CN107916288A - 一种ffpe组织样本的超低频建库方法 - Google Patents

一种ffpe组织样本的超低频建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种FFPE组织样本的超低频建库方法，步骤包括：FFPE样本的DNA提取；DNA打断；去磷酸化与DNA变性；生物素UID单链接头的添加；链霉素磁珠捕获与洗脱；双链第二接头的添加与文库洗脱：通过T4DNA连接酶，在上述靶DNA分子的另一端加上第二个接头，并洗去过剩与残留的接头；LM‑PCR扩增，引入barcode；磁珠纯化PCR扩增产物。本发明针对某些严重降解的FFPE DNA微量样本实现建库捕获测序，在建库开始前通过引入UID标签接头，从而为后续排除建库、捕获以及上机测序过程中引入的技术突变提供前提条件。

Description

一种FFPE组织样本的超低频建库方法
技术领域
本发明涉及一种FFPE组织样本的超低频建库方法，主要解决基于NGS测序过程中，FFPE 样本的建库测序问题。
背景技术
目前FFPE样本的建库方法主要有两类：
第一类为双链DNA建库方法，该方法不足之处主要表现在以下几个方面：
1、双链DNA所需建库样本量较大，因此，无法满足临床上的某些组织样本的需要，比如穿刺组织的FFPE样本，5～10年的FFPE样本等；
2、由于在建库过程中需要多步纯化过程，因此某些较短的或者超短的DNA，单链的DNA，严重损伤的DNA均被损失，无疑给原本就珍贵的样本雪上加霜，从而造成某些超低频率的突变无法检出；
3、由于建库过程需要对某些严重降解的样本进行末端修复，PCR富集，上机测序等，这些过程均存在着引入技术突变的可能性，从而导致检测的不准确。
第二类为单链DNA建库方法，该方法的不足之处在于：
1、在单链建库过程中，单链接头与单链DNA的连接具有偏好性，连接效率比较低，导致依然需要较大的起始建库样本量；
2、在现有的单链建库中依然存在着与双链DNA建库共有的问题，那就是同样存在着无法排除因人为操作引入的突变。
发明内容
本发明目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种FFPE组织样本的超低频建库方法。
本发明为达到上述目的，所采用的技术手段是：一种FFPE组织样本的超低频建库方法，其步骤如下：
步骤一、FFPE样本DNA的提取；
步骤二、DNA片段化处理：确定提取的FFPE DNA样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；
步骤三、DNA的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶FastAP，对DNA5’与3’端去磷酸化；
步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链DNA进行连接；
步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；
步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dNTP、酶条件下，进行延伸反应；
步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链DNA分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；
步骤八、LM-PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的PCR反应，靶向富集DNA分子；
步骤九、磁珠纯化PCR扩增产物。
进一步的，所述步骤一中FFPE样本DNA的提取是指：
单链接头的获得：
按照以下序列信息合成两条序列，
Adaptor序列：5’Pho-GCTACCCCAC-NNNNNNNNNNNN-AGATCGGAAG-XXXXXXXXXXXX-TEG-Biotin3’；
Splinter序列：3’NNNNNN-CGATGGGGTG5’；
Adaptor序列的纯化：总反应体系为20 ul：2 ul of 10 µM A序列, 16 ul 1 x T4 RNA连接酶buffer, 1 ul Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I,1 ul T4 多久核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min；
Splinter序列的纯化：总反应体系为20 ul：4 ul of 10 µM Splinter序列, 14 ul 1x T4 RNA 连接酶buffer, 1 ul Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I,1 ulT4 多聚核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min；
将上述20 ul的Adaptor序列与20 ul的Splinter序列组成40 ul反应体系，PCR仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s，合成单链接头；
双链第二接头的获得：
按照以下序列信息合成两条序列：
5’CGACGCTCTTC-ddC 3’
5’Pho-GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 3’
总反应体系为50 ul:20 ul 500 µM 上链序列，20 ul 500 uM下链序列，9.5 ul TEbuffer, 0.5 ul 5M NaCl；反应条件为：PCR仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s；反应结束后，加入50 ul的TE buffer，合成双链第二接头。
相关试剂配制：
1xBWT+SDS Buffer：1 M NaCl，10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)，0.05%Tween-20，0.5% SDS；
0.1xBWT+SDS Buffer：0.1 M NaCl， 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA (pH8.0)， 0.05% Tween-20，0.5% SDS；
Stringency wash buffer：49.5 ml的ddH20， 250 ul的20%(wt/vol) SDS，250 ul的20× SSC buffer；
0.1xBWT Buffer：0.1 M NaCl，10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA (pH 8.0)，0.05% Tween-20；
TE Buffer：49.4 ml的ddH20，500 ul的1 M Tris-HCl(pH 8.0)，100 ul 的0.5 M EDTA(pH 8.0)。
进一步的，所述根据降解程度决定是否打断是指：根据凝胶电泳显示的降解程度，将提取的FFPE DNA样本分为四种类型：无降解，有主带且主带大小大于2K；轻度降解，有主带但主带范围在1K～2K之间；中度降解，无主带，条带弥散，片段范围在100bp～2kb之间；严重降解，无主带，片段大小小于500bp；严重降解的样本，无需打断，直接建库，无降解、轻度降解与中度降解的需要进行超声打断。
进一步的，所述步骤三中，去磷酸化反应体系为：8 ul 10x T4 RNA ligation
Buffe；2 ul 2% Tween 20；1ul FastAP；x ul FFPE DNA；34.6-x ul ddH20；去磷酸化反应条件为35～39℃，6～15min，然后90～100℃变性1～5min，立即冰浴。
进一步的，所述步骤四中，单链接头为带有UID标签与Splinter序列的接头，其中UID标签用于标记每条单链DNA分子。
进一步的，所述步骤四中，连接酶为T4 DNA连接酶，连接反应的体系为：32 ul 50% PEG-8000；0.4 ul 100 mM ATP；1 ul 单链接头；1 ul T4 DNA Ligase；45.6 ul步骤三变性产物；连接反应温度35～39℃，反应时间35～80min。
进一步的，所述步骤五中，使用MyOne C1磁珠，进行捕获；文库洗脱过程中，先将样本90～100℃变性处理1～10min，立即冰浴后，进行洗脱Buffer，洗去Splinter序列，弃上清。
更进一步的，所述步骤六中，延伸反应使用48 ul Buffer回溶磁珠，Buffer体系为：39.1 ul ddH20；5 ul 10 x Klenow reaction buffer；0.4 ul 25 mM dNTP；2.5 ul 1%Tween-20 和1 ul 延伸引物(100uM)；引物退火条件为：65℃，2 min。
进一步的，所述步骤七中，连接酶为T4 DNA连接酶，进行双链第二接头的添加，连接体系为：73.5 ul ddH20；10 ul 10x T4 DNA 连接酶buffer；10 ul 50 % PEG-4000；2 ul第二接头(100uM)；2.5 ul 1% Tween-20；2 ul T4 DNA 连接酶，连接条件为：15～30℃，反应时间35～80min。
本发明有益效果在于：针对FFPE组织样本等降解样本的二代测序建库时，提供一种解决办法，其次在建库的初期通过对每一个DNA进行标记，从而为后续排除因技术引入突变提供条件。
具体实施方式
实施例1
一种FFPE组织样本的超低频建库方法，其步骤如下：
步骤一、FFPE样本DNA的提取；
步骤二、DNA片段化处理：提取过程，需要根据凝胶电泳显示的降解程度，将提取的FFPEDNA样本分为四种类型：无降解，有主带且主带大小大于2K；轻度降解，有主带但主带范围在1K～2K之间；中度降解，无主带，条带弥散，片段范围在100bp～2kb之间；严重降解，无主带，片段大小小于500bp；严重降解的样本，无需打断，直接建库，无降解、轻度降解与中度降解的需要进行超声打断；
步骤三、DNA的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶FastAP，对DNA5’与3’端去磷酸化；
步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链DNA进行连接；
步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；
步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dNTP、酶条件下，进行延伸反应；
步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链DNA分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；
步骤八、LM-PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的PCR反应，靶向富集DNA分子；
步骤九、磁珠纯化PCR扩增产物。
实施例2
步骤一、单链接头的获得：按照以下序列信息合成两条序列：
Adaptor序列（A）：5’Pho-GCTACCCCAC-NNNNNNNNNNNN-AGATCGGAAG-XXXXXXXXXXXX-TEG-Biotin；
序列(A)为接头序列，由5部分组成，包括10nt的碱基序列区，12nt的UID区，10nt的illumina接头区，10个C3-Spacer区以及与链霉素结合的生物素区；
Splinter序列（B）：3’NNNNNN-CGATGGGGTG5’；
序列(B)为Splinter序列，由2部分组成，包括6nt的随机序列区与10nt的互补区，
Adaptor（A）的纯化：总反应体系为20 ul：2 ul of 10 µM A序列, 16 ul 1 x T4 RNA连接酶buffer, 1 ul Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I,1 ul T4 多久核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min。
Splinter序列（B）纯化：总反应体系为20 ul：4 ul of 10 µM Splinter序列, 14ul 1 x T4 RNA 连接酶buffer, 1 ul Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I,1ul T4 多聚核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min。
单链接头的合成：将上述20 ul的Adaptor序列与20 ul的Splinter序列组成40 ul反应体系，PCR仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s。
双链第二接头的获得：
按照一下序列信息合成两条序列：
5’CGACGCTCTTC-ddC 3’
5’Pho-GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 3’
双链第二接头的合成：总反应体系为50 ul:20 ul 500 µM 上链序列，20 ul 500 uM下链序列，9.5 ul TE buffer, 0.5 ul 5M NaCl；反应条件为：PCR仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s；反应结束后，加入50 ul的TE buffer。
相关试剂配制：
1xBWT+SDS Buffer：1 M NaCl，10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)，0.05%Tween-20，0.5% SDS；
0.1xBWT+SDS Buffer：0.1 M NaCl， 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA (pH8.0)， 0.05% Tween-20，0.5% SDS；
Stringency wash buffer：49.5 ml的ddH20， 250 ul的20%(wt/vol) SDS，250 ul的20× SSC buffer；
0.1xBWT Buffer：0.1 M NaCl，10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA (pH 8.0)，0.05% Tween-20；
TE Buffer：49.4 ml的ddH20，500 ul的1 M Tris-HCl(pH 8.0)，100 ul 的0.5 M EDTA(pH 8.0)。
步骤二、打断：根据提取FFPE样本的降解程度，选择打断或者不打断，
DNA的降解程度采用2%琼脂糖凝胶电泳进行判断，判断标准为
无降解 有主带，且主带大小大于2K
轻度降解 有主带，但主带范围在1K-2K之间
中度降解 无主带，条带弥散，片段范围在100bp-2kb之间
严重降解 无主带，片段大小小于500bp
DNA样本的打断标准为，严重降解的样本无需打断，直接进行下一步骤；如果为无降解或者轻度/中度降解的样本需要进行打断。
步骤三、磷酸化与热变性：反应体系为45.6 ul：8 ul 10 x T4 RNA连接buffer, 2ul 2% Tween 20,ul FastAP，x ul FFPE DNA；34.6-x ul ddH20；去磷酸化反应条件为：37℃，10min。变性条件为：95℃，2min；立即冰浴。
步骤四、生物素UID单链接头的连接：此步骤分为2个部分，1）单链接头的合成；2）单链接头与变性DNA的连接。反应体系为80 ul：32 ul 50 % PEG-8000； 0.4 ul 100 mMATP；1 ul 单链接头；1 ul T4 DNA Ligase；45.6 ul磷酸化变性产物，反应条件为：37℃，1h。
步骤五、磁珠捕获与洗脱：使用MyOne C1磁珠捕获片段，使用洗脱试剂进行洗脱：磁珠的准备：使用500 ul的1xBWT+SDS Buffer洗涤20 ul Myone C1磁珠两次，250 ul的1xBWT+SDS Buffer重悬；磁珠捕获：将连接产物95℃孵育1 min，快速转移至冰上，冰浴冷却2-5min，加入重悬磁珠250 ul，室温条件下摇管20min，磁力架上，弃上清，200 ul 0.1 xBWT+SDS重悬磁珠，磁力架上弃上清；洗脱去除Splinter序列：100 ul 45℃预热的Stringency wash buffer重悬磁珠，45℃加热振荡孵育3 min，磁力架上，弃上清，200 ul0.1 x BWT重悬磁珠，磁力架上，弃上清。
步骤六、引物退火与延伸：
延伸引物序列为：5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3’
延伸反应体系为：总体系为48 ul，39.1 ul ddH20，5 ul 10 x Klenow reactionbuffer，0.4 ul 25 mM dNTP，2.5 ul 1% Tween-20，1 ul退火引物，将其与上述磁珠混合；
延伸反应条件为：65℃，2 min，立即转移冰上冷却2-5min，加入2 ul Klenowfragment， 25℃，5 min，35℃，25min，期间每间隔2s，混匀样本60s。
延伸后洗脱：将延伸产物置磁力架上，弃上清，200 ul 0.1 x BWT+SDS Buffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清，100 ul Stringency wash buffer，45℃条件下重悬磁珠，45℃，热浴振荡3min，磁力架上，弃上清，200 ul 0.1 x BWT Buffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清。
步骤七、双链第二接头添加与洗脱：双链第二接头的添加，分为两个步骤：1）双链第二接头的合成；2）双链第二街头的连接。总反应体系为100 ul:73.5 ul ddH20，10 ul 10x T4 DNA 连接酶 buffer，10 ul 50% PEG-4000，2 ul双链第二接头(100 µM), 2.5 ul 1%Tween-20，2 ul T4 DNA连接酶，用反应液重悬延伸后洗脱的磁珠，反应条件为22℃，1h；连接后洗脱：连接产物磁力架上，弃上清，200 ul 0.1 x BWT+SDS Buffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清，100 ul Stringency wash buffer，45℃条件下重悬磁珠，45℃，热浴振荡3min，磁力架上，弃上清，200 ul 0.1 x BWT Buffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清，20 ul TEBuffer回溶磁珠，然后95℃，热浴2min。
LM-PCR扩增，引入barcode:
扩增引物序列为：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT 3’，
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT NNNNNNNN GTGACTGGAGTTCAGACGTGT 3’，其中每个粗体部分代表Barcode序列
LM-PCR反应体系为：总反应体系为50ul：25ul 2 x KAPA HiFi HotStart ReadyMixr，2.5 ul上游引物，2.5 ul下游引物，20 ul TE Buffer回溶的磁珠，进行PCR反应。
磁珠纯化PCR扩增产物：Beckman磁珠纯化PCR产物。
本发明针对FFPE组织样本等降解样本的二代测序建库时，提供一种解决办法，其次在建库的初期通过对每一个DNA进行标记，从而为后续排除因技术引入突变提供条件。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、FFPE样本DNA的提取；
步骤二、DNA片段化处理：确定提取的FFPE DNA样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；
步骤三、DNA的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶FastAP，对DNA5’与3’端去磷酸化；
步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链DNA进行连接；
步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；
步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dNTP、酶条件下，进行延伸反应；
步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链DNA分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；
步骤八、LM-PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的PCR反应，靶向富集DNA分子；
步骤九、磁珠纯化PCR扩增产物。
2.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述根据降解程度决定是否打断是指：根据凝胶电泳显示的降解程度，将提取的FFPE DNA样本分为四种类型：无降解，有主带且主带大小大于2K；轻度降解，有主带但主带范围在1K～2K之间；中度降解，无主带，条带弥散，片段范围在100bp～2kb之间；严重降解，无主带，片段大小小于500bp；严重降解的样本，无需打断，直接建库，无降解、轻度降解与中度降解的需要进行超声打断。
3.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤三中，去磷酸化反应体系为：8 ul 10x T4 RNA ligation Buffe；2 ul 2% Tween 20；1ulFastAP；x ul FFPE DNA；34.6-x ul ddH20；去磷酸化反应条件为35～39℃，6～15min，然后90～100℃变性1～5min，立即冰浴。
4.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤四中，单链接头为带有UID标签与Splinter序列的接头，其中UID标签用于标记每条单链DNA分子。
5.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤四中，连接酶为T4 DNA连接酶，连接反应的体系为：32 ul 50 % PEG-8000；0.4 ul 100 mMATP；1 ul 单链接头；1 ul T4 DNA Ligase；45.6 ul步骤三变性产物；连接反应温度35～39℃，反应时间35～80min。
6.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤五中，使用MyOne C1磁珠，进行捕获；文库洗脱过程中，先将样本90～100℃变性处理1～10min，立即冰浴后，进行洗脱Buffer，洗去Splinter序列，弃上清。
7.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤六中，延伸反应使用48 ul Buffer回溶磁珠，Buffer体系为：39.1 ul ddH20；5 ul 10 xKlenow reaction buffer；0.4 ul 25 mM dNTP；2.5 ul 1% Tween-20 和1 ul 延伸引物100uM；引物退火条件为：65℃，2 min。
8.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤七中，连接酶为T4 DNA连接酶，进行双链第二接头的添加，连接体系为：73.5 ul ddH20；10 ul10x T4 DNA 连接酶buffer；10 ul 50 % PEG-4000；2 ul 第二接头100uM；2.5 ul 1%Tween-20；2 ul T4 DNA 连接酶，连接条件为：15～30℃，反应时间35～80min。
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