KR20210141915A - 표적화된 핵산 라이브러리 형성을 위한 방법 - Google Patents

표적화된 핵산 라이브러리 형성을 위한 방법 Download PDF

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KR20210141915A
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아비다 바이오메드 인코포레이티드
헹 왕
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Abstract

본 개시물은 표적 서열의 증폭 및 분석을 위한 프로브의 표적화된 혼성체화 및/또는 근접 결찰을 제공한다. 표적 서열로의 프로브의 혼성체화는 직접적으로 이루어지거나 간접적인 회합을 통해 이루어질 수 있다.

Description

표적화된 핵산 라이브러리 형성을 위한 방법
본 개시물은 표적 서열의 증폭 및 분석을 위한 프로브의 표적화된 혼성체화 및/또는 근접 결찰을 제공한다.
교차 참조
본 출원은 2018년 11월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 62/770,585에 대한 우선권을 주장하며, 이것은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵산 표적 캡쳐 방법은, 예를 들어, 표적화된 시퀀싱을 위해 특정 유전자, 엑손, 및 다른 관심 있는 게놈 영역이 풍부화될 수 있게 한다. 하지만, 현재의 표적 캡쳐-기반 시퀀싱 방법은 다루기 힘들고 긴 프로토콜과 비용이 많이 드는 공정을 수반할 수 있다. 현재의 표적 캡쳐-기반 방법은 또한 작은 캡쳐 패널 (예를 들어, 500개 미만의 프로브)에 대해 낮은 온-타겟(on-target) 비율 및, 예를 들어, 프라이머 상호작용으로 인한 다중-PCR 앰플리콘-기반 표적 시퀀싱에 대해, 특히 분자 바코드(molecular barcode)를 가진 PCR 프라이머에 대해 낮은 유연성을 나타낼 수 있다. 더욱이, 현재의 핵산 표적 캡쳐 방법은 낮은 변환율로 인해 낮은 투입량 및 손상된 DNA에 부적당할 수 있다.
바이설파이트 변환은 핵산 분자의 메틸화 패턴을 연구하는데 유용한 기술일 수 있고 시퀀싱에 의해 메틸화를 연구하는데 사용될 수 있다. 하지만, 바이설파이트 변환은, 예를 들어, 절단을 생성함으로써, 핵산을 손상시킬 수 있다. 차세대 시퀀싱 (NGS) DNA 라이브러리가 바이설파이트로 처리되면, 상당한 양의 핵산이 손상될 수 있고 이후의 증폭 단계에서 회복될 수 없으며, 이로써 낮은 변환율을 제공한다. 더욱이, 바이설파이트 변환은 단일 가닥 또는 단편화된 DNA 및 감소된 서열 복잡성을 초래할 수 있기 때문에, 변환된 DNA는 통상적인 어댑터(adaptor)-결찰 기반 라이브러리 구성에 힘든 투입물이 될 수 있다. 바이설파이트 처리된 무세포 (cfDNA) 또는 전형적으로 작은 초기 투입량을 가진 순환 종양 세포 DNA (ctDNA)는 낮은 변환율 (예를 들어, 바이설파이트 처리된 cfDNA에 대해 5% 이하)을 고려하면 더 큰 도전을 제공할 수 있다. 이에 더하여, 바이설파이트 변환시, 임의의 비-메틸화된 "C"는 "U"로 변환될 수 있으며, 이것은 결국 PCR 증폭 후 "T"로 변환될 수 있다. 바이설파이트 변환 전 증폭은 메틸화 정보를 보존할 수 없을 수도 있기 때문에, 바이설파이트 변환 후 캡쳐가 더 흔하게 사용될 수 있다. 프로브 또는 PCR 프라이머 디자인 또는 생산은 바이설파이트 변환 후 서열을 기반으로 할 수 있고, 그것은 더 복잡한 공정이다. 바이설파이트 변환 전 캡쳐가 사용되면, 기존 시장의 프로토콜은 높은 DNA 투입량을 필요로 할 수 있다 (예를 들어, 250 ng 초과). 이러한 제약은 표적화된 영역이 현재의 프로브 캡쳐 또는 다중-PCR 접근법에 의해 풍부화되는 것을 어렵게 만들 수 있다.
그러므로, 더 효율적이고, 사용하기 쉽고, 빠르고, 유연하고, 실현 가능한 표적 핵산 캡쳐 방법 및 바이설파이트 처리된 핵산을 특히 cfDNA와 같은 낮은 투입량 샘플에 대해 분석하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 본원에서 개시된 방법은 매우 낮은 DNA 투입량 샘플에 대한 증폭 이전 및 바이설파이트 변환 이전의 혼성체화-기반 캡쳐에 사용될 수 있다.
캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계; 주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계; 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계; 및 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착된다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 제2 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계; 주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착된다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 제2 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계; 주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및 캡쳐 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 주형 핵산 분자에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 본원에서 개시된다. 방법은 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 제1 어댑터를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 방법은 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 주형 핵산 분자의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계; 주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및 표적 특이적 영역을 분리시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 표적 특이적 영역을 분리시키기 전에 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제1 브릿지(bridge) 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩(landing) 서열은 어댑터 앵커(anchor) 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및 주형 핵산 분자의 3' 단부를 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 어댑터 앵커 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 어댑터 앵커 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있다. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있다. 제1 브릿지 프로브는 제1 표적 특이적 영역과 제1 어댑터 랜딩 서열 사이에 제1 링커를 포함할 수 있다. 부착시키는 단계는 리가제로 주형 핵산 분자의 3' 단부를 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 결찰시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 어댑터 앵커 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착된다. 방법은 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물에서 제2 어댑터 프라이머를 제2 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은 제1 브릿지 결합 서열을 분리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 브릿지 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 제1 어댑터를 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 주형 핵산 분자의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 어댑터 앵커 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 서열 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있다. 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있다. 제2 브릿지 프로브는 제2 표적 특이적 영역과 제2 어댑터 랜딩 서열 사이에 제2 링커를 포함할 수 있다.
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있거나; 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있거나; 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있거나; 또는 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있다. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있으며; 제1 브릿지 프로브의 제1 링커 및 제2 브릿지 프로브의 제2 링커는 서로 혼성체화할 수 있다.
캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 표적 서열 영역은 주형 핵산 분자의 표적 서열을 기반으로 디자인될 수 있고, 주형 핵산의 표적 서열은 바이설파이트 처리 후 비-메틸화된 시토신을 보유할 수 있다. 방법은 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하여, 바이설파이트 처리의 생성물일 수 있는 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 표적 서열 영역은 바이설파이트 처리 후 주형 핵산 분자의 표적 서열을 기반으로 디자인될 수 있으며, 주형 핵산에서 비-메틸화된 시토신은 바이설파이트 처리 중에 우라실로 변환된다. 방법은 핵산 분자의 5' 단부를 탈인산화하여, 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브는 라벨을 더 포함할 수 있다. 방법은 브릿지 프로브를 라벨에 의해 캡쳐하는 단계를 더 포함할 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 라벨은 고체 지지체 상에 캡쳐될 수 있다. 고체 지지체는 비드(bead)일 수 있다. 비드는 라벨을 표적화하는 캡쳐 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 캡쳐 모이어티는 스트렙타비딘일 수 있다. 방법은 주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 부착시킨 후 캡쳐 프로브 및 주형 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 증폭된 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함할 수 있다. 시퀀싱은 차세대 시퀀싱을 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 단일 가닥 DNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 RNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 손상된 DNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (formalin fixed paraffin embedded: FFPE) 샘플로부터 유래될 수 있다. 주형 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 무세포 핵산은 무세포 DNA를 포함할 수 있다. 무세포 DNA는 순환 종양 DNA를 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 시험관 내(in vitro) DNA 복구 단계는 주형 핵산 분자 상에서 수행될 수 없다.
표적 서열에 혼성체화하고 표적 서열을 포함하는 주형에 부착된 프로브를 사용하여 표적 서열을 캡쳐하는 단계; 및 프로브에 부착된 표적 서열을 바이설파이트로 처리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 표적 서열로의 앵커 프로브의 부착을 용이하게 하는 브릿지 프로브를 사용하여 표적 서열을 캡쳐하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 앵커 프로브에 부착된 표적 서열을 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역 및 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착되는 5' 단부를 포함하는 캡쳐 프로브; 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 제1 어댑터 프라이머 (여기서 제1 어댑터 프라이머를 연장하는 것은 제1 연장 생성물을 생성함); 제1 연장 생성물에 부착된 제2 어댑터; 및 제2 어댑터에 혼성체화하는 제2 어댑터 프라이머를 포함하는 키트가 본원에서 개시된다. 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역을 포함하는 브릿지 프로브; 브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하는 브릿지 결합 서열 및 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 5' 단부를 포함하는 어댑터 앵커 프로브를 포함하는 키트가 본원에서 개시된다.
표적 특이적 영역의 5' 단부에서 제1 어댑터 위치를 더 포함하는 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계; 표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및 주형으로서 제1 어댑터를 사용하여 주형 핵산 분자의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 캡쳐 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 제1 연장 생성물의 5' 단부를 인산화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 제2 연장 생성물에 부착된다. 방법은 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은 제2 어댑터에 부착되는 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 결합 모이어티를 더 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다.
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및 제1 브릿지 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 제1 브릿지 프로브는 제1 어댑터를 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착된다. 방법은 제2 어댑터의 부착 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착될 수 있다. 방법은 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제1 브릿지 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 더 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다.
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되고, 제1 브릿지 프로브는 표적 특이적 영역의 5' 단부에 위치한 제1 어댑터를 더 포함하는 단계; 및 제1 표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및 주형으로서 제1 어댑터를 사용하여 주형 핵산 분자의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 어댑터를 부착시키기 전에 제1 연장 생성물의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 제2 연장 생성물에 부착된다. 방법은 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착될 수 있다. 방법은 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계는 주형 핵산 분자의 3' 단부에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 분열시킬 수 있다.
제1 브릿지 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 더 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다.
참조에 의한 통합
이 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 개개의 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된 것으로 나타나는 바와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 개시물의 신규한 특징들이 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 개시물의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 개시물의 원칙이 활용되는 예시의 구체예를 제시하는 다음 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1A-1C는 주형에서 표적 서열 (TS)로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화 및 이후의 증폭의 하나의 구체예를 예시한다. 도 1A는 TS로의 캡쳐 프로브의 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 근접 결찰을 나타낸다. 도 1B는 AD1 프라이머를 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 도 1C는 도 1B의 연장 생성물 및 주형으로의 제2 어댑터 (AD2)의 결찰 및 AD2 프라이머 및 AD1 프라이머를 사용한 TS의 추가의 증폭을 위해 제2 어댑터에 어닐링(anneal)하는 프라이머를 예시한다.
도 2A-2C는 주형 및 상이한 증폭 방법에서 표적 서열 (TS)로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화의 하나의 구체예를 예시한다. 도 2A는 표적 서열로의 캡쳐 프로브의 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 혼성체화를 나타낸다. 도 2B는 AD1 프라이머를 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 도 2C는 AD1 프라이머를 이용한 표적 서열의 추가의 증폭을 위한 표적 특이적 영역 (TSR) 프라이머의 사용을 예시한다.
도 3A-3C는 표적 서열 (TS)로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화 및 또 다른 증폭 방법의 구체예를 나타낸다. 도 3A는 표적 서열로의 캡쳐 프로브의 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 혼성체화를 나타낸다. 도 3B는 주형의 5' 단부의 인산화 및 프라이머로서 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역 (TSR) (캡쳐 프로브의 3' 단부)을 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 도 3C는 도 3B의 생성물로의 AD2 어댑터의 결찰 및 표적 서열의 추가의 증폭을 위해 AD1 및 AD2에 어닐링하기 위한 프라이머의 사용을 예시한다.
도 4A-4C는 표적 서열의 이후의 증폭을 촉진하기 위한 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역 (TSR)의 제거를 예시한다. 도 4A는 주형의 표적 서열로의 캡쳐 프로브의 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 근접 결찰을 나타낸다. 도 4B는 캡쳐 프로브의 TSR의 분열을 나타낸다. 도 4C는 캡쳐 프로브에서 AD1 서열에 어닐링되는 AD1 프라이머의 연장 및 표적 서열의 증폭을 나타낸다.
도 5A-5C는 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 간접적인 회합을 나타낸다. 도 5A는 어댑터 앵커 프로브 및 주형 둘 다로의 브릿지 프로브의 혼성체화로 인한 주형과 어댑터 앵커 프로브의 회합 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 이후의 결찰을 나타낸다. 표적-특이적 영역 (TSR)은 브릿지 프로브의 3' 부분에 위치한다. 도 5B는 AD1 프라이머를 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 도 5C는 도 5B의 생성물로의 AD2 어댑터의 결찰 및 AD1 및 AD2 프라이머를 사용한 추가의 증폭을 나타낸다.
도 6A-6C는 어댑터 앵커 프로브의 간접적인 회합 및 상이한 증폭 방법을 나타낸다. 도 6A는 어댑터 앵커 프로브 및 주형 둘 다로의 브릿지 프로브의 혼성체화로 인한 주형과 어댑터 앵커 프로브의 회합 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 이후의 결찰을 나타낸다. 표적-특이적 영역 (TSR)은 브릿지 프로브의 3' 부분에 위치한다. 도 6B는 AD1 프라이머를 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 도 6C는 표적 서열 및 AD1 프라이머의 보체에 어닐링되는 프라이머를 사용한 추가의 증폭을 나타낸다.
도 7A-7C는 브릿지 프로브를 사용한 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 간접적인 회합을 나타내며 표적 특이적 영역 (TSR)은 브릿지 프로브의 5' 부분에 위치한다. 도 7A는 어댑터 앵커 프로브 및 주형 둘 다로의 브릿지 프로브의 혼성체화로 인한 주형과 어댑터 앵커 프로브의 회합 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 이후의 결찰을 나타낸다. 도 7B는 AD1 프라이머를 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 브릿지 프로브, 주형, 및 어댑터 앵커 프로브 사이의 결합은 AD1 서열에 프라이머를 어닐링시키기 전에 변성될 수 있다. 도 7C는 도 7B의 생성물로의 AD2 어댑터의 결찰 및 AD1 및 AD2 프라이머를 사용한 추가의 증폭을 나타낸다.
도 8A-8C는 브릿지 프로브를 통한 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 간접적인 회합 및 브릿지 프로브의 표적 특이적 영역 (TSR)의 연장을 나타낸다. 도 8A는 어댑터 앵커 프로브 및 주형 둘 다로의 브릿지 프로브의 혼성체화로 인한 주형과 어댑터 앵커 프로브의 회합 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 이후의 결찰을 나타낸다. 도 8B는 프라이머로서 TSR (브릿지 프로브의 3' 단부)을 사용한 주형에 상보적인 가닥의 합성을 나타낸다. 도 8C는 도 8B의 생성물로의 AD2 어댑터의 결찰과 AD1 및 AD2 프라이머를 사용한 추가의 증폭을 나타낸다.
도 9는 주형 및 어댑터 앵커 프로브로의 다수의 브릿지 프로브의 혼성체화를 나타내며, 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 근접 결찰로 이어진다. 두 브릿지 프로브는 3' 부분에서 표적 특이적 영역 (TSR)을 포함한다.
도 10은 주형 및 어댑터 앵커 프로브로의 또 다른 세트의 브릿지 프로브의 혼성체화, 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 이후의 결찰을 나타낸다. 두 브릿지 프로브는 5' 부분에서 표적 특이적 영역 (TSR)을 포함한다.
도 11은 주형으로의 상이한 브릿지 프로브의 혼성체화 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 결찰을 나타낸다. 제1 브릿지 프로브는 3' 부분에서 표적 특이적 영역 (TSR)을 포함하고 제2 브릿지 프로브는 5' 부분에서 TSR을 포함하여, 두 브릿지 프로브의 링커의 혼성체화 및 안정한 조립으로 이어진다.
도 12는 주형으로의 브릿지 프로브의 혼성체화 및 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 결찰을 나타낸다. 제1 브릿지 프로브는 5' 부분에서 TSR을 포함하고 제2 브릿지 프로브는 3' 부분에서 TSR을 포함한다.
도 13A-B는 표적을 포함하는 주형으로의 프로브 결찰에 관하여 상이한 순서의 바이설파이트 처리를 이용한 표적 증폭에 대한 2개의 구체예를 예시한다. 도 13A는 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브로의 혼성체화 전에 DNA 투입물의 바이설파이트 처리를 나타낸다. 도 13B는 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브로의 혼성체화 및 근접 결찰 이후 DNA 투입물의 바이설파이트 처리를 나타낸다.
도 14는 결찰된 주형 DNA에 대한 바이설파이트 처리의 효과를 나타낸다. 바이설파이트 변환은 주형 DNA의 이중 가닥 부분을 온전하게 내버려두어, 주형 DNA의 비-바이설파이트 변환된 TS의 보체에 어닐링하도록 디자인된 TSR PCR 프라이머의 사용을 허용한다.
도 15A- 15B는 엑소뉴클레아제를 사용한 오프-타겟(off-target) 결찰 생성물의 선택적 제거를 위한 계획을 나타낸다.
도 16A-16B는 적절하게 결찰된 표적 주형 및 어댑터 앵커 프로브의 선택을 위한 고체상 캡쳐 방법을 나타낸다.
도 17A-17C는 시작 물질로서 ssDNA 또는 손상된 dsDNA를 사용하는 라이브러리 구성 방법을 나타낸다.
도 18A는 (1) 브릿지 프로브가 있거나 또는 (2) 없이 주형에 어댑터 앵커 프로브를 부착시키기 위한 개략도를 예시한다. 도 18B는 브릿지 프로브가 있는 설정에 대한 결찰된 주형 및 어댑터 앵커 프로브 생성물 (1); 브릿지 프로브가 없는 설정에 대한 결찰 생성물의 결핍 (2)에 대한 아가로스 겔 이미지를 나타낸다.
도 19A-19C는 주형 핵산으로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화 이후의 상이한 어댑터 추가 방법을 예시한다.
도 20A-20D는 브릿지 프로브와의 상호작용을 통한 어댑터 앵커 프로브와 주형 핵산의 간접적인 회합 이후의 상이한 어댑터 추가 방법을 나타낸다.
도 21A-21E는 브릿지 프로브와의 상호작용을 통한 주형 핵산과 어댑터 앵커 프로브의 간접적인 회합의 다양한 구성형태를 나타낸다.
도 22A-22G는 표적 프로브와 주형 핵산의 직접적인 혼성체화를 통한 어댑터 추가, 및 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 주형 핵산의 분해 단계를 예시한다.
도 23A-23F는 표적 프로브와 주형 핵산의 간접적인 회합을 통한 어댑터 추가, 및 브릿지 프로브의 연장 단계를 예시한다.
도 24A-24F는 표적 프로브와 주형 핵산의 간접적인 회합을 통한 어댑터 추가, 및 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 주형 핵산의 분해 단계를 예시한다.
도 25A-25D는 어댑터를 가진 폴리뉴클레오타이드 프라이머의 사용을 통한 어댑터 추가 단계를 예시한다.
도 26은 캡쳐 프로브에 의한 직접적인 혼성체화에 의한 어댑터 추가 및 합성 DNA 주형을 사용하여 주형 핵산의 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대한 실험의 개략적인 개요를 나타낸다.
도 27은 캡쳐 프로브에 의한 직접적인 혼성체화에 의한 어댑터 추가 및 단편화된 게놈 DNA를 사용하여 주형 핵산의 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대한 또 다른 실험의 개략적인 개요를 나타낸다.
I. 개요
표적화된 어댑터 근접 결찰 및 풍부화 (Targeted Adaptor proximity Ligation and Enrichment: TALE) 및 이후의 시퀀싱 (TALE-SEQ)을 위한 방법 및 키트가 본원에서 제공된다. TALE은 단일 단계에서 표적 풍부화 및 라이브러리 구성을 달성할 수 있다. TALE은 또한 투입물으로서 단일 가닥 DNA를 이용하고, 증폭 전에 표적 서열을 풍부화할 수 있다. 더욱이, 본원에서 개시된 방법 및 키트는 차세대 시퀀싱 (NGS)을 사용하여 낮은 변환율을 가질 수 있는 손상된 DNA를 사용할 수 있다. 본원에서 제공된 방법 및 키트는 공정 내 몇몇 단계와 관련된 더 작은 DNA 손실로 인해 더 높은 변환율 및 개선된 민감도를 제공할 수 있다. 게다가, 다수의 브릿지 프로브-어댑터 앵커의 사용은 캡쳐 특이성 및 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 방법 및 키트는 NGS의 표적 풍부화를 위한 빠르고 쉽고 유연한 디자인 및 저비용 해결책을 제공할 수 있다.
주형으로의 캡쳐 프로브의 표적화된 혼성체화 및 주형의 단부로의 캡쳐 프로브의 단부의 근접 부착, 및, 예를 들어, 부착된 어댑터를 이용하는 주형에서 표적 서열의 이후의 증폭을 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 다중-폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 분석과 비교하여 핵산 패널 디자인 유연성 및 실현 가능성을 개선할 수 있고 상당한 시간과 비용을 절약할 수 있다. 방법은 또한 높은 핵산 샘플 복잡성을 보존할 수 있고, 예를 들어, 투입물로서 손상된 DNA를 사용하여 높은 변환율로 인해 낮은 편향 제공을 특징으로 할 수 있다.
게다가, 본원에서 개시된 국소화된 표적 캡쳐 방법은 이중 가닥 DNA 복구 단계 및 지루한 프로브 혼성체화/풍부화를 제거할 수 있다. 개시된 방법은 단일 가닥 DNA, 손상된 DNA, 예를 들어, 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 샘플로부터 단편화된 DNA, 바이설파이트 처리된 DNA, 및 RNA 상에서 사용될 수 있다.
a. 직접적인 혼성체화 개요에 의한 표적화된 프로브 추가
직접적인 혼성체화 및 부착에 의해 표적 서열을 가진 주형 핵산 분자에 캡쳐 프로브를 선택적으로 부착시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 캡쳐 프로브는 주형 핵산 분자 내 특정 표적 서열에 혼성체화할 수 있는 표적 특이적 영역을 포함하도록 디자인되어 표적 주형에 혼성체화될 수 있다. 혼성체화로 인한 근접성은 주형 핵산 분자의 3' 단부로의 캡쳐 프로브의 5' 단부의 부착을 촉진할 수 있다. 캡쳐 프로브의 5' 단부는 리가제를 사용한 결찰에 의해 주형의 3' 단부에 부착될 수 있다. 캡쳐 프로브의 5' 단부는 주형 핵산 분자로의 결찰을 촉진하도록 인산화될 수있다. 주형 핵산 분자의 5' 단부는, 예를 들어, 주형 내 표적 서열로의 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역의 혼성체화 이전에 자가-결찰을 감소시키기 위해 탈인산화될 수 있다.
캡쳐 프로브는 증폭을 위한 프라이머 어닐링 부위의 역할을 하는 어댑터를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 주형 핵산 분자의 나중의 시퀀싱, 검출, 확인, 측정, 및/또는 분석을 위해 부착된 주형 핵산 분자를 고유하게 확인하기 위해 분자 바코드 (MB)를 더 포함할 수 있다.
b. 간접적인 회합 개요에 의한 표적화된 프로브 추가
개시된 방법은 또한 간접적인 회합 및 부착에 의해 표적 서열을 가진 주형 핵산 분자에 어댑터 앵커 프로브를 선택적으로 부착시키는 단계를 포함하는 특정 구체예를 포함한다. 브릿지 프로브는 주형 핵산 분자 내 특정 표적 서열에 혼성체화하도록 디자인되어 표적 주형에 혼성체화될 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 차례로 브릿지 프로브에 혼성체화하도록 디자인될 수 있고 브릿지 프로브에 혼성체화되어, 3개의 혼성체화된 핵산 분자의 조립체를 생성한다. 3개의 핵산 분자 사이에서 혼성체화로 인한 근접성은 주형 핵산 분자의 3' 단부로의 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부의 부착을 촉진할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부는 리가제를 사용한 결찰에 의해 주형의 3' 단부에 부착될 수 있다. 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부는 주형으로의 결찰을 촉진하도록 인산화될 수 있다. 주형 핵산 분자의 5' 단부는 자가 결찰을 감소시키기 위해 탈인산화될 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 증폭을 위한 프라이머 어닐링 부위의 역할을 하는 어댑터를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 주형 핵산 분자의 나중의 시퀀싱, 검출, 확인, 측정, 및/또는 분석을 위해 부착된 주형을 고유하게 확인하기 위해 분자 바코드를 더 포함할 수 있다.
c. 직접적인 혼성체화 개요에 의한 어댑터 추가
직접적인 혼성체화에 의해 표적 서열을 가진 주형 핵산 분자에 캡쳐 프로브를 선택적으로 혼성체화하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 개시된 방법은 주형 핵산에 표적 프로브를 부착시키거나 결찰시키지 않으면서 표적 프로브의 하나 이상의 어댑터를 연장 생성물에 추가하거나 통합시키는 단계를 포함하는 특정 구체예를 포함한다. 캡쳐 프로브는 주형 핵산 분자 내 특정 표적 서열에 혼성체화할 수 있는 표적 특이적 영역을 포함하도록 디자인되어 표적 주형에 혼성체화될 수 있다. 캡쳐 프로브는 증폭을 위한 프라이머 어닐링 부위의 역할을 할 수 있는 어댑터를 더 포함할 수 있다. 어댑터는 표적 특이적 영역의 5' 단부에 위치할 수 있다.
캡쳐 프로브와 혼성체화되면, 주형 핵산 분자는 주형 핵산의 임의의 3' 돌출부를 분해시키기 위해 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉될 수 있다. 분해 후, 주형 핵산 분자의 3' 단부는 어댑터에 상보적인 서열을 포함하는 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다.
어떤 경우에, 캡쳐 프로브 및 주형 핵산의 혼성체화시, 캡쳐 프로브의 3' 단부는 어댑터를 포함하는 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다.
캡쳐 프로브는 주형 핵산 분자의 나중의 시퀀싱, 검출, 확인, 측정, 및/또는 분석을 위해 부착된 주형 핵산 분자를 고유하게 확인하기 위해 분자 바코드를 더 포함할 수 있다.
d. 간접적인 회합 개요에 의한 어댑터 추가
개시된 방법은 또한 브릿지 프로브를 주형 핵산에 선택적으로 혼성체화하는 단계를 포함하는 특정 구체예를 포함한다. 개시된 방법은 표적화된 프로브를 주형 핵산에 부착시키거나 결찰시키지 않으면서 브릿지 프로브의 하나 이상의 어댑터를 연장 생성물에 추가하거나 통합시키는 단계를 포함하는 특정 구체예를 포함한다. 브릿지 프로브는 주형 핵산 분자 내 특정 표적 서열에 혼성체화하도록 디자인되어 표적 주형에 혼성체화될 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 차례로 브릿지 프로브에 혼성체화하도록 디자인될 수 있고 브릿지 프로브에 혼성체화되어, 3개의 혼성체화된 핵산 분자의 조립체를 생성할 수 있다. 다수의 혼성체화 조립체는 시너지 작용하여 복합체에 더 많은 안정성을 제공할 수 있다. 브릿지 프로브는 증폭을 위한 프라이머 어닐링 부위의 역할을 할 수 있는 어댑터를 더 포함할 수 있다. 어댑터는 표적 특이적 영역의 5' 단부에 위치할 수 있다.
캡쳐 프로브와 혼성체화시, 주형 핵산 분자는 주형 핵산의 임의의 3' 돌출부를 분해시키기 위해 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉될 수 있다. 분해 후, 주형 핵산 분자의 3' 단부는 어댑터에 상보적인 서열을 포함하는 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다. 브릿지 프로브의 3' 단부는 또한 브릿지 프로브와 주형의 혼성체화시 어댑터를 포함하는 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다.
브릿지 프로브는 주형 핵산 분자의 나중의 시퀀싱, 검출, 확인, 측정, 및/또는 분석을 위해 부착된 주형 핵산 분자를 고유하게 확인하기 위해 분자 바코드 (MB)를 더 포함할 수 있다.
II. 직접적인 혼성체화에 의한 프로브 추가
본원에서 개시된 방법은 주형으로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화 및 결찰을 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 프라이머가 혼성체화될 수 있는 어댑터를 포함할 수 있다. 증폭은 시퀀싱 및/또는 라이브러리 구성을 위한 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.
a. 어댑터를 사용한 표적화된 프로브 근접 결찰 및 증폭
캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계; 주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계; 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계; 및 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다.
캡쳐 프로브는 주형을 고유하게 확인하고 및/또는 주형 핵산 분자에 대한 캡쳐 프로브의 특이성을 보장하기 위해 고유한 확인 서열을 가진 분자 바코드 (MB)를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 주형 핵산 분자로의 어댑터, 예를 들어, 이중 가닥 제2 어댑터의 하나의 가닥의 결찰을 촉진하기 위해 5' 단부에서 인산화될 수 있다. 주형 핵산 분자를 증폭시키기 위해, 제2 어댑터에 혼성체화하는 제2 어댑터 프라이머는 제1 어댑터 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 프라이머는 주형 핵산 분자를 증폭시키기 위해 제1 어댑터 프라이머와 함께 사용될 수 있다.
도 1A는 주형 핵산 분자로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 결찰의 방법을 예시한다. 핵산, 예를 들어, 표적 서열 (해시 마크(hash mark), TS)을 함유하는 이중 가닥 (ds) DNA가 주형으로 사용될 수 있다. 가닥 중 하나가 손상될 수 있다 (예를 들어, 닉 발생(nicked)). 캡쳐 프로브는 주형의 TS에 상보적인 표적 특이적 영역 (TSR) 및 제1 어댑터 (AD1)를 포함한다. 캡쳐 프로브의 5' 단부는 인산화될 수 있다. 주형은 5' 단부에서 탈인산화될 수 있다. 캡쳐 프로브의 TSR은 주형의 TS에 혼성체화될 수 있고 캡쳐 프로브의 인산화된 5' 단부는 혼성체화 이후 근접성으로 인해 주형의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 제1 어댑터 프라이머 (AD1 프라이머)는 캡쳐 프로브의 제1 어댑터 (AD1)에 혼성체화될 수 있고, 예를 들어, 도 1B에서 나타난 바와 같이 상보적인 가닥을 합성하기 위한 가닥 대체 메커니즘으로 연장될 수 있다. 도 1C는 TS의 추가의 증폭을 위한 결찰된 제2 어댑터 (AD2)의 사용을 예시한다. 이중 가닥 AD2는 주형 및 그것의 연장 생성물에 결찰될 수 있고 PCR은 각 단부에서 AD1 및 AD2에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 수행되며, 이로써 TS를 증폭시키고 라이브러리를 생성할 수 있다. 어떤 경우에, 단일 가닥 AD2 어댑터는 연장 생성물의 3'에 결찰된다. 캡쳐 프로브는 이후의 분석에서 주형을 고유하게 확인하기 위한 고유한 분자 바코드 (MB)를 포함할 수 있다.
캡쳐 프로브가 주형에 부착되면 상이한 프라이머가 증폭에 이용될 수 있다. 도 2C에서 나타난 바와 같이, 표적 서열 (TS)은 AD1 및 TS의 보체에 혼성체화하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 프라이머는 TS의 보체에 플랭킹하는 영역 (예를 들어, TS의 보체의 5' 또는 3')에 어닐링되도록 디자인될 수 있다.
TSR은 주형에 캡쳐 프로브를 결찰시킨 후 캡쳐 프로브로부터 분리 또는 분열될 수 있다. 분열은 헤어핀 루프(hairpin loop)를 제거할 수 있다. 원래의 주형 가닥은 TSR 및 TS의 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 결찰에 의해 형성된 헤어핀 루프가 AD1로의 프라이머 어닐링 및 이후의 연장을 방해할 수 있기 때문에 PCR 반응에 바람직한 주형이 아닐 수도 있다. TSR은, 예를 들어, 도 4A 및 4B에서 나타난 바와 같이, 주형으로의 캡쳐 프로브의 근접 결찰 이후, 예를 들어, TSR의 5' 단부와 AD1의 3' 단부 사이에서, 예를 들어, 제한 효소에 의해 분열될 수 있다. 분열된 TSR은 주형으로부터 제거될 수 있고 AD1 프라이머는 TSR이 제거된 후 주형을 증폭시키기 위한 연장 반응에 사용될 수 있다 (예를 들어, 도 4C 참조).
b. TSR을 사용한 표적화된 프로브 근접 결찰 및 증폭
캡쳐 프로브의 3' 단부는 별개의 연장 프라이머를 필요로 하지 않으면서 주형 핵산 분자에 상보적인 가닥을 합성하기 위한 연장 프라이머의 역할을 할 수 있다. 도 3A-3C는 주형으로의 캡쳐 프로브의 근접 결찰 후 주형을 증폭시키기 위한 캡쳐 프로브의 TSR 영역의 가능한 사용을 예시한다. 혼성체화된 캡쳐 프로브는 그것의 5' 단부가 주형의 3' 단부에 결찰되면 헤어핀 루프를 형성할 수 있다 (예를 들어, 도 3A 및 도 3B 참조). TSR (캡쳐 프로브의 3' 단부에서)은 프라이머와 유사한 주형의 5' 단부를 향해 연장되어, 주형에 혼성체화된 상보적인 서열을 형성할 수 있다 (예를 들어, 도 3B-3C 참조). 이중 가닥 AD2는 루프형(looped) 연장된 주형의 단부에 결찰될 수 있다 (예를 들어, 도 3C 참조). 어떤 경우에, 단일 가닥 AD2 어댑터는 주형의 5' 단부에 결찰될 수 있다. 주형의 5' 단부는 AD2의 가닥이 주형에 결찰된다는 것을 보장하도록 인산화될 수 있다. 그 다음에 주형 가닥은 AD1 및 AD2 서열에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 추가로 증폭될 수 있다 (예를 들어, 도 3C 참조).
III. 간접적인 회합에 의한 프로브 추가
프로브는 주형과 간접적으로 회합되고 주형에 근접 결찰될 수 있다. 이 방법은 캡쳐 프로브 패널의 디자인에 유연성을 제공할 수 있고 결찰 후 주형으로부터 TSR의 분리를 허용할 수 있다. 브릿지 프로브는 주형의 TS에 혼성체화하는 TSR 및 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열 (BBS)에 혼성체화하는 어댑터 랜딩 서열 (ALS)을 포함할 수 있다. 주형과 브릿지 프로브 사이 및 브릿지 프로브와 어댑터 앵커 프로브 사이의 혼성체화는 어댑터 앵커 프로브를 주형에 가까이 가져와서, 주형으로의 어댑터 앵커 프로브의 결찰을 촉진할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 AD1, 고유한 식별자, MB, 및 5' 포스페이트를 더 포함할 수 있다.
a. 어댑터를 사용한 표적화된 프로브 근접 결찰 및 증폭
주형 핵산 분자의 제1 표적 서열 (TS)에 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR)을 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열 (ALS)은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열 (BBS)에 결합되는 단계; 및 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 주형 핵산 분자의 3'을 부착시켜 (예를 들어, 결찰시켜), 어댑터 앵커 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다 (예를 들어, 도 5A 및 도 6A 참조). 제1 브릿지 프로브는 표적 특이적 영역 (TSR)과 ALS를 연결하는 링커를 더 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 5A 및 도 6A 참조).
어댑터 앵커 프로브는 이후의 분석에서 주형을 고유하게 확인하기 위해 (예를 들어, 도 5A 및 도 6A 참조) 및/또는 주형 핵산 분자에 대한 캡쳐 프로브의 특이성을 보장하기 위해 고유한 확인 서열을 가진 MB를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 주형 핵산 분자로의 제2 어댑터 (예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 어댑터)의 하나의 가닥의 결찰을 촉진하기 위해 5' 단부에서 인산화될 수 있다 (예를 들어, 도 5A 및 도 6A 참조). 주형 핵산 분자를 증폭시키기 위해, 제2 어댑터에 혼성체화하는 제2 어댑터 프라이머가 제1 어댑터 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 어떤 경우에, 주형 핵산 분자의 표적 서열 (TS)의 보체에 혼성체화하는 프라이머는 주형 핵산 분자를 증폭시키기 위해 제1 어댑터 프라이머와 함께 사용될 수 있다 (예를 들어, 도 6C 참조). 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR)은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있다 (예를 들어, 도 5A 및 6A 참조). 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR)은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있다 (예를 들어, 도 7A 참조). 어댑터 앵커 프로브는 브릿지 프로브를 통해 주형과 회합될 수 있고 어댑터 앵커 프로브의 인산화된 5' 단부는 주형의 3' 단부에 결찰되어, 주형에 어댑터 앵커 프로브의 AD1 및 MB를 부착시킬 수 있다 (예를 들어, 도 5A, 6A, 7A, 및 8A 참조). 결찰된 주형은 AD1 및 AD2에 어닐링되는 프라이머 (예를 들어, 도 5C 및 7C 참조) 또는 AD1 및 TS의 보체에 어닐링되는 프라이머 (예를 들어, 도 6C 참조)를 사용하여 증폭될 수 있다. 어댑터 앵커 프로브에 TSR이 없을 수 있고; 어댑터 앵커 프로브에 TSR이 없을 때, 주형으로 이중 가닥을 형성할 수 없다. 어떤 경우에, 어댑터 앵커 프로브와 주형 사이의 직접적인 혼성체화는 프라이머 어닐링, 예를 들어, 어댑터 앵커 프로브에서 AD1 어댑터로의 AD1 프라이머의 어닐링을 방해할 수 있다.
b. TSR을 사용한 표적화된 프로브 근접 결찰 및 증폭
제1 브릿지 프로브의 3' 단부에서 TSR은 제1 연장 생성물을 생성하기 위해 프라이머와 유사하게 연장될 수 있다 (예를 들어, 도 8B 참조). 제2 어댑터 (AD2)는 제1 연장 생성물에 부착될 수 있고 AD2 프라이머는 주형을 증폭시키기 위해 AD1 프라이머와 함께 사용될 수 있다 (예를 들어, 도 8C 참조). AD2는 이중 가닥일 수 있고 주형 및 제1 연장 생성물에 부착될 수 있고, 주형의 5' 단부의 인산화에 의해 촉진될 수 있다 (예를 들어, 도 8C 참조). 어떤 경우에, AD2는 단일 가닥이고 주형의 5' 단부에 결찰된다. 다른 구체예에서, 표적 서열은 AD1 및 TS의 보체에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
도 8A-8C는 TSR (브릿지 프로브의 3' 단부)을 사용한 연장 반응의 예를 예시한다. 브릿지 프로브의 3' 단부에서 TSR은 주형에 상보적인 서열을 가진 제1 연장 생성물을 합성하기 위해 연장 프라이머의 역할을 할 수 있다 (예를 들어, 도 8B 참조). 주형의 5' 단부는 이중 가닥 AD2의 결찰을 촉진하기 위해 인산화될 수 있다 (예를 들어, 도 8C 참조). 어떤 경우에, 단일 가닥 AD2는 주형의 5' 단부에 결찰된다. 주형은 AD1 및 AD2 서열에 어닐링되는 프라이머 세트 (또는 AD2의 보체)에 의해 증폭될 수 있다.
c. 다수의 표적화된 프로브 브릿지 프로브의 혼성체화 및 근접 결찰
방법은 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열 (TS2)에 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역 (TRS2)을 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열 (ALS2)은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열 (BBS2)에 결합된다 (예를 들어, 도 9-12 참조). 제2 브릿지 프로브는 제2 표적 특이적 영역 (TSR2)과 ALS2를 연결하는 링커를 더 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 9-12 참조). 제2 브릿지 프로브는 제2 표적 특이적 영역 (TSR2)과 제2 어댑터 랜딩 서열 (ALS2) 사이에 제2 링커를 포함할 수 있다.
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR1)은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역 (TSR2)은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있으며, 예를 들어, 도 9에서 예시된 바와 같다. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR1)은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역 (TSR2)은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있다 (예를 들어, 도 10 참조). 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR1)은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역 (TSR2)은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있다 (예를 들어, 도 12 참조). 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역 (TSR1)은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있을 수 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역 (TSR2)은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있을 수 있다 (예를 들어, 도 11 참조). 제1 브릿지 프로브의 링커는 제2 브릿지 프로브의 링커에 더 혼성체화할 수 있다. 제1 브릿지 프로브와 제2 브릿지 프로브의 혼성체화는 4개의 핵산 분자 조립체를 안정화시킬 수 있고 주형의 3' 단부로의 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부의 결찰을 촉진할 수 있다 (예를 들어, 도 11 참조).
2개 초과의 브릿지 프로브가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 75, 100개, 또는 그 이상의 브릿지 프로브가 본원에서 기재된 방법에서 주형과 어댑터 앵커 프로브를 연결하는데 사용될 수 있다.
IV. 직접적인 혼성체화에 의한 어댑터 추가
본원에서 개시된 방법은 캡쳐 프로브과 주형 핵산의 직접적인 혼성체화, 뿐만 아니라 연장 생성물로의 캡쳐 프로브의 어댑터의 추가 또는 통합을 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 어댑터를 포함할 수 있으며, 여기에서 프라이머가 혼성체화될 수 있다. 증폭은 시퀀싱 및/또는 라이브러리 구성에 대한 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다. 어댑터 추가는 또한 주형 핵산에 캡쳐 프로브를 결찰시키지 않으면서 실행될 수 있다.
주형 핵산 분자는 저투입량 샘플, 예컨대 무세포 DNA (cfDNA) 및 순환 종양 DNA (ctDNA)로부터 캡쳐되고 풍부화될 수 있다. 캡쳐 및 풍부화는 캡쳐 프로브와의 직접적인 혼성체화에 의해 실행될 수 있다. 캡쳐 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
도 19A-19C는 주형 핵산으로의 캡쳐 프로브의 직접적인 혼성체화 이후 다양한 어댑터 추가 또는 통합 방법을 예시한다. 표적 서열 (해시 마크, TS)을 함유하는 핵산이 주형으로 사용될 수 있다. 캡쳐 프로브는 주형의 TS에 상보적인 표적 특이적 영역 (TSR) 및 어댑터 (AD)를 포함할 수 있다. 도 19A는 캡쳐 프로브와 주형 핵산의 혼성체화 또는 캡쳐에 이어서, 주형으로의 어댑터의 직접적인 부착을 나타낸다. 도 19C는 주형으로의 혼성체화 이후 주형으로의 어댑터를 포함한 캡쳐 프로브의 부착을 나타낸다. 표적 서열 (해시 마크, TS)을 함유하는 핵산이 주형으로 사용될 수 있다. 캡쳐 프로브는 주형의 TS에 상보적인 표적 특이적 영역 (TSR) 및 어댑터 (AD)를 포함할 수 있다.
a. 엑소뉴클레아제 분해 후 어댑터 추가
캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 캡쳐 프로브는 표적 특이적 영역의 5' 단부에서 제1 어댑터 위치를 더 포함하는 단계; 표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 주형 핵산 분자의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 방법은 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함한다. 어떤 경우에, 캡쳐 프로브의 3' 단부는 제2 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다.
도 19B는 캡쳐 프로브와 주형 핵산 분자의 혼성체화 또는 캡쳐에 이어서, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제로의 단일 가닥 3' 돌출부의 분해를 예시한다. 분해 후, 주형 핵산은 주형으로서 캡쳐 프로브의 어댑터를 사요하여 연장되며, 따라서 어댑터를 연장 생성물에 통합시킨다.
도 22A-22G는 혼성체화, 분해, 및 연장 단계를 추가로 예시한다. 도 22E는 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계로서, 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착되는 단계; 및 표적 특이적 프라이머를 연장시켜 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 나타낸다. 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물은 도 22G의 증폭된 생성물을 생성하기 위해 더 증폭될 수 있다.
어떤 경우에, 개시된 방법은 도 22F에서 나타난 바와 같이 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 5' 단부에 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 제1 연장 생성물의 5' 단부는 제2 어댑터의 부착을 촉진하기 위해 인산화될 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있으며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 제2 연장 생성물에 부착된다. 제2 어댑터의 부착 후, 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물은 도 22G의 증폭된 생성물을 생성하기 위해 증폭될 수 있다.
b. 캡쳐 프로브 연장 후 어댑터 추가
혼성체화된 또는 캡쳐된 주형 핵산 분자는 또한 별개의 연장 프라이머에 대한 필요 없이 캡쳐 프로브의 3' 단부를 연장시켜 제1 연장 생성물을 생성함으로써 증폭될 수 있다. 캡쳐 프로브는 어댑터를 포함할 수 있다.
방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 주형 핵산의 5' 단부는 주형으로의 제2 어댑터의 부착 또는 결찰을 촉진하기 위해 인산화될 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있다. 이중 가닥 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착될 수 있다. 제2 어댑터 프라이머는 제1 연장 생성물에 부착된 제2 어댑터에 혼성체화되고 연장되어 제2 연장 생성물을 생성할 수 있다. 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물은 증폭된 생성물을 생성하기 위해 증폭될 수 있다.
어떤 경우에, 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물에 혼성체화될 수 있다. 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물에 상보적인 가닥 (제2 연장 생성물)을 합성하기 위해 연장될 수 있다. 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물은 증폭되어 더 많은 증폭된 생성물을 형성할 수 있다.
어댑터는 직접적인 또는 간접적인 상호작용을 통해 어댑터에 부착된 혼성체화된 표적 프로브를 연장시킴으로써 연장 생성물에 추가될 수 있다 (도 25A, 상단 및 중간 참조). 티민은 말단 뉴클레아제 트랜스퍼라제에 의해 DNA 주형에 추가될 수 있다 (도 25A, 하단 참조). 폴리-아데닌 (폴리A) 올리고뉴클레오타이드는 연장된 주형의 3'-폴리T에 혼성체화될 수 있다. 도 25B에서 예시된 바와 같이, 폴리A 올리고뉴클레오타이드는 폴리A의 3' 단부가 연장될 때, 제1 연장 생성물에 제1 어댑터를 포함할 수 있도록 어댑터에 부착될 수 있다. 폴리-시토신 (폴리C)은 연장 생성물의 3' 단부에 추가될 수 있으며, 이것은 제2 어댑터에 부착된 폴리-구아닌 (폴리G) 프라이머와 상보적으로 결합할 수 있다 (도 25C 참조). 폴리G-어댑터는 뉴클레오타이드 추가 공정이 계속되고 제2 어댑터가 제1 연장 생성물에 추가되도록 주형의 역할을 할 수 있다 (도 25D 참조).
V. 간접적인 회합에 의한 어댑터 추가
표적 프로브 혼성체화는 주형 핵산 및 조립체를 형성하는 하나 이상의 프로브의 시너지 상호작용에 의해 촉진될 수 있다. 다중-복합 조립체는 주형과 표적 프로브 사이에서 혼성체화 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 브릿지 프로브는 주형의 표적 영역에 혼성체화하는 표적 특이적 영역 및 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열 (BBS)에 혼성체화하는 어댑터 랜딩 서열 (ALS)을 포함할 수 있다. 주형과 브릿지 프로브 사이 및 브릿지 프로브와 어댑터 앵커 프로브 사이의 혼성체화는 다중-복합 조립체를 형성할 수 있다. 브릿지 프로브는 AD1, 고유한 식별자, MB, 및/또는 5' 포스페이트를 더 포함할 수 있다. 연장 생성물은 브릿지 프로브를 사용하여 합성될 수 있다. 어댑터는 또한 브릿지 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브를 주형 핵산에 결찰시키지 않으면서 연장 생성물로 추가되거나 통합될 수 있다. 2개 초과의 브릿지 프로브가 본원에서 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 75, 100대, 또는 그 이상의 브릿지 프로브가 주형과 어댑터 앵커 프로브를 연결하는데 사용될 수 있다.
주형 핵산은 무세포 DNA (cfDNA) 및 순환 종양 DNA (ctDNA)와 같은 저투입량 샘플로부터 캡쳐 및 풍부화될 수 있다. 캡쳐 및 풍부화는 브릿지 프로브와의 혼성체화를 통한 어댑터 앵커 프로브와의 간접적인 회합에 의해 실행될 수 있다. 브릿지 프로브 및/또는 어댑터 앵커 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
도 20A-20D는 브릿지 프로브 및 어댑터 앵커 프로브와의 혼성체화 또는 캡쳐 이후 어댑터를 주형 핵산에 추가하거나 통합시키는 상이한 방법을 나타낸다. 도 20A는 캡쳐된 주형 핵산으로의 어댑터의 결찰을 예시한다. 도 20D는 혼성체화 이후 주형으로의 어댑터를 포함하는 어댑터 앵커 프로브의 근접 결찰을 나타낸다.
방법은 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다 (예를 들어, 도 21A-21E 참조). 제2 브릿지 프로브는 제2 표적 특이적 영역과 제2 어댑터 랜딩 서열을 연결하는 링커를 더 포함할 수 있다.
a. 브릿지 프로브 연장 후 어댑터 추가
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있는 단계; 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있는 단계; 및 제1 브릿지 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 제1 브릿지 프로브는 제1 어댑터를 포함할 수 있다.
방법은 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터일 수 있다. 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착될 수 있다. 제2 어댑터를 주형에 부착시키기 전에, 주형 핵산 분자의 5' 단부는 인산화될 수 있다.
대안으로, 표적 특이적 프라이머는 제1 연장 생성물에 혼성체화될 수 있고 제2 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다. 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착될 수 있다. 제1 어댑터를 포함하는 프라이머는 제2 연장 생성물에 혼성체화될 수 있고 제3 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다. 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시키는 것은 추가의 증폭된 생성물을 생성할 수 있다.
도 20B는 주형으로서 표적 핵산 분자를 사용하여 브릿지 프로브의 3' 단부를 연장시킴으로써 연장 생성물로의 어댑터의 통합을 나타낸다.
도 23A-23F는 연장 생성물에서 하나 이상의 어댑터의 통합을 예시한다. 도 23A-23C는 제1 브릿지 프로브, 뿐만 아니라 제1 연장 생성물의 혼성체화 및 연장을 나타낸다. 표적 특이적 프라이머는 제1 연장 생성물에 혼성체화될 수 있고 제1 연장 생성물에 상보적인 가닥을 합성하기 위해 연장될 수 있으며, 제1 어댑터를 포함하는 프라이머는 제2 연장 생성물에 상보적인 서열을 생성하기 위해 제2 연장 생성물에 혼성체화될 수 있다 (도 23D 참조). 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물은 도 23F에서 나타난 증폭된 생성물을 생성하기 위해 증폭될 수 있다. 또 다른 경우에, 제2 (이중 가닥) 어댑터는 제1 연장 생성물의 3' 단부 및 주형 핵산 분자의 5' 단부에 부착될 수 있다 (도 23E 참조). 주형 핵산 분자의 5' 단부는 제2 어댑터의 부착 전에 인산화될 수 있다. 브릿지 프로브는 주형 핵산 분자의 나중의 시퀀싱, 검출, 확인, 측정, 및/또는 분석을 위해 부착된 주형을 고유하게 확인하기 위해 연장 생성물에 포함될 수 있는 분자 바코드를 더 포함할 수 있다.
어댑터는 어댑터에 부착된 혼성체화된 브릿지 프로브를 연장시킴으로써 연장 생성물에 추가되거나 통합될 수 있다. 어댑터는 또한 주형 핵산 분자로의 3' 프라이머 연장을 먼저 수행함으로써 연장 생성물에 추가될 수 있다. 폴리-티민 (폴리T) 올리고뉴클레오타이드는 말단 핵 트랜스퍼라제에 의해 DNA 주형의 3' 단부에 추가될 수 있다. 폴리-아데닌 (폴리A) 올리고뉴클레오타이드는 연장된 주형의 3'-폴리T에 혼성체화될 수 있다. 폴리A 올리고뉴클레오타이드는 폴리A의 3' 단부가 연장될 때, 제1 연장 생성물이 제1 어댑터를 포함할 수 있도록 어댑터에 부착될 수 있다. 폴리-시토신 (폴리C)은 제1 연장 생성물의 3' 단부에 추가될 수 있으며, 이것은 제2 어댑터에 부착된 폴리-구아닌 (폴리G) 프라이머와 상보적으로 결합할 수 있다. 폴리G-어댑터는 주형으로서 역할을 할 수 있고, 제1 연장 생성물은 제2 어댑터를 추가하기 위해 더 연장될 수 있다.
b. 엑소뉴클레아제 분해 후 어댑터 추가
브릿지 프로브와 혼성체화시, 주형은 단일 가닥 3' 돌출부를 가질 수 있다. 3' 돌출부는 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제로서 작용하는 효소로 분해될 수 있다.
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되고, 제1 브릿지 프로브는 표적 특이적 영역의 5' 단부에 위치한 제1 어댑터를 더 포함하는 단계; 및 표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및 주형으로서 제1 어댑터를 사용하여 주형 핵산 분자의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다 (도 20C 참조).
도 24A-24F는 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제로 분해된 후 연장 생성물에서 하나 이상의 어댑터를 통합시키는 단계를 추가로 예시한다. 도 24A-24C는 주형 및 어댑터 앵커 프로브로의 다수의 브릿지 프로브의 혼성체화에 이어서, 제1 어댑터에 상보적인 서열을 포함하는 제1 연장 생성물을 생성하기 위해 주형으로서 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터를 사용한 주형의 3' 단부의 연장을 나타낸다. 제1 연장 생성물은 제1 어댑터를 포함하는 프라이머와 혼성체화될 수 있고 프라이머의 3' 단부는 제2 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다 (도 24D-24E 참조). 표적 특이적 프라이머는 제2 연장 생성물에 혼성체화될 수 있고 3' 단부는 제3 연장 생성물을 생성하기 위해 연장될 수 있다 (도 24D 참조). 제2 어댑터는 제1 연장 생성물로의 표적 특이적 프라이머의 혼성체화 전에 표적 특이적 프라이머에 부착될 수 있다. 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물은 더 많은 증폭된 생성물을 생성하기 위해 증폭될 수 있다 (도 24F 참조). 도 24E에서 예시된 바와 같이, 제2 (이중 가닥) 어댑터는 제1 연장 생성물의 5' 단부 및 제2 연장 생성물의 3' 단부에 부착될 수 있다. 제1 연장 생성물은 제2 어댑터로의 부착 전에 인산화될 필요가 있을 수 있다.
어떤 경우에, 주형 핵산 분자의 3' 단부는 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 생성하기 위해 제1 브릿지 프로브의 3' 단부의 연장 전에, 동시에, 또는 후에 연장될 수 있다. 주형 핵산 분자는 임의의 3' 돌출부를 제거하기 위해 주형 핵산의 3'의 연장 전에 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉될 수 있다.
VI. 바이설파이트 변환에 대한 작업 흐름
핵산의 바이설파이트 처리를 위한 방법이 본원에서 제공된다. 바이설파이트 처리된 핵산은 핵산의 메틸화를 연구하는데 사용될 수 있다. 바이설파이트 처리는 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변환시킬 수 있다. 시토신의 메틸화 (예를 들어, 5'-메틸시토신)은 바이설파이트가 메틸화된 시토신을 우라실로 변환시키는 것을 방지할 수 있다.
주형으로의 캡쳐 프로브의 결찰 후, 결과로 생성된 생성물은 바이설파이트로 처리될 수 있다 (예를 들어, 도 13B 참조). 이중 가닥 서열의 형성 (예를 들어, 주형의 TS와 캡쳐 프로브의 TSR 사이)은 바이설파이트 처리 동안에 우라실로의 혼성체화된 영역에서 시토신의 변환에 대해 보호할 수 있다 (예를 들어, 도 14 참조). 주형 및 어댑터 앵커 프로브로의 브릿지 프로브의 혼성체화에 의해 형성된 이중 가닥 서열은 우라실로의 혼성체화된 영역에서 시토신의 바이설파이트 변환에 대한 보호를 제공할 수 있다. 게다가, 바이설파이트 처리가 비-메틸화된 시토신을 우라실로 변환시킬 수 있기 때문에, TS 영역에서 우라실로의 시토신의 변환에 대한 보호는 비-바이설파이트 변환된 DNA에 어닐링되도록 디자인된 증폭 프라이머의 사용을 허용한다. 바이설파이트 변환 전 캡쳐를 위해, 프로브는 또한 변환되지 않은 서열에 대해 디자인될 수 있다. 변환되지 않은 시토신에 어닐링되는 프로브 및 프라이머는 더 양호한 혼성체화를 디자인하고 제공하기 위해 더 간단할 수 있다.
a. 주형 핵산으로의 표적 프로브의 혼성체화 및/또는 결찰 후 바이설파이트 처리
주형 핵산 (예를 들어, DNA)은 본원에서 기재된 바와 같이 표적화된 어댑터 근접 결찰 및 풍부화 (TALE) 및 이후의 시퀀싱 (TALE-SEQ)에 사용될 수 있다 (예를 들어, 도 13B (1310); (1312) 참조). 주형 핵산 (예를 들어, DNA)은, 예를 들어, 게놈 DNA, 또는 cfDNA일 수 있다. 주형 핵산 (예를 들어, DNA)은, 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이, 예를 들어, 도 1A - 도 12 및 도 17 (1314)에서 예시된 바와 같이, 근접 결찰에 의해 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브에 부착될 수 있다. 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브에 부착된 주형 핵산 (예를 들어, DNA)은, 예를 들어, 메틸화 시퀀싱을 위해, 바이설파이트로 처리되고 (1316), 연장되고 (1318), 이후에 증폭될 수 있다 (1320). 어떤 경우에, 바이설파이트 처리는 캡쳐 프로브의 TSR의 분리 전에 일어날 수 있다 (예를 들어, 도 4B 참조). 어떤 경우에, 바이설파이트 처리는 주형 핵산 분자로의 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 혼성체화 후에 수행될 수 있다. 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산 분자는 메틸화 시퀀싱을 위해 바이설파이트로 처리되고, 연장되고, 이후에 증폭될 수 있다.
캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 표적 특이적 영역은 주형 핵산 분자의 표적 서열을 기반으로 하여 디자인될 수 있고, 주형 핵산 분자의 표적 서열은 바이설파이트 처리 후에 비-메틸화된 시토신을 보유할 수 있다.
도 14는 TS 및 TSR의 혼성체화 및 주형으로의 캡쳐 프로브의 결찰 이후 일어나는 바이설파이트 처리 동안 우라실로의 변환으로부터 TS 및 TSR 부위 내 메틸화되지 않은 시토신의 보호를 예시한다. 이 예에서, 캡쳐 프로브는 주형에 혼성체화되고 캡쳐 프로브의 5' 단부는 주형의 3' 단부에 근접 결찰되어, 이중 가닥 영역 및 헤어핀 루프를 형성한다 (예를 들어, 도 14 참조). 이후에, 부착된 주형은 바이설파이트로 처리되며 그 동안 혼성체화된 TSR-TS 영역에서 비-메틸화된 시토신은 우라실로 변환되지 않는 반면에, 단일 가닥 영역에서 (루프에서) 비-메틸화된 시토신은 우라실로 변환된다. TS 영역에서 우라실로의 시토신의 변환에 대한 보호는 비-바이설파이트 변환된 DNA에 어닐링되도록 디자인된 프로브의 사용을 허용할 수 있다. 어떤 경우에, 프라이머 결합 부위 (예를 들어, 어댑터 및/또는 주형)에서 하나 이상의 시토신 잔기는 바이설파이트 변환으로부터 보호되지 않는다. 바이설파이트 변환 이후, 어댑터에서 프라이머 결합 부위는 하나 이상의 우라실을 포함할 수 있다. 프라이머는 하나 이상의 우라실을 포함하는 어댑터 서열에 상보적이도록 디자인될 수 있다. 프라이머는 하나 이상의 우라실을 포함하는 어댑터 서열에 100% 상보적이거나, 또는 하나 이상의 우라실을 포함하는 어댑터 서열에 100% 미만으로 상보적일 수 있다.
주형은 바이설파이트 처리 후 하나 이상의 우라실을 포함할 수 있다. 어댑터에 어닐링되는 프라이머는 가닥 연장을 위해 하나 이상의 우라실을 포함하는 주형을 사용할 수 있다. 연장된 가닥은 하나 이상의 우라실에 대해 염기 쌍을 형성하는 하나 이상의 아데닌을 포함할 수 있다. 연장 생성물은 주형으로부터 변성될 수 있다. 프라이머는 하나 이상의 아데닌을 포함하는 영역에서 연장 생성물에 어닐링되고 연장될 수 있다. 프라이머는, 예를 들어, 어댑터 프라이머를 가진 주형의 증폭에 사용에 사용될 수 있다.
b. 주형으로의 표적 프로브의 혼성체화 및/또는 결찰 전에 바이설파이트 처리
주형 핵산 분자는 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브로의 혼성체화 및 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브로의 결찰 전에 바이설파이트 처리될 수 있다 (예를 들어, 도 13A (1300) 참조). DNA는 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변환시키기 위해 바이설파이트로 처리될 수 있다 (1302). 바이설파이트 처리된 DNA는 표적화된 어댑터 근접 결찰 및 풍부화 (TALE) 및 이후의 시퀀싱 (TALE- SEQ) (1304)을 위한 투입물 로서 사용될 수 있다. 바이설파이트 처리된 DNA는, 예를 들어, 도 1A - 도 12 및 도 17에서 예시된 바와 같이 근접 어댑터 결찰 (1306)을 위한 투입물로서 사용될 수 있다. 프로브의 TSR은 주형에 어닐링되도록 디자인될 수 있으며 기존의 비-메틸화된 시토신은 우라실로 변환되었다. 근접 어댑터 결찰 후, 연장 (1306)이 수행될 수 있으며 이어서 표적 증폭 (1308)이 수행될 수 있다.
VII. 클린업(Clean-up)/특이성
a. 엑소뉴클레아제를 사용한 오프-타겟 핵산 분자 또는 무작위 결찰 생성물의 클린업
어떤 경우에, 캡쳐 프로브의 5' 단부는 주형에 어닐링되는 캡쳐 프로브의 TSR 없이 주형의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부는 브릿지 프로브를 통해 주형과 회합하는 어댑터 앵커 프로브 없이 주형의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 이들 결찰 이벤트의 생성물은 원치않는 것일 수 있다. 주형으로의 프로브의 임의의 비특이적 부착을 분해시키기 위해 엑소뉴클레아제가 직접적인 혼성체화 및 결찰 단계 이후에 결과로 생성된 핵산 분자에 추가될 수 있다.
한 예에서, 캡쳐 프로브의 5' 단부는 주형의 TS로 어닐링되는 캡쳐 프로브의 TSR 없이 주형의 3' 단부에 결찰되어, 선형 분자 (예를 들어, 줄기 루프가 없는 분자)를 생성할 수 있다 (예를 들어, 도 15B 참조). 임의의 특이적 부착은, 주형의 TS와의 캡쳐 프로브의 TSR의 혼성체화로 인해, 주형을 엑소뉴클레아제 (예를 들어, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제)로 분해되는 것으로부터 보호할 수 있는 헤어핀 루프를 생성할 수 있다 (예를 들어, 도 15A). 도 15A는 주형 TS로의 캡쳐 TSR의 특이적 혼성체화 및 주형의 3' 단부로의 캡쳐 프로브의 5' 단부의 결찰을 나타낸다. 혼성체화 및 결찰은 엑소뉴클레아제 (예를 들어, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제) 분해로부터 그것을 보호하는 헤어핀 루프를 형성할 수 있다. 주형의 5' 단부는 5'에서 3' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 분열을 방지할 수 있는 블록을 포함할 수 있다. 도 15B는 주형의 3' 단부로의 캡쳐 프로브의 5' 단부의 결찰을 나타내며, 주형의 TSR은 주형의 TS에 어닐링되지 않고, 주형은 TS를 포함하지 않는다. 하나 이상의 브릿지 프로브가 사용되는 경우에, 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부는 하나 이상의 브릿지 프로브를 통해 주형과 회합하는 어댑터 앵커 프로브와 함께 주형의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 결찰은 엑소뉴클레아제 (예를 들어, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제) 분해에 대해 보호하기 위한 헤어핀 루프 형성을 초래하지 않으며, 오프-타겟 무작위 결찰 생성물의 분해로 이어진다. 도 15B는 유리 주형, 유리 캡쳐 프로브, 및 캡쳐 프로브 및 주형의 오프-타겟 결찰 생성물을 분열시키는 엑소뉴클레아제 (예를 들어, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제)를 예시한다. 오프-타겟 결찰 생성물의 엑소뉴클레아제 분열은 캡쳐 프로브가 주형에 특이적으로 혼성체화되고 캡쳐 프로브가 주형에 부착된 (예를 들어, 결찰된) 결찰 생성물의 선택을 초래할 수 있다. 엑소뉴클레아제 처리 후, 이후의 연장 및 증폭 단계가 수행되기 전에 결찰 생성물로부터 엑소뉴클레아제를 제거하기 위해 정제 단계가 수행될 수 있다.
b. 고체상 추출
예를 들어, 어댑터 앵커 프로브가 주형에 결찰되기 전에 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 (또는 브릿지 프로브를 통해 어댑터 앵커 프로브와 회합된 주형)을 선택하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 방법은 고체상 추출을 이용할 수 있다. 방법은 어댑터 앵커 프로브가 어댑터 앵커 프로브와 특이적으로 회합된 주형에 결찰될 가능성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브를 고체 지지체에 결합시키기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 어댑터 앵커 프로브가 브릿지 프로브에 독립적으로 주형에 부착될 (예를 들어, 결찰될) 가능성에 의해 차선의 특이성이 도입될 수 있다. 이러한 비-특이적 결찰 생성물, 뿐만 아니라 미결합 프로브를 감소시키기 위해서, 라벨 (예를 들어, 비오틴) 및 캡쳐 모이어티 (예를 들어, 스트렙타비딘 비드)가 이용될 수 있다.
캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브는 라벨을 포함할 수 있다. 개시된 방법은 라벨에 의해 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브에 캡쳐되는 단계를 더 포함할 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 라벨은 핵산 서열, 예컨대 폴리 A 또는 폴리 T, 또는 특이적 서열일 수 있다. 핵산 서열은 길이가 약 5 내지 30개의 염기일 수 있다. 핵산 서열은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 라벨은 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브의 3' 단부에 있을 수 있다. 라벨은 항체, 예컨대 5-브로모유리딘, 및 비오틴에 의해 인식될 수 있는 펩타이드, 또는 변형된 핵산일 수 있다. 라벨은 "클릭(click)" 화학 반응과 같은 반응에 의해 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브에 컨쥬게이션될 수 있다. "클릭" 화학 반응은 DNA와 유사한 생체 분자로의 형광 염료와 유사한 리포터 분자의 컨쥬게이션을 허용할 수 있다. 클릭 화학 반응은 공유 생성물 (예를 들어, 1,5-이중치환된 1,2,3-트리아졸)을 수득할 수 있는 아지드와 알킨 사이의 반응일 수 있다. 구리는 촉매의 역할을 할 수 있다.
라벨은 고체 지지체 상에서 캡쳐될 수 있다. 고체 지지체는 자성을 가질 수 있다. 고체 지지체는 비드, 유동 세포, 유리, 플레이트, 하나 이상의 미세 유체 채널을 포함하는 디바이스, 또는 컬럼을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 자성 비드일 수 있다.
고체 지지체 (예를 들어, 비드)는 라벨에 결합할 수 있는 하나 이상의 캡쳐 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 캡쳐 모이어티로 코팅됨으로써). 캡쳐 모이어티는 스트렙타비딘일 수 있고, 스트렙타비딘은 비오틴에 결합할 수 있다. 캡쳐 모이어티는 항체일 수 있다. 항체는 라벨에 결합할 수 있다. 캡쳐 모이어티는 핵산, 예를 들어, DNA 및/또는 RNA를 포함하는 핵산일 수 있다. 핵산 캡쳐 모이어티는, 예를 들어, 어댑터 앵커 프로브 또는 브릿지 프로브 상의 서열에 결합할 수 있다. 어떤 경우에, 고체 표면에 결합된 항-RNA/DNA 하이브리드(hybrid) 항체가 캡쳐 모이어티로서 사용될 수 있다.
라벨 및 캡쳐 모이어티는 하나 이상의 공유 또는 비-공유 결합을 통해 결합할 수 있다. 고체 지지체 상에 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브의 캡쳐 후, 고체 지지체는, 예를 들어, 샘플로부터 결합되지 않은 주형을 제거하기 위해 세척될 수 있다. 어떤 경우에, 세척 단계가 수행되지 않는다. 세척은 엄중하거나 부드러울 수 있다. 캡쳐된 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브 (및 회합된 주형)은, 예를 들어, 라벨이 비오틴이고 캡쳐 모이어티가 스트렙타비딘일 때 샘플에 유리 비오틴을 추가함으로써 용출될 수 있다.
주형의 3' 단부로의 캡쳐 프로브의 5' 단부의 결찰은 캡쳐 프로브가 고체 지지체 상에 캡쳐된 동안에 일어날 수 있다. 주형의 3' 단부로의 캡쳐 프로브의 5' 단부의 결찰은 캡쳐 프로브/주형 복합체가 고체 지지체로부터 용출된 후 일어날 수 있다. 캡쳐 프로브의 5' 단부 또는 어댑터 앵커 프로브는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브가 고체 지지체 상에 캡쳐된 동안에 인산화될 수 있다.
주형의 3' 단부로의 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부의 결찰은 어댑터 앵커 프로브 (및 회합된 브릿지 프로브(들) 및 주형)이 고체 지지체 상에 캡쳐된 동안에 일어날 수 있다. 주형의 3' 단부로의 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부의 결찰은 어댑터 앵커 프로브 (및 회합된 브릿지 프로브(들) 및 주형)이 고체 지지체로부터 용출된 후 일어날 수 있다. 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부는 고체 지지체로부터 용출 후 인산화될 수 있다.
연장 단계 (예를 들어, 캡쳐 프로브에서 AD1 어댑터에 어닐링되는 AD1 프라이머의 연장)는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브가 고체 지지체 상에 캡쳐된 동안에 또는 캡쳐 프로브 (및 결찰된 주형) 또는 어댑터 앵커 프로브 (및 결찰된 주형)가 고체 지지체로부터 용출된 후에 수행될 수 있다.
도 16A는 주형, 브릿지 프로브, 및 어댑터 앵커 프로브 혼성체화 이후 스트렙타비딘 비드를 사용하여 클린업을 수행하는 단계를 예시하며, 어댑터 앵커 프로브의 3' 단부는 비오티닐화된다. 혼성체화 복합체 및 유리 어댑터 앵커 어댑터는 둘 다 비드에 결합할 수 있다. 결합되지 않은 주형 및 브릿지 프로브는 세척될 수 있다. 근접 결찰은 혼성체화 복합체와 일어날 수 있다. 결찰은 복합체가 비드 상에 있는 동안 수행될 수 있다. 결찰은 비드로부터 복합체를 용출시킨 후에 수행될 수 있다. 하지만, 유리 어댑터 앵커 프로브에 대해 임의의 주형 DNA에 결찰할 가능성이 극적으로 감소할 수 있다. 도 16B에서, 제1 및/또는 제2 브릿지 프로브의 5' 단부 또는 3' 단부는 비오티닐화될 수 있다. 스트렙타비딘 비드는 혼성체화되지 않은 어댑터 앵커 어댑터 및 주형을 제거하는데 사용될 수 있으며, 이것은 어댑터 앵커 프로브 및 주형의 무작위 결찰을 방지할 수 있다.
VIII. 주형 핵산 분자
주형 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 게놈 DNA (gDNA), 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, cDNA, cfDNA, 또는 합성 DNA일 수 있다. DNA는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 단편화된 DNA, 또는 손상된 DNA일 수 있다. RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, microRNA, snRNA, piRNA, 작은 비-암호화 RNA, 폴리솜 RNA, 인트론 RNA, 사전-mRNA, 바이러스 RNA, 또는 무세포 RNA일 수 있다.
주형 핵산은 자연 발생하거나 합성일 수 있다. 주형 핵산은 변형된 헤테로환형 염기를 가질 수 있다. 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보스, 또는 다른 헤테로환일 수 있다. 주형 핵산은 변형된 당 모이어티를 가질 수 있다. 변형된 당 모이어티는 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 트레오스 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 고정된(locked) 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 헥시톨 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 유연한 핵산일 수 있다. 주형 핵산은 글리세롤 핵산을 포함할 수 있다.
주형 핵산 분자는 저투입량 (예를 들어, 핵산 물질 1 ng) 샘플, 예컨대 무세포 DNA (cfDNA) 및 순환 종양 DNA (ctDNA)로부터 캡쳐되고 풍부화될 수 있다. 저투입량 샘플은 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 6 ng, 7 ng, 8 ng, 9 ng, 10 ng, 또는 그 이상의 핵산 물질을 가질 수 있다. 투입량 샘플은 10 ng, 9 ng, 8 ng, 7 ng, 6 ng, 5 ng, 4 ng, 3 ng, 2 ng, 1 ng 미만, 또는 그 이하의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 200 pg 내지 10 ng의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 10 ng 미만의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 10 ng, 5 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 25 pg 미만, 또는 그 이하의 핵산 물질을 가질 수 있다. 어떤 경우에, 투입 샘플은 1 ng, 10 ng, 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng, 또는 그 이상의 핵산 분자를 가질 수 있다. 투입 샘플은 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng 미만, 또는 그 이하의 핵산 물질을 가질 수 있다. 캡쳐 및 풍부화는 표적 프로브 혼성체화에 의해 실해오딜 수 있다. 표적 프로브는 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 및/또는 어댑터 앵커 프로브일 수 있다. 표적 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
주형 핵산은 손상될 수 있다. 손상된 핵산은 변화되거나 손실된 염기, 및/또는 변형된 백본(backbone)을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 산화, 방사선, 또는 무작위 돌연변이에 의해 손상될 수 있다. 주형 핵산은 바이설파이트 처리에 의해 손상될 수 있다.
손상된 DNA에 대해, 본 개시물은 공정에서 몇몇 단계로부터의 더 적은 DNA 손실로 인한 더 높은 변환율 및 개선된 민감도를 고려하여, 이중 가닥 DNA 복구 단계를 제거할 수 있다.
도 17A는 라이브러리 구성을 위한 주형으로서 손상된 dsDNA (닉(nick)을 가짐) 또는 ssDNA의 사용을 예시한다. 손상은 바이설파이트 처리 때문일 수 있다. 손상된 dsDNA에 대해, dsDNA는 변성될 수 있으므로 적어도 하나의 손상되지 않은 가닥이 주형으로 사용될 수 있다. 주형은 캡쳐 프로브에 혼성체화 및 부착될 수 있고 다양한 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
주형은 무세포 DNA (cfDNA) 또는 순환 종양 DNA (ctDNA)로부터 유래될 수 있다. cfDNA는 공급원이 태아 또는 종양일 수 있다. 주형은 대상체의 액체 생검, 고체 생검, 또는 고정된 조직으로부터 유래될 수 있다. 주형은 cDNA일 수 있고 역전사에 의해 생성될 수 있다. 주형 핵산은, 제한되는 것은 아니지만, 혈장, 혈청, 가래, 침, 소변, 또는 땀을 포함하는 유체 샘플로부터 유래될 수 있다. 유체 샘플은 주형 핵산의 메틸화 패턴을 연구하고 및/또는 주형 핵산의 조직 기원을 결정하기 위해 바이설파이트 처리될 수 있다. 주형 핵산은 간, 식도, 신장, 심장, 폐, 비장, 방광, 결장, 또는 뇌로부터 유래될 수 있다. 주형 핵산은 주형 핵산이 유래되는 장기의 메틸화 패턴을 분석하기 위해 바이설파이트로 처리될 수 있다. 대상체는 메틸화 관련 질환, 예컨대 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 죽상 경화증(atherosclerosis), 신경 질환, 및 암으로부터 고통받을 수 있다.
주형 핵산은 수컷 또는 암컷 대상체로부터 유래될 수 있다. 대상체는 유아일 수 있다. 대상체는 청소년일 수 있다. 대상체는 젊은 성인일 수 있다. 대상체는 노인일 수 있다.
주형 핵산은 인간, 래트, 마우스, 다른 동물, 또는 특정 식물, 박테리아, 조류, 바이러스, 등으로부터 기원할 수 있다. 주형 핵산은 영장류로부터 기원할 수 있다. 영장류는 침팬지 또는 고릴라일 수 있다. 다른 동물은 히말라야 원숭이(rhesus macaque)일 수 있다. 주형은 또한 숙주-병원체, 박테리아 집단, 등을 포함한 상이한 종의 게놈의 혼합물일 수 있다. 주형은 둘 이상의 종의 게놈으로부터 발현된 RNA로부터 만들어진 cDNA일 수 있다.
주형 핵산은 표적 서열을 포함할 수 있다. 표적 서열은 엑손이다. 표적 서열은 인트론일 수 있다. 표적 서열은 프로모터를 포함할 수 있다. 표적 서열은 이전에 공지될 수 있다. 표적 서열은 이전에 부분적으로 공지될 수 있다. 표적 서열은 이전에 공지되이 않을 수 있다. 표적 서열은 염색체, 염색체 아암(arm), 또는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자는 병태, 예를 들어, 암과 관련된 유전자일 수 있다.
주형 핵산 분자는, 예를 들어, 자가-결찰의 비율을 감소시키기 위해, 혼성체화 전에 탈인산화될 수 있다.
IX. 캡쳐 프로브
캡쳐 프로브는 표적 서열을 가진 주형 핵산 분자를 캡쳐하는데 사용될 수 있다. 캡쳐 프로브는 또한 근접에 의해 주형 핵산 분자에 결찰될 수 있다. 유리 프로브와 주혀의 결찰 비율은 결찰 단부 사이의 상대적으로 넓은 공간으로 인해 매우 낮을 수 있다. 하지만, 혼성체화된 캡쳐 프로브는 유리 캡쳐 프로브와 비교하여 캡쳐 프로브와 주형 사이의 결찰 가능성을 증가시킬 수 있다. 캡쳐 프로브는 DNA를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 RNA를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 우라실 또는 메틸화된 시토신을 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 캡쳐 프로브는 우라실을 포함하지 않는다.
캡쳐 프로브는 약 400개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 300개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 200개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 180개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 150개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 120개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 100개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 90개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 80개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 70개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 40개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 약 10 내지 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 약 200개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 약 120개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 약 120개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 또는 약 30 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
주형 핵산으로의 캡쳐 프로브의 결찰 온도는 약 70℃, 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 약 50℃, 약 45℃, 또는 약 45℃ 내지 약 55℃일 수 있다.
캡쳐 프로브는 라벨을 더 포함할 수 있다. 라벨은 형광일 수 있다. 형광 라벨은 유기 형광 염료, 금속 킬레이트, 탄소 나노튜브, 양자점, 금 입자, 또는 형광 광물일 수 있다. 라벨은 방사성일 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 캡쳐 프로브는 라벨링된 핵산 바인더 분자에 결합할 수 있다. 핵산 바인더 분자는 항체, 항생제, 히스톤, 항체, 또는 뉴클레아제일 수 있다.
복수의 캡쳐 프로브가 샘플에서 사용될 수 있다. 복수의 캡쳐 프로브는 유사한 용융 온도를 갖도록 디자인될 수 있다. 일련의 캡쳐 프로브에 대한 용융 온도는 약 15℃ 이내, 약 10℃ 이내, 약 5℃ 이내, 또는 약 2℃ 이내일 수 있다. 하나 이상의 캡쳐 프로브에 대한 용융 온도는 약 85℃, 약 80℃, 약 75℃, 약 70℃, 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 또는 약 50℃일 수 있다. 캡쳐 프로브에 대한 용융 온도는 약 50℃ 내지 약 85℃, 약 55℃ 내지 약 80℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 52℃ 내지 약 58℃일 수 있다.
캡쳐 프로브는 분자 바코드 (MB)를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 어댑터 서열 (예를 들어, 어댑터 프라이머로의 결합을 위한)을 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 표적 특이적 영역 (TSR)을 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 샘플을 구별하기 위한 지표를 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는, 예를 들어, TSR과 어댑터 서열 사이에 제한 엔도뉴클레아제 분열 부위를 포함할 수 있다. 분자 바코드 또는 지표는 어댑터 서열의 5' 및 TSR의 5'일 수 있다.
a. 분자 바코드
분자 바코드는 고유한 확인 도구를 제공하고 프로브와 주형 사이에서 특이성 결합의 관찰을 허용할 수 있다. 분자 바코드는 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 15개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드, 약 8 뉴클레오타이드, 또는 약 4 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 분자 바코드는 DNA를 포함할 수 있다. 분자 바코드는 RNA를 포함할 수 있다. 분자 바코드는 우라실을 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 분자 바코드는 우라실을 포함하지 않는다. 캡쳐 프로브는 지표를 포함할 수 있다. 지표는 샘플을 확인하는데 사용될 수 있다. 지표는 길이가 2 내지 16개의 뉴클레오타이드, 또는 약 6 또는 약 8개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
b. 어댑터 및 어댑터 프라이머
캡쳐 프로브 내 어댑터는 증폭을 위한 프라이머 결합에 대한 위치를 제공할 수 있다. 어댑터 프라이머는 어댑터 상의 부위에 상보적으로 결합할 수 있고 주형 내 표적 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 50개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 45개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 40개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 35개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 30개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 25개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 20개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 15개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 어댑터 프라이머는 약 18 내지 약 30개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
어댑터는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 어댑터는 자연 발생 또는 합성 핵산일 수 있다. 어댑터는 변형된 헤테로환형 염기를 가질 수 있다. 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보스, 또는 다른 헤테로환일 수 있다. 어댑터는 변형된 당 모이어티를 가질 수 있다. 변형된 당 모이어티는 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다. 어댑터는 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다. 어댑터는 트레오스 핵산을 포함할 수 있다. 어댑터는 고정 핵산을 포함할 수 있다. 어댑터는 헥시톨 핵산을 포함할 수 있다. 어댑터는 유연한 핵산을 포함할 수 있다. 어댑터는 글리세롤 핵산을 포함할 수 있다.
c. 표적 특이적 영역 (TSR)
캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 TSR은 주형의 표적 서열에 혼성체화하도록 디자인될 수 있다. TSR은 바이설파이트 변환된 표적 서열 또는 바이설파이트 보호된 표적 서열에 대해 디자인될 수 있다. 어떤 경우에, 프로브의 표적 특이적 영역의 100%가 주형의 표적 서열에 상보적일 수 있다. 프로브의 표적 특이적 영역의 약 75%가 주형의 표적 서열에 상보적일 수 있다. 프로브의 표적 특이적 영역의 약 50%가 주형의 표적 서열에 상보적일 수 있다. 표적 특이적 영역은 약 35개의 뉴클레오타이드, 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 15개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 특이적 영역은 본원에서 기재된 표적 서열에 어닐링될 수 있다.
X. 어댑터 / 어댑터 프라이머 / 증폭
부착, 추가, 또는 통합된 어댑터는 증폭을 위한 프라이머 혼성체화 부위를 제공할 수 있다. 제1 어댑터 (AD1)는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브를 통해 주형에 부착될 수 있다. AD1에 대한 프라이머는 주형에 상보적인 가닥을 합성하는데 이용될 수 있다. 제2 어댑터 (AD2)는 주형을 더 증폭시키기 위해 주형의 5' 단부 및/또는 상보적인 가닥의 3' 단부에 부착될 수 있다. 라이브러리는 AD1 프라이머 및 AD2 프라이머를 사용하여 구성될 수 있다. 선택적 증폭은 AD1 프라이머 및 TSR 또는 그것의 플랭킹 영역에 대한 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.
어댑터는 단일 가닥 핵산일 수 있다. 어댑터는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 어댑터는 부분적인 듀플렉스(duplex)일 수 있으며, 짧은 가닥보다 더 긴 긴 가닥을 갖거나, 동일한 길이의 2개의 가닥을 갖는다.
XI. 브릿지 프로브
브릿지 프로브는 주형 핵산 분자를 표적 서열 및 어댑터 앵커 프로브에 혼성체화하는데 사용될 수 있다. 브릿지 프로브는 어댑터 앵커 프로브 및 주형의 간접적인 회합을 추가로 허용하여, 그것들의 부착을 촉진할 수 있다. 유리 어댑터 앵커 프로브 및 주형의 결찰 비율은 상호작용의 무작위성으로 인해 매우 낮을 수 있다. 하지만 혼성체화된 브릿지 프로브는 유리 어댑터 앵커 프로브와 비교하여 어댑터 앵커 프로브와 주형 사이의 결찰 가능성을 증가시킬 수 있다. 브릿지 프로브는 DNA를 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 RNA를 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 우라실 및 메틸화된 시토신을 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 우라실을 포함하지 않을 수도 있다.
브릿지 프로브는 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역 (TSR)을 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 어댑터 랜딩 서열 (ALS)을 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 TSR과 ALS를 연결하는 링커를 포함할 수 있다. TSR은 브릿지 프로브의 3' 부분에 위치할 수 있다. TSR은 브릿지 프로브의 5' 부분에 위치할 수 있다.
브릿지 프로브는 하나 이상의 분자 바코드를 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
브릿지 프로브는 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 300개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드, 약 120개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 90개의 뉴클레오타이드, 약 80개, 약 70개의 뉴클레오타이드, 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
다수의 브릿지 프로브는 샘플 내 다수의 표적 서열에 어닐링하는데 사용될 수 있다. 브릿지 프로브는 유사한 용융 온도를 갖도록 디자인될 수 있다. 일련의 브릿지 프로브에 대한 용융 온도는 약 15℃ 이내, 약 10℃ 이내, 약 5℃ 이내, 또는 약 2℃ 이내일 수 있다. 하나 이상의 브릿지 프로브에 대한 용융 온도는 약 75℃, 약 70℃, 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 약 50℃, 약 45℃, 또는 약 40℃일 수 있다. 브릿지 프로브에 대한 용융 온도는 약 40℃ 내지 약 75℃, 약 45℃ 내지 약 70℃, 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 52℃ 내지 약 58℃일 수 있다.
어댑터 앵커 프로브의 사용은 특정 브릿지 프로브 주위의 하나 이상의 브릿지 프로브와 함께 시너지 효과를 통해 표적 서열로의 특정 브릿지 프로브의 혼성체화를 안정화시키는 것을 도울 수 있다. 다수의 브릿지 프로브 조립체를 형성하기 위한 혼성체화 온도는 단일 브릿지 프로브의 용융 온도보다 더 높을 수 있다. 더 높은 온도는 더 낮은 온도에서 일어날 수 있는 비특이적 혼성체화를 감소시킴으로써 더 양호한 캡쳐 특이성을 초래할 수 있다. 혼성체화 온도는 개개의 브릿지 프로브의 용융 온도보다 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 또는 약 20℃ 더 높을 수 있다. 혼성체화 온도는 브릿지 프로브의 용융 온도보다 약 5℃ 내지 약 20℃ 더 높거나, 또는 복수의 브릿지 프로브의 평균 용융 온도보다 약 5℃ 내지 약 20℃ 더 높을 수 있다.
다수의 브릿지 프로브에 대한 혼성체화 온도는 약 75℃, 약 70℃, 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 또는 약 50℃일 수 있다. 다수의 브릿지 프로브에 대한 혼성체화 온도는 약 50℃ 내지 약 75℃, 55℃ 내지 약 75℃, 60℃ 내지 약 75℃, 또는 65℃ 내지 약 75℃일 수 있다.
브릿지 프로브는 라벨을 더 포함할 수 있다. 라벨은 형광일 수 있다. 형광 라벨은 유기 형광 염료, 금속 킬레이트, 탄소 나노튜브, 양자점, 금 입자, 또는 형광 광물일 수 있다. 라벨은 방사성일 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 브릿지 프로브는 라벨링된 핵산 바인더 분자에 결합할 수 있다. 핵산 바인더 분자는 항체, 항생제, 히스톤, 항체, 또는 뉴클레아제일 수 있다.
브릿지 프로브는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 15개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 링커는 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
링커는 비-핵산 폴리머s (예를 들어, 일련의 탄소)를 포함할 수 있다. 링커 비-뉴클레오타이드 폴리머는 약 30개의 유닛, 약 25개의 유닛, 약 20개의 유닛, 약 15개의 유닛, 약 10개의 유닛, 또는 약 5개의 유닛을 포함할 수 있다.
브릿지 프로브는 3' 및/또는 5' 단부에서 블로킹될 수 있다. 브릿지 프로브는 5' 포스페이트가 없을 수 있다. 브릿지 프로브는 3' OH가 없을 수 있다. 브릿지 프로브는 3' ddC, 3' 반전된 dT, 3' C3 스페이서, 3' 아미노, 또는 3' 인산화를 포함할 수 있다.
XII. 어댑터 앵커 프로브
어댑터 앵커 프로브는 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드, 약 120개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 90개의 뉴클레오타이드, 약 80개의 뉴클레오타이드, 약 70개의 뉴클레오타이드, 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 약 20 내지 약 70개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
브릿지 프로브로의 어댑터 앵커 프로브의 용융 온도는 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 약 50℃, 약 45℃. 또는 약 45℃ 내지 약 70℃일 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 라벨을 포함할 수 있다. 라벨은 형광일 수 있다. 형광 라벨은 유기 형광 염료, 금속 킬레이트, 탄소 나노튜브, 양자점, 금 입자, 또는 형광 광물일 수 있다. 라벨은 방사성일 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 라벨링된 핵산 바인더 분자에 결합할 수 있다. 핵산 바인더 분자는 항체, 항생제, 히스톤, 항체, 또는 뉴클레아제일 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 분자 바코드 (MB)를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 어댑터 서열 (예를 들어, 어댑터 프라이머로의 결합을 위해)을 포함할 수 있다. 캡쳐 프로브는 브릿지 결합 서열 (BBS)을 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 1 내지 100개의 BBS를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 샘플을 구별하기 위한 지표를 포함할 수 있다. 분자 바코드 또는 지표는 어댑터 서열의 5' 및 BBS의 5'일 수 있다.
XIII. 효소
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 DNA 폴리머라제의 예는 클레노브(Klenow) 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제, Bca 폴리머라제, phi 29 DNA 폴리머라제, Vent 폴리머라제, Deep Vent 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T4 폴리머라제, T7 폴리머라제, 또는 대장균(E. coli) DNA 폴리머라제 1을 포함한다.
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 리가제의 예는 CircLigase, CircLigase II, 대장균 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, DNA 리가제 I, DNA 리가제 II, DNA 리가제 III, DNA 리가제 IV, Taq DNA 리가제, 또는 Tth DNA 리가제를 포함한다.
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 엑소뉴클레아제의 예는 DNA 폴리머라제 I (polA), II (polB) 및 III (dnaQ/mutD)와 관련된 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제 I, 큰 (클레노브) 단편, T4 DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 IV, 엑소뉴클레아제 VII, 엑소뉴클레아제 IX, 엑소뉴클레아제 X, RecBCD 엑소뉴클레아제, RecJ 엑소뉴클레아제, RecE 엑소뉴클레아제, SbcCD 엔도/엑소뉴클레아제, 리보뉴클레아제 T, 또는 TatD 엑소뉴클레아제를 포함한다. 엑소뉴클레아제는 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제 또는 5'에서 3' 방향의 엑소뉴클레아제일 수 있다.
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제는 I형, II형, III형, 또는 IV형일 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제는 AciI, HindIII, SspI, MluCI, BspMI, EcoP15, EcoRI, HsdR, HsdM, HhaI, NotI, FokI, 또는 BaeI를 포함할 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제는 4-커터(cutter), 5-커터, 또는 6-커터일 수 있다.
XIV. 증폭 생성물의 다운스트림 분석
본원에서 기재된 방법을 사용하여 생성된 증폭된 생성물은 서던 블롯팅, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (예를 들어, 실시간 PCR (RT-PCR), 디지털 PCR (dPCR), 물방울 디지털 PCR (ddPCR), 정량적 PCR (Q-PCR), nCounter 분석 (Nanostring technology), 겔 전기영동, DNA 마이크로어레이, 질량 분석법 (예를 들어, 직렬 질량 분석법, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법 (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry: MALDI-TOF MS), 연쇄 종결 반응 시퀀싱 (Sanger 시퀀싱), 또는 차세대 시퀀싱을 포함한 다양한 방법을 사용하여 더 분석될 수 있다.
차세대 시퀀싱은 454 시퀀싱 (ROCHE) (파이로시퀀싱(pyrosequencing) 사용), 가역적 종결 염료를 사용한 시퀀싱 (ILLUMINA 시퀀싱), 반도체 시퀀싱 (THERMOFISHER ION TORRENT), 단일 분자 실시간 (SMRT) 시퀀싱 (PACIFIC BIOSCIENCES), 나노포어(nanopore) 시퀀싱 (예를 들어, OXFORD NANOPORE 또는 GENIA의 기술을 사용함), 파이로가인산분해(pyrophosphorolyis)를 사용하는 미세 방울 단일 분자 시퀀싱 (BASE4), 예를 들어, 핵산 (DNA/RNA)이 나노갭(nanogap)을 통과함에 따라 나노전극을 통해 터널 전류를 측정하여 전류 차이를 계산하는 단일 분자 전자 검출 시퀀싱 (QUANTUM BIOSYSTEMS의 QUANTUM SEQUENCING), GenapSys Gene Electornic Nano-Integrated Ultra-Sensitive (GENIUS) 기술 (GENAPYS), QIAGEN의 GENEREADER, 특이적 형광단에 의해 확인된 중심 결정 염기 (또는 염기의 쌍)를 가진 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드의 순차적 혼성체화 및 결찰을 사용한 시퀀싱 (SOLiD 시퀀싱)을 포함할 수 있다. 시퀀싱은 쌍 형성된 단부의 시퀀싱일 수 있다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여 시퀀싱될 수 있는 샘플로부터의 표적 서열의 수는 약 5, 10, 15, 25, 50, 100, 1000, 10,000, 100,000, 또는 1,000,000개, 또는 약 5 내지 약 100개, 약 100 내지 약 1000개, 약 1000 내지 약 10,000개, 약 10,000 내지 약 100,000개, 또는 약 100,000 내지 약 1,000,000개일 수 있다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여 생성된 핵산 라이브러리는 하나 이상의 샘플로부터 생성될 수 있다. 각각의 라이브러리는 샘플과 관련된 상이한 지표를 가질 수 있다. 예를 들어, 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브는 핵산을 동일한 샘플로부터 유래된 것으로 확인하는데 사용될 수 있는 지표를 포함할 수 있다 (예를 들어, 동일한 제1 지표를 포함하는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 제1 세트는 제1 대상체의 제1 샘플로부터의 제1 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 동일한 제2 지표를 포함하는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 제2 세트는 제2 대상체의 제2 샘플로부터의 제2 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 제1 및 제2 라이브러리가 모아지고, 시퀀싱되고, 지표는 시퀀싱된 핵산이 유래된 샘플을 식별하는데 사용될 수 있다). 본원에서 기재된 방법을 사용하여 생성된 증폭된 생성물은 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 100, 1000, 또는 10,000개의 샘플로부터의 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있으며, 각각의 라이브러리는 상이한 지표를 갖고, 라이브러리는 모아지고, 예를 들어, 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱될 수 있다.
시퀀싱은 적어도 100, 1000, 5000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 또는 10,000,000개의 서열 판독값을 생성할 수 있다. 시퀀싱은 약 100개의 서열 판독값 내지 약 1000개의 서열 판독값, 약 1000개의 서열 판독값 내지 약 10,000개의 서열 판독값, 약 10,000개의 서열 판독값 내지 약 100,000개의 서열 판독값, 약 100,000개의 서열 판독값 내지 약 1,000,000개의 서열 판독값, 또는 약 1,000,000개의 서열 판독값 내지 약 10,000,000개의 서열 판독값을 생성할 수 있다.
시퀀싱의 깊이는 약 1x, 5x, 10x, 50x, 100x, 1000x, 또는 10,000x일 수 있다. 시퀀싱의 깊이는 약 1x 내지 약 10x, 약 10x 내지 약 100x, 약 100x 내지 약 1000x, 또는 약 1000x 내지 약 10000x일 수 있다.
XV. 적용
a. 핵산 특징의 검출
본원에서 기재된 방법 및 키트를 사용하여 생성된 증폭된 핵산 생성물은 하나 이상의 핵산 특징에 대해 분석될 수 있다. 하나 이상의 핵산 특징은 하나 이상의 메틸화 이벤트일 수 있다. 메틸화는 CpG 디뉴클레오타이드에서 시토신의 메틸화일 수 있다. 메틸화된 염기는 5-메틸시토신일 수 있다. 비-CpG 맥락에서 시토신은 메틸화될 수 있다. 메틸화된 또는 메틸화되지 않은 시토신은 CpG 섬(CpG island)에 있을 수 있다. CpG 섬은 높은 빈도의 CpG 부위를 가진 게놈의 영역일 수 있다. CpG 섬은 적어도 200 bp, 또는 약 300 내지 약 3000 bp일 수 있다. CpG 섬은 적어도 60%의 CpG 디뉴클레오타이드 함유량일 수 있다. CpG 섬은 유전자의 프로모터 영역에 있을 수 있다. 메틸화는 5-hmC (5-하이드록시메틸시토신), 5-fC (5-포르밀시토신), 또는 5-caC (5-카르복실시토신)일 수 있다. 본원에서 기재된 방법 및 키트는, 예를 들어, 고체 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 무세포 DNA를 포함하는 혈장, 혈청, 소변, 또는 침의 DNA의 메틸화 패턴을 검출하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 핵산 특징은 데 노보(de novo) 돌연변이, 넌센스(nonsense) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이, 침묵 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 삽입, 치환, 점 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP), 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV), 데 노보 단일 뉴클레오타이드 변이체, 결실, 재배열, 증폭, 염색체 전위, 중간 결실, 염색체 역위, 이형접합성 상실, 기능 상실, 기능 획득, 우성 음성, 또는 치사 돌연변이일 수 있다. 증폭된 핵산 생성물은 생식계열 돌연변이 또는 체세포 돌연변이를 검출하기 위해 분석될 수 있다. 하나 이상의 핵산 특징은 병태, 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 신경 질환, 감염 (예를 들어, 바이러스 감염), 또는 대사 질환과 관련이 있을 수 있다.
b. 진단/검출/모니터링
개시된 방법 및 키트는 또한 병태를 진단 또는 검출하는데 사용될 수 있다. 병태는 심리적 장애일 수 있다. 병태는 노화일 수 있다. 병태는 질환일 수 있다. 병태 (예를 들어, 질환)는 암, 신경 질환 (예를 들어, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 자폐 범주성 장애(autism spectrum disorder), 레트 증후군(Rett Syndrome), 조현병(schizophrenia)), 면역 결핍, 피부 질환, 자가면역 질환 (예를 들어, 안구 베체트 병(Ocular Behcet's disease), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus: SLE), 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis: RA), 다발성 경화증, 감염 (예를 들어, 바이러스 감염), 또는 대사 질환 (예를 들어, 고혈당, 고지질혈증, 2형 진성 당뇨병)일 수 있다. 암은, 예를 들어, 결장암, 유방암, 간암, 방광암, 윌름스 암(Wilms cancer), 난소암, 식도암, 전립선암, 골암, 또는 간세포 암종, 교아종, 유방암, 편평세포 폐암, 갑상선 암종, 또는 백혈병일 수 있다 (예를 들어, JJin and Liu (2018) DNA methylation in human disease. Genes & Diseases, 5:1-8 참조). 병태는 베크위드-위드만 증후군(Beckwith-Wiedemann Syndrome), 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 또는 안젤만 증후군(Angelman syndrome)일 수 있다.
본원에서 제공된 방법 및 키트를 사용하여 생성된 무세포 DNA의 메틸화 패턴은 암의 마커로 사용될 수 있다 (예를 들어, Hao et al., DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers. Proc . Natl . Acad . Sci . 2017; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2015116837 참조). 무세포 DNA의 메틸화 패턴은 DNA의 기원의 조직을 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2005019477 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 메틸화 일배체형(haplotype) 정보를 결정하는데 사용될 수 있고 무세포 DNA의 조직 또는 세포 기원을 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Seioighe et al, (2018) DNA methylation haplotypes as cancer markers. Nature Genetics 50, 1062-1063; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2015116837; 미국 특허 출원 공개 번호 20170121767 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 암에 걸린 대상체 및 암이 없는 대상체에서, 예를 들어, 무세포 DNA의 메틸화 수준을 검출하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Vidal et al. A DNA methylation map of human cancer at single base-pair resolution. Oncogenomics 36, 5648-5657; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2014043763 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 메틸화 수준을 결정하거나 또는 무세포 DNA 혼합물에 대한 상이한 조직의 부분적인 기여도를 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2016008451 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는, 예를 들어, 메틸화 일배체형의 패턴 및 풍부함을 비교하는 것을 기반으로 하여, 예를 들어, 혈장에서 무세포 DNA의 기원의 조직에 사용될 수 있다 (예를 들어, Tang et al., (2018) Tumor origin detection with tissue-specific miRNA and DNA methylation markers. Bioinformatics 34, 398-406; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2018119216 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 암 세포를 정상 세포와 구별하고 기원의 조직에 따른 상이한 암 유형을 분류하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20170175205A1 참조). 본원에서 제공된 방법 및 키트는 모 샘플을 사용하여 태아 DNA 또는 태아 이상을 검출하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Poon et al. (2002) Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry, 48: 35-41 참조).
개시된 방법은 병태를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 병태는 질환일 수 있다. 질환은 암, 신경 질환 (예를 들어, 알츠하이머 병), 면역 결핍, 피부 질환, 자가면역 질환 (예를 들어, 안구 베체트 병), 감염 (예를 들어, 바이러스 감염), 또는 대사 질환일 수 있다. 암은 차도가 있을 수 있다. 개시된 방법이 낮은 수준의 이상을 검출하기 위해 cfDNA 및 ctDNA를 사용할 수 있기 때문에, 본 개시물은 질환을 모니터링하는 상대적으로 비침습성인 방법을 제공할 수 있다. 개시된 방법은 처리 또는 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 처리 또는 치료는 병태, 예를 들어, 질환, 예를 들어, 암, 또는 본원에서 개시된 임의의ㅇ 병태에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
어댑터 앵커 프로브의 결찰
도 18A는 2가지 반응 계획의 개략적인 개요를 제공한다. 왼쪽의 반응 계획 (1)에서, 브릿지 프로브, 주형, 및 어댑터 앵커 프로브를 함께 인큐베이션한다. 브릿지 프로브를 주형 상의 표적 서열에 혼성체화하고, 브릿지 프로브를 어댑터 앵커 프로브 상의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화한다 (1; 상단). 혼성체화는 어댑터 앵커 프로브의 인산화된 5' 단부 및 주형의 3' 단부의 근접 결찰을 촉진한다 (1; 상단). 그 다음에, PCR을 사용하여 결찰 생성물을 증폭시킨다 (1; 하단). 오른쪽의 제2 반응 (2)에서, 주형 및 어댑터 앵커 프로브를 브릿지 프로브의 부재 하에 함께 인큐베이션한다 (2; 상단). 유사한 반응 단계를 반응 계획 (1)과 같이 수행한다.
이 예에서, 반응 계획 (1)에서, 표적 특이적 결합 서열 (서열 번호: 2)을 가진 어댑터 앵커 프로브를 공지된 표적 서열 (서열 번호: 1)을 가진 주형 DNA에 결찰시켰으며 브릿지 프로브 (서열 번호: 3)의 혼성체화에 의해 촉진되었다. 브릿지 프로브는 주형의 표적 서열에 상보적이도록 디자인된 표적 특이적 영역을 포함하였다. 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2 (표 1)에서 이탤릭체 문자는 각각 주형의 표적 서열 및 표적 특이적 영역 및 브릿지 프로브를 나타낸다. 브릿지 프로브는 브릿지 프로브의 브릿지 결합 서열에 상보적인 어댑터 랜딩 서열 및 표적 특이적 영역과 어댑터 랜딩 서열을 연결하는 올리고-T 링커를 더 포함하였다. 브릿지 결합 서열 및 어댑터 랜딩 서열은 표 1의 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3에서 밑줄 그어져 있다. 브릿지 결합 서열에 더하여, 어댑터 앵커 프로브를 고유한 서열의 어댑터 및 분자 바코드를 함유하도록 디자인하였다. 서열 번호: 2의 볼드체 서열은 AD1 프라이머 결합 부위를 나타낸다. AD1 및 TSR에 어닐링하는 프라이머를 주형의 표적 서열을 증폭시키는데 사용하였다. "N"은 4개의 DNA 뉴클레오타이드 중 임의의 것을 나타낸다. 어느 뉴클레오타이드가 우선적으로 결찰되고 시퀀싱되는지를 찾기 위해 주형의 상이한 3' 단부를 테스트하였다. 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에서 4개의 뉴클레오타이드는 분자 바코드를 나타낸다. 다양한 조합의 분자 바코드를 합성하고 주형과 혼합하였다.
Figure pct00001
다음은 반응 계획 (1)에 대한 혼성체화 및 결찰 조건이다. 1fmole의 주형, 10fmole의 브릿지 프로브, 및 200fmole의 어댑터 앵커 프로브를 12ul 부피로 혼합하였고 95℃에서 30초 동안 변성시킨 다음 얼음 위에 두었다. 2uL의 10x CircLigase 버퍼, 4uL의 5M 베타인, 1μL의 50 mM MnCl2를 변성된 DNA 혼합물에 추가하여 최종 부피 20uL 중 2.5mM MnCl2, 1M 베타인, 0.033M 트리스-아세테이트 (pH 7.5), 0.066 M 칼륨 아세테이트, 및 0.5 mM DTT의 최종 농도에 도달하였다. MJ 유전자 증폭기(thermocycler) 상에서 50℃에서 30 min 동안 혼합물을 인큐베이션하여 혼성체화를 수행하였다. 100 유닛의 CircLigase II를 혼합물에 추가하고 MJ 유전자 증폭기 상에서 50℃에서 20 min 동안 인큐베이션하여 결찰을 실행하였다. 0.2μM의 PCR 프라이머를 이용한 PCR 반응을 위한 주형으로서 결찰된 생성물 1μL를 취했다. 95℃에서 15 sec 동안의 변성 조건, 58℃에서 15 sec 동안의 어닐링 조건, 및 68℃에서 30 sec 동안의 연장 조건을 가진 PCR을 20 주기 동안 실행하였다. 주형 및 어댑터 앵커 프로브의 혼합물에 브릿지 프로브가 포함되지 않았다는 것을 제외하면 반응 계획 (2)에 대한 조건은 동일하였다. PCR 생성물 10μL를 80V에서 20min 동안 2% 아가로스 겔 상에서 실행하였고 DNA 밴드를 UV 광 상자 상에서 가시화하였으며 겔을 1X GelRed로 염색하였다.
도 18B에서 나타난 바와 같이, 레인 1에서 2개의 밴드가 대략 100 bp 및 50 bp 영역에 나타났으며, 이것은 반응 계획 (1)의 PCR 반응 생성물을 보유하고 있었다. 100 bp는 결찰된 주형 및 어댑터 앵커 프로브의 크기와 일치하며, 결찰이 성공적임을 시사한다. 더 낮은 밴드는 증폭 단계에서 사용된 프라이머의 예상된 크기이다. ~100 bp 밴드는 반응 계획 (2)에 대해 레인 2에서 검출 불가능하며, 반응 계획 (1)의 브릿지 프로브가 주형과 어댑터 앵커 프로브의 결찰을 촉진하였다.
실시예 2
엑소뉴클레아제 분해 및 연장에 의한 어댑터 추가
도 26은 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 캡쳐 프로브 혼성체화 및 분해의 개략적인 개요를 제공한다. 혼성체화 캡쳐를 위해, 캡쳐 프로브 주형 상의 표적 서열에 혼성체화하였다 (E-T1, 서열 번호: 6 및 E-T2, 서열 번호: 7). 반응을 위해서, 합성 주형 E-T1(표 3의 투입 혼합물 1,3,5,7) 또는 E-T2 (표 3의 투입 혼합물 2,4,6,8)를 듀플렉스 버퍼 중에 1:1의 비의 농도 (1 uM)로 캡쳐 프로브 (서열 번호: 8)와 혼합하였다. DNA 혼합물을 92℃에서 2 min 동안 변성시키고, 유전자 증폭기 상에서 실온으로 냉각시켰다.
표 2는 사용된 주형 핵산, 캡쳐 프로브, PCR 프라이머의 서열, 뿐만 아니라 실험의 연장 생성물을 나열한다. 어댑터 서열은 볼드체로 나타나고 표적 서열은 이탤릭체이다. E-T2 주형은 E-T1과 비교하여 표적 특이적 영역 (TSR)의 다운스트림에 더 많은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이로써 캡쳐 프로브에 혼성체화될 때, E-T2는 단일 가닥 3' 돌출부를 갖는다.
Figure pct00002
혼성체화 후, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제를 사용하여 주형 상의 단일 가닥 3' 돌출부를 분해시켰다. 엑소뉴클레아제 분해 및 연장을 위해, DNA 혼합물을 DNA 폴리머라제 I, 큰 (클레노브) 단편 또는 T4 폴리머라제와 반응시켰다. 표 3은 각각의 혼합물에 사용된 주형 및 효소의 조합을 나열한다.
Figure pct00003
E-T1/E-T2 및 캡쳐 프로브-어닐링된 생성물의 약 12000개의 카피를 각각의 분해 및 연장 혼합물에 사용하였다. 클레노브 반응 혼합물에 대하여, 1X NEB 버퍼 2, 50uM dNTP, 및 0.1U/ul 클레노브를 추가하고 25℃에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. T4 폴리머라제 혼합물에 대하여, 1X NEB 버퍼 2.1, 10uM dNTP, 및 0.06U/ul T4 폴리머라제를 추가하고 12℃에서 15 min 동안 인큐베이션하였다.
PCR 생성물을 PCR 프라이머 (EGFR 정방향 프라이머, 서열 번호: 9 및 캡쳐 프로브 역방향 프라이머, 서열 번호: 10)를 사용한 qPCR에 의해 평가하였다. 클레노브 또는 T4 폴리머라제 (투입 혼합물 3,4,7, 및 8)와 반응하지 않고 이로 인해 주형이 여전히 3' 돌출부를 보유하는 PCR 생성물은 어댑터를 포함하는 것으로 검출되지 않았다 (표 3 참조). 그에 반해, 어댑터 추가를 투입 혼합물 1, 2, 5, 및 6에서 검출하였다. 투입 혼합물 1, 2, 5, 및 6의 생성물은 또한 서열 번호: 10의 서열을 갖는 것으로 검출되었다. E-T1 주형의 순환 역치 (Ct) 값은 사용된 엑소뉴클레아제/폴리머라제와 상관없이 E-T2보다 낮았으며, E-T1이 3' 돌출부를 포함하지 않기 때문에 연장이 E-T1 주형으로 더 쉽게 일어난다는 것을 나타낸다.
실시예 3
T4 폴리머라제를 사용하는 엑소뉴클레아제 분해 및 연장에 의한 어댑터 추가
도 27은 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제에 의한 캡쳐 프로브 혼성체화 및 분해의 개략적인 개요를 제공한다. 캡쳐 프로브를 주형 상의 표적 서열과 혼성체화하였다. 서열 번호: 12를 포함하는 것으로 알려져 있는 단편화된 게놈 DNA (gDNA)를 주형으로 사용하였다. 혼성체화 캡쳐를 위해, 20ng의 단편화된 (피크 크기 160bp) 주형 gDNA를 10 pmol 캡쳐 프로브와 함께 사용하였다. DNA 투입물 및 혼성체화 프로브를 혼성체화 버퍼에서 95℃에서 30 sec 동안 변성시켰고, 혼합물을 60℃로 서서히 냉각시켰다. 혼성체화물을 유전자 증폭기 상에서 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 혼성체화 버퍼는 DNA 100ng/ul, 1ug/ul 소 혈청 알부민 (BSA), 1ug/ul 피콜, 1ug/ul 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 0.075M 나트륨 시트레이트, 0.75 M NaCl, 5x SSC, 및 1X 덴하르트 용액(Denhardt's solution)을 함유하였다.
클린업을 위해서, 혼성체화된 조립체를 스트렙타비딘 비드 (Thermo Fisher Dynabeads M270 Streptavidin)와 함께 실온에서 10 min 동안 인큐베이션하였다. 클린업을 3회 세척 (세척 1:5X SSPE, 1%SDS; 세척 2: 2X SSPE, 0.1%; 세척 3: 0.1X SSPE, 0.01% 트리톤)으로 수행하였다.
그 다음에, 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제 (T4 폴리머라제)를 캡쳐 조립체에 추가하여 주형 상의 단일 가닥 3' 돌출부를 분해시키고 주형을 연장시켰다. 캡쳐 조립체를 25 ul T4 폴리머라제 혼합물 (투입 혼합물 1, 2, 3)에 재현탁시키고, 12℃에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. 반응을 95℃에서 1 min 동안 열사(heat kill)로 중단시켰다. 투입 혼합물 4는 T4 폴리머라제로 처리하지 않았다.
qPCR을 실행하여 어댑터의 추가를 평가하였다. 풍부화된 DNA를 프로브 EGFR 표적화 서열 (EGFR 정방향 프라이머, 서열 번호: 13 및 역방향 프라이머, 서열 번호: 14)을 사용하는 qPCR에 의해 평가하였다. 어댑터 추가를 EGFR 및 어댑터 서열 PCR (EGFR 정방향 프라이머, 서열 번호: 13 및 프로브 역방향 프라이머, 서열 번호: 15, 표 4 및 5 참조)에 의해 평가하였다. 도 27은 qPCR 평가에 대한 개략도를 예시한다. 어댑터 추가가 T4 폴리머라제로 처리된 모든 샘플 (투입 혼합물 1, 2, 및 3)에서 검출되었지만 T4 폴리머라제 반응이 없는 샘플에서는 검출되지 않았다 (표 5 참조). 엑소뉴클레아제 분해된 혼합물 (투입 혼합물 1, 2, 및 3)의 순환 역치 (Ct) 값은 비-분해된 주형 (투입 혼합물 4)보다 낮았다. 모든 샘플에서, EGFR PCR에 대한 Ct는 유사하였으며, EGFR은 모든 반응에서 캡쳐되었음을 나타내고, 풍부화된 DNA에 대한 Ct를 캡쳐 풍부화 없는 gDNA의 동일한 부분과 비교하였고 EGFR의 65%가 회복되었다는 것을 발견하였다.
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 바람직한 구체예가 본원에서 나타나고 기재되어 있지만, 이러한 구체예가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 많은 변형, 변화, 및 치환이 이제 당업자에게 일어날 것이다. 본원에서 기재된 본 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 한정하고 이들 청구범위 및 그 동등물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 커버된다.
SEQUENCE LISTING <110> AVIDA BIOMED, INC. <120> METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID LIBRARY FORMATION <130> 55328-701.601 <140> PCT/US2019/062507 <141> 2019-11-20 <150> 62/770,585 <151> 2018-11-21 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (70)..(70) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 1 cgtcgctatc aaggaattaa gagaagcaac atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcga 60 tgtgagtttn 70 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <220> <221> modified_base <222> (2)..(4) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 2 gnnngatcgt cggactgtag aactctgaac cgaacgacga catagaccac 50 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 3 gtggtctatg tcgtcgttcg tttttttttt tttttcttgt tggctttcgg agatgttgc 59 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gttcagagtt ctacagtccg acgatc 26 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 cgtcgctatc aaggaattaa g 21 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctgtgg gggtccatgg ctctgaacct 60 <210> 7 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctgtgg gggtccatgg ctctgaacct 60 caggcccacc ttttcttccg gtt 83 <210> 8 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 8 gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaggttcag agccatggac ccccacattt 60 ttttttt 67 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 cccgtcgcta tcaaggaatt aaga 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 gactggagtt cagacgtgtg c 21 <210> 11 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctgtgg gggtccatgg ctctgaacct 60 agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 92 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 tgtgggggtc catggctctg aacctcaggc ccacct 36 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 cccgtcgcta tcaaggaatt aaga 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 ccacacagca aagcagaaac tcac 24 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 gactggagtt cagacgtgtg c 21

Claims (168)

  1. 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계;
    주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계;
    제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계;
    제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계; 및
    제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터이며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 제2 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6 항에 있어서, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계;
    주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및
    캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제9 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12 항에 있어서, 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터이며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 제2 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제11 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21 항에 있어서, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계;
    주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및
    캡쳐 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 주형 핵산 분자에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  25. 제24 항에 있어서, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 제1 어댑터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26 항에 있어서, 제2 어댑터를 주형 핵산 분자의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29 항에 있어서, 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제26 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제29 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제34 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제33 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계;
    주형 핵산 분자의 3' 단부를 캡쳐 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및
    표적 특이적 영역을 분리시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  43. 제42 항에 있어서, 표적 특이적 영역을 분리시키기 전에 캡쳐 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42 항 또는 제43 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42 항 또는 제43 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46 항에 있어서, 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제47 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48 항에 있어서, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제48 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제46 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52 항에 있어서, 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제52 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및
    주형 핵산 분자의 3' 단부를 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 부착시켜, 어댑터 앵커 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  56. 제55 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브에 부착된 주형 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 제1 표적 특이적 영역과 제1 어댑터 랜딩 서열 사이에 제1 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 부착 단계는 리가제로 주형 핵산 분자의 3' 단부를 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 결찰시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 어댑터 앵커 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제62 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제63 항에 있어서, 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시켜, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제1 항에 있어서, 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제64 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터이며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제64 항에 있어서, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물에서 제2 어댑터 프라이머를 제2 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제67 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제68 항에 있어서, 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제68 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 어댑터에 부착된 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제63 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제71 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제72 항에 있어서, 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제72 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제53 항 또는 제55 항에 있어서, 제1 브릿지 결합 서열을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 제1 어댑터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제77 항에 있어서, 제2 어댑터를 주형 핵산 분자의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제78 항에 있어서, 제2 어댑터를 부착시키기 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제78 항에 있어서, 어댑터는 이중 가닥 어댑터인 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제78 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 어댑터 앵커 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제81 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제82 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제83 항에 있어서, 제2 어댑터 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제84 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제84 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 제2 어댑터 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제82 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제87 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제88 항에 있어서, 제1 어댑터 프라이머 및 표적 특이적 프라이머로 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제55 항 또는 제56 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 서열 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하며, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제91 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제91 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제91 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브는 제2 표적 특이적 영역과 제2 어댑터 랜딩 서열 사이에 제2 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제91 항에 있어서, i) 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있거나; ii) 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있거나; iii) 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있거나; 또는 iv) 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 5' 부분에 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 3' 부분에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제91 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역은 제1 브릿지 프로브의 3' 부분에 있고 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역은 제2 브릿지 프로브의 5' 부분에 있고; 제1 브릿지 프로브의 제1 링커 및 제2 브릿지 프로브의 제2 링커는 서로 혼성체화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제9 항, 제25 항, 제43 항, 또는 제56 항 중 어느 한 항에 있어서, 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 표적 서열 영역은 주형 핵산 분자의 표적 서열을 기반으로 하여 디자인되고, 주형 핵산의 표적 서열은 바이설파이트 처리 후 비-메틸화된 시토신을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제1 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자를 바이설파이트로 처리하여, 바이설파이트 처리의 생성물인 제1 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항의 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제98 항에 있어서, 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 표적 서열 영역은 바이설파이트 처리 후 주형 핵산 분자의 표적 서열을 기반으로 하여 디자인되며, 주형 핵산 내 비-메틸화된 시토신은 바이설파이트 처리 동안에 우라실로 변환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자의 5' 단부를 탈인산화하여, 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항의 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브는 라벨을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제101 항에 있어서, 라벨에 의해 브릿지 프로브를 캡쳐하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제101 항에 있어서, 라벨은 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제102 항에 있어서, 라벨은 고체 지지체 상에 캡쳐되는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제104 항에 있어서, 고체 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제105 항에 있어서, 비드는 라벨을 표적화하는 캡쳐 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제106 항에 있어서, 캡쳐 모이어티는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자의 3' 단부를 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항의 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 5' 단부에 부착시킨 후 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 더 포함하며, 핵산 분자는 캡쳐 프로브 및 주형 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제18 항, 제22 항, 제36 항, 제40 항, 제69 항, 제73 항, 제85 항, 또는 제89 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 제109 항에 있어서, 시퀀싱은 차세대 시퀀싱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 단일 가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 손상된 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 샘플로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제115 항에 있어서, 무세포 핵산은 무세포 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제116 항에 있어서, 무세포 DNA는 순환 종양 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관 내 DNA 복구 단계는 제1 항, 제9 항, 제24 항, 제42 항 또는 제55 항 중 어느 한 항의 이전에는 주형 핵산 분자 상에서 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 프로브를 사용하여 표적 서열을 캡쳐하는 단계로서, 프로브는 표적 서열에 혼성체화하고 프로브는 표적 서열을 포함하는 주형에 부착되는 단계; 및
    프로브에 부착된 표적 서열을 바이설파이트로 처리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  120. 브릿지 프로브를 사용하여 표적 서열을 캡쳐하는 단계를 포함하며 브릿지 프로브는 표적 서열로의 앵커 프로브의 부착을 촉진하는 단계를 포함하는 방법.
  121. 제120 항에 있어서, 앵커 프로브에 부착된 표적 서열을 바이설파이트로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화된 표적 특이적 영역 및 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 5' 단부를 포함하는 캡쳐 프로브;
    캡쳐 프로브의 제1 어댑터에 혼성체화하는 제1 어댑터 프라이머로서, 제1 어댑터 프라이머를 연장하면 제1 연장 생성물이 생성되는, 제1 어댑터 프라이머;
    제1 연장 생성물에 부착된 제2 어댑터; 및
    제2 어댑터에 혼성체화하는 제2 어댑터 프라이머
    를 포함하는 키트.
  123. 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역을 포함하는 브릿지 프로브;
    브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하는 브릿지 결합 서열 및 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 5' 단부를 포함하는 어댑터 앵커 프로브
    를 포함하는 키트.
  124. 캡쳐 프로브의 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 캡쳐 프로브는 표적 특이적 영역의 5' 단부에서 제1 어댑터 위치를 더 포함하는 단계;
    표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및
    주형으로서 제1 어댑터를 사용하여 주형 핵산 분자의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  125. 제124 항에 있어서, 캡쳐 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제124 항에 있어서, 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제125 항 또는 제126 항에 있어서, 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제127 항에 있어서, 제2 어댑터를 부착시키기 전에 제1 연장 생성물의 5' 단부를 인산화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제127 항 또는 제128 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터이며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 제2 연장 생성물에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제129 항에 있어서, 제1 연장 생성물 및 제2 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제125 항 또는 제126 항에 있어서,
    표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계로서, 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착되는 단계; 및
    표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제131 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제124 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제124 항에 있어서, 캡쳐 프로브는 결합 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제134 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제135 항에 있어서, 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 제136 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제134 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계;
    제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및
    제1 브릿지 프로브의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  140. 제139 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 제1 어댑터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 제140 항에 있어서, 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 3' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 제141 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터이며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 주형 핵산 분자에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 제142 항에 있어서, 제2 어댑터의 부착 전에 주형 핵산 분자의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 제140 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 제144 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 제145 항에 있어서, 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  147. 제146 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 제139 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 제139 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 제149 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제150 항에 있어서, 지지체는 비드인것을 특징으로 하는 방법.
  152. 제151 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  153. 제149 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  154. 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되고, 제1 브릿지 프로브는 표적 특이적 영역의 5' 단부에 위치한 제1 어댑터를 더 포함하는 단계; 및
    제1 표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및
    주형으로서 제1 어댑터를 사용하여 주형 핵산 분자의 3' 단부를 연장시켜, 제1 연장 생성물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  155. 제154 항에 있어서, 제1 어댑터를 포함하는 프라이머를 제1 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 제1 어댑터를 포함하는 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 제2 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  156. 제155 항에 있어서, 제2 어댑터를 제1 연장 생성물의 5' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  157. 제156 항에 있어서, 제2 어댑터의 부착 전에 제1 연장 생성물의 5' 단부를 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  158. 제157 항에 있어서, 제2 어댑터는 이중 가닥 어댑터이며, 제2 어댑터의 2개의 가닥 중 하나는 제2 연장 생성물에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  159. 제158 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 제2 연장 생성물에 혼성체화하는 단계; 및 표적 특이적 프라이머를 연장시켜, 제3 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  160. 제159 항에 있어서, 표적 특이적 프라이머는 제2 어댑터에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  161. 제159 항에 있어서, 제2 연장 생성물 및 제3 연장 생성물을 증폭시켜, 증폭 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  162. 제154 항에 있어서, 주형 핵산 분자를 3'에서 5' 방향의 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계는 주형 핵산 분자의 3' 단부에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 분열시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  163. 제154 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 분자 바코드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  164. 제154 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  165. 제164 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  166. 제165 항에 있어서, 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  167. 제166 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  168. 제164 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
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