CN104995314A - 用于基因型鉴定结核分枝杆菌的引物、snp标记及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供用于基因型鉴定结核分枝杆菌(M.tuberculosis)之引物组，其选自引物组1至25(SEQ ID No.1至50)；亦提供用于基因型鉴定结核分枝杆菌之延伸引物，其选自SEQ ID No.51至75之一。本申请提供结核分枝杆菌之单核苷酸多态性标记之组合。本申请进一步提供用于基因型鉴定结核分枝杆菌之方法及试剂盒。

Description

用于基因型鉴定结核分枝杆菌的引物、SNP标记及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年11月26日提交的美国临时专利申请No.61/730,033的优先权，其公开的内容通过引用全部并入本文。
背景技术
1.技术领域
本发明系关于检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，尤其是基因型鉴定结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，之引物、SNP标记及方法。
2.相关领域的描述
结核病(TB)为全球性的健康议题。世界卫生组织(WHO)已确认结核病为流行病之一，并评估全球约三分之一的人口曾被结核分枝杆菌(MTB)所感染。流行病学研究已证实，不同基因型之结核分枝杆菌(MTB)可能于不同地区盛行，且基因型分布系与人口迁移相关。MTB基因组多样性是否会影响人类疾病之临床状况仍未有定论。
MTB菌株H37Rv之完整基因组已于1988年公开，其长度约4Mb，并包含约4000个基因。MTB可被分类为6个主要菌株及15个次要菌株。基因组变异影响MTB之传播、毒性、抗微生物剂抗性及其它属性，因此，用以区分不同MTB分离株之分子技术之发展亦为流行病学之重要关注焦点。
已发展出聚焦于产生系统发生信息数据之基因型鉴定方法，以研究不同来源之多个临床样品。近来，常使用两种基因型鉴定方法进行结核病传播之研究(van Deutekom H.et al.,J Clin Microbiol 2005,43(9):4473-4479)。间格区寡核苷酸分型(spoligotyping)系基于直接重复(DR)基因座之多态性，所述基因座由以非重复性间隔序列分开之36-bp之DR拷贝所组成。其为以PCR为基础之反向杂交技术进行MTB基因型鉴定。携带式数据格式可使实验室之间之比对更易于进行。到公开时日，基于间格区寡核苷酸分型特征匹配建立了可免费取得的菌株品系鉴定之数据库(Brudey K et al.,BMC Microbiol2006,6:23)。另一种用于MTB菌株分型之分子技术则以分枝杆菌散置重复单元(MIRU)之不同数量纵列重复(VNTR)为基础(Mazars E.et al.,Proc NatlAcad Sci USA 2001,98(4):1901-1906；Comas I.et al.,PLoS One 2009,4(11):e7815；Supply P.et al.,Mol Microbiol 2000,36(3):762-771)。此方法系基于在所选的12、15或24个MIRU基因座的每个中所观察到的重复之数目，所述重复之数目使用以PCR为基础之方法确定。
然而，用于基因型鉴定MTB的常规方法仍有缺点，包含DNA样品需求量大、耗时、敏感性及特异性不足、无法对特定菌株进行基因分型。因此，仍须改善基因型鉴定MTB之方法。
发明内容
本申请描述用于基因型鉴定结核分枝杆菌之引物组，其选自引物组1至25之一。
本申请提供用于基因型鉴定结核分枝杆菌之延伸引物，其选自SEQ IDNo.51至75之一。
本申请提供结核分枝杆菌之单核苷酸多态性标记之组合，所述标记选自SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ IDNo.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。
本申请亦提供一种基因型鉴定结核分枝杆菌方法，包括取得样品；使用选自引物组1至25(SEQ ID No.1至50)之一种或多种引物组进行扩增，并获得至少一种第一DNA片段；使用所得第一DNA片段作为模板，并使用选自SEQ ID No.51至75之一种或多种延伸引物进行扩增，并获得至少一种第二DNA片段；以及，使用质谱检测该第二DNA片段。
于其它实施例中，本申请亦提供一种用于基因型鉴定结核分枝杆菌之试剂盒，包括选自由引物组1至25(SEQ ID No.1至50)所成群组之至少一引物组，及选自由SEQ ID No.51至75所成群组之至少一延伸引物。
附图说明
图1系选择品系特异性DNA标记之整体流程图。
图2显示MTB基因组中SNP标记之连锁不平衡。该LD图系以Haploview软件所制作，且图上之颜色码系依循Haploview之标准颜色表，蓝色表示|D'|＝1且LOD<2，鲜红色表示|D'|＝1且LOD≥2。
图3显示使用菌株特异性SNP标记之MTB分离株之系统发生分析。藉由Phylip软件使用110-SNP数据(A)与25-tagSNP数据(B)以计算根井距离，然后以邻接法构建系统发生树。图3亦显示MTB染色体上之分类的SNP位置：110-SNP(C)及25-tagSNP(D)。
图4显示用于菌株分类之特异性标记鉴定。藉由组合间格区寡核苷酸分型及SNP基因型鉴定数据，表征了51个现代北京、25个荷兰、11个EAI、10个古代北京、7个T及3个LAM分离株之110个SNP之等位基因之频率。
图5显示以四种品系特异性SNP标记为基础之决定树。32个品系特异性SNP中的4个具有100％之变异等位基因之频率，用于将81个临床分离株分类为古代北京(Ba)、现代北京(Bm)、东非-印度(EAI)及拉丁美洲和地中海(LAM)品系。
图6显示欧美品系内之高基因多态性。(A)使用4,419个全基因组SNP标记之欧美菌株之系统发生分析，以Phylip软件(邻接法)计算根井距离而构建系统发生树。(B)欧美菌株之主成分分析(PCA)，将4,419个全基因组SNP标记之基因型数据转换成数值，接着以PCA法使用SAS程序分析该14个欧美临床分离株及H37Rv参考菌株。
图7显示以156个结核分枝杆菌分离株之24-MIRU-VNTR基因型鉴定为基础之最小生成树。圆圈代表通过24-MIRU-VNTR基因型鉴定进行分类之不同类型，且依据间格区寡核苷酸分型之分类上色。圆圈尺寸代表特定基因型之分离株之数目(表示无法以间格区寡核苷酸分类者)。
图8显示欧美品系之新的假设性亚型定义，使用4,419个全基因组SNP标记之欧美菌株之系统发生分析，以Phylip软件(邻接法)基于根井距离而构建系统发生树。
图9显示新的假设性欧美亚型中之高度基因纯合性。14个欧美菌株(7个Haarlem及7个T株)以454或HiSeq2000测序仪进行全基因组测序，基于系统发生树(图8)，该等菌株有两个主要簇(分别为6个EuAm1亚型及7个EuAm2亚型)。81个EuAm1-特异性之SNP及133个EuAm2-特异性之SNP的变体等位基因频率＝100％。
图10显示具有多重反应井方案的25个tagSNP之PCR引物、延伸引物、位置及对应之等位基因。
图11显示本申请与常规基因型鉴定方法之比较。
发明详述
于本申请中，用于基因型鉴定结核分枝杆菌之引物组选自引物组1-25，各引物组系含有正向引物与反向引物。引物组1-25如下所示：
引物组1：ACGTTGGATGTTCTGGACGACCTGTCCTAC(SEQ ID No.1)及ACGTTGGATGAGCTGCGCCAAGGTTCGTG(SEQ ID No.2)；
引物组2：ACGTTGGATGTTGTAGCTGCCCAAATTGCC(SEQ ID No.3)及ACGTTGGATGGGCTTCAATCTCGGCTTGG(SEQ ID No.4)；
引物组3：ACGTTGGATGTATTCAACACCGGCATCGGG(SEQ ID No.5)及ACGTTGGATGTCGCCTGGTCGTGGAAGAAC(SEQ ID No.6)；
引物组4：ACGTTGGATGATCGGACAGCAGAAGGCAC(SEQ ID No.7)及ACGTTGGATGACTCCCGCGGAACGTGGTG(SEQ ID No.8)；
引物组5：ACGTTGGATGCAACACCGGCAACTTCAAC(SEQ ID No.9)及ACGTTGGATGAATTAGCGTCTCCTCCGTTG(SEQ ID No.10)；
引物组6：ACGTTGGATGTCGAACCCGCCGACAAATG(SEQ ID No.11)及ACGTTGGATGTCGATTGGTCGCATGCACTG(SEQ ID No.12)；
引物组7：ACGTTGGATGAAACCTCGGCATAGGGATCG(SEQ ID No.13)ACGTTGGATGTCGACAGGACTATTGGTAGC及(SEQ ID No.14)；
引物组8：ACGTTGGATGAAGACGACGGGCCGGATATG(SEQ ID No.15)及ACGTTGGATGCGTCAAGAGCTTCCCAAATC(SEQ ID No.16)；
引物组9：ACGTTGGATGCATCCGGGAACACCGTAAAC(SEQ ID No.17)及ACGTTGGATGATCACCTTCTTATCGGGTGG(SEQ ID No.18)；
引物组10：ACGTTGGATGCCTGGATTTCAGATATTGCC(SEQ ID No.19)及ACGTTGGATGTGGCCAGCCCTAGCAAGTC(SEQ ID No.20)；
引物组11：ACGTTGGATGAGAACAAACGCGGGATTCAC(SEQ IDNo.21)及ACGTTGGATGTCTCCCGGAGATCACCATTC(SEQ ID No.22)；
引物组12：ACGTTGGATGGTTGTTTTTGGCCGGGCAG(SEQ ID No.23)及ACGTTGGATGATCGAGCAGACTCAGCGCTT(SEQ ID No.24)；
引物组13：ACGTTGGATGTGCTACCGCCAATGTTCAAC(SEQ ID No.25)及ACGTTGGATGATGGCGTTGACATAACTCGG(SEQ ID No.26)；
引物组14：ACGTTGGATGATAGCAAGCACGATTGCGAC(SEQ IDNo.27)及ACGTTGGATGACCCCCCGCTGAGGGCGTA(SEQ ID No.28)；
引物组15：ACGTTGGATGGATTCGATTGGGGAAACGGC(SEQ IDNo.29)及ACGTTGGATGTTCCACATTGGTGATCAGCG(SEQ ID No.30)；
引物组16：ACGTTGGATGCAAACGGCGTCACTTTGGTC(SEQ ID No.31)及ACGTTGGATGTGAAATGTGGGCCCAAGACG(SEQ ID No.32)；
引物组17：ACGTTGGATGCGATTTCGATCGGGATGTTG(SEQ ID No.33)及ACGTTGGATGCAATCACGATCCCCTCAATC(SEQ ID No.34)；
引物组18：ACGTTGGATGAGGCAAAGGAAAATCGACCG(SEQ IDNo.35)及ACGTTGGATGTTGACAAACTGAAACACCGC(SEQ ID No.36)；
引物组19：ACGTTGGATGACAACCGGCCGCAGCGTTT(SEQ ID No.37)及ACGTTGGATGAAGAACACCGAAAGTGGCTG(SEQ ID No.38)；
引物组20：ACGTTGGATGTGCATTGGCCACTAAAGCTC(SEQ ID No.39)及ACGTTGGATGTCGATGACTATCTGCGGATG(SEQ ID No.40)；
引物组21：ACGTTGGATGACCCATTTGCCGAACGTGTC(SEQ ID No.41)及ACGTTGGATGTGCTTGGCGACTTTGTGCAG(SEQ ID No.42)；
引物组22：ACGTTGGATGAGCGTGAAGAAGACGACGA(SEQ ID No.43)及ACGTTGGATGGTCTGTTGTCATTACGGGAG(SEQ ID No.44)；
引物组23：ACGTTGGATGACATCAGGTGATGGTCATGC(SEQ IDNo.45)及ACGTTGGATGCGAAGGGAACAATGGATGTG(SEQ ID No.46)；
引物组24：ACGTTGGATGTATGCCAACCGATTTGCCTG(SEQ IDNo.47)及ACGTTGGATGACATATTGTCCACCGCGTAG(SEQ ID No.48)；及
引物组25：ACGTTGGATGTCTTGGCAGCGGCATGGAC(SEQ IDNo.49)及ACGTTGGATGCCGAATTTCCAGTCTCACAG(SEQ ID No.50)。
该引物组可应用于聚合酶链反应，以扩增含有结核分枝杆菌之单核苷酸多态性(SNP)之DNA片段。上述引物组可单独使用或组合使用。于一些实施方案中，该引物组之组合可在一个测试管中同时应用进行PCR测试。于一些实施方案中，可同时使用选自引物组1-12之任意之组合。于一些实施方案中，可同时使用选自引物组13-22之任意之组合。于一些实施方案中，可同时使用选自引物组23-25之任意之组合。
于本申请中，用于基因型鉴定结核分枝杆菌之延伸引物选自SEQ ID No.51-75。该等延伸引物系如下所列：
GACCTGTCCTACGAACCGGTGATGG(SEQ ID No.51)，
CGTTGCCCACGTTGTTGGCG(SEQ ID No.52)，
CACCGGCCAACGTCTCGGGCATG(SEQ ID No.53)，
CCCCCGACCGGCCGTTCTTCG(SEQ ID No.54)，
TTCAACGGCGGCATCAT(SEQ ID No.55)，
GCCGAAACAAGATTTGC(SEQ ID No.56)，
CCTTCTGCGTCTCCAAT(SEQ ID No.57)，
GATATGGGGCCGCGGAT(SEQ ID No.58)，
ACCGTAAACGGGCCTAACCCTCC(SEQ ID No.59)，
TTGGGGCTGGGAACTGGG(SEQ ID No.60)，
ATTCACGTGAAAACCCTCG(SEQ ID No.61)，
AGCTCAGCGCGCGGCTGGTGT(SEQ ID No.62)，
CAAAATACGGCGATCATCATGGG(SEQ ID No.63)，
CCACCAGTACTTGCCGC(SEQ ID No.64)，
ATCGGGGTGACGATGAG(SEQ ID No.65)，
GCCGAGGAGCCCGCGTAACCGT(SEQ ID No.66)，
TGTTGATCGGCCCGAGGC(SEQ ID No.67)，
GCGGGCGTGGAACGCTGGTC(SEQ ID No.68)，
AGCGTTTCCAGGTCACCGCA(SEQ ID No.69)，
CCAGAGCGCAACAACAA(SEQ ID No.70)，
CACGCTGGCATCAAGTTC(SEQ ID No.71)，
GAAGACGACGAGGACGACTGGG(SEQ ID No.72)，
GACGATTCCGGGCATGCG(SEQ ID No.73)，
TGCCTGCCTGGTATGAC(SEQ ID No.74)，及
GGCATGGACGGGATCGG(SEQ ID No.75)。
于一实施方案中，该延伸引物可应用于聚合酶链反应，以扩增具有结核分枝杆菌之单核苷酸多态性(SNP)为末端核苷酸之DNA片段。上述引物可单独使用或组合使用。于一些实施方案中，该等引物之组合可于一个测试管中同时应用进行PCR测试。
于本申请中，结核分枝杆菌之SNP标记选自：SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。详细序列信息如下所示。
SEQ ID No.76：
TGCCGGGCCGCCTCCAGTCGACGTCGGGTAGTCGCTACCGCCGGCACCACCACCCGGCGCACCAGCTGGTCCTGCTCGGCGAATAGCTCGGCGGCCGCCGCCTCGGCTCGCAATCGTTGTACCCCACCGGTGATCGCGTTGACCGTCATCACGCCCGCTACCAGTAGCGCGTCGATATTGCTGCCGACAATCGCCGATGCTGCGGCGCCCACCGCCAGGATCGGAGTCAGCGGATCGGCCAGTTCATGGCGGGTGGCCACCGCCAGCTGCGCCAAGGTTCGTGCCGGGCCGCGCAGCGGCTCCATCACCGGTTCGTAGGACAGGTCGTCCAGAATGCGCCGCCAGGCCGGGATTCCGGGTTCGACGGCCAAGGGTCGGGAGCCGCCGGCTAGCCGCGAGTAGACGATCTCGGGGTCCAGCGCGTGCCAGGCGGTCAGCGGTTGCGGGGTGGGGTCGGGCATCCGCAGCACCTTGGCGGCCGACCACATTCCGGACACCAAAGCCGTTGCGGCAGCGGCATTGACCGGATTGAGCCAGCGACGGAAGCTGGCTGGGTTGGTGGTTTTGTCCTGCTCACCGGTGACCAACAACAGCCCGGCCA；
SEQ ID No.77：
AGCGTTGGGACCCAGCGAGATGAGGTGCTGCATTTCCAGGGACGCGATGACGGCGCTCTGCGAATAGCCGAACACGGTGACGTGGTTTCCGGCGTTGATTTGCTCCCAAATCGCGCCGTCGAGAATCTGTAGGCCCAACTGCACCGAGGTTTGGAAGGGCAGGGATTTGACGCCGGTGATCGGATATAGCTCTTCGGGCGTCACCAGCGCTTTGACGACCGGATTCGAGACGACGGGGTCGATGAACAAGGTCGTGATGGCGTTGACATAACTCGGCGTGGGTATCGGTGACCCGGTGCCACCCATGATGATCGCCGTATTTTGGTTGAACATTGGCGGTAGCACCGGGGGTGAGGTTGGCTTAAAGAGTCCGGCCGTCGCCTCCTGCACCAGCGCGCTCGTGTTGGTGGCCTCGGCATTGACAAATGCGTTTGCGGCCGCCGCCAACCTCTGGGTGAATTCGTTGTGAAACGCCGCAACCTGTGCGCTGATCGCCTGGAACTGCTGGCCGTACGCGCCGAACAGCGTGGCAAGGGCCGTGGACACTTCGTCCGCGGCAGCCGCCGCCAGGCCGGTTGTCGGGGCCGCGACGGCCGCCGTA；
SEQ ID No.78：
CCGACAACACCGGCCCACCCGGCAGCGTGGTGCTCAGCGAGTTGGCGGCGTAGAAGGCGGCCTCCGACCGCCATTGCTTGACGTGCACCCCGGCGGATTTCAGCAGGGTTCGCTGAATCTGGGCGAAGCTGTGCATCGAGGCGCCCGCGGCTGCCACCGCGGCCAGCAACCACCACCACTTGGCGCGATACAAGCTCACCCAGGCCTTGGCGAGCTGGTCCCAGCCCAACGCCACCTCTATAGCAAGCACGATTGCGACGATGGCCAGTACCGCCCATCGCAACCACCAGTACTTGCCGCACGGGGGTACGCCCTCAGCGGGGGGTGCCCCCACCCGCGTGCGAGGGAGTGCCCCCACGCGCTGGCGGAGGTTGCGGGCGGGGGCGTCGTGCGACACGTGCTTAAGGGTAACCGTGCAGGTGGCGCCGTAATCGCGATACATCGCTAACCGTGTCAGCCTCGTTGGGGGGTCGTGACCGGATCGTGCCGCCTGGCAAAGTAACTATGCGGGCTCGACGCGACCCGCCGCGACCTTACGACGCCGCCGTTCCCGTTACGCTTGCCGGATGTCGGCGAGCCTGGATGACGCTTCGGTCGCACC；
SEQ ID No.79：
CGAGGCCAGGTTCCAAAAGCCCGAAGCGCCGCCGCCGAAGTTGCCGAAGCCCGAGGCGGTGCCGGCGCCAGCGTTGAAGAAGCCCGACGACGGGCTGGTGGTCGAGTTCCCGAAGCCCGGGGCCGCCGGAATCTTGATGAGCGGGATGCTGACGCCCCCCACCATGCCGGTGAGGTTGCCGTCGATCGTGGTGGTTGGTCCGCCCACGGTGATCGTCACCGTGGGAAGGGTGAGCGTGGATTGCGGGAGCTCGACCGGGCCGTAGTAAACAACGAAGGGAACAATGGATGTGAAGGGCAAGCGCATGCCCGGAATCGTCATCACGCTTCCGGGCATGACCATCACCTGATGTATCGGCATGCTGAATAGCTGCGCGTTTATCGGAATGGCGGGAATCTCGAGGGCGATATCGGCACCGATCAGGCCTTGGTAGTCGCCCCGCCACAAGACGCCGTTGCTGTAGTTGCCGGCGATGAAGGCGCCGGTGTTGACGTTGCCGGTGTTGGCCACTCCAGTGTTGTAGTCGCCGGTGTTGAAGTAGCCGGTGTTGTAGTTACCTGCGTTGAAGCTGCCGGTGTTGTAGTTGCCGGTGTTGAAGTTC；
SEQ ID No.80：
TTGAACAACCCGACGTTTCCGCTGCCGGAGTTGAACAGGCCGATGTTGTGGCTGCCCGAGTTGAAGCTGCCGAACCCGATCTGTCCGTTGCCGGTGAGCCCGATGCCGACATTGTTGCTGCCCGTATTCCCAAAGCCGACATTGTTGCTGCCGGTGTTCGCAAAGCCGATGTTGTGGCCGCCCAGGTTGGCCAAACCCAGGTTGTCGCTGCCCAGGTTTGCAAAGCCGAGGTTGTAGCTGCCCAAATTGCCGAAGCCGACGTTGAACACGCCGACGTTTCCGTTGCCCACGTTGTTGGCGGCGACGTTTGCCAAGCCGAGATTGAAGCCCGCCGCGCTCGGGGGGCCGGCAGCGGCTGCCGCGGCGCTGGTCAGCCGCTCCGATAGGCCCGCCAGCTTCTTCAGCTGCTGGGTGAACGGCATCAACGCGGAGACGGCCGCCGACGCTCCAGCGTGATAGCCAACCATCGCGGCCACATCCTGGGCCCACATCCGCTCATAGGCGGCCTCGGTGGCCGCGATCGCCGGAGCGTTGAATCCCAGCAGATTCGAGCTCACCAGCGACACCAGCACGGCGCGGTTGGCCGCGACGATCGCCGGAT；
SEQ ID No.81：
AGTCGCCGGCGTTGCCGAATCCGAAGTTGTAGCTGCCCAGGTTGCCTAGGCCGATGTTGTAGTTACCCAGGTTCGCCGGGCCGATGTTGTATGAGCCCTGGTTTCCGCCGAAGACGTTGAAGCTGCCGAGGTTGCCGCTGCCGAGGTTGAAGCTGCCGATGTTCGCCAAGCCGGCGTTGCTGTCGCCTACGTTGGAGAAGCCGACGTTGAATTGGCCGATGTTTCCCAGGCCGAGGTTGAACATCGACATCCCGGTCGCCTGGTCGTGGAAGAACCCCGCGAGGTTGCTGCCGATGTTGAGCATGCCCGAGACGTTGGCCGGTGCCCCGATGCCGGTGTTGAATACGCCCGAGACGGTATCGCCCAGGTTCGCCAGTCCCGATTGCAGCGAGCCGTAGTTGTTGAAGCCCGAGGTCGCGGAGTTCGCGACGTTCTGGAAGCCGGAAATGTTGGCGCCGATGTTGGCGATGCCCGATACGGTTCCGGGGCCGCCGTTGAAGAAGCCCGAGGACGGATCGGTGGTGGCGTTGAAAAAGCCCGTGGTAGCCGCAATGTTGACGAACGTGACATCGAAGGGACCGACGCTTGCGGTGGCCGGGAT；
SEQ ID No.82：
TAAAGCTCAACGGCTACAACACCGCCCAGTTCGGCAAGTGCCACGAAGTCCCGGTCTGGCAGACCAGCCCGGTCGGGCCGTTCGACGCGTGGCCCAGCGGCGGCGGTGGTTTCGAATACTTCTACGGGTTTATCGGTGGCGAGGCTAACCAGTGGTATCCGAGTCTGTACGAGGGCACCACGCCGGTCGAGGTGAACCGCACGCCCGAGGAGGGTTACCATTTCATGGCGGACATGACCGACAAGGCCCTCGGCTGGATCGGACAGCAGAAGGCACTGGCCCCCGACCGGCCGTTCTTCGCGTACTTCGCCCCGGGCGCCACCCACGCGCCCCACCACGTTCCGCGGGAGTGGGCCGACAAGTACCGGGGCCGCTTCGATGTGGGCTGGGACGCACTGCGAGAGGAAACCTTCGCCCGGCAAAAGGAACTCGGGGTGATCCCGGCGGACTGCCAGCTGACCGCGCGGCACGCCGAAATCCCGGCGTGGGACGACATGCCGGAGGACCTCAAACCCGTGCTATGCCGGCAGATGGAGGTCTACGCGGGCTTTCTGGAATACACCGACCACCACGTCGGCCGGCTCGTCGACGGCCTGCAGCG；
SEQ ID No.83：
GTTGGCGAAGCCCGAGATTTGTAAATTACCAACGTTTTGGGCGCCGGAGTTTCCCCTACCAGAATTATTGAAACCCGAATTTCCACTGCCGGCGTTTCCGAATCCCGAGTTTTCGCCCAGCCCATCGGTAGTATTGCCGAAACCGGTGTTCAGGTTGCCCGCGTTAAAGCCGCCCGTGTTGATATTGCCAGAATTTGCGAAGCCGGTGTTCGTCAGGCCAGAGTTCAAGAAACCAGAATTAGCGTCTCCTCCGTTGAAGCTGCCTGAGTTGAATGCACCCGAGTTGAAGCTACCGGTGTTGATGATGCCGCCGTTGAAGTTGCCGGTGTTGAAATCGCCCGCGTTCCCTATGCCGGTATTGGCCTGACCTGAGTTGCCAAAGCCAGTGTTGACGCTTAACGCGTTCCCGAAGCCGGTGTTGATAAAGCCGGAGTTTCCGAAGCCGGTGTTGATGTTGCCTGAGTTGGCTACGCCCGTGTTGGTGACGCCCGAGTTGCCCACGCCGAAGTTGCCGCTGCCCGAGTTGAAGAAGCCGATGTTCCCGGTGCCCGAGTTACCAAATCCTATATTACCGCTACCGGAATTCAGTCCGCCAAAGCCG；
SEQ ID No.84：
TTGTCCGCAGGAGTGTTGAGTGAGGCGGCCAGCGCCGTGTAGTAGTCACGGTGACGTGCGTGCACATCGGCCTCGCCGGAGTCGCCCAGTTTTTCCAGCGCGTACCGACGCACCGTTTCCAGCAGCCGGTACCGCGTGCGGCCCTGGCAGTCGTCGGCCACCACCAGCGACTTGTCTACCAGCAGGGTCAGCTGATCAAGCACCGAAAACGGATCCAGGTCGCTACCGGCGGCGACCGCCCGCACCGCGGCGAGGTCGAACCCGCCGACAAATGGCGCCAGTCGCCGAAACAAGATTTGCCCGGTCTCGGTCAGCAGTGCATGCGACCAATCGATCGAGGCGCGAAGTGTCTGCTGGCGCTGCACCGCGCCCCGCACACCGCCGGCCAACAGCCGGAAACAGTCGTCCAGACCGTCGGCAATCTCGAGCGGTGACATCGACCGCACCCGTGCGGCAGCGAACTCGATCGCCAGCGGTATGCCGTCTAGCCGCCGGCAGATCTCGCCGACGGCCGCGGCGTTGTGATTGGCGATGGTGAACCCGGGCTGAACTCGGCTGGCTCGGTCAGCAAACAATTCGACTGCTTCGTCGGTTATCGACA；
SEQ ID No.85：
TCCAACTCGAAGATTGTTGTCCCGATTGGCCATTGCAATCGGAATGCACGGGAATCCAATCCTGCAGCCAAGATGACCACCTGCTTCATGCCGGCGGCCGTTGCCCGGGAGAAATACTCGTCGAAATACCTGGTGCGGGCACCTTGGAAGTTGACGAAATGCTCACCGAAGTCCCCGGTTGTCAGATAGTGATCGGGCAGCTTGCCGTCCAATACGTCGGCCCATTCACCACCTGCGGCACGGCAGAAAACCTCGGCATAGGGATCGATGGCCAGCGGATCGGCCTTCTGCGTCTCCAATACTCTTGCGGCGGCTACCAATAGTCCTGTCGAACCAACACTCGTGGTGACATCCCAGCTATCGTCCTCGGTCCGCATTCATCGAACTCTAGTTGCTCCAGTCCGCCCACCGCTGTCGGTATCCCAGCGCAGTCGGCCGTGCACACATATCTGCGCGGTGGACTTGGTACTTCTACGCGCATTCGCCGATGTTTTGCGATCCGCGGCGGGTCTATGGTGCCATTTATGTGCCAGGATCGGTCTTCAATAACAACGTCGCGAAGCGAGGGGTCGTGACGTGAGAGGGCTCGCTTATGCCGGCG；
SEQ ID No.86：
GAGCGCTACCTTGGATGTTGAGGGAGTTGAACTCCGGCGGAAAAATTGTGAAATCCATTGTCGCTCAACCGCTGTCTAGGTGGAGGTGCCCGCGCGGTTGGCTAATTCGGTGAGCCAATACGAAGTCTTGCTGGTCTGAAGTGTTTGGACAAATGACTCGTGGATCACATGGGCCTGGCGCGCGATCGCCTTGTACAGCTCGCCGTGCATGGAAAACAGCATCGACGTCACGATGGACACAAGATCGTGGGCGGGGGATTCCACATTGGTGATCAGCGGCGTGACCCCGTCATCATGGGCACTCATCGTCACCCCGATCTCGTGGAGGTTGGCGGCCGTTTCCCCAATCGAATCGGGCCGTGTGGTGACAAAAGACACGCGTGCATCTCCTTCCACTGACGTGGTCTGATGGTGGGGGTCAGCGACGACTTGGGGTTCCGCACGGCATTGTAGACGGAATCGTTCACTAAGGTATTTTCACCATAACGGCTTCGGTCACAAAACGGTAGCGATTCTGTTGAGGAATTTTTTCGACGCTCGCCCGGTAGGGTGCCTCCATGTCTGAGACGCCGCGGCTGCTGTTTGTTCATGCACACCCCGA；
SEQ ID No.87：
TCTGTGGGTGGTCCCGGATGTCGCGGCCCGCGGAGCCGATCTTGCCCATGTCCCAGTGGTGACGCTGGTCGGAAGCGCCCGGCACTATTGGGGCGCGGTGGCGGCGGTGTTGGCGGCAGTGTGTGCTTTGCTCGCTGCCGTCTTCTTGATGAGTTCGGCGGCGATTCGCGGGTCGGCTGGCGAGGACATGGCGAGATATGCGGCGCCCCGCGCCCGCCGGTCGATTGCCCGGCGCCAGCACTCGAATGCGGCCGGCCGGGCGGCTCCGCAAGACGACGGGCCGGATATGGGGCCGCGGATATCGGAGCGAATGATTTGGGAAGCTCTTGACGAGGGCCGTGACCCGACCGATCGGGAGCAGGAGTCTGACACCGAGGGGCGGTGACGGACCGCGCGCTGACGGTCGCTACCCTTCATGGACGTCGTCGAAATTGACGAGCGCGTGTGGGTGACAGTGGGAAGGGAACGGCAGGCATGAGTCCGGCAACCGTGCTCGACTCCATCCTCGAGGGAGTCCGGGCCGACGTTGCCGCGCGTGAAGCCTCGGTGAGCCTGTCGGAGATCAAGGCTGCCGCCGCTGCGGCGCCGCCGCCGCTCGACG；
SEQ ID No.88：
AACCCACGGTGTTGTAAAACAGCTGTGATATCGGCAGATACCAGTTGATGAACCATTCCAGCCACCCCGGGGTCGCGGCGGCGGTCAACGCGGACGACAGGGGCGAGGTGAGGCCCAGCAGCGTGTTGGGCAAGTGGGCGATCAGCTCCGCTATTGCGCTCTGCGCCGCGCCGGCTGAGGTGCCGGCGGCTTTGGCGACTGCGGACAACTGCGTCGCCGCGGCGGATGGGCTGGTGGTGTTCGGCGGCGGGGCAAACGGCGTCACTTTGGTCGCGGTCGCCGAGGAGCCCGCGTAACCGTGCATGGCCATGGCGTCTTGGGCCCACATTTCAGCGTATTGAGCTTCGGTGGCCGCGATTGATGCGGTGTTTTGACCGAACACGTTATGCGTGACCAGCGACGTGAGCCGCGCGCGATTGGCCGCGATCAGCGGCGGGGGCACAATGGCGGCAAACGCGGTTTCGTAAGCGGCCGCCGCCGCACGCGCCTGACTGGCTGCCTGCTCAGCTTGGATGGCGGTGGCTCGCATCCACGCCACATACGGGGCGACCGCTTCGACCATCAACGTCGACGCCGGACCCAGCCATTCTTCGGTTTGCAG；
SEQ ID No.89：
CCGGCCACCTGTGGCACCAGCGTCTATGTCTACCCATTCGACCTTGCCGACGAGGTCTTTACCTGGGCCCGCGCGGTCAGCGCCGAAGTCGACCCTCGGGTCGAGCTGCAAGCCCTTGCCTCCCGCGGTGAACCGAGCATGGGCATCGACGTCCCCGTCATCTCCCTTGCCTCGCCCGCTTTCGCTGACTCGCCCGAAGAGGCCGAACAGGCCCTCGCCCTGTTCGGCACCTGCCCGGTTGTCGAGCAGGCACTGGTCAAAGTCCCTTATATGCCAACCGATTTGCCTGCCTGGTATGACATCGCGATGACCCACTACCTGTCAGACCATCACTACGCGGTGGACAATATGTGGACGTCGGCGTCCGCTGAGGACCTGCTGCCGGGTATCCGCTCAATCCTGGACACGCTGCCCCCGCATCCGGCGCACTTCCTCTGGCTGAACTGGGGTCCATGCCCTCCCCGTCAAGACATGGCCTATAGCATCGAAGCCGACATCTACTTGGCGCTCTACGGCTCCTGGAAGGATCCGGCCGACGAGGCGAAGTACGCCGACTGGGCGCGGTCCCACATGGCCGCGATGTCGCATCTGGCGGTCGGCA；
SEQ ID No.90：
TGTTACCGACGCCGGAGTGAAAGGCCGATGTCGCTAGGCCCAGCGTGCTGGTGTTGTAGAGGCCTGAGACTGTGTTGCCGAAGTTCAAGATTCCCGATGTCAGTGGCCCGACGTTAAGGAATCCGGAGTTGCCGAGATTCCCAGCAATGTTCCAGAAGCCAGATCCGCCCGAACCGACGTTCCCGAAACCCGATGTGCCGCCCGTACCGCTGTTGAAGAAGCCCGATGACGGGGTGGTGGTCGAGTTTCCGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTTCGATCGGGATGTTGATCGGCCCGAGGCGGCCGGACACGTCGATGCCCAACGGGATTGAGGGGATCGTGATTGGCGGGGTAGTGAGGGGGCCGATGGCGCCGCCCACATCAATACCCAACGGGATTGCCGGAAGTGAGTAGCCATCCGGGAACACCGTAAACGGGCCTAACCCTCCGCCCACATCAATACCCAACGGGATTGCCGGAAGTGAGTAGCCATCCGGGAACACCGTAAACGGGCCTAACCCTCCGCCCACATCAATACCCAACGGGATTGCCGGAAGTGAGTAGCCATCCGGGAACACCGTAAACGGGCCTAACCCTCCACC；
SEQ ID No.91：
GCTGCCGGACACGTCGATGCCCAACGGGATTGAGGGGATCGTGATTGGCGGGGTAGTGAGGGGGCCGATGGCGCCGCCCACATCAATACCCAACGGGATTGCCGGAAGTGAGTAGCCATCCGGGAACACCGTAAACGGGCCTAACCCTCCGCCCACATCAATACCCAACGGGATTGCCGGAAGTGAGTAGCCATCCGGGAACACCGTAAACGGGCCTAACCCTCCGCCCACATCAATACCCAACGGGATTGCCGGAAGTGAGTAGCCATCCGGGAACACCGTAAACGGGCCTAACCCTCCGCCCACATCAATACCCAACGGAATAGCCGGCAAACTATAACCACCCGATAAGAAGGTGATGGGACCGATTTGACCACTCACTGTCACGTAATCTGGAGGGAATCCGGGGAAAAATGGCGGAATCGCGGGAATCTCAGGAGTGCCTAGCTGTATCGATATGCTACCCGGGCCTATGCTGCCAACGGTGGGATTTACGCCGAATAAGCCGATCGCAAGCGGAGACGCGGGGATCGAAATCGATCCCACGTTAATGACCTGGAACGCCGATAGCTCTAGGCCAATAGAATTTAGAGTGATCGGC；
SEQ ID No.92：
CCATGCGGTGCCGCGGTGGTCCAGCCAGCGCCCTGCAGTGTGCTGGTGCTCGATACCAGGTTGGCCTGTCCCGCCCAGCTGGGCGGCACCGACAATGCGCCGATTGACGACGCCCGACTAAGGCCGGCGGCTAGCGGAGCCGCACCCAGACCGGCCGCGATCGGCGCCTCGCCGACGGCCGCCTCCGCCGCCCCCAGCTCCGATAGGCCCGCGCCCTCCAAGCCCTCCTCGAGGGCGGCTTCCTCGGCAGCCGGAAGAAGACCACCGCTGGCCAGCCCTAGCAAGTCCGACGCGGCGGAGACCCAGTTCCCAGCCCCAATGTTGAAGATATTGGCAATATCTGAAATCCAGGAGGGCACCTTCCCGGGCGTGGAACCCAAGATGCTCGCGATACCCGACAACGGCGAAGCGGCCGCGGATGAGTTGGCGGCCTCGGTGGCCGCATAGGTGCCAGCGCTGACCCCCAGGGTCTTCACAAACAGGTCGTATACCGCAGCTGCTTCAGCACTGACCTGCTGGTAGAGAGTGCCGTACGCGGTGAACAACGGCGCCTGTAGCACTGATATCTCATCAGCGGCGGCGGGAATCACGCCCGTGGTGG；
SEQ ID No.93：
ACGTCGAGCCAACCCCACTTCAGTGGGTAGGTGAACTCGTCCAGCAGATAGAAGTCGTGACGTTGCGTGGCCAGCCGGAGCGCGATCTCGGCCCAACCGTCCGCCGCCGCGGCCGCACGATCGACGTCGGTGCCGGCCTTGCGAGACGTACGTGTCCAGGACCAGCCCGCACCCATCTTGTGCCACTCCACCGCTCCGCCGATCCCGTGCTGGTCGTGCAGCCGGCCCAGTTGACGAAACGCCGCCTCCTCACCCACTTTCCACTTAGCGCTCTTGACAAACTGAAACACCGCGATGTCCCGACCAGCGTTCCACGCCCGCAACGCCATTCCGAACGCCGCGGTCGATTTTCCTTTGCCTTCACCGGTGTGTACCGCCAGTATCGGCATGTTGCGCCGGGCCCGGGTGGTCAGGCCATCGTTGGGCACTGCGAGCGGATTGCCCTGCGGCATGTGTGGTTACCTATCCATCGTCAAGCCACGCCACGCACGGCATGCACTAGATAATCCGCGTGCAACTGCTCCAACCGAACCACCGGCGCACCCAGCTGACGAGCCAGTTGCGCTGCCAAACCCAGCCGTACATACGACGTTTCGCAGTC；
SEQ ID No.94：
CTGCGAGTGGGCCGACCGATAGGCCCGATGCTGGCACAGACCGCGACCAGCGTCCATGATGCACTCGAACGTCACGGCGGCACAACCATTTTCGAGGCTAAACTAGACGGCGCGCGAGTGCAGATCCACCGGGCAAACGACCAGGTCAGGATCTACACCCGAAGCCTGGACGACGTCACTGCCCGGCTGCCCGAGGTGGTGGAGGCAACACTGGCACTGCCGGTCCGGGATCTAGTGGCCGACGGCGAGGCGATCGCGCTGTGCCCGGACAACCGGCCGCAGCGTTTCCAGGTCACCGCACCACGGTTCGGCCGATCGGTCGATGTTGCGGCTGCCCGCGCGACGCAGCCACTTTCGGTGTTCTTCTTCGACATCCTGCATCGGGATGGTACCGACTTGCTCGAAGCGCCGACCACCGAGCGGCTGGCCGCCCTGGACGCACTGGTGCCGGCTCGGCACCGCGTGGACCGGCTGATCACGTCCGATCCAACGGACGCGGCCAACTTCCTGGATGCGACGCTGGCCGCCGGCCACGAGGGGGTGATGGCCAAGGCACCGGCCGCTCGTTACCTTGCGGGTCGCCGCGGAGCGGGCTGGCTGA；
SEQ ID No.95：
ACGGTGAGGCCGGCCGGGAACAAGGCCAAGGACGATGTGGACAGATTGAAAGTCGCGCCGAACGGGCCGGGGATCGTGCCCGGGCCGCCGTAGCTGCCGATGATGGGTCCATTGATCTGCAGGTCGCTGATGCTGAGGTAGAACGACCCGGAGGGGAATTTCGCGCCGGGTGGGCCTAGCGGCGGGCCGTAGTGGTCGATCGTGATGAACGGGTCCGGCAAGACGACCGGGTCCGCGGTGATTTCTGCCATGGCGGTTTGCCCGAAAAGAACAAACGCGGGATTCACGTGAAAACCCTCGTGGCCGACGGTTCCGGTCACGTGGATCGGGATCGCGGGAATGGTGATCTCCGGGAGAGTGAATTCGCGGATCCCGATGAATCCCCCGGTGATTTGTATGTCGAATGCCGGAATATCGATGGGCTGGACGTGGATGGGACCGATCCCGCCAATCACCTGCAGGTCAATGGGGATTTCGGAAATGGTGAAAAGGGTGCCGGGGGTGAAGGGGGCCAGGACGTTGATGTTGTTGCCCGTTAAGAAGAAACCGGTGTTGTGGCTTCCCGAATTGAATACGCCCAAATTCCCGGTGCCGGAGTTGA；
SEQ ID No.96：
ACAAGCGCGGTAGCCCGCTCGACATCGCTTGCTGTCATTGCGGCAGGTGCTTGATAGAGGGCCGCCAATTCGGTCGCCGCTTCGGATCGCGAGTTCAGGGCGGCAACAACTGGCAGTGTCGCCTTACGTCGGGCAAGGTCGTTGCCGACCGGCTTTCCCGTCACACCAGGGTCACCCCAGATGCCGATCAGATCGTCGACGCATTGAAACGCAAGACCCAACTCATGGCCAAAACGCTCCAACGCAGCAATCGTCGCGTCGTCTGCATTGGCCACTAAAGCTCCCAGAGCGCAACAACAATCGGTCAGGGCGGCCGTCTTGCCCGCGGCCATCCGCAGATAGTCATCGACTGTAACTTCGGGCTGTCCCTCCAATAAACAATCCTCAAACTGGCCGATACACAAGTCCAGGCACGACATCTGCAATCGCCTTATCGCCCTGACCGCCACACACTCGTCGGTCAGGCCGGTCAGTATCCGAACGGCCGTGGCGTGCAACGCATCTCCCAACAGGATCGCGACGCCCACACCCCACACACTCCATACCGTCGGCCGTCCCCTGCGAGTCGCATCCCCATCCATCACATCGTCATGCAACAACG；
SEQ ID No.97：
GTCAGCCAGTCGTTGCGAACATCGTCGTCCACGTAGGGCTGTATCTGTTGGCGAACCACTTCGACGGCCGTCGGCCGATCTGCCCCCTCCGTCGTGAGCGCTTCGGCCGCAGCCAACCATGCCGGCCGCTGCGCCAGGGCACGCTCGTCGATCGCAATGGCCGTCGCGACTTTGGAGTCCACCAGCTGCCAGAGGTTGTCGCGCAGCGATTCGCAGCGTTGGGCCGCGGCACGGACTTCGGTGACCACCGAATTTCCAGTCTCACAGTGACGCTGCACAAAGTGCACCGCCGCGTCGGCCTCCGATCCCGTCCATGCCGCTGCCAAGACGGCGACCTGGCTACGCTCCATCCGCAGCGCCTCCATGAGCACACTGGCGGCAGCCCGCAGCTGCGCGCAGTCAGCGTCGAGCGCGTGCAGGTCAAGTCCGTCTTCGCTGCCGTACCAGTCGTGGATCTGGGCAGGGTAGGCGGTCAGGTCGGGATGTTGGTAGCCCACCAGGTGGCAAGCCCGCACGTAGCTTTGCGTGTGCTCGGCTGCGGGCCTGCCCTCGGCGAGACGCTCAGCGACGTTCAACCGGTCAGCCACCCTCACCCGATCCG；
SEQ ID No.98：
CGCCAGCACCGCGGGGCTCGCCGCCGGGGTCGTGGCGGTCCAAACGGCCGGAACCTTCAATCCCCCGACCGACGCCGCCTGACCGACGGCGCCCGCAACGCCGCTCAGGCCAGCACTCGGAATGGCCGGAACGGCGGCCGGCAACGCCTTGGCGGCCTCACCGGCGGCTTTGGCGCCTTCACTCGCCCACTTCGGCAGGTCGTGCGCCAGGCCAAAGTAGTCCTTGAATTGGGTGACCATGAGCCGAGCGGGCGAGACCCATTTGCCGAACGTGTCCATGGCCACGCTGGCATCAAGTTCTGCCGACCCGGTCACACCCTGCACAAAGTCGCCAAGCACTCCGCCCACGATGAGCCCGCTACCGTCCGAGGACCAGGTGTGCCCGGTCAAACCGAGCGCCTTGCCAAGGTCGGTGAGCCAAGGCGGTTCATTGGTGAAGATTCCGCTAAGCCCAAACAACGCTTTAGGAATGTCGGTGAGTGCTTGCGCATTTGCGGCCCCGCTGACAGCTTGTCCGACAGATGCGGCCTGGCTGGCCAGCCCGGCCGGGTTGATGGTCTGCGCCGCCGGATTGAATGGCGACAACTGCGTCGCCGCCGCC；
SEQ ID No.99：
TGCGCGATGCCGACGATGCCGCGCTGCTTGCCGCAATCGAGGACTGCGCGCGTGCCGAGGTGGCCGCCGGCGCCCGCCGCCTGTCAGCGATCGCCGAACTCACCAGCCGGCGCACCGGCAATGACCAGCGGGCCGACTGGGCGTGCGACGGCTGGGACTGCGCGGCCGCCGAGGTGGCCGCCGCACTGACCGTAAGCCACCGTAAGGCCTCCGGGCAGATGCATCTGAGCCTCACCCTAAACCGACTGCCCCAGGTGGCGGCGTTGTTTTTGGCCGGGCAGCTCAGCGCGCGGCTGGTGTTGATCATCGCCTGGCGCACCTACCTGGTTCGCGACCCCGAAGCGCTGAGTCTGCTCGATGCCGCCCTCGCCAAACACGCCACAGCGTGGGGTCCGCTGTCGGCCCCCAAACTGGAAAAGGCTATCGACTCCTGGATTGATCGGTACGATCCCGCCGCACTGCGACGCACCCGTATCTCGGCCCGCAGCCGCGACCTGTGCATCGGTGATCCCGACGAAGATGCCGGCACCGCCGCACTATGGGGCCGGTTGTTTGCCACCGACGCCGCCATGCTGGATAAGCGCCTCACCCAGCTGGCCCA；和
SEQ ID No.100：
ATCCGCTGGCTGGTGGATCAGGCCCCAGCGCGGGCGCGGGCCTGCTGCGCGCGGAGTCGCTACCTGGCGCAGGTGGGTCGTTGACCCGCACGCCGCTGATGTCTCAGCTGATCGAAAAGCCGGTTGCCCCCTCGGTGATGCCGGCGGCTGCTGCCGGATCGTCGGCGACGGGTGGCGCCGCTCCGGTGGGTGCGGGAGCGATGGGCCAGGGTGCGCAATCCGGCGGCTCCACCAGGCCGGGTCTGGTCGCGCCGGCACCGCTCGCGCAGGAGCGTGAAGAAGACGACGAGGACGACTGGGCCGAAGAGGACGACTGGTGAGCTCCCGTAATGACAACAGACTTCCCGGCCACCCGGGCCGGAAGACTTGCCAACATTTTGGCGAGGAAGGTAAAGAGAGAAAGTAGTCCAGCATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAAT.
前述结核分枝杆菌之SNP系分别对应于：参考菌株之基因组位置128290之"T"；参考菌株之基因组位置178812之"A"；参考菌株之基因组位置243118之"A"；参考菌株之基因组位置374353之"G"；参考菌株之基因组位置375095之"G"；参考菌株之基因组位置430332之"G"；参考菌株之基因组位置756840之"C"；参考菌株之基因组位置848652之"G"；参考菌株之基因组位置991896之"C"；参考菌株之基因组位置996219之"A"；参考菌株之基因组位置1300047之"A"；参考菌株之基因组位置1810066之"A"；参考菌株之基因组位置1932201之"G"；参考菌株之基因组位置2008738之"A"；参考菌株之基因组位置2165256之"G"；参考菌株之基因组位置2165554之"G"；参考菌株之基因组位置3078579之"A"；参考菌株之基因组位置3157993之"C"；参考菌株之基因组位置3426415之"C"；参考菌株之基因组位置3734189之"T"；参考菌株之基因组位置3797876之"T"；参考菌株之基因组位置3859376之"T"；参考菌株之基因组位置4061113之"T"；参考菌株之基因组位置4221423之"T"；以及参考菌株之基因组位置4352162之"C"。
于本申请中，该参考菌株为结核分枝杆菌H37Rv，具有完整基因组序列，编号NC_000962.2。所述基因组序列为公开信息，已公开于美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/57116681？report＝fasta)，该基因组序列标题为"gi57116681/ref.NC_000962.2/Mycobacterium tuberculosis H37Rvchromosome,complete genome"。
表1显示本申请之SNP标记之详细信息。于表1中，H37Rv基因组位置指示了各SNP标记于参考染色体中的位置，参考等位基因指示了存在于结核分枝杆菌H37Rv菌株中的核苷酸，而变体等位基因则为本申请之SNP标记。
表1、M.tuberculosis之SNP标记
于一些实施方案中，不同基因型之结核分枝杆菌具有SNP标记之不同组合。优选地，该SNP标记之组合含有至少2种标记，例如3种、5种、7种、10种、15种、20种或25种标记。然而，于一些实施方案中，上述SNP标记可单独使用。
本申请亦提供基因型鉴定结核分枝杆菌之方法，包括：取得样品；使用选自引物组1至25(SEQ ID No.1至50)之一种或多种引物组进行扩增，并获得至少一种第一DNA片段；使用所得第一DNA片段作为模板，并使用选自SEQ ID No.51至75之一种或多种延伸引物进行扩增，并获得至少一种第二DNA片段；以及，使用质谱检测该第二DNA片段。
于一些实施方案中，该方法可进一步包括：以选自表1之单核苷酸多态性标记为基础，分析该质谱数据。
于一优选实施方案中，该质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。
可应用于本方法之样品之实例包括，但不限于，细菌培养物、鼻涕、痰、唾液、血液、组织或器官切片、活检物(biopsy)等。
本申请进一步提供用于基因型鉴定结核分枝杆菌之试剂盒，包含：选自引物组1至25(SEQ ID No.1至50)之至少一种引物组，及选自SEQ ID No.51至75之至少一种延伸引物。于一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含以单核苷酸多态性标记为基础之结核分枝杆菌基因型之数据库，优选系以表1所示之单核苷酸多态性标记为基础者。
实施例
为了研究MTB之传播、毒性、抗微生物剂抗性及其它属性，发明人利用下一代DNA测序仪(Roche 454/Illumina GAIIx)将分离自台湾人群之六个菌株之基因组进行测序。以比较基因组分析为基础，与参考菌株H37Rv进行比较，于PE/PPE及非-PE/PPE基因家族中分别发现了60个与141个菌株特异性单核苷酸多态性(SNP)。于本申请中，品系特异性SNP用作标记，以设计出新的菌株分类方案，并构建系统发生分析。将此基因型鉴定面板的表现与现行标准测试，针对156株结核分枝杆菌复合群(MTBC)分离株具特异性之间格区寡核苷酸分型(spoligotyping)图谱进行比较。
材料与方法
细菌菌株及分子分型
MTB分离菌株系由台湾五个综合医院(位于四个地理区域)之分枝杆菌学实验室于2004年至2007年间所收集，换句话说，该等菌株收集自台北三军总医院(北区)、门诺医院(东区)、湾桥荣民医院(中区)、台南胸腔医院(南区)及高雄荣民总医院(南区)。如前所示，用于本研究之细菌菌株在台湾MTB多样性上具有代表性(Chang JR et al.,Clin Microbiol Infect 2011,17(9):1391-1396；Dou HY et al.,BMC Infect Dis 2008,8:170；Dou HY et al.,Infect Genet Evol 2008,8(3):323-330；Dou HY et al.,J Microbiol Methods 2009,77(1):127-129)。以国际标准流程进行间格区寡核苷酸分型及MIRU-VNTR基因型鉴定。共156株分离株(包括北京、EAI、Haarlem、LAM、T、MANU及其它未分类菌株)用于后续分析，所示分离株具有可用的所有基因分型数据。
MTB菌株之基因组测序
六株MTB菌株：W6、M3、M7、A27、A18及M24分别属于基因群现代北京、Haarlem、拉丁美洲-地中海(LAM)、T、东非-印度(EAI)及古代北京。它们代表分离自三个不同台湾族群之临床菌株之主要类型，并以454焦磷酸测序法进行全基因组测序(Margulies M et al.,Nature 2005,437(7057):376-380)。利用Genome Sequencer 20(GS-20)或Genome SequencerFLX(GS-FLX)仪器(454 Life Sciences,Roche)以14-28倍基因组深度对TB菌株分别进行测序，对各菌株用500-800碱基对之鸟枪文库。
以Nextera DNA样品制备试剂盒(Illumina,CA,USA)制备六个MTBHaarlem及六个T临床分离株之DNA文库，并使用HiSeq2000测序仪于流通槽的一条通道进行多重测序(2x100bp)。进行去多重(de-multiplex)程序后，各样品之平均序列大小为3.38Gb，且当定位(mapping)于H37Rv参考序列时，该等样品之深度范围为568至1068倍，因此，该等样品之参考覆盖度为99.44％至99.82％。
定位于H37Rv参考序列
将来自各菌株之454测序原始数据(sff文件)收集至一特定文件夹作为读取来源，以与参考菌株H37Rv之基因组进行比对。H37Rv基因组序列及已经注释之基因信息均可由Microbial Genome Assembly/Annotation Projects的NCBI ftp站(site)，(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/Mycobacterium_tuberculosis_H37Rv_ uid57777/)下载。454GS Reference Mapper(Roche)软件(2.3版)系用以将454读取定位于该参考序列(详细信息如表2所示)；并于参考菌株和六个MTB临床菌株之间产生高信赖度变异。
表2、品系特异性之单核苷酸多态性(SNP)之统计
菌株特异性之SNP的选择
以结果为基础，所述结果含有与至少三个非二重复读取之“高信赖度”差异，所述读取(a)显示该等差异，(b)在该差异之两侧均具有至少五个碱基，(c)于该读取中具有少数其它分离之序列差异，及(d)于正向具有至少一比对点(aligned)且于反向具有至少一比对点。另外，只有在所有六个菌株中具有至少三个被覆盖之读取，且变异率高于或等于80％的那些变异位点被视为有效。以自制底稿(home-made scripts)将全部六个菌株之定位结果合并，并将该等有效变异置入MySQL数据库中进行进一步分析。选择具菌株特异性(仅见于单一菌株中)的SNP，并分成两类：PE/PPE蛋白质家族及非PE/PPE。依据该变异之位置，它们可与编码序列为同义或非同义。且于非PE/PPE组中，该等变异亦可位于非编码序列，此为基因间区域。为了以MassARRAY分析仪(购自Sequenom)进一步确认，以各变异点之全深度及变异深度均高于15且变异频率必须高于90％之标准减少变异之数量。
对于Illumina HiSeq2000测序数据之SNP召唤(SNP calling)，系使用CLCGenomics Workbench软件(Aarhus,Denmark)以默认参数分析各样品之定位序列数据。我们应用额外滤器以鉴定具有高于30倍深度及>95％变体频率之高度可信之SNP。
以MassArray系统为基础之SNP基因型鉴定
使用MassArray Assay Design 3.1软件(Sequenom,San Diego,CA)设计用于60个PE/PPE及60个随机选择的非PE/PPE之SNP之PCR及延伸引物，其中五个因序列艰困而被排除。PCR系于384孔平盘中进行，每孔体积5ul，1pmol之对应引物，5ng之基因组DNA及HotStar reaction Mix(Qiagen)。每种样品需要三孔。PCR条件如下：94℃为15min，接着为94℃(20s)、56℃(30s)、72℃(60s)之40个循环，及最终延伸为72℃ 3min。于引物延伸流程中，各样品系以94℃变性，接着为94℃(5s)、52℃(5s)、72℃(5s)之40个循环。以MassARRAY质谱仪(购自Sequenom)撷取由时间解析光谱所得之质谱，各光谱接着以SpectroTYPER软件(Sequenom)分析以进行基因型召唤。分析该基因型谱后，五个SNP之分簇模式无法用于正确执行基因型召唤，且最终在后续分析中使用110个SNP(57个PE/PPE及53个非PE/PPE)之数据。
连锁不平衡及系统发生分析
如图2所示，以haploview软件为基础，使用Lewontin D’测量以评估该连锁不平衡(LD)之标记间系数。以额外严格标准，即各对标记之间为r2＝1，从110个SNP中选出25个tagSNP。以SNP数据应用Phylip软件计算根井距离，接着以邻接法构建系统发生树。
结果
六株MTB临床分离株之基因组测序
选择品系特异性DNA标记之整体方案系如流程图(图1)所示。基于我们先前对于台湾MTB菌株之研究(Dou,et al)，我们选择代表性菌株进行全基因组测序。该等细菌之起始分组系以间格区寡核苷酸分型及MIRU为基础，我们还考虑感染该等MTB之患者之族群背景。我们采用454技术以全基因组鸟枪法产生高覆盖度序列。将该代表性菌株之基因组序列与参考菌株比较，以产生各分离株之变体序列。以总数120个的SNP形成一基因型鉴定面板，用以研究150个额外的临床分离株，该等分离株已利用间格区寡核苷酸分型及MIRU两者鉴定过。在系统发生分析及决定树之分析后，将该等156个分离株(6+150)以所选标记分群。为了改善该基因型鉴定面板并扩展选择品系特异性SNP之基础，将无法以最小化之SNP标记组分类者进一步测序。接着将该测序数据用于比较性分析，以将该流程精细化。为了获得来自当地族群之代表性MTB菌株之基因组内容，且解析它们与参考菌株H37Rv之相异处，我们以454平台对六个分离株进行全基因组鸟枪测序。将三个分离株W6、M3、M7藉由454GS20测序仪以96碱基对之平均读取长度进行测序。随着测序技术进展，将另外三个分离株A27、A18、M24藉由454FLX测序仪以较长的平均读取长度227碱基对及较少测序实验运行次数进行测序。该等测序深度于454GS20数据中为约14X～23X，而于454FLX数据中为约16X～28X。
该定位结果总结于表3。六个分离株均得到至少95.8％之定位的读取，覆盖该参考序列之97％及以上。以454GS20测序之三个分离株之片段重迭数为214～305，而以454FLX测序之三者则为290～299。以454GS20测序之三个分离株之较大片段重迭(>＝1,000bp)之数量为134～158，而以454FLX测序之三者则为196～200，表示以454FLX测序之三个分离株之较大片段重迭比率较高。于该六个分离株中，较大片段重迭之Phred分数40及以上(Q40Bases)之碱基质量为99.48％至99.95％，表示该测序质量够高。
表3、六株MTB临床分离株之基因组测序及比对结果
$深度＝总碱基/H37Rv基因组长度
*大重叠：重叠长度>＝1000bp
avg重叠尺寸&N50重叠尺寸从大重叠计算      用454 gsMapper Release:2.3计算
该等MTB临床分离株之基因变异
由该六个分离株之定位结果，共取得9,003个高信赖度(HC)变异(关于HC变体之定义，请参见方法章节)，包括SNP、多核苷酸多态性(MNP)、插入及缺失(INDEL)。以至少一个分离株具有超过80％之变异频率，且依标准序列位置将该等变异进行排列后，共有3,819个参考位置是该六个分离株均有至少三个读取覆盖的。为了简化，选择仅含有SNP之3,582个参考位置进行后续分析(其它27个位置为INDEL且210个位置为MNP)。
于该等3,582个SNP中，404个SNP共存于所有六个分离株中，且分别有13、19、232、538个SNP共存于所述六个分离株的五个、四个、三个及两个中(详见表4)。最丰富的SNP为2,376菌株特异性者(HC差异仅存在于该六个菌株的一个中)，我们用其作为寻找品系特异性SNP之候选者。该等候选SNP依照其在编码区或非编码区的位置而分为三种主要类型：PE/PPE基因家族、非PE/PPE基因家族、及基因间SNP(如表2所示)。针对位于编码区之该等SNP，除了M7分离株以外，非同义SNP相较于同义SNP似乎具有更多或同等数量。如我们所知，该两种新基因家族PE/PPE之存在系包含约10％之TB基因组之编码能力，因此PE/PPE家族中的SNP数量一般会大幅少于位于其它非PE/PPE基因家组中者。A18(属于EAI品系)的特异性SNP数量，系高于其它五个分离株4～10倍，推测该品系可能具有较高突变率，可快速适应其宿主环境之改变。
表4、各菌株之各位置之全深度≧3且变异率≧80％之高信赖度SNP
156个结核分枝杆菌临床分离株之SNP基因型鉴定
为了表征用于系统发生分析的156个临床分离株之SNP，选出具有高信赖度分数之120个品系特异性SNP，设计用于Sequenom MassArray分析的引物。该120个品系特异性SNP不均等地选自如表5所示的六个品系样品，此系因在该等样品之间的品系特异性SNP总数不同所致。将该120个品系特异性SNP分成两类：[5]PE/PPE基因家族中的60个SNP全部；[8]非PE/PPE基因家族的1,215个非同义SNP中的60个(详如表6所示)。120个SNP中有5个，因为GC含量过高和/或引物二聚体，而无法于Sequenom基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱(MALDI-TOF)系统中设计引物。120个SNP中的115个被设计成10个多重反应，并于156个临床结核分枝杆菌分离株中进行基因型鉴定。我们排除了召唤率低(<95％)且分簇模式差的五个SNP，其余110个SNP则用于后续分析。与Sequenom及454测序数据比较，假阳性及假阴性率均为0％，且于156个样品中之该110个SNP各自的平均召唤率为97％。基于如图2所示的连锁不平衡分析，于MTB基因组中的该等SNP之间具有很强的关联性。该110个品系特异性SNP由25tagSNP以r2＝1进行完全标签(tag)。
表5、用于菌株分型之品系特异性SNP之选择
表6、用于Sequenom MassArray之基因型鉴定面板之SNP数
MTB分离株之系统发生及分群分析
为了追踪156个临床分离株之间的关系，以110-SNP或25-tagSNP信息为基础而构建系统发生树，如图3(A)及3(B)所示。该110-SNP及该25-tagSNP之位置系如图3(C)及3(D)所示。虽然于此两种系统发生树所用标记总数量并不相同，但25-tagSNP之系统发生树的型态与110-SNP之系统发生树相同，表示该25个tagSNP足以代表菌株之间的基因组变异。以间格区寡核苷酸分型之初步品系信息为基础，10个古代北京株、51个现代北京株、11个东非-印度株(EAI)、及3个拉丁美洲-地中海株(LAM)被分群至两种系统发生树中的相对应的枝。另外，6个无法以间格区寡核苷酸分型之分离株，依据系统发生树之节点，则应归属于现代北京(n＝2)、EAI(n＝2)及LAM(n＝2)品系。
组合间格区寡核苷酸分型及SNP基因型鉴定数据，我们表征了于51个现代北京、25个荷兰、11个EAI、10个古代北京、7个T及3个LAM分离株之110个SNP之等位基因之频率，如图4所示。该110个SNP于该等菌株中均为品系特异性，且于对应品系中展现多态性。重要的是，32个SNP变体于MTB品系中是一致的(表5)；于古代北京中的7个SNP具有100％之变异等位基因频率而为品系特异性，3个于现代北京中、19个于EAI中、且3个于LAM中。因此，该32个SNP的每个可用于代表古代北京、现代北京、EAI及LAM之MTB品系，以四种品系特异性SNP标记为基础，构建出决定性系统发生树(图5)。以该决定树为基础，107个以间格区寡核苷酸分型之分离株中的75个(70％)可被正确地分群至相对应之品系，且49个无法以间格区寡核苷酸分型之分离株中的6个(10.1％)可被分群至已知的品系。
107个以间格区寡核苷酸分型之分离株中的32个(30％)，以该25个tagSNP仅能勉强分类，且此种分离株均归属于欧美品系(以间格区寡核苷酸分型数据，分别分类为25个Haarlem及7个T)。我们假设于Haarlem或T中存在间格区寡核苷酸分型之高遗传杂合性，造成决定树没有Haarlem及T菌株的叶上(图5)。为了探究欧美品系之基因组多态性，我们进行全基因组测序以表征六个Haarlem及六个T菌株之基因组谱。于该十二个欧美菌株中，发现了4,419个SNP(表7)。组合M3、A27(454测序数据)及前述12个样品(HiSeq2000测序数据)之SNP信息以构建系统发生树及进行主成分分析，并发现以间格区寡核苷酸分型为相同之菌株无法进行良好的分簇(图6)。这些结果说明，在欧美品系(包括Haarlem和T亚型)内有高纯合性，且24-MIRU-VNTR系统发生树也支持这一发现(图7)。重要的是，被用以鉴定品系特异性SNP及构建决定树(图6)之M3及A27分离株，被一起分簇；但一些Haarlem及T分离株则远离M3及A27，因此决定树没有用于分类这两种亚型的叶。另外，系统发生树有两个主要簇(图8)，于此称为EuAm1及EuAm2亚型。基于新提出之EuAm亚型之假设性定义，于各EuAm亚型中具有高纯合性，如图9所示；且仅需要两个SNP即可将欧美菌株分类为两种假设性亚型。
表7、欧美品系之Haarlem亚型及T亚型中之SNP的发现
使用25个tagSNP进行MTB之基因型鉴定
如上所述，该25个tagSNP可良好的代表菌株之间的基因组变异。以MassArray Assay Design 3.1软件(Sequenom,San Diego,CA)设计出25个tagSNP之PCR引物及延伸引物。图10显示所述25个tagSNP之PCR引物、延伸引物、位置及对应之等位基因。PCR系于384孔平盘中，以每孔体积5ul，1pmol之对应引物，5ng之基因组DNA及HotStar reaction Mix(Qiagen)进行。每样品需要三孔。PCR条件如下：94℃为15min，接着为94℃(20s)、56℃(30s)、72℃(60s)之40个循环，及最终延伸为72℃达3min。于引物延伸流程中，各样品系以94℃变性，接着为94℃(5s)、52℃(5s)、72℃(5s)之40个循环。以MassARRAY质谱仪(Sequenom)撷取由时间解析光谱所得之质谱，各光谱接着以Sequenom TYPER软件(Sequenom)分析以进行SNP基因型召唤。
讨论
结核病在台湾及全世界仍为一主要公共卫生议题。在过去几年间，用于结核病的分子流行病学研究之基因型鉴定方法之发展有助于了解MTB在人群的传播。菌株分类至亚品系提供MTB菌株之遗传变异之表型结果之观点。MTB菌株之系统发生分析亦提供对于MTB进化及清楚的分枝的存在的新观点。由公共健康观点，决定MTB临床分离株之遗传变异最理想的方法应为简单、可负担、具有迅速的周转时间且结果应为以易于在实验室之间分享之格式可转移的。在本研究中，我们设计了品系特异性标记之选择流程，藉由基因组测序、比较性分析及以DNA质谱进行基因型鉴定，并且亦验证了此种新的分类方式之实用性及正确性。由于其实验室操作迅速容易，且用于交换及比较的数据格式简单，本文报道之方案具有成为新的标准方法之潜力。对于开发有效率之感染控制政策，本申请确实有价值。
虽然间格区寡核苷酸分型分析为一直接明确之技术，但其较IS6110RFLP具有较低之鉴别率。此外，其为一费力耗时之方法。即使以间格区寡核苷酸分型为基础之菌株分类于约90％的案例中可将MTBC菌株归类至正确的系统发生品系，但一些菌株根本无法进行分类，且本研究中显示也可能分类错误(图7)。MIRU-VNTR基因座之分析为可重复及高敏感性，且其提供了较间格区寡核苷酸分型更佳的方案。然而，依其脉络，此种方式之鉴别性可以低于或等于IS6110RFLP。菌株特异性SNP分型可提供精确的以序列为基础的信息，且可被自动化，以供分子流行病学及系统发生分析之大型研究。间格区寡核苷酸分型及MIRU分型之组合可被视为TB菌基因型鉴定之最省成本之方法。然而，间格区寡核苷酸分型对于约20-40％之菌株仍无法分类，且没有填补该缺点之方案。所提出之MIRU–VNTR分型方法无法有效地区分包括多株北京基因型菌株之结核分枝杆菌菌株。故，于北京基因型盛行之地区，可能无法将此分型方法应用于日常流行病学研究。不用RFLP分析，需要加入数个VNTR基因座以使用VNTR作为日常性流行病学工具。
对于理解传播动力学，结核分枝杆菌分离株之额外基因型鉴定为必要的。遗传信息能协助确定用于传播动力学的精确的量化测量，及加强典型流行病学模型。评估菌株间遗传关系之能力提供一种有力方式以解决许多流行病学议题，如：追踪传播链、决定感染源、由来自复发或治疗失败之再活化及再感染区分近期传播、检测实验室交叉污染、监测特定遗传菌株(包括具特定流行病学重要性者)之地理分布及散布或研究结核分枝杆菌之进化。
所提出之品系特异性DNA标记之选择之流程(图1)为一有效且具逻辑性之方式，将MTB分离株区分为遗传亚型。重要的是，我们的流程的概念亦可应用至微生物项目之其它领域，如搜寻不同临床分离株之高度保守结构域以开发疫苗。
第11图显示本申请与常规基因型鉴定方法之比较。对于本申请之25-tagSNP基因型鉴定方法，检测所需样品可低至20ng之用于PCR之DNA样品。基于MALDI-TOF技术，序列检测之特异性及敏感性几乎能达到100％；然而，常规的基于PCR之间格区寡核苷酸分型及MIRU则否。藉由使用本申请之25-tagSNP基因型鉴定方法，192个样品之检测可于48小时之内完成。据此，本申请之25-tagSNP之基因型鉴定方法之优点包括优异的特异性及敏感性、较低的样品要求、可快速且大量检测。
通过参考以上详述的优选的实施方案和实施例公开了本发明，然而，应理解该等实施例系仅用于说明，并非意欲限制本发明。可以预期本领域技术人员容易想到修饰和组合，所述修饰和组合在本发明的精神以及后附权利要求书之范畴以及其等价系统和方法以内。

Claims (12)

1.用于基因型鉴定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)之引物组，选自下列引物组之一：
引物组1：ACGTTGGATGTTCTGGACGACCTGTCCTAC(SEQ ID No.1)及ACGTTGGATGAGCTGCGCCAAGGTTCGTG(SEQ ID No.2)；
引物组2：ACGTTGGATGTTGTAGCTGCCCAAATTGCC(SEQ ID No.3)及ACGTTGGATGGGCTTCAATCTCGGCTTGG(SEQ ID No.4)；
引物组3：ACGTTGGATGTATTCAACACCGGCATCGGG(SEQ ID No.5)及ACGTTGGATGTCGCCTGGTCGTGGAAGAAC(SEQ ID No.6)；
引物组4：ACGTTGGATGATCGGACAGCAGAAGGCAC(SEQ ID No.7)及ACGTTGGATGACTCCCGCGGAACGTGGTG(SEQ ID No.8)；
引物组5：ACGTTGGATGCAACACCGGCAACTTCAAC(SEQ ID No.9)及ACGTTGGATGAATTAGCGTCTCCTCCGTTG(SEQ ID No.10)；
引物组6：ACGTTGGATGTCGAACCCGCCGACAAATG(SEQ ID No.11)及ACGTTGGATGTCGATTGGTCGCATGCACTG(SEQ ID No.12)；
引物组7：ACGTTGGATGAAACCTCGGCATAGGGATCG(SEQ ID No.13)ACGTTGGATGTCGACAGGACTATTGGTAGC及(SEQ ID No.14)；
引物组8：ACGTTGGATGAAGACGACGGGCCGGATATG(SEQ ID No.15)及ACGTTGGATGCGTCAAGAGCTTCCCAAATC(SEQ ID No.16)；
引物组9：ACGTTGGATGCATCCGGGAACACCGTAAAC(SEQ ID No.17)及ACGTTGGATGATCACCTTCTTATCGGGTGG(SEQ ID No.18)；
引物组10：ACGTTGGATGCCTGGATTTCAGATATTGCC(SEQ ID No.19)及ACGTTGGATGTGGCCAGCCCTAGCAAGTC(SEQ ID No.20)；
引物组11：ACGTTGGATGAGAACAAACGCGGGATTCAC(SEQ IDNo.21)及ACGTTGGATGTCTCCCGGAGATCACCATTC(SEQ ID No.22)；
引物组12：ACGTTGGATGGTTGTTTTTGGCCGGGCAG(SEQ ID No.23)及ACGTTGGATGATCGAGCAGACTCAGCGCTT(SEQ ID No.24)；
引物组13：ACGTTGGATGTGCTACCGCCAATGTTCAAC(SEQ ID No.25)及ACGTTGGATGATGGCGTTGACATAACTCGG(SEQ ID No.26)；
引物组14：ACGTTGGATGATAGCAAGCACGATTGCGAC(SEQ ID No.27)及ACGTTGGATGACCCCCCGCTGAGGGCGTA(SEQ ID No.28)；
引物组15：ACGTTGGATGGATTCGATTGGGGAAACGGC(SEQ ID No.29)及ACGTTGGATGTTCCACATTGGTGATCAGCG(SEQ ID No.30)；
引物组16：ACGTTGGATGCAAACGGCGTCACTTTGGTC(SEQ ID No.31)及ACGTTGGATGTGAAATGTGGGCCCAAGACG(SEQ ID No.32)；
引物组17：ACGTTGGATGCGATTTCGATCGGGATGTTG(SEQ ID No.33)及ACGTTGGATGCAATCACGATCCCCTCAATC(SEQ ID No.34)；
引物组18：ACGTTGGATGAGGCAAAGGAAAATCGACCG(SEQ IDNo.35)及ACGTTGGATGTTGACAAACTGAAACACCGC(SEQ ID No.36)；
引物组19：ACGTTGGATGACAACCGGCCGCAGCGTTT(SEQ ID No.37)及ACGTTGGATGAAGAACACCGAAAGTGGCTG(SEQ ID No.38)；
引物组20：ACGTTGGATGTGCATTGGCCACTAAAGCTC(SEQ ID No.39)及ACGTTGGATGTCGATGACTATCTGCGGATG(SEQ ID No.40)；
引物组21：ACGTTGGATGACCCATTTGCCGAACGTGTC(SEQ ID No.41)及ACGTTGGATGTGCTTGGCGACTTTGTGCAG(SEQ ID No.42)；
引物组22：ACGTTGGATGAGCGTGAAGAAGACGACGA(SEQ ID No.43)及ACGTTGGATGGTCTGTTGTCATTACGGGAG(SEQ ID No.44)；
引物组23：ACGTTGGATGACATCAGGTGATGGTCATGC(SEQ ID No.45)及ACGTTGGATGCGAAGGGAACAATGGATGTG(SEQ ID No.46)；
引物组24：ACGTTGGATGTATGCCAACCGATTTGCCTG(SEQ ID No.47)及ACGTTGGATGACATATTGTCCACCGCGTAG(SEQ ID No.48)；及
引物组25：ACGTTGGATGTCTTGGCAGCGGCATGGAC(SEQ ID No.49)及ACGTTGGATGCCGAATTTCCAGTCTCACAG(SEQ ID No.50)。
2.权利要求1之引物组，其系用于聚合酶链反应，以扩增含有结核分枝杆菌之单核苷酸多态性(SNP)之DNA片段。
3.用于基因型鉴定结核分枝杆菌之延伸引物，选自下列引物之一：
GACCTGTCCTACGAACCGGTGATGG(SEQ ID No.51)、
CGTTGCCCACGTTGTTGGCG(SEQ ID No.52)、
CACCGGCCAACGTCTCGGGCATG(SEQ ID No.53)、
CCCCCGACCGGCCGTTCTTCG(SEQ ID No.54)、
TTCAACGGCGGCATCAT(SEQ ID No.55)、
GCCGAAACAAGATTTGC(SEQ ID No.56)、
CCTTCTGCGTCTCCAAT(SEQ ID No.57)、
GATATGGGGCCGCGGAT(SEQ ID No.58)、
ACCGTAAACGGGCCTAACCCTCC(SEQ ID No.59)、
TTGGGGCTGGGAACTGGG(SEQ ID No.60)、
ATTCACGTGAAAACCCTCG(SEQ ID No.61)、、
AGCTCAGCGCGCGGCTGGTGT(SEQ ID No.62)、
CAAAATACGGCGATCATCATGGG(SEQ ID No.63)、
CCACCAGTACTTGCCGC(SEQ ID No.64)、
ATCGGGGTGACGATGAG(SEQ ID No.65)、
GCCGAGGAGCCCGCGTAACCGT(SEQ ID No.66)、
TGTTGATCGGCCCGAGGC(SEQ ID No.67)、
GCGGGCGTGGAACGCTGGTC(SEQ ID No.68)、
AGCGTTTCCAGGTCACCGCA(SEQ ID No.69)、
CCAGAGCGCAACAACAA(SEQ ID No.70)、
CACGCTGGCATCAAGTTC(SEQ ID No.71)、、
GAAGACGACGAGGACGACTGGG(SEQ ID No.72)、
GACGATTCCGGGCATGCG(SEQ ID No.73)、
TGCCTGCCTGGTATGAC(SEQ ID No.74)以及
GGCATGGACGGGATCGG(SEQ ID No.75)。
4.权利要求3之延伸引物，其系用于聚合酶链反应，以扩增具有结核分枝杆菌之单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段，所述SNP作为所述DNA的末端核苷酸。
5.结核分枝杆菌之单核苷酸多态性标记之组合，所述标记选自SEQ IDNo.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ IDNo.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ IDNo.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。
6.一种基因型鉴定结核分枝杆菌之方法，包括：取得样品；使用选自引物组1至25(SEQ ID No.1至50)之一种或多种引物组进行扩增，并获得至少一种第一DNA片段；使用所得第一DNA片段作为模板，并使用选自SEQ ID No.51至75之一种或多种延伸引物进行扩增，并获得至少一种第二DNA片段；以及，使用质谱检测该第二DNA片段。
7.权利要求6之方法，进一步包括：以选自结核分枝杆菌之单核苷酸多态性标记之组合的单核苷酸多态性标记为基础，分析该质谱数据，所述结核分枝杆菌之单核苷酸多态性标记选自SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ IDNo.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ ID No.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ IDNo.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ ID No.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。
8.权利要求6之方法，其中，该质谱系基质辅助激光解吸电离飞行时 间质谱(MALDI-TOF MS)。
9.权利要求6之方法，其中，该样品系细菌培养物、鼻涕、痰、唾液、血液、组织或器官切片和/或活检物。
10.一种用于基因型鉴定结核分枝杆菌之试剂盒，包含选自引物组1至25(SEQ ID No.1至50)之至少一种引物组，及选自SEQ ID No.51至75之至少一种延伸引物。
11.权利要求10之试剂盒，其进一步包含以单核苷酸多态性标记为基础之结核分枝杆菌基因型之数据库。
12.权利要求11之试剂盒，其中，该单核苷酸多态性标记选自结核分枝杆菌之单核苷酸多态性(SNP)标记之组合，所述结核分枝杆菌之单核苷酸多态性标记可以选自SEQ ID No.76之位置301之"T"、SEQ ID No.77之位置301之"A"、SEQ ID No.78之位置301之"A"、SEQ ID No.79之位置301之"G"、SEQ ID No.80之位置301之"G"、SEQ ID No.81之位置301之"G"、SEQ ID No.82之位置301之"C"、SEQ ID No.83之位置301之"G"、SEQ IDNo.84之位置301之"C"、SEQ ID No.85之位置301之"A"、SEQ ID No.86之位置301之"A"、SEQ ID No.87之位置301之"A"、SEQ ID No.88之位置301之"G"、SEQ ID No.89之位置301之"A"、SEQ ID No.90之位置301之"G"、SEQ ID No.91之位置301之"G"、SEQ ID No.92之位置301之"A"、SEQ ID No.93之位置301之"C"、SEQ ID No.94之位置301之"C"、SEQ IDNo.95之位置301之"T"、SEQ ID No.96之位置301之"T"、SEQ ID No.97之位置301之"T"、SEQ ID No.98之位置301之"T"、SEQ ID No.99之位置301之"T"、以及SEQ ID No.100之位置301之"C"。
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