV error(Cross validation error)最低点对应的K值来确定最佳分群数。结果如图9和图10所示。图9中黑、白、灰不同的柱代表不同的群，每行代表所有个体对应一个分群值时的情况，例如K＝2是表示所有样品在分成两种遗传成分时的群体结构；图10中展示了36个ITS序列样品分群值从1-20的聚类情况。图10为每个K值对应的CV error值，结果显示，K为3时CV error最小，即为最佳K值；也就是说，CV error最低点对应的K值确定最佳分群数为3，反映了所有36个ITS序列样品来自于3个原始的祖先，该结果与前述分析结果一致。根据以上分析，本例最终构建了用于苜蓿黄萎病菌溯源检测的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件部分结果如表3和表4所示。
表3苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的突变位点及序列
Figure BDA0002594157790000121
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Figure BDA0002594157790000131
表4苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的序列信息和菌株信息
Figure BDA0002594157790000132
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Figure BDA0002594157790000141
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Figure BDA0002594157790000151
表3为突变位点及序列，表4是表3中相应序号的位点和序列对应的序列信息和菌株信息。表3中“-”表示空缺，即相应位置无碱基。
二、苜蓿黄萎病菌溯源检测
1.苜蓿黄萎病菌溯源检测
1.1 DNA提取与纯化
本例首先对苜蓿黄萎病菌进行液体培养或平板培养，然后采用CTAB法对基因组DNA进行提取，测定DNA浓度和纯度后，保存于-20℃冰箱备用。DNA提取详细如下：
1)实验器皿于121℃、30min湿热灭菌或180℃干热灭菌1h；
2)从培养基上刮取100mg左右的菌丝体至研钵内，加入液氮充分研磨，加入4mL预热的CTAB抽提液；
3)将离心管放入水浴锅前先振荡1min，然后放入65℃水浴锅水浴15min，每隔3min～5min振荡一次；
4)加三氯甲烷4mL，用移液器混匀1min，水浴10min；4℃、12000g离心15min，取上清液加等体积异丙醇，轻轻摇匀，然后-20℃静置15min；
5)4℃、12000g离心15min，小心去除上清液，留沉淀；加70％预冷酒精，洗涤三次，放于通风处干燥；加入50μL～100μL灭菌的去离子水溶解DNA，即获得基因组DNA。
用核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度＝OD260/OD280
DNA浓度＝50×OD260 g/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～1.9。
1.2基因片段的扩增与测序
以提取的基因组DNA为模板，采用ITS扩增通用引物对苜蓿黄萎病菌的ITS片段进行PCR扩增，PCR扩增产物自行测序或送测序公司进行测序，获得待溯源对象的ITS序列。
其中，PCR扩增反应可参考如下反应体系：
10×PCR缓冲液5μL、2.5mmol/L的dNTPs 5μL、10μM正向引物1μL、10μM反向引物1μL、5U/μL的Taq酶0.3μL、模板DNA 10ng，最后补无菌水至50μL。
用双蒸水替代模板DNA作为空白对照，阳性对照采用含有苜蓿黄萎病菌的DNA，每个样品做两个平行试验。
在对PCR扩增产物进行测序前，建议先对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶纯化，具体的，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，采用核酸蛋白分析仪对DNA进行定量检测。测序引物与PCR扩增引物相同，即直接采用ITS通用引物进行测序。
1.3分子系统进化分析
将PCR扩增产物的测序结果，即待溯源对象的ITS序列导入Mega软件，同时导入“一、苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备”获得的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件，该溯源序列排列文件通常为mas格式或meg格式，本例具体为mas格式文件，对全部序列进行排列。
对排列后的mas格式文件，基于Neighbor-joining Tree构建分子系统进化树。Phylogeny Test选择Bootstrap 1000 replicates，其他参数选择默认参数。
1.4网络进化分析
将PCR扩增产物的测序结果，即待溯源对象的ITS序列导入DnaSP软件或者Network软件中，同时导入“一、苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备”获得的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件，将全部序列一起进行网络构建，选择系统默认参数。
2.结果判断
根据待溯源对象的ITS序列在系统进化树上与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中已溯源的苜蓿黄萎病菌菌株的分支聚集结果进行判定，具体如下：
1)如果待溯源对象的ITS序列与已溯源的菌株序列聚为一支，且重复率为100％，即判定该待溯源对象菌株与已溯源的菌株具有相同的溯源信息，即具有相同的来源地和宿主信息。
2)如果待溯源对象的ITS序列未与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的任一已溯源的菌株序列聚为一支，则需结合网络进化分析的网络进化图进行判定；
具体的，采用网络进化分析软件将待溯源对象的基因片段序列与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的所有已溯源的菌株序列一起进行网络构建；在构建的网络进化图中寻找待溯源对象的基因片段序列的进化分支起源点和方向，确认突变衍化历史。
如果待溯源对象的基因片段序列所在的分支起源点具有其它已溯源的菌株序列的方向分支，并且这些其它已溯源的菌株序列的方向分支的溯源信息具有相关性，则判断待溯源对象的溯源信息与已溯源的菌株的来源地和寄主信息具有相关性。
如果待溯源对象的基因片段序列所在的分支起源点没有其它方向分支，或各方向分支之间没有相关性，则无法判断待溯源对象的来源地和寄主信息。
根据本例的苜蓿黄萎病菌溯源检测方法，能够对苜蓿黄萎病菌的来源地、寄主等信息进行溯源判断，在此基础上，还可以将新检测的苜蓿黄萎病菌的来源地、寄主等信息进一步补充到所构建的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中，例如采用系统进化树分析或网络进化分析，或者两者同时使用，将新的溯源信息或新的菌株核酸序列有序的排列到相应的聚集分支或者进化分支起源点和方向上。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (12)

1.一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测方法，其特征在于：包括比对排列步骤和溯源判断步骤；
所述比对排列步骤包括，采用比对软件将待溯源对象的基因片段序列比对排列到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中，并采用系统进化树构建软件构建分子系统进化树；
所述溯源判断步骤包括，根据待溯源对象的基因片段序列在系统进化树上与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中已溯源的菌株序列的分支聚集结果，判断待溯源对象的溯源信息；
所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件包含苜蓿黄萎病菌的基因片段序列信息以及各基因片段序列对应的苜蓿黄萎病菌菌株的溯源信息；
所述溯源判断步骤，具体包括，
如果待溯源对象的基因片段序列与已溯源的菌株序列聚为一支，且重复率为100％，即判定待溯源对象与已溯源的菌株具有相同的溯源信息；
如果待溯源对象的基因片段序列未与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的任一已溯源的菌株序列聚为一支，则进一步进行网络进化分析；
所述网络进化分析包括，采用网络进化分析软件将待溯源对象的基因片段序列与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中的所有已溯源的菌株序列一起进行网络构建；在构建的网络进化图中寻找待溯源对象的基因片段序列的进化分支起源点和方向，确认突变衍化历史；
如果待溯源对象的基因片段序列所在的分支起源点具有其它已溯源的菌株序列的方向分支，并且这些其它已溯源的菌株序列的方向分支的溯源信息具有相关性，则判断待溯源对象的溯源信息与已溯源的菌株的溯源信息具有相关性；如果待溯源对象的基因片段序列所在的分支起源点没有其它方向分支，或各方向分支之间没有相关性，则无法判断待溯源对象的溯源信息。
2.根据权利要求1所述的溯源检测方法，其特征在于：所述溯源信息包括来源地信息和寄主信息。
3.根据权利要求1所述的溯源检测方法，其特征在于：所述比对软件为Mega软件。
4.根据权利要求1所述的溯源检测方法，其特征在于：所述系统进化树构建软件基于Neighbor-joining Tree构建分子系统进化树，Phylogeny Test选择Bootstrap1000replicates。
5.根据权利要求1所述的溯源检测方法，其特征在于：所述网络进化分析软件为DnaSP软件或Network软件。
6.根据权利要求1-5任一项所述的溯源检测方法，其特征在于：所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件采用以下方法构建获得，
获取苜蓿黄萎病菌的所有核酸序列及其备注信息，根据核酸序列所在的基因片段进行分类，根据所有核酸序列分析各基因片段的种内遗传距离，结合种内遗传距离和核酸序列备注信息筛选用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段；
对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的所有核酸序列进行聚类分析和筛选，选择有效的、具有种内差异的，且溯源信息完整的核酸序列组成待分析核酸序列库；
对待分析核酸序列库中的所有核酸序列分别进行系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析；并对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的SNP位点进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析；根据分析结果，将待分析核酸序列库中的所有核酸序列按照溯源信息进行分类排列，即获得所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。
7.一种用于苜蓿黄萎病菌溯源检测的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法，其特征在于；包括，
获取苜蓿黄萎病菌的所有核酸序列及其备注信息，根据核酸序列所在的基因片段进行分类，根据所有核酸序列分析各基因片段的种内遗传距离，结合种内遗传距离和核酸序列备注信息筛选用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段；
对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的所有核酸序列进行聚类分析和筛选，选择有效的、具有种内差异的，且溯源信息完整的核酸序列组成待分析核酸序列库；
对待分析核酸序列库中的所有核酸序列分别进行系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析；并对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的SNP位点进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析；根据分析结果，将待分析核酸序列库中的所有核酸序列按照溯源信息进行分类排列，即获得所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：还包括通过系统进化树分析和/或网络进化分析对已经制备的所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件进行补充或完善，将新的溯源信息或新的菌株核酸序列补充到所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中。
9.一种苜蓿黄萎病菌的溯源检测装置，其特征在于：包括比对排列模块和溯源判断模块；
所述比对排列模块，包括用于采用比对软件将待溯源对象的基因片段序列比对排列到苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中，并采用系统进化树构建软件构建分子系统进化树；
所述溯源判断模块，包括用于根据待溯源对象的基因片段序列在系统进化树上与苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中已溯源的菌株序列的分支聚集结果，判断待溯源对象的溯源信息；
还包括苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块；
所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块，包括用于获取苜蓿黄萎病菌的所有核酸序列及其备注信息，根据核酸序列所在的基因片段进行分类，根据所有核酸序列分析各基因片段的种内遗传距离，结合种内遗传距离和核酸序列备注信息筛选用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段；
对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的所有核酸序列进行聚类分析和筛选，选择有效的、具有种内差异的，且溯源信息完整的核酸序列组成待分析核酸序列库；
对待分析核酸序列库中的所有核酸序列分别进行系统进化分析、主成分分析、群体遗传结构分析；并对筛选的用于苜蓿黄萎病菌溯源的基因片段的SNP位点进行基于SNP的群体遗传分析和基于SNP的系统进化树分析；根据分析结果，将待分析核酸序列库中的所有核酸序列按照溯源信息进行分类排列，即获得所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件。
10.根据权利要求9所述的溯源检测装置，其特征在于：所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件构建模块，还包括用于通过系统进化树分析和网络进化分析对已经制备的所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件进行补充或完善，将新的溯源信息或新的菌株核酸序列补充到所述苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件中。
11.一种用于苜蓿黄萎病菌溯源检测的装置，其特征在于：包括存储器和处理器；
所述存储器用于存储程序；
所述处理器用于执行所述存储器存储的程序实现权利要求1-6任一项所述的溯源检测方法或权利要求7或8所述的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法。
12.一种计算机可读存储介质，其特征在于：包括存储于其中的程序，所述程序能够被处理器执行实现权利要求1-6任一项所述的溯源检测方法或权利要求7或8所述的苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件的制备方法。
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