CN109610011A - 一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，属于基因测序领域；所述NanoDNA超长伴随建库试剂盒组成原料包括：末端修复/dA尾添加模块45～55份，FFPE修补液45～55份以及纳米盘45～55份，所有原料均按重量份计算；所述NanoDNA超长伴随建库试剂盒使用方法包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序；所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒实用性强，其不仅能够使测序片段长短数据均匀化得到更长的测序片段，进而使测序产出数据量伸长，而且与现有技术中使用的DNA常规试剂盒Qaigene相比，所述NanoDNA超长伴随建库试剂盒廉价、便捷以及高效。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体是一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒及其使用方法。
背景技术
随着新一代的测序技术日趋成熟，对测序长度的要求也从原来Sanger最长测序片段1Kb，二代测序最长测序片段600bp再到PacBio SMRT最长测序片段22Kb，随着技术的发展Nanopore测序提出理论值提取DNA多长就可以测多长，而提取DNA测序片段已经可以平均达到1Mb以上甚至是6Mb，超长测序带来的基因研究益处也得到凸显。
如何让提取的DNA长度与测序的长度保持等长这是目前业内急需解决的问题，如：目前在为了能保持提取1Mb测序长度就是1Mb，大多都是靠昂贵的设备来完成，设备费用高达上百万元每台。常规流程中是DNA进行磁珠筛选建库，由于磁珠有其长度最大吸附片段能力限制，市面上常规磁珠最大吸附片段长度多保持在10-20kb，也就意味着提取多长的DNA片段都必须打断或分选出最长20kb的片段才可以上机测序或者是用随机输入片段，让测序片段长短数据无法均匀化得到一条更长的测序片段，由此带来的就是测序产出数据量的下降，测序长度降低。一个廉价、便捷、高效的试剂盒来配合现在日趋要求测序长度变长至关重要。
针对上述背景技术中的问题，本发明旨在提供一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒及其使用方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒及其使用方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其组成原料包括：末端修复/dA尾添加模块45～55份，FFPE修补液45～55份以及纳米盘45～55份，所有原料均按重量份计算。
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上30～60min，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为35ul，LLB25.5ul以及无菌无核酸水2.5ul。
作为本发明进一步的方案：所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPERepair Mix混合组成，FFPE Repair Buffer的使用体积为6.5ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2ul。
作为本发明再进一步的方案：使用Elution Buffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒实用性强，其不仅能够使测序片段长短数据均匀化得到更长的测序片段，进而使测序产出数据量伸长，而且与现有技术中使用的DNA常规试剂盒Qaigene相比，所述NanoDNA超长伴随建库试剂盒廉价、便捷以及高效，值得在基因测序领域推广与使用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其原料组成为：末端修复/dA尾添加模块45份，FFPE修补液45份以及纳米盘45份，所有原料均按重量份计算。
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
所述长片段DNA提取采取Qaigene常规试剂盒提取DNA方式。
所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上30min，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为35ul，LLB25.5ul以及无菌无核酸水2.5ul。
所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPE Repair Mix混合组成，FFPERepair Buffer的使用体积为6.5ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2ul；使用ElutionBuffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
实施例2
一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其原料组成为：末端修复/dA尾添加模块55份，FFPE修补液55份以及纳米盘55份，所有原料均按重量份计算。
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
所述长片段DNA提取采取Qaigene常规试剂盒提取DNA方式。
所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上60min，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为35ul，LLB25.5ul以及无菌无核酸水2.5ul。
所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPE Repair Mix混合组成，FFPERepair Buffer的使用体积为6.5ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2ul；使用ElutionBuffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
实施例3
一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其原料组成为：末端修复/dA尾添加模块50份，FFPE修补液50份以及纳米盘50份，所有原料均按重量份计算。
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
所述长片段DNA提取采取Qaigene常规试剂盒提取DNA方式。
所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上45min，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为35ul，LLB25.5ul以及无菌无核酸水2.5ul。
所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPE Repair Mix混合组成，FFPERepair Buffer的使用体积为6.5ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2ul；使用ElutionBuffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
实施例4
一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其原料组成为：末端修复/dA尾添加模块47份，FFPE修补液47份以及纳米盘47份，所有原料均按重量份计算。
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
所述长片段DNA提取采取Qaigene常规试剂盒提取DNA方式。
所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上40min，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为35ul，LLB25.5ul以及无菌无核酸水2.5ul。
所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPE Repair Mix混合组成，FFPERepair Buffer的使用体积为6.5ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2ul；使用ElutionBuffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
实施例5
一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其原料组成为：末端修复/dA尾添加模块52份，FFPE修补液52份以及纳米盘52份，所有原料均按重量份计算。
所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
所述长片段DNA提取采取Qaigene常规试剂盒提取DNA方式。
所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上50min，去除上清液后接着用浓度为70％的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为35ul，LLB25.5ul以及无菌无核酸水2.5ul。
所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPE Repair Mix混合组成，FFPERepair Buffer的使用体积为6.5ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2ul；使用ElutionBuffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
对比例：使用DNA常规试剂盒Qaigene并且采用业内认为很难实现长片段的宏基因组DNA测序方法。
通过对五个实施例以及一个对比例进行基因测序实验，宏基因组建库DNA片段收集50bp～97Kb，基因测序时间为30分钟；对基因测序测得的数据进行统计与分析，得出结果如表1所示：
表1
| 实验组 | 测序长度(kb) | 产生数据量(kb) |
| 实施例1 | 50 | 46 |
| 实施例2 | 46 | 41 |
| 实施例3 | 60 | 59 |
| 实施例4 | 58 | 56 |
| 实施例5 | 54 | 52 |
| 对比例1 | 11 | 25 |
通过对五个实施例与一个对比例进行对比，得出结论：
五个实施例的测序长度均长于对比例，五个实施例中，测序长度由大到小排序为：
实施例3＞实施例4＞实施例5＞实施例1＞实施例2，即实施例3的测序长度最长。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其特征在于组成原料包括：末端修复/dA尾添加模块45～55份，FFPE修补液45～55份以及纳米盘45～55份，所有原料均按重量份计算。
2.根据权利要求1所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒，其特征在于：末端修复/dA尾添加模块50份，FFPE修补液50份以及纳米盘50份，所有原料均按重量份计算。
3.一种如权利要求1-2任一所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：长片段DNA提取、可选进行的DNA修复、DNA双末端修复、DNA衔接头配对连接、DNA上样前准备、筛选回收后长片段DNA文库上样以及基因测序。
4.根据权利要求3所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：所述可选进行的DNA修复实施方式为：将提取的目标基因DNA片段和DNA修复混合液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，然后静置在磁力架纳米盘去吸附经过修复的DNA片段，去除上清液后接着用浓度为70%的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
5.根据权利要求4所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：所述DNA修复混合液由FFPE Repair Buffer以及FFPE Repair Mix混合组成，FFPE RepairBuffer的使用体积为6.5 ul，FFPE Repair Mix的使用体积为2 ul。
6.根据权利要求3所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：所述DNA双末端修复的实施方式为：将经过可选进行的DNA修复步骤得到的DNA片段、双II末端准备酶混合物以及双 II末端预混缓冲液放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上30～60min，去除上清液后接着用浓度为70%的乙醇洗涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，使纳米盘上吸附的DNA片段脱落，最后用无核酸酶水洗涤纯化脱落的DNA片段。
7.根据权利要求3所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：所述DNA衔接头配对连接具体实施方式为：将经过双末端修复得到的DNA片段、Blunt/TA连接酶以及Adapter Mix放入装有纳米盘的0.2mlPCR管中，轻摇后静置在磁力架纳米盘上，去除上清液后接着用ABB buffer涤纳米盘上吸附的DNA片段两次，最后使用Elution Buffer洗涤纳米盘上吸附的DNA片段，使米盘上吸附的DNA片段脱落。
8.根据权利要求7所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：使用Elution Buffer洗脱纳米盘上吸附的DNA片段动作轻柔，以一分钟摇晃5次到6次频率操作。
9.根据权利要求3所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：所述DNA上样前准备的实施方式为：将经过DNA衔接头配对连接步骤得到的DNA片段混合液800ul、RBF576ul以及无菌无核酸水624ul混合后从灌注口加入DNA测序仪后，盖上加样口静置5min，接着再从灌注口加入DNA片段混合液200ul。
10.根据权利要求3所述的NanoDNA超长伴随建库试剂盒的使用方法，其特征在于：所述筛选回收后长片段DNA文库上样具体实施方式为：将RBF 、LLB以及无菌无核酸水混合后滴加入加样口，盖上加样口后准备运行测序，RBF体积使用量为 35 ul，LLB25.5 ul以及无菌无核酸水2.5 ul。
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