CN114107525B - 一种铜绿假单胞菌的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在铜绿假单胞菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑17的标记位点；所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.34所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定铜绿假单胞菌并精细的区分不同的菌株；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析；所述试剂盒对铜绿假单胞菌具有高通量、多靶点、高灵敏、高准确和监测变异的检测优势，可应用于大规模样本的检测，对铜绿假单胞菌的科研和防疫监测均具有重要意义。

Description

一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas_aeruginosa)原称绿脓杆菌。广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌可感染人体的任何组织和部位，经常引起手术切口、烧伤组织感染，表现为局部化脓性炎症。也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、脓胸等。另外可引起菌血症、败血症以及婴儿严重的流行性腹泻。近年来，由于免疫抑制剂、光谱抗生素的广泛使用，铜绿假单胞菌感染呈现增多趋势；并且，随着耐药菌株的流行，此菌感染后会导致较高的死亡率。因此，快速、准确的铜绿假单胞菌的检测对于早期诊断及控制具有重要意义。
另外，铜绿假单胞菌也是实验室进行研究常用的模式病原微生物。其作为群体生物，在和宿主、环境的互作中，群体内个体会发生变异。对于实验室的研究来说，这种不易被察觉的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人Hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。因此，开发高效、准确、灵敏和可监测变异的铜绿假单胞菌检测分析方法对于铜绿假单胞菌的科学研究和应用都具有重要意义。
经典的铜绿假单胞菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、依赖于病原菌分离培养、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组技术需要的繁琐的病原菌的分离培养步骤和宏基因组测序技术带来的大量数据浪费和背景噪音，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异和免培养的优势。现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的多等位基因型。
因此，开发铜绿假单胞菌的高多态性的新型分子标记及其高效、准确、灵敏、不依赖于培养的检测技术，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对铜绿假单胞菌进行鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏、高准确和免培养的效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点是指在铜绿假单胞菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括铜绿假单胞菌参考序列上MNP-1～MNP-17的标记位点。
上述技术方案中，MNP-1～MNP-17的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括17对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.34所示。
上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。
在本发明的第三方面，提供了一种用于检测所述铜绿假单胞菌MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
在本发明的第四方面，提供了所述的铜绿假单胞菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在铜绿假单胞菌的鉴定和制备铜绿假单胞菌鉴定产品中的应用。
在本发明的第五方面，提供了所述的铜绿假单胞菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在检测铜绿假单胞菌菌株内部和菌株间遗传变异中的应用。
在本发明的第六方面，提供了所述的铜绿假单胞菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在构建铜绿假单胞菌数据库中的应用。
在本发明的第七方面，提供了所述的铜绿假单胞菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在铜绿假单胞菌精细分型检测中的应用。
以上所述铜绿假单胞菌的鉴定、菌株内部和菌株间遗传变异、数据库构建、精细分型检测应用中，具体操作步骤为：首先是获取待测样本的细菌总DNA；利用本发明的试剂盒对所述总DNA和空白对照进行第一轮多重PCR扩增，循环数不高于25个；对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；检测多个菌株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；测序结果比对到所述的铜绿假单胞菌的参考序列上，获取在所述总DNA的检测序列数目和基因型数据。根据在所述总DNA和所述空白对照获得的铜绿假单胞菌测序序列数量和检出MNP标记的数目，对所述总DNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析，获得检出MNP标记数目、覆盖每个所述MNP标记的测序序列数目和所述MNP标记基因型数据。
当用于铜绿假单胞菌鉴定时，根据在待测样品和空白对照中检出的铜绿假单胞菌的测序序列数量和检出MNP标记的数目，进行质控后判定待测样品中是否含有铜绿假单胞菌的核酸。其中，所述的质控方案和判定方法是以拷贝数已知的铜绿假单胞菌的DNA为检测样本，评估所述试剂盒检测铜绿假单胞菌的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测铜绿假单胞菌时的质控方案和判定方法。
当用于铜绿假单胞菌遗传变异检测时，包括菌株间和菌株内部的遗传变异检测。菌株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法，获得待比较菌株各自在所述MNP标记的基因型数据。通过基因型比对，分析待比较菌株在所述MNP标记上的主基因型(在一个MNP标记具有超过50％测序片段支持的基因型)是否存在差异。若待比较菌株在至少一个MNP标记的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案，也可以通过单重PCR对待比较菌株的17个位点分别进行扩增，然后对扩增产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较菌株每个MNP标记的基因型进行比对。如果存在主基因型不一致的MNP标记，则待比较菌株之间存在变异。当检测菌株内部的遗传变异时，则通过统计模型判定在待测菌株所述的MNP标记是否检出主基因型以外的次基因型。若待测菌株在至少一个MNP标记存在次基因型，则判定待测菌株内部存在遗传变异。
当用于构建铜绿假单胞菌DNA指纹数据库时，将从样本中鉴定的铜绿假单胞菌的所述MNP标记的基因型数据，录入数据库文件，构成铜绿假单胞菌的DNA指纹数据库；每次鉴定不同的样本时，通过和所述铜绿假单胞菌的DNA指纹数据库比对，鉴定样本中的铜绿假单胞菌是否和数据库中的菌株在所述MNP标记存在主基因型的差异，在至少1个MNP标记存在主基因型差异的铜绿假单胞菌即为新的变异类型，收录进DNA指纹数据库。
当用于铜绿假单胞菌分型时，是对待测样本中的铜绿假单胞菌进行鉴定，获得每个所述MNP标记的基因型；收集网上公开的铜绿假单胞菌的基因组序列和已构建的铜绿假单胞菌DNA指纹数据库构建铜绿假单胞菌参考序列库；将待测样本中铜绿假单胞菌的基因型和所述铜绿假单胞菌的参考序列库进行比对。根据同所述参考序列库的比对结果，鉴定样品中的铜绿假单胞菌是已有的菌株还是新的变异株，实现对铜绿假单胞菌的精细分型。
本发明在铜绿假单胞菌领域属于首创，并未见相关文献报道；MNP标记主要基于参考序列开发，根据已报道的铜绿假单胞菌代表菌株的重测序数据可以挖掘大规模的区分于其他物种、在铜绿假单胞菌物种内部多态、两侧序列保守的MNP标记；通过MNP标记两侧的保守序列可以设计适用于于多重PCR扩增的MNP标记检测引物；再根据标准品的测试结果，可筛选出一套多态性最大、特异性高的一套MNP标记、兼容性最好的引物组合以及检测试剂盒。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供了一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。所提供的铜绿假单胞菌的17个MNP标记和其引物组合，可进行多重PCR扩增，融合二代测序平台进行扩增产物的测序，满足对铜绿假单胞菌进行高通量、高效率、高准确性和高灵敏度检测的需求，满足铜绿假单胞菌标准的、可共享的指纹数据构建的要求；准确检测铜绿假单胞菌菌株间遗传变异的需求；鉴定铜绿假单胞菌纯合和杂合的需求，为铜绿假单胞菌的科学研究和监测提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为MNP标记多态性原理图；
图2为铜绿假单胞菌MNP标记位点的筛选和引物设计流程图；
图3为MNP标记位点的检测流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本发明开发适应于检测群体生物的、物种特异的新型分子标记-MNP标记。MNP标记是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与SSR标记和SNP标记相比，MNP标记具有以下优势：(1)等位基因丰富，单个MNP标记上有2n种等位基因，高于SSR和SNP；(2)物种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现物种鉴定，减少了检测错误率。基于超多重PCR结合二代高通量测序技术检测MNP标记的MNP标记法具有以下优势：(1)输出的是碱基序列，无需平行实验，可构建标准化的数据库进行共享共用；(2)高效率，利用样品DNA条形码，突破测序样品数量的局限，可一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记分型；(3)高灵敏度，利用多重PCR一次检测多个靶标，避免单个靶标扩增失败导致高的假阴性和低的灵敏度；(4)高准确性，利用二代高通量测序仪对扩增产物测序数百次。
鉴于以上优点和特性，MNP标记及其检测技术MNP标记法可实现群体生物多等位基因型的分类与溯源，在病原微生物的鉴定、指纹数据库构建、遗传变异检测等方面都具有应用潜力。目前在铜绿假单胞菌中，尚未有关于MNP标记的报道，也缺乏相应的技术。因此，本发明开发了铜绿假单胞菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在铜绿假单胞菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括以AE00409134为参考基因组的MNP-1～MNP-17的标记位点。
接着，本发明开发了用于检测所述铜绿假单胞菌MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括17对引物，所述17对引物的核苷酸序列如SEQID NO.1～SEQ ID NO.34所示。所述引物互相间不冲突，可以通过多重PCR进行高效的扩增。
所述多重PCR引物组合物可以作为用于检测所述铜绿假单胞菌MNP标记位点的检测试剂盒。
本发明的试剂盒能够准确、灵敏地检测低至10拷贝/反应的铜绿假单胞菌。
本发明的MNP标记和所述试剂盒在复杂模板中检测铜绿假单胞菌具有高特异性。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用进行详细说明。
实施例1、铜绿假单胞菌MNP标记位点的筛选和多重PCR扩增引物的设计
S1、铜绿假单胞菌MNP标记位点的筛选
基于网上公开的500个铜绿假单胞菌不同分离株的基因组完整或部分序列，通过序列比对，获得17个MNP标记位点。对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序获得待检测微生物物种代表小种的基因组序列信息，其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10个遗传上具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。筛选的17个MNP标记位点如表1所示：
表1-所述MNP标记位点以及检测引物在参考序列上的起始位置
Figure BDA0003348047260000061
Figure BDA0003348047260000071
所述步骤S1具体包括：
选择所述铜绿假单胞菌的一个代表株的基因组序列作为参考基因组，将所述基因组序列和所述参考基因组进行序列比对，获得所述铜绿假单胞菌各菌株的单核酸多态性位点；
在所述参考基因组上，以100～300bp为窗口，以1bp为步长进行窗口平移，筛选获得多个候选MNP标记区域，其中，所述候选MNP标记区域含有≥2个所述单核苷酸变异位点，且两端各30bp的序列上均不存在所述单核酸多态性位点；
在所述候选多核苷酸多态性位点区域中筛选区分度DP≥0.2的区域作为MNP标记位点；其中，DP＝d/t，t是在所述候选多核苷酸多态性位点区域中所有小种两两比较时的比较对数，d是在所述候选多核苷酸多态性位点区域中至少两个单核酸多态性差异的样品对数。
作为一种可选的实施方式，在所述参考基因组上，以100～300bp为窗口进行筛选时，也可选用其他步长，本实施方式采用步长为1bp，有利于全面的筛选。
S2、多重PCR扩增引物的设计
通过引物设计软件设计所述MNP标记的多重PCR扩增引物，引物设计遵循引物间互不干扰，所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。
该实施方式中，用于鉴定所述MNP标记位点的引物，如表1所示。
S3、引物组合的检测效率评估
所述MNP标记的检测方法是通过多重PCR对所有MNP标记一次性进行扩增，通过二代高通量测序对扩增产物进行测序，对测序数据进行分析，根据检出的位点评价所述引物组合的兼容性。
使用购买的拷贝数已知的铜绿假单胞菌标准菌株CMCC(B)10104(货号：VIP(S)133303)的DNA，加入到人基因组DNA中，制备成1000拷贝/反应的模板，使用所述的引物组合，根据在4个文库中MNP标记的检出情况筛选物种特异、区分度高的MNP标记组合以及扩增均匀、兼容性最优的引物组合，最终筛选出本发明表1所述的17个MNP标记及其检测引物组合物。
实施例2所述MNP标记和引物鉴定铜绿假单胞菌的性能评估和阈值设置
本实施例中，将购买的铜绿假单胞菌标准品DNA加入到人基因组DNA(2ng/反应)中，制备铜绿假单胞菌浓度为1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应的模拟样本。同时设置的等体积的无菌水作为空白对照。共计4个样本，每个样本每天构建3个重复文库，连续检测4天，即每个样本获得12组测序数据，具体如表2所示。根据在12次重复实验中，在空白对照和模拟样本中检出的铜绿假单胞菌MNP标记的测序片段数和位点数，评估检测方法的重现性、准确性、灵敏度，制定质控体系污染和目标病原体检出的阈值。MNP标记的检测流程如图3所示。
1、MNP标记和试剂盒检测流感嗜血杆菌的灵敏度和稳定性评估
如表2所示，所述试剂盒能在1拷贝/反应的样本中稳定的检出5个以上MNP标记，在10拷贝/反应的样本中稳定的检出10个以上MNP标记，而在0拷贝/反应的样本中最多检出1个MNP标记，所述试剂盒能够明显区分1拷贝/反应和0拷贝/反应的样品，具有技术稳定性和低至1拷贝/反应的检测灵敏度。
表2-MNP标记和试剂盒检测铜绿假单胞菌的灵敏度和稳定性分析
Figure BDA0003348047260000081
2、MNP标记和试剂盒检测铜绿假单胞菌的重现性和准确性评估
基于两次重复中，共同检出位点的基因型是否可重现，评估MNP标记检测方法检测铜绿假单胞菌的重现性和准确性。具体地，对100拷贝/反应的样品的12组数据分别进行成对比较，结果如表3所示。
表3-MNP标记检测试剂盒检测铜绿假单胞菌的重现性和准确性评估
Figure BDA0003348047260000082
Figure BDA0003348047260000091
由表3可知，主基因型存在差异的MNP标记数目都为0；依据2次重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，r代表重现率，即主基因型可重现的位点数目占共有位点数目的比率。本项目重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间MNP标记主基因型的差异对数为0，重现率r＝100％，准确率a＝100％。
3、MNP标记检测试剂盒检出铜绿假单胞菌的阈值判定
如表2所示，在1个拷贝/反应的样本中能检出至少4个铜绿假单胞菌的MNP标记，而在部分空白对照中也检出了铜绿假单胞菌的MNP标记。由于MNP标记检测方法的极度灵敏，因此检测过中的数据污染容易导致假阳性的产生。因此本实例中制定质控方案，具体如下：
1)测序数据量大于5.1百万碱基。测算依据是每个样品检测MNP标记的数目是17个，一条测序片段的长度是300个碱基，所以当数据量大于5百万碱基时，大部分样品一次实验可以保证覆盖每个位点的测序片段数量达到1000倍，保证对每个MNP标记碱基序列的精准分析。
2)根据测试样品中的铜绿假单胞菌的信号指数S和空白对照中铜绿假单胞菌的噪音指数P判定污染是否可接受，其中：
空白对照噪音指数P＝nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中，铜绿假单胞菌的测序片段的数量和总测序片段数量。
测试样品的信号指数S＝nt/Nt，其中nt和Nt分别代表测试样品中，铜绿假单胞菌的测序片段的数量和总测序片段数量。
3)计算测试样品中MNP标记位点的检出率，指的是检出位点数和总设计位点数的比值。
表4-4个样本12次检测中铜绿假单胞菌的信噪比
Figure BDA0003348047260000092
Figure BDA0003348047260000101
结果如表4所示，铜绿假单胞菌在空白对照(即0拷贝/反应的样本)中的噪音指数平均值是0.02％，而在1个拷贝/反应的样品中的信号指数平均值是0.25％，1个拷贝/反应的样品和空白对照的信噪比的平均值是10.41，因此，本发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的。
在10拷贝/反应的样品和空白对照的信噪比的平均值是133.92，最低信噪比是130，在10拷贝/反应的12组数据中，能稳定的检出至少10个MNP标记，占总位点的58.8％。因此，在保证准确性的情况下，本发明优选的阈值是铜绿假单胞菌的信噪比判定阈值130，即当样品中铜绿假单胞菌的信噪比大于130，且位点检出率大于等于58.8％时，判定样本中检出了铜绿假单胞菌的核酸。基于此判定阈值，本发明所提供的试剂盒能准确灵敏的检测到10拷贝/反应的铜绿假单胞菌。根据表2的检测结果，本发明所提供的试剂盒在低至1拷贝/反应的样本中也能检出远高于0拷贝/反应的所述的铜绿假单胞菌的MNP标记，也可以根据检测需求，降低判定阈值，提高检测的灵敏度至1拷贝/反应的样本。
4、MNP标记检测方法检测铜绿假单胞菌的特异性评估
人为的将铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌、不动杆菌属菌株、百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、EB病毒、流感嗜血杆菌、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、人博卡病毒、肺炎克雷伯杆菌、军团菌属菌株、卡他莫拉菌、立克次氏体属、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌的DNA按照等摩尔量的混在一起，制备混合模板，以无菌水模板作为空白对照，采用本发明所提供的方法对混合模板中的铜绿假单胞菌进行检测，进行3个重复实验，在3个重复实验中都能检出所述铜绿假单胞菌的17个MNP标记。经序列比对和按照所述的质控方案和判定阈值进行分析后，在3个重复实验中铜绿假单胞菌均判定为阳性表明所述MNP标记和所述试剂盒在复杂模板中检测铜绿假单胞菌的高特异性。
实施例3、铜绿假单胞菌菌株间的遗传变异检测
利用所述的试剂盒对湖北省疾控预防控制中心提供的6份铜绿假单胞菌菌株进行检测，样本依次命名为S1-S6，其中有S2-S6菌株是同一个菌株不同时期繁殖的子代菌株。每个样品的测序平均覆盖倍数达3314倍，每个菌株均可以检出全部17个MNP标记(表5)。将6个菌株的指纹图谱进行两两比对，结果如表5所示，有S1菌株和其他5份菌株存在至少在4个MNP标记的主基因型存在差异；S-2和和其他4份备份菌株也在2个MNP标记存在主基因型的差异(表5)，表明所述试剂盒不仅可以检测存不同菌株间的差异，还发现了相同命名菌株不同时期备份间的遗传变异。
表5-6个铜绿假单胞菌菌株的检测分析
Figure BDA0003348047260000111
由表5可知，本发明的试剂盒通过检测MNP标记鉴定菌株间遗传变异的应用可以用于保证不同实验室相同命名铜绿假单胞菌菌株的遗传一致性，从而保证研究结果的可比较性，这对于铜绿假单胞菌的科学研究具有重要意义。而在临床上，可针对差异位点是否影响抗药性斟酌诊断方案。
实施例4、铜绿假单胞菌菌株内部的遗传变异检测
作为群体生物，铜绿假单胞菌群体内部部分个体发生变异，使群体不再纯合，形成异质的杂合群体，影响尤其是试验用微生物表型的稳定性和一致性。这种变异体在对群体进行分子标记检测时，表现为位点的主基因型外的等位基因型。当变异个体还未累积时，只占群体的极少部分，表现为低频率的等位基因型。低频率的等位基因型往往和技术错误混在一起，导致现有技术难以区分。本发明检测的是高多态性的MNP标记。基于多个错误同时发生的几率低于一个错误发生的几率，MNP标记的技术错误率显著低于SNP标记。
本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行：首先按照以下规则排除具有链偏好性(在DNA双链上覆盖的测序序列数的比值)的等位基因型：链偏好性大于10倍，或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。
不存在链偏好性的基因型基于表6测序序列数目和比例判定其真实性。表6列出了基于BINOM.INV函数计算在α＝99.9999％的概率保障下，emax(n＝1)和emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％时，在各个位点中次等位基因型测序序列数目的临界值，只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等位基因型。当存在多个候选次等位基因时，对各候选等位基因型的P值进行多重校正，FDR<0.5％的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。
表6涉及到的参数emax(n＝1)和emax(n≥2)指的是携带n个SNP的错误等位基因的测序序列数占该位点总测序序列数的最高比例。emax(n＝1)和emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％是根据在930个纯合MNP标记检测到的所有次等位基因型的频率获得。
表6-部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值
Figure BDA0003348047260000121
Figure BDA0003348047260000131
按表5所示，将在所述MNP位点主基因型存在差异的S1和S2两个菌株的DNA按照以下8个比例1/1000，3/1000，5/1000，7/1000，1/100，3/100，5/100，7/100混合，制备人工杂合样本。使用本发明所述的试剂盒进行检测，每个样本检测3次重复，获得共计24个测序数据。通过和所述两个菌株的MNP标记的基因型进行精准比对，按照上述参数，在24个人工杂合样本中均检测到了存在多个基因型的MNP标记，说明了所提供的铜绿假单胞菌MNP标记和试剂盒在检测菌株群体内部遗传变异的高灵敏性和准确性。
实施例5、铜绿假单胞菌DNA指纹数据库的构建
利用常规CTAB法、商业化试剂盒等方法提取用于构建铜绿假单胞菌DNA指纹数据库的所有菌株或是样本的DNA，采用琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测DNA的质量。若所提取的DNA在260nm与230nm处的吸光度值的比值大于2.0，260nm与280nm吸光度值比值介于1.6与1.8之间，DNA电泳主带明显，无明显降解和RNA残留，则说明基因组DNA达到相关的质量要求，可进行后续实验。
将上述6个菌株的测序数据同参考基因型进行序列比对后，获得每个菌株每个标记位点的主基因型，形成每个菌株的MNP指纹图谱。将获得的每个菌株的MNP指纹图谱录入数据库文件，形成铜绿假单胞菌的DNA指纹数据库。
所构建的DNA指纹数据库基于检测的菌株的基因序列，因此和所有的高通量测序数据兼容，具有完全可共建共享、随时可更新的特征。将每次检测获得的菌株的MNP指纹图谱同已构建的DNA指纹数据库进行比对，将主基因型存在差异的菌株的MNP指纹图谱录入所构建的DNA指纹数据库，达到指纹数据库的实时更新和共建共享。
实施例6、在铜绿假单胞菌精细分型中的应用
构建由公开的铜绿假单胞菌的基因组序列和铜绿假单胞菌MNP指纹数据库组成的参考序列库；利用所述的引物组合和MNP标记位点检测方法对待测样本中的铜绿假单胞菌进行检测，获得了每个菌株MNP指纹图谱；将每个菌株的DNA指纹图谱同构建的参考序列库进行比对，和已有参考序列相同的，认定为已有的菌株的极近似株，在一个以上MNP标记存在主基因型差异的，认定为新的变异株，实现对铜绿假单胞菌的精细分型。
对6份铜绿假单胞菌菌株的检测如表5所示，所检测的6份铜绿假单胞菌中，S1和其他5份在4个以上MNP标记的主基因型存在差异，17个MNP标记的基因型和铜绿假单胞菌NCTC10332菌株一致，判定为NCTC10332菌株的极近似株。S3-S6菌株在17个MNP标记的基因型保持一致，且和PAO1菌株的基因型一致；S2菌株和PAO1菌株最相似，在2个MNP标记存在差异，被认定为新的变异株。由此可见，所述MNP标记和试剂盒对铜绿假单胞菌的分辨率达到了单碱基的水平，可以实现对样本中铜绿假单胞菌的精细分型。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种铜绿假单胞菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgtactgt tcatccaggt c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttggcca ccgcgttg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gataggcgtc gtcgagcc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagcatccg cgaactgg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccgacaga ccgtagac 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagaatgcca ccaaggatct cg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttccagagc ttgccgaact 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatcgcctca aacgcctgat 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgttcctgct acgcatcgg 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgaccttccg ttccagcg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggtcgggtt gttcgggt 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgtctaccc gatcgcca 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcaagtggcc gttgtagtc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttcgccttc gccgagtg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catcgacagt cgcggcgg 18
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgcatggac aaaaggattt cgtc 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtagtcgtc ccaaccatcg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtcgatgacg gtggtcctg 19
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggagaaaggc ccgatccg 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccgaccagca gccagaac 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agaagcgcgt cgaggtattc 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccgatcctct accgccag 18
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgacgttcc tgtttgaaaa ggatg 25
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcaacatgg gcgcggta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gacaacgcca tggccctc 18
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgatagttg atccagccca t 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gattgttcct ggccctggc 19
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgccagtgat cgcgcgtc 18
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagggcatgg cattcctgat c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgatggcata gtggaaacgc 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggccacgcac tgttcgag 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cgctggcgct gttgttca 18
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtgcagaaga tatgcgcgtc 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gatcttcaac cagggcctga a 21

Claims (6)

1.一种用于检测铜绿假单胞菌的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括17对引物，所述17对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.34所示。
2.一种用于铜绿假单胞菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
4.一种权利要求1所述的引物组合物或权利要求2-3任一所述的检测试剂盒在检测铜绿假单胞菌菌株内部和菌株间遗传变异中的应用。
5.一种权利要求1所述的引物组合物或权利要求2-3任一所述的检测试剂盒在构建铜绿假单胞菌指纹数据库中的应用。
6.一种权利要求1所述的引物组合物或权利要求2-3任一所述的检测试剂盒在铜绿假
单胞菌精细分型检测中的应用。
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