发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种鼓泡状接头元件,使用该接头元件构建测序文库的方法,所构建的测序文库及其应用。本发明通过创新的鼓泡状接头元件及其在溶液中和在磁珠上进行的连接反应技术,着重解决了CG测序平台双接头建库法中存在的接头连接步骤过多、PCR扩增次数多、整体文库构建时间长、成本高、建库起始量要求高的问题。与现有方法相比,整个建库周期和成本降低了约一半,建库起始量从3ug可降低至1ug。
第一方面,本发明提供了一种接头元件,该接头元件是由一条核酸长链A和一条核酸短链B形成的两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体,所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰,所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T;
任选地,所述杂交体中具有III类限制性内切酶识别位点;优选地,所述III类限制性内切酶的识别位点与接头元件-目标DNA连接处相距0-2bp。
关于上述接头元件,作为优选,所述杂交体按构型分为如下三个部分:
组成1:包括长链A的3’端的核酸片段A1与短链B的5’端的核酸片段B1,所述核酸片段A1与所述核酸片段B1部分互补杂交,形成互补的双链部分和位于长链A3’末端的游离部分;
组成2:包括长链A中段的核酸片段A2与短链B中段的核酸片段B2;所述核酸片段B2与核酸片段A2不互补,从而形成鼓泡结构;
组成3:包括长链A的5’端的核酸片段A3与短链B的3’端的核酸片段B3;核酸片段A3的5’末端为磷酸化修饰,核酸片段B3的3’末端为碱基T;除了3’末端的碱基T外,核酸片段B3的所有碱基均与核酸片段A3的碱基互补配对,从而形成短链3’末端突出1个碱基T的互补双链;
其中,任选地,所述组成3中具有III类限制性内切酶的识别序列。
进一步优选地,所述核酸片段A1的长度为10-20nt,所述核酸片段B1的长度为8-16nt;所述核酸片段A2的长度为11-36nt,所述核酸片段B2的长度为11-21nt;所述核酸片段A3的长度为6-8nt,所述核酸片段B3的长度为7-9nt。
进一步优选地,所述核酸片段B1中具有酶作用位点;更进一步优选地,所述酶作用位点为U或dU,对应的酶为USER酶;
进一步优选地,所述核酸片段A2中含有标签序列。
进一步优选地,所述III类限制性内切酶为Acu I、Bpm I、BceA I、Bbv I、BciV I、BpuE I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmF I、BtgZ I、Eci I、EcoP15I、Eco57M I、Fok I、Hga I、Hph I、Mbo II、Mnl I、SfaN I、TspDT I、TspDW I或Taq II。
在一个优选的具体实施方案中,上述接头元件的核酸长链A的序列为:
5’-/Phos/CTGCTGACGTACTG(N)AGCACGAGACGTTCTCGACT/ddC/-3’;其中,/Phos/表示磷酸化修饰,N表示标签序列,/ddC/表示双脱氧胞苷;优选地,所述标签序列长度为6nt-10nt;更优选地,所述标签序列为5’-TGTCATAAAT-3’;即,在一个更优选的具体实施方案中,所述接头元件的核酸长链A的序列为:
5’-/Phos/CTGCTGACGTACTGTGTCATAAATAGCACGAGACGTTCTCGACT/ddC/-3’(见SEQID NO:1);
其核酸短链B的序列(SEQ ID NO:2)为:
5’-GAGAACGUCTCGTGCUACGTTCTCGACTCAGCAGT-3’。
在另一个优选的具体实施方案中,上述接头元件的核酸长链A的序列(SEQ ID NO:3)为:
5’-/Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGTGCTTAGGACAT-3’,其中/Phos/表示磷酸化修饰;
其核酸短链B的序列(SEQ ID NO:4)为:
5’-GTCCTAAGCACUGTAGTGTACGATCCGACTT-3’。
第二方面,本发明提供了一种接头连接方法,其为将如第一方面所述的接头元件连接在待测DNA片段两端。
在具体实施方案中,通过连接反应,将所述接头元件加在待测DNA片段的两端;
优选地,在所述接头元件连接前,还包括将待测DNA片段进行平端修复、5’末端磷酸化和3’末端加碱基A的步骤。
在具体实施方案中,例如,使用DNA聚合酶、优选T4DNA聚合酶进行平端修复;例如,使用核苷酸激酶、优选T4多聚核苷酸激酶进行5’末端磷酸化;例如,使用去除了3’→5’外切酶活性的聚合酶,例如Klenow exo-,进行3’末端加碱基A的步骤。
第三方面,本发明提供了一种测序文库的构建方法,其使用如第一方面所述的接头元件或使用如第二方面所述的接头连接方法进行接头连接。
作为优选,上述测序文库的构建方法具体包括以下步骤:
1)将双链DNA片段进行平端修复、5’末端磷酸化和3’末端加碱基A;
优选地,所述双链DNA片段是通过如下步骤制备的:
1-1)对mRNA样本进行片段化处理,从而获得片段化的mRNA;
1-2)对所述片段化的mRNA进行反转录,从而获得cDNA扩增产物,作为双链DNA片段;
任选地,所述双链DNA片段直接由DNA样本进行片段化处理而得;
优选地,所述片段化为利用物理方法或化学方法,对样本进行随机打断或切断;进一步优选地,利用物理超声法或酶反应法进行所述片段化;
优选地,所述平端修复是利用T4DNA聚合酶进行的;
优选地,所述磷酸化是利用核苷酸激酶、优选T4多聚核苷酸激酶进行的;
优选地,所述3’末端加碱基A是利用去除3’→5’外切酶活性的Klenow聚合酶进行的;
2)通过连接反应,在步骤1)所得DNA片段两端分别加上接头元件1;
在一个优选的具体实施方案中,所述接头元件1的核酸长链A的序列为:
5’-/Phos/CTGCTGACGTACTG(N)AGCACGAGACGTTCTCGACT/ddC/-3’,其中/Phos/表示磷酸化修饰,N表示标签序列,/ddC/表示双脱氧胞苷;优选地,所述标签序列长度为6nt-10nt;更优选地,所述标签序列为5’-TGTCATAAAT-3’;即,在一个更优选的具体实施方案中,所述接头元件的核酸长链A的序列为:
5’-/Phos/CTGCTGACGTACTGTGTCATAAATAGCACGAGACGTTCTCGACT/ddC/-3’(见SEQID NO:1);
其核酸短链B的序列为:
5’-GAGAACGUCTCGTGCUACGTTCTCGACTCAGCAGT-3’;
3)以步骤2)所得DNA片段为模板,以分别与接头元件1的长链3’端,和短链的核酸片段B2和/或B3中的部分序列互补的核酸单链为引物,进行PCR扩增;
两条引物中部具有酶作用位点,且其中一条引物中引入生物素标记;
优选地,所述酶作用位点为U或dU,对应的酶为USER酶;
当使用上述具体的接头元件1时,此处的引物对为:
引物1序列(SEQ ID NO:5)如下:
AGTCGAGAACGUCTCG/iBiodT/GCT;/iBiodT/表示生物素标记的dT;
引物2序列(SEQ ID NO:6)如下:
ACGTTCTCGACUCAGCAG;
4)利用所述酶作用位点,在步骤3)所得扩增片段两端制造粘性末端,利用粘性末端,将扩增片段连接成环状核酸双链;
5)用III类限制性内切酶酶切消化步骤4)所得环状核酸双链,然后利用亲和素磁珠捕获酶切后的DNA片段;
或者,5’)先利用亲和素磁珠捕获步骤4)所得环状核酸双链,再用III类限制性内切酶酶切消化捕获的环状核酸双链;
优选地,所述亲和素磁珠为链霉亲和素磁珠;
6)对步骤5)或5’)所得酶切后的DNA片段进行平端修复和3’末端加碱基A;
7)通过连接反应,在步骤6)所得DNA片段两端分别加上接头元件2;
所述接头元件2的序列不同于接头元件1的序列,且所述接头元件2的核酸片段B1中含酶作用位点;优选地,所述酶作用位点为U或dU,对应的酶为USER酶;
当使用上述具体的接头元件1时,优选地,所述接头元件2的核酸长链A的序列为:
5’-/Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGTGCTTAGGACAT-3’,其中/Phos/表示磷酸化修饰;
其核酸短链B的序列为:
5’-GTCCTAAGCACUGTAGTGTACGATCCGACTT-3’;
8)利用接头元件2的核酸片段B1中的酶作用位点,将步骤7)所得DNA片段上的接头元件2的核酸片段B1切断,同时使切除核酸片段B1的接头元件5’末端磷酸化;
9)将步骤8)所得DNA片段进行变性处理,分离并回收非生物素标记的核酸单链;优选地,采用碱变性法或高温变性法;
10)将步骤9)所得非生物素标记的核酸单链进行环化,形成单链环状核酸产物,即为测序文库;
优选地,利用介导片段实现所述核酸单链的环化,所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端;
当使用上述具体的接头元件2时,优选地,所述介导片段的序列为:5’-ATCGTACACTACATGTCCTAAGCA-3’,见SEQ ID NO:7;
优选地,还包括在核酸单链环化完成后,消化线性单链的步骤;进一步优选地,用核酸外切酶1和/或3进行消化。
步骤10)所得单链环状核酸产物可以直接进入后续的测序步骤,经过滚环复制后形成核酸纳米球(DNB)进行核酸序列信息读取。
第四方面,本发明提供了一种测序文库,由如第三方面所述的测序文库构建方法制得。所制得的测序文库为单链环状测序文库。
第五方面,本发明提供了如第四方面所述的测序文库在基因组测序中的应用,优选地,在目标基因组区域测序中的应用。
作为优选,使用单链环状文库测序平台进行测序;进一步优选地,使用CompleteGenomics公司的测序平台进行测序。
第六方面,本发明提供了一种核酸测序方法,包括将如第四方面所述的测序文库进行测序的步骤;
优选地,使用单链环状文库测序平台进行测序;进一步优选地,使用CompleteGenomics公司的测序平台进行测序;
优选地,还包括将测序结果进行组装和/或拼接的步骤。
第七方面,本发明提供了一种测序文库构建试剂盒,其包括如第一方面所述的接头元件。
优选地,所述试剂盒还包括核苷酸激酶,优选T4多聚核苷酸激酶;DNA聚合酶,优选T4DNA聚合酶或去除了3’→5’外切酶活性的聚合酶,例如Klenow exo-;USER酶;以及III类限制性内切酶,例如Acu I、Bpm I、BceA I、Bbv I、BciV I、BpuE I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmF I、BtgZ I、Eci I、EcoP15I、Eco57M I、Fok I、Hga I、Hph I、Mbo II、Mnl I、SfaN I、TspDT I、TspDW I或Taq II。
有益效果
相比现有的双接头建库法,本发明采用了新颖的鼓泡状接头元件,简便的连接方法,并利用了在磁珠上进行酶反应的方法。
现有方法采用的定向接头连接法,在保证接头定向连接的同时,最大程度地降低DNA片段间相互连接问题,采用了将5’接头和3’接头分开设计,分步连接的方法。每加一端接头,都需要接头序列、封闭序列、引物序列共同作用来完成,完成整个过程需要6步酶反应、5步纯化操作,步骤繁琐,建库成本(序列成本、酶反应试剂成本、纯化成本)高,周期长,样品损耗大。
而本发明采用的鼓泡状接头元件及其连接方法,能够在保证接头定向连接的前提下,提高建库效率,降低建库成本和起始量。
由于在连接方法设计时,将目的DNA片段进行了3’末端加A处理,因此3’T突出的鼓泡状接头元件可以与3’A突出的目的DNA进行有效地定向连接。相对现有方法的分步连接策略,本发明采用的方法实现了接头的一步连接,完成整个过程只需要3-4步酶反应,3步纯化操作,步骤简单,建库成本降低,周期缩短,另外,纯化次数减少使样品损耗降低,建库起始量可从原来的3μg降低至1μg。
传统的定向接头连接法与本发明的鼓泡状接头元件连接方法的对比详见图3。由图3可以看出,定向接头连接方法需要经过去磷酸化、末端修复、加5’接头、引物延伸、加3’接头、切口平移及连接这6步酶反应及5次纯化操作才能将接头A的序列定向加入到目的DNA两端,而本发明的鼓泡状接头元件连接方法只需要经过磷酸化与末端修复一步反应、加A、加鼓泡状接头、USER酶切(可省略)这4步(或3步)酶反应及3次纯化操作即可较快速地将接头A的序列定向加入到目的DNA两端。
此外,传统的在溶液中的酶反应方法,酶反应过程中DNA和反应液是混合在一起的,反应完成后,需要去除掉酶和其他杂质,因而需要采用硅柱纯化(如Qiagen PCRPurification Kit)或普通磁珠纯化(如Agencourt AMPure XP beads)的方法来纯化DNA,这些纯化方法不仅试剂成本高,纯化操作时间较长,而且每次纯化之后DNA样品会有10-30%的损失。本发明独创地采用在磁珠上进行酶反应的方法,由于目的DNA一直被绑定在亲和素磁珠上,酶反应完之后只需要用磁力架吸附固定住磁珠,然后吸弃反应上清液,再用合适的缓冲液冲洗掉磁珠上残留的杂质,即可达到纯化DNA的目的。因此,本方法不仅节省了纯化试剂成本,降低了DNA样品损失(只有约1%的损失),还有利于自动化操作的实现和工作效率的提升。
关于在溶液中进行酶反应和在磁珠上进行酶反应的方法对比,在图4中进行了清晰的说明;图4显示了从Ⅲ类内切酶切割至单链分离的酶反应大致步骤。具体地,图4显示,Ⅲ类内切酶切割之后,溶液中的酶反应需要做两步磁珠纯化以选择符合目的DNA大小的酶切片段,但该片段选择方法同时也会引入部分同样片段大小的非目的DNA酶切片段;而磁珠上的酶反应利用目的DNA片段A接头上标记的生物素与链霉亲和素磁珠的特异结合,可准确地富集到目的DNA酶切片段。对于接头元件2的连接,现有方法需要做6次酶反应和6次磁珠纯化才能完成;本发明采用的方法只需要做2次酶反应和2次磁珠洗涤即可完成。
另外,现有方法加完接头元件2需要进行PCR扩增提高目的DNA产量,再进行1次单链分离和1次特异性单链捕获反应,才能得到目的单链DNA;本发明采用的方法加完接头元件2之后无需PCR扩增,通过USER酶切切除非目的接头序列的同时形成5’磷酸化末端,再通过变性的方法,就可将目的单链DNA洗脱下来。这是由于本发明采用在磁珠上的酶反应方法,使得DNA样品的损耗大大降低,在加完接头元件2之后,不需要做PCR扩增(PCR-free)就能得到足量的上机文库,这样不仅省去了一步PCR扩增反应,而且简化了筛选目的单链的步骤,使接头B至单链分离环节的建库流程得到极大地简化。此外,由于减少了文库构建的PCR扩增循环数,可以提高文库的库容,降低上机文库中重复读长的个数,提高文库的测序数据有效率。
总之,本发明通过新颖的鼓泡状接头元件,以及在溶液中和在磁珠上进行接头连接反应的技术,成功对CG双接头建库法文库构建流程的进行了改进和优化,主要改进的地方为第一次接头连接由6步酶反应、5次磁珠纯化简化为4步酶反应、3步纯化,第二次接头连接由6次酶反应、6次磁珠纯化简化为2次酶反应、2次磁珠洗涤,同时省去了第二次PCR扩增和一次单链富集筛选步骤,使整个建库周期和成本降低了约一半,建库起始量从3ug可降低至1ug,并有利于实现高通量建库的自动化和文库测序数据有效率的提高。
具体实施方式
为便于理解本发明,本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1本发明的测序文库构建
1、基因组DNA打断:
炎黄1号细胞基因组DNA打断有多种方式,无论是物理超声法还是酶反应法,市场上有非常成熟的方案。本实施例采用的是物理超声打断法。
取96孔PCR板一块,加入一根聚四氟乙烯线,加入基因组DNA 1ug,加入TE缓冲溶液或无酶纯水补齐100ul。将板封膜后至于E220超声打断仪上超声打断。
打断条件设置如下:
填充系数 |
21% |
压力(PIP) |
500 |
脉冲系数 |
500 |
打断时间 |
20s,2次 |
2、打断片段选择:
可以采用磁珠纯化法或凝胶回收法。本实施例采用磁珠纯化法,具体如下:
取打断后的DNA,加入45ul Ampure XP磁珠,混匀后放置7-15min;置入磁力架后收集上清,在上清中加入18ul Ampure XP磁珠,混匀后放置7-15min;置入磁力架吸去上清,用75%乙醇洗磁珠两次;晾干后加入50ul TE缓冲溶液,混匀后放置7-15min溶解回收产物。
3、片段磷酸化及末端修复一步反应:
取上步骤回收产物,按下表配制体系:
无酶纯水 |
9.33ul |
10X NEBNext末端修复缓冲液 |
7.00ul |
T4脱氧核糖核酸聚合酶(3U/ul) |
1.87ul |
T4多聚核苷酸激酶(10U/ul) |
1.40ul |
牛血清白蛋白(20mg/ml) |
0.40ul |
总共 |
20.00ul |
将20ul反应液加入前一步的回收产物中,混匀,置于20℃孵育30min。反应完后,用70ul Ampure XP磁珠进行纯化,40ulTE缓冲液溶解回收产物。(反应产物的纯化有多种方式,有磁珠法、柱纯化法、凝胶回收法等等。均可用于替换。本实施例如不做特殊说明,均采用磁珠法纯化。)
4、片段末端加A反应:
按下表配制体系:
将体系混匀后加入上一步骤产物中,混匀后置于37℃孵育30min。用60ul AmpureXP磁珠进行纯化,40ul TE缓冲溶液溶解回收产物。
5、接头元件1连接:
本方案中使用的接头元件1序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化,“dd”示双脱氧,“bio”示生物素,字体加粗示标签序列):
长链1:
/Phos/CTGCTGACGTACTGTGTCATAAATAGCACGAGACGTTCTCGACT/ddC/
短链1:GAGAACGUCTCGTGCUACGTTCTCGACTCAGCAGT
接头元件1混合液(25uM)按以下配方配制:
长链1(200uM) |
12.5ul |
短链1(200uM) |
12.5ul |
氯化钠(5M) |
1.2ul |
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(1M,pH7.8) |
1.2ul |
乙二胺四乙酸二钠(20mM) |
0.5ul |
无酶纯水 |
72.1ul |
总共 |
100.0ul |
将6ul配制好的接头元件1混合液(25uM)加入上一步骤产物中,充分混匀。
连接反应体系按以下配方配制:
本方案使用的连接缓冲液1配方:
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 7.8) |
150mM |
聚乙二醇8000 |
15% |
氯化镁 |
30mM |
核糖核苷三磷酸 |
3mM |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于20℃孵育30min。反应完成后,加入35ul乙二胺四乙酸二钠(35uM),混匀。用50ul Ampure XP磁珠进行纯化,52ul TE缓冲液溶解回收产物。
此步骤完成了目的核酸片段与接头元件1的连接。连接前、后产物及连接后的PCR扩增产物电泳结果如图5所示。
6、聚合酶链式反应:
引物1序列(SEQ ID NO:5)如下:
AGTCGAGAACGUCTCG/iBiodT/GCT
引物2序列(SEQ ID NO:6)如下:
ACGTTCTCGACUCAGCAG
按下表配制反应体系:
将上步骤50ul回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表条件进行反应:
反应完成后,使用450ul Ampure XP磁珠进行纯化,65ul TE缓冲液溶解回收产物。取1ul回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度。取2.4ug产物进行下一步反应。
7、去尿嘧啶:
配制以下反应液:
10X Taq缓冲液 |
5ul |
USER酶(1U/ul) |
8ul |
总体积 |
13ul |
将以上反应液加入37ul(2.4ug)上步骤反应产物中,混匀后置于37℃孵育1h。
8、双链环化:
配制以下反应体系1:
将上一步骤反应产物加入反应体系1中,置于60℃水浴反应30min。反应完成后置于常温水浴反应20min。
配制以下反应体系2:
将反应体系2,加入上步反应体系中,置于室温孵育1h。
500ul反应产物中加入330ul Ampure XP磁珠,混匀后放置7-15min;置入磁力架后收集上清,在上清中加入170ul Ampure XP磁珠,混匀后放置7-15min;置入磁力架吸去上清,用75%乙醇洗磁珠两次;晾干后加入68.1ul TE缓冲液溶解纯化产物。
9、线性消化:
配制以下反应体系:
将上步骤产物加入反应体系中,混匀后置于37℃孵育1h。
使用80ul Ampure XP磁珠纯化。使用82ul TE缓冲液溶解回收产物。
10、酶切处理:
配制以下反应体系:
无酶纯水 |
233.2ul |
10X NEBuffer3.1 |
36ul |
Ecop15I内切酶(10U/ul) |
10.8ul |
总体积 |
280ul |
将上步骤产物加入反应体系中,混匀后置于37℃孵育16h。
11、结合链霉亲和素磁珠:
取90ul MyOne Streptavidin C1磁珠,吸弃上清,用1x磁珠结合缓冲液清洗两次(每次450ul,每次清洗完需要吸弃上清)后重悬于90ul 1x磁珠结合缓冲液中,并加入0.9ul0.5%吐温20,混匀备用。
向360ul上步骤反应产物中加入72ul氯化钠溶液(3M),混匀。加入已清洗的90ulMyOne Streptavidin C1磁珠,混匀,室温静置10min。置磁力加上3min,去除上清液。用1x低盐清洗缓冲液(含0.05%吐温20)清洗两次(每次150ul,每次清洗完需要吸弃上清),用90ul1x低盐清洗缓冲液重悬磁珠。
12、末端修复及末端加A一步反应:
配制以下反应体系:
无酶纯水 |
0.4ul |
10X NEBuffer2 |
12ul |
dATP(100mM) |
4ul |
dNTP(25mM) |
0.4ul |
没有外切酶活性的Klenow片段(5U/ul) |
3.2ul |
总体积 |
20ul |
将该反应体系加入上步骤磁珠重悬液中,混匀后置于37℃孵育1h。
反应完成后,加入2.2ul乙二胺四乙酸二钠溶液(0.5M),混匀,室温静置1min,吸弃上清。用1x低盐清洗缓冲液(含0.05%吐温20)清洗两次,用80ul 1x低盐清洗缓冲液重悬磁珠。
13、接头元件2连接:
长链2:/Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGTGCTTAGGACAT
短链2:GTCCTAAGCACUGTAGTGTACGATCCGACTT
接头元件2混合液(10uM)按以下配方配制:
长链2(100uM) |
10ul |
短链2(100uM) |
10ul |
氯化钠(1M) |
5ul |
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(0.2M,pH7.8) |
5ul |
乙二胺四乙酸二钠(2mM) |
5ul |
无酶纯水 |
65ul |
总共 |
100ul |
将30ul配制好的接头元件2混合液(10uM)加入上一步骤磁珠重悬液中,充分混匀。
连接反应体系按以下配方配制:
将连接反应体系加入磁珠重悬液中,混匀,室温静置30min。反应完之后,加入3.42ul乙二胺四乙酸二钠(0.5M),混匀,静置1min,吸弃上清。用1x低盐清洗缓冲液(含0.05%吐温20)清洗两次,用80ul 1x低盐清洗缓冲液重悬磁珠。
此步骤完成了目的核酸片段与接头元件2的连接。连接效果可通过取下一步洗脱单链核酸3ul,扩增8个循环之后,取5uL电泳检测得知,电泳结果如图6所示。
14、去尿嘧啶及洗脱单链核酸:
将1ul USER酶加入到上步骤磁珠重悬液中,混匀,置于37孵育1h。反应完之后,加入8.1ul乙二胺四乙酸二钠(0.1M),混匀,静置1min,吸弃上清。用1x低盐清洗缓冲液(含0.05%吐温20)清洗两次,吸弃上清。用75ul氢氧化钠(0.1M)重悬磁珠,室温静置5min,洗取上清。加入37.5ul酸性缓冲液中和获得的单链分离产物,中和后产物总体积112.5ul。
15、单链环化:
配制以下反应体系1,其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列为:ATCGTACACTACATGTCCTAAGCA(即SEQ ID NO:7)。
无酶纯水 |
59ul |
介导片段(100uM) |
4ul |
总共 |
63ul |
将反应体系1加入上步骤的单链分离产物中,混匀。
配制反应体系2:
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃孵育1.5h。
16、消化线性单链:
配置以下反应缓冲液:
将20ul反应缓冲液加入上一步骤的350.5ul反应产物中,混匀,置于37℃孵育30min。加入15.4ul乙二胺四乙酸(500mM),混匀。使用500ul PEG32磁珠纯化回收,70ul TE缓冲液溶解产物。
本实施例最终产物浓度和总量情况如下:电泳结果见图7。
|
浓度(ng/ul) |
总量(ng) |
分子量(pmol) |
产物1 |
0.35 |
24.50 |
0.44 |
产物2 |
0.34 |
23.80 |
0.42 |
产物3 |
0.35 |
24.50 |
0.44 |
产物4 |
0.28 |
19.60 |
0.35 |
产物5 |
0.37 |
25.90 |
0.46 |
产物6 |
0.39 |
27.30 |
0.49 |
产物7 |
0.30 |
21.00 |
0.37 |
从结果来看,各产物浓度与总量满足了后续测序要求(分子量≧0.12pmol),电泳结果也显示片段集中,是质量非常高的文库。证明本方案是完全成功的。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程,但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因科技有限公司
<120> 鼓泡状接头元件和使用其构建测序文库的方法
<130> PIDC3171300PCN
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> /分子类型="DNA"
/"/Phos/"="末端磷酸基团修饰"
/"/ddc/"="双脱氧胞嘧啶"
<400> 1
/Phos/ctgctgacgt actgtgtcat aaatagcacg agacgttctc gact/ddc/ 45
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagaacguct cgtgcuacgt tctcgactca gcagt 35
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> /"/Phos/"="末端磷酸基团修饰"
<400> 3
/Phos/agtcggaggc caagcgtgct taggacat 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcctaagca cugtagtgta cgatccgact t 31
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> /"/iBiodT/"="生物素标记的脱氧胸腺嘧啶"
<400> 5
agtcgagaac guctcg/iBiodT/gct 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgttctcga cucagcag 18
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atcgtacact acatgtccta agca 24