JP2022516821A - 複合体が表面結合されたトランスポソーム複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年1月11日に出願された米国特許仮出願第62/791,509号及び2019年4月30日に出願された米国特許仮出願第62/840,610号に対する優先権の利益を主張するものである。
本開示は、固体支持体に固定化されたトランスポソーム複合体を使用して、核酸(例えば、DNA)を断片化及びタグ付けするための方法及び組成物を含む、PCR増幅を使用せずにタグ付けされた核酸断片のライブラリを生成するための方法、組成物、及びキットに関する。
トランスポソーム複合体
末端配列
アダプタ配列
A14-ME:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(配列番号:1)
B15-ME:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(配列番号:2)
ME’:5’-phoS-CTGTCTCTTATACACATCT-3’(配列番号:3)
A14:5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(配列番号:4)
B15:5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’(配列番号:5)
ME:AGATGTGTATAAGAGACAG(配列番号:6)
付着ポリヌクレオチド
P5:AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(配列番号:7)
P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(配列番号:8)
及びこれらの誘導体。いくつかの実施例では、P7配列は、G*位、例えば、8オキソ-グアニンにおける修飾グアニンを含む。他の実施例では、*は、G*と隣接する3’Aとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの実施例では、P5及び/又はP7プライマーは、非天然リンカーを含む。任意選択的に、P5及びP7プライマーの一方又は両方は、ポリTテールを含み得る。ポリTテールは、一般に、上記の配列の5’末端に、例えば、5’塩基と末端アルキン単位との間に位置するが、場合によっては3’末端に位置し得る。ポリT配列は、任意の数、例えば、2~20個のTヌクレオチドを含み得る。P5及びP7プライマーが実施例として与えられるが、本明細書に提示される実施例では、任意の好適なプライマーが使用され得ることを理解されたい。P5及びP7プライマー配列を含むプライマー配列を有するインデックス配列は、配列決定のためのライブラリを活性化するためにP5及びP7を加える役割を果たす。P5及びP7プライマーが実施例として与えられるが、本明細書に提示される実施例では、任意の好適な増幅プライマーが使用され得ることを理解されたい。
固体支持体
タグ付き核酸断片を生成する固定化されたトランスポソーム複合体/方法
組み合わされたタグメンテーション及びインデックス付けを介してタグ付き核酸配列を生成する方法
標的核酸
配列決定方法
実施例1:ユーザの開裂可能なリンカーを有する付着オリゴヌクレオチドなし
実施例2:PCR増幅を使用しない、タグ付き核酸断片のライブラリの生成
実施例3:試験ライブラリの配列決定比較
実施例4:開裂可能なリンカーを有する二股オリゴヌクレオチド
配列:CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(配列番号:21)を有するME’_B15’_P7’(75μM)を含むオリゴヌクレオチドと、を含むビオチン化オリゴヌクレオチド(50μM)を、
10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTAで、及び25mM NaClで処理し、95℃で10分間加熱し、次いで1秒当たり-0.1℃で10℃まで冷却した。次いで、ビオチン化オリゴの最終濃度が2μMであり、トランスポザーゼの濃度が4μMであるように、アニーリングされたトランスポゾンをトランスポザーゼ酵素と混合した。混合物を37℃で一晩インキュベートして、溶液相トランスポソーム複合体を形成した。次いで、溶液相トランスポソーム複合体を、ストレプトアビジンがコーティングされたビーズ及びHT1緩衝液(Illumina)と混合し、室温で1時間回転させることによって固相支持体上に固定化した。次いで、15%グリセロール標準保存緩衝液(Illumina)中に再懸濁させる前に、ビーズをHT1緩衝液中で3回洗浄した(図2A)。
実施例5:修飾された伸張-ライゲーションプロトコル
実施例6:チューブ内でのPCRフリー固定化トランスポソーム
実施例7:開裂可能なリンカーを有しないPCRフリーの調製
実施例8:96ウェルライブラリのPCRフリー調製
実施例9:組み合わされたタグメンテーション及びインデックス付けによるライブラリの調製
配列表
配列番号:1-A14-ME
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
配列番号:2-B15-ME
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
配列番号:3-ME’
phos-CTGTCTCTTATACACATCT
配列番号:4-A14
TCGTCGGCAGCGTC
配列番号:5-B15
GTCTCGTGGGCTCGG
配列番号:6-ME
AGATGTGTATAAGAGACAG
配列番号:7-P5
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC
配列番号:8-P7
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*A
配列番号:9-P5_A14_ME
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
配列番号:10-P_ME’_B15
5Phos/CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC
配列番号:11-Bio_P7_i701_B1_5_ddC
5Biosg/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG/3ddC/
配列番号:12-A14’_P5’_bio
GACGCTGCCGACGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3Bio/
配列番号:13-P_A14_ME
5Phos/TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
配列番号:14-A14’_nitro_P5’_bio
GACGCTGCCGACGACCC/i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd//i5NitInd/GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3Bio/
配列番号:15-A14’_12anc’_2sp_P5’_bio
GACGCTGCCGACGACCGAGCATATCC/iSp18//iSp18/GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/3BioTEG/
配列番号:16-P5_i501
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGC
配列番号:17-P_i701’_P7_ddC
5Phos/TAAGGCGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG/3ddC/
配列番号:18-P7_i701_B15_ddC
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG/3ddC/
配列番号:19-P5_i501_12anc
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCGGATATGCTCGG
配列番号:20-ビオチン化オリゴヌクレオチド
/5Biosg/TTUUUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACA
配列番号:21-ME’_B15’_P7’
CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
配列番号:22-例示的なアンカー配列
GGATATGCTCGG
配列番号:23:例示的な配列X
ATCTGACTATCCCCTGCG
配列番号:24:例示的な配列X’
CGCAGGGGATAGTCAGAT
Claims (52)
- アニーリングされたトランスポゾン/付着ポリヌクレオチドハイブリッドであって、
(a)3’トランスポゾン末端配列及び5’アダプタ配列を含む第1のトランスポゾンと、
(b)5’トランスポゾン末端配列及び3’アダプタ配列を含む第2のトランスポゾンであって、前記5’トランスポゾン末端配列が、前記3’トランスポゾン末端配列に対して相補的である、第2のトランスポゾンと、
(C)付着ポリヌクレオチドであって、
(i)前記2つのアダプタ配列のうちの1つにハイブリダイズする付着アダプタ配列、及び
(ii)結合要素、を含む付着ポリヌクレオチドと、を含む、アニーリングされたトランスポゾン/付着ポリヌクレオチドハイブリッド。 - トランスポソーム複合体であって、
(a)トランスポザーゼと、
(b)3’トランスポゾン末端配列及び5’アダプタ配列を含む第1のトランスポゾンと、
(c)5’トランスポゾン末端配列及び3’アダプタ配列を含む第2のトランスポゾンであって、前記5’トランスポゾン末端配列が、前記3’トランスポゾン末端配列に対して相補的である、第2のトランスポゾンと、
(d)付着ポリヌクレオチドであって、
(i)前記2つのアダプタ配列のうちの1つにハイブリダイズする付着アダプタ配列、及び
(ii)結合要素、を含む付着ポリヌクレオチドと、を含む、トランスポソーム複合体。 - 固定化されたトランスポソーム複合体であって、
固体支持体と、
前記固体支持体に固定化されたトランスポソーム複合体と、を含み、
前記トランスポソーム複合体が、
(a)トランスポザーゼと、
(b)3’トランスポゾン末端配列及び5’アダプタ配列を含む第1のトランスポゾンと、
(c)5’トランスポゾン末端配列及び3’アダプタ配列を含む第2のトランスポゾンであって、前記5’トランスポゾン末端配列が、前記3’トランスポゾン末端配列の少なくとも一部に対して相補的である、第2のトランスポゾンと、
(d)付着ポリヌクレオチドであって、
(i)前記2つのアダプタ配列のうちの1つにハイブリダイズする付着アダプタ配列、及び
(ii)結合要素、を含む付着ポリヌクレオチドと、を含み、
前記結合要素が、前記固体支持体に固定化されている、固定化されたトランスポソーム複合体。 - 固定化されたトランスポソーム複合体であって、
(a)トランスポザーゼと、
(b)3’トランスポゾン末端配列及び5’アダプタ配列を含む第1のトランスポゾンと、
(c)前記3’トランスポゾン末端配列の少なくとも一部に対して相補的な5’トランスポゾン末端配列及び3’アダプタ配列を含む第2のトランスポゾンと、
(d)開裂可能なリンカーを介して前記5’アダプタ配列に付着した結合要素と、を含み、
前記結合要素が固体支持体に固定化されている、固定化されたトランスポソーム複合体。 - 前記付着ポリヌクレオチドが、スペーサ領域、アンカー領域、プライマー配列、若しくはインデックスタグ配列、又はこれらの組み合わせを更に含み、任意選択的に、捕捉配列、バーコード配列、開裂配列、若しくは配列決定関連配列、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項2~4のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記第1のトランスポゾンが、前記5’アダプタ配列の5’にプライマー配列を更に含み、前記付着ポリヌクレオチドが、(i)前記5’アダプタ配列と相補的であり、かつ前記5’アダプタ配列にハイブリダイズする部分と、(ii)相補的プライマー配列と、を含む、請求項5に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記第1のトランスポゾンが、前記5’アダプタ配列の5’にプライマー配列を更に含み、前記付着ポリヌクレオチドが、インデックスタグ配列及びプライマー配列を含む、請求項5に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記第2のトランスポゾンが、前記3’アダプタ配列を含み、前記付着ポリヌクレオチドが、(i)前記3’アダプタ配列に対して相補的であり、かつ前記3’アダプタ配列とハイブリダイズする部分と、(ii)インデックスタグ配列と、(iii)プライマー配列と、を含む、請求項5に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記付着ポリヌクレオチドが、スペーサ領域又はスペーサ領域及びアンカー領域を含む、請求項5に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記第1のトランスポゾンが、前記5’アダプタ配列を含み、前記付着ポリヌクレオチドが、(i)前記5’アダプタ配列と相補的であり、かつ前記5’アダプタ配列にハイブリダイズする部分と、(ii)スペーサ領域と、(iii)プライマー配列と、を含む、請求項9に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記付着ポリヌクレオチドが、A14’配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記スペーサ領域が、非DNAスペーサである、請求項9~11のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記スペーサ領域が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、又は30塩基対とほぼ同等の長さであり、任意選択的に、前記スペーサ領域が、8又は10塩基対又はヌクレオチドとほぼ同等の長さである、請求項9~12のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記スペーサ領域が、ユニバーサル塩基を含み、任意選択的に、前記ユニバーサル塩基が、イノシン又はニトロインドール配列を含む、請求項9~13のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記スペーサ領域が、1つ以上のC18スペーサ、1つ2つ以上のC9スペーサ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項9~13のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記スペーサ領域が、2×sp18合成リンカー、2つのC18スペーサ、C9スペーサ、又は2つのC18スペーサ及び1つのC9スペーサを含む、請求項15に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記アンカー領域が、インデックス付けオリゴヌクレオチドのアンカー領域相補体に対して相補的であり、前記インデックス付けオリゴヌクレオチドが、前記アンカー領域相補体及びインデックスタグ配列(-アンカー’-インデックスタグ配列-)を含む、請求項5~16のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記アンカー領域相補体が、複数のインデックス付けオリゴヌクレオチドに共通である、請求項17に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記複数のインデックス付けオリゴヌクレオチドの各インデックスタグ配列が、同じであるか又は異なっている、請求項17に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記結合要素が、ビオチンを含む、請求項2~19のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記結合要素が、3’ビオチンリンカーである、請求項20に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記トランスポザーゼが、Tn5トランスポザーゼ、野生型Tn5トランスポザーゼ、又は過剰活性Tn5トランスポザーゼ、又はこれらの変異体である、請求項2~10のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記付着ポリヌクレオチドの前記プライマー配列が、前記インデックス付けポリヌクレオチドのインデックスプライマー配列に対して相補的である、請求項2~22のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記固体支持体が、ビーズ、常磁性ビーズ、フローセル、マイクロ流体デバイスの表面、チューブ、プレートのウェル、スライド、パターン化表面、又はマイクロ粒子である、請求項3~23のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記固体支持体が、複数の固体支持体を含む、請求項24に記載のトランスポソーム複合体。
- 前記複数の固体支持体が、複数のビーズを含む、請求項25に記載のトランスポソーム複合体。
- キットであって、
請求項2~26のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体と、
インデックス配列を含むインデックスミックスと、を含む、キット。 - 前記インデックスミックスが、i5インデックス配列及びi7インデックス配列を含み、前記i5インデックス配列が、前記付着ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、前記i7インデックス配列が、前記3’アダプタ配列にハイブリダイズする、請求項27に記載のキット。
- タグ付き核酸断片のライブラリを生成する方法であって、標的核酸を複数の標的断片に断片化し、かつ前記第1のトランスポゾンの前記3’末端を前記標的断片の前記5’末端に結合して複数の5’タグ付き標的断片を産生するのに十分な条件下で、請求項3~26のいずれか一項に記載の固定化されたトランスポソーム複合体を前記標的核酸と接触させることを含む、方法。
- 非結合核酸を除去するように前記固体支持体を処理すること、又は、
任意選択的に、
(a)前記固体支持体を加熱すること及び/若しくは
(b)前記固体支持体を酵素変性剤で洗浄することによって、前記トランスポザーゼを前記複合体から除去するように前記固体支持体を処理すること、を更に含み、
前記酵素変性剤が任意選択的に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、グアニジン塩酸塩、尿素、又はプロテイナーゼを含む、請求項29に記載の方法。 - 前記接触させることが、生体試料を前記トランスポソーム複合体と混合することを含む、請求項29又は請求項30に記載の方法。
- 前記生体試料が、細胞溶解物若しくは全細胞を含むか、又は血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、糞便、浸軟組織、及び固定された組織FFPEから選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記接触させることが、複数のインデックス付けオリゴヌクレオチドを前記付着ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを更に含み、前記複数のインデックス付けオリゴヌクレオチドが、同じ又は異なるインデックス配列を含む、請求項29~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖を伸張かつライゲーションして、完全二本鎖タグ付き断片を産生するように、前記複数の5’タグ付き標的断片をポリメラーゼ及びリガーゼで処理することを更に含む、請求項29~33のいずれか一項に記載の方法。
- ポリメラーゼ及びリガーゼで前記処理することが、DNA二次構造破壊剤の存在下で行われ、前記破壊剤が任意選択的にDMSOである、請求項34に記載の方法。
- ポリメラーゼ及びリガーゼで前記処理することが、前記プライマー配列の相補体であるオリゴヌクレオチドの存在下で行われ、前記オリゴヌクレオチドが、P7’オリゴヌクレオチドであり、前記プライマー配列が、P7配列である、請求項34又は請求項35に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性を欠くT4 DNAポリメラーゼ変異体を含む、請求項34~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全二本鎖タグ付き断片を前記固体支持体から除去することを更に含む、請求項29~37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記除去することが、前記完全二本鎖タグ付き断片を前記固体支持体から開裂するのに十分な熱及び/又は変性剤を適用することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記5’タグ付き標的断片又は完全二本鎖タグ付き断片のうちの1つ以上を配列決定することを更に含む、請求項29~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記断片が、前記接触することの後及び前記配列決定することの前に、PCRにより定量化されない、請求項40に記載の方法。
- 前記核酸が、DNA又はRNAである、請求項29~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3’アダプタ配列が、インデックスアダプタ配列の少なくとも一部に対して相補的である、請求項29に記載の方法。
- 前記付着ポリヌクレオチドの前記プライマー配列が、インデックスプライマー配列の少なくとも一部に対して相補的である、請求項29に記載の方法。
- タグ付き核酸断片のライブラリを生成する方法であって、
a)標的核酸を複数の標的断片に断片化し、かつ前記第1のトランスポゾンの前記3’末端を前記標的断片の前記5’末端に結合して複数の5’タグ付き標的断片を産生するのに十分な条件下で、請求項3~26のいずれか一項に記載の固定化されたトランスポソーム複合体を前記標的核酸と接触させることと、
b)任意選択的に、(a)前記固体支持体を加熱すること、及び/若しくは(b)前記固体支持体を酵素変性剤で洗浄することによって、非結合核酸を除去するように前記固体支持体を処理すること、又は前記トランスポザーゼを前記複合体から除去するように前記固体支持体を処理することであって、前記酵素変性剤が任意選択的に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、グアニジン塩酸塩、尿素、又はプロテイナーゼを含む、処理することと、
c)前記5’タグ付き標的断片を伸張及びライゲーションして完全二本鎖タグ付き断片を産生するように、前記複数の5’タグ付き標的断片をポリメラーゼ及びリガーゼで処理することであって、任意選択的に、ポリメラーゼ及びリガーゼで前記処理することが、DNA二次構造破壊剤の存在下で行われ、前記破壊剤が、任意選択的に、DMSOである、処理することと、
d)前記完全二本鎖タグ付き断片を前記固体支持体から除去することであって、任意選択的に、前記除去することが、前記完全二本鎖タグ付き断片を前記固体支持体から開裂するのに十分な熱及び/又は変性剤を適用することを含み、任意選択的に、前記変性剤が、NaOHである、除去することと、
e)捕捉ビーズを使用して前記完全二本鎖タグ付き断片を選択することであって、任意選択的に、前記捕捉ビーズが磁気ビーズであり、更に任意選択的に、2つの別個の選択する工程が実行される、選択することと、を含む、方法。 - 前記固定化されたトランスポソーム複合体が、
固体支持体と、
前記固体支持体に固定化されたトランスポソーム複合体であって、
前記トランスポソーム複合体が、
(a)トランスポザーゼと、
(b)3’トランスポゾン末端配列及びアンカー配列(Anchor)を含む第1のトランスポゾンと、
(c)5’トランスポゾン末端配列及びB15’配列を含む第2のトランスポゾンと、
(d)付着ポリヌクレオチドであって、
(i)アンカー配列相補体(Anchor’)、A14’配列、スペーサ、及びP5’配列、並びに
(ii)ビオチンを含む結合要素であって、前記ビオチンが、前記固体支持体に固定化されている、結合要素、を含む、付着ポリヌクレオチドと、を含む、トランスポソーム複合体と、を含む、請求項45に記載の方法。 - 前記完全二本鎖タグ付き結合断片のうちの1つ以上を配列決定することを更に含む、請求項45又は46に記載の方法。
- タグ付き核酸断片のライブラリを生成する方法であって、
a.標的核酸を複数の標的断片に断片化し、かつ前記標的断片の前記5’末端に各第1のトランスポゾンの前記3’末端を結合して第1の固定化されたトランスポソーム複合体から生成された複数の第1の5’タグ付き標的断片及び第2の固定化されたトランスポソーム複合体から生成された複数の第2の5’タグ付き標的断片を産生するのに十分な条件下で、請求項3~26のいずれか一項に記載の第1の固定化されたトランスポソーム複合体及び請求項3~26のいずれか一項に記載の第2の固定化されたトランスポソーム複合体を前記標的核酸と接触させることであって、
前記第1の固定化されたトランスポソーム複合体が、固体支持体と、前記固体支持体に固定化された第1のトランスポソーム複合体と、を含み、前記第1のトランスポソーム複合体が、
i.トランスポザーゼと、
ii.3’トランスポゾン末端配列及びアンカー配列を含む第1のトランスポゾンと、
iii.5’トランスポゾン末端配列を含む第2のトランスポゾンと、
iv.(i)アンカー配列相補体、A14’配列、スペーサ、及びP5’配列、並びに(ii)ビオチンを含む結合要素であって、前記ビオチンが前記固体支持体に固定化されている、結合要素、を含む、第1の付着ポリヌクレオチドと、を含み、
前記第2の固定化されたトランスポソーム複合体が、固体支持体、及び前記固体支持体に固定化された第2のトランスポソーム複合体を含み、前記第2のトランスポソーム錯体が、
i.トランスポザーゼと、
ii.3’トランスポゾン末端配列及びアンカー配列を含む第1のトランスポゾンと、
iii.5’トランスポゾン末端配列を含む第2のトランスポゾンと、
iv.(i)アンカー配列相補体、B15’配列、スペーサ、及びP7’配列、並びに(ii)ビオチンを含む結合要素であって、前記ビオチンが前記固体支持体に固定化されている、結合要素、を含む、第2の付着ポリヌクレオチドと、を含む、接触させることと、
b.前記5’タグ付き標的配列を第1及び第2のインデックス付けオリゴヌクレオチドのプールと接触させることによって、各5’タグ付き標的断片を第1のインデックス付けオリゴヌクレオチド又は第2のインデックス付けオリゴヌクレオチドのいずれかにライゲーションするように、前記複数の5’タグ付き標的配列をリガーゼで処理することであって、各第1のインデックス付けオリゴヌクレオチドが、A14配列、i5配列、及びP5配列を含み、第1の5’タグ付き標的断片と会合することができ、各第2のインデックス付けオリゴヌクレオチドが、B15配列、i7配列、及びP7配列を含み、第2の5’タグ付き標的断片と会合して、インデックス付けオリゴヌクレオチドにライゲーションされた複数の5’タグ付き標的断片を産生することができる、処理することと、
c.任意選択的に、(a)前記固体支持体を加熱し、及び/又は(b)前記固体支持体を酵素変性剤で洗浄することによって、前記トランスポザーゼを前記複合体から除去するように前記固体支持体を処理することであって、前記酵素変性剤が任意選択的に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、グアニジン塩酸塩、尿素、又はプロテイナーゼを含む、処理することと、
d.完全二本鎖タグ付き断片を伸張かつ産生するようにポリメラーゼでインデックス付けオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記複数の5’タグ付き標的配列を処理することと、を含む、方法。 - 第1の固定化されたトランスポソーム複合体と第2の固定化されたトランスポソーム複合体とを前記接触させること、及び前記複数の5’タグ付き標的断片をリガーゼで前記処理することが、単一の反応において実行される、請求項48に記載の方法。
- 前記二本鎖タグ付き断片が、溶液中で産生される、請求項48又は請求項49に記載の方法。
- 捕捉ビーズを使用して前記完全二本鎖タグ付き断片を選択することを更に含み、任意選択的に、前記捕捉ビーズが磁気ビーズであり、更に任意選択的に、2つの別個の選択工程が実行される、請求項48~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全二本鎖タグ付き断片のうちの1つ以上を配列決定することを更に含む、請求項48~51のいずれか一項に記載の方法。
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