JP2021526367A - 核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用する増幅法によって、ステップa)の前駆体を増幅するステップと、
c)ステップb)において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第1及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断された増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと
を含む方法に関する。
i)増幅ステップb)と消化ステップc)の間に、
ii)消化ステップc)と変性ステップe)の間に、又は、
iii)変性ステップe)の後に
追加することによって達成される。
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び、
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のプライマーは、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーは、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている。
第2のエンドヌクレアーゼと、任意選択で、第1のエンドヌクレアーゼとを含む容器と、
第1の態様の方法の増幅ステップb)において使用するための酵素を、任意選択で、第1の及び/又はタグ付き第2のプライマーと組み合わせて含む容器と、
アフィニティー精製のための固相支持体を含む容器と、任意選択で、
変性のための化学物質を含む容器と
を含む、本発明の方法において使用するためのキットオブパーツに関係する。
本発明の方法、組成物、使用及びその他の態様に関する種々の用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用される。このような用語には、特に断りのない限り、本発明が関係する技術分野におけるその通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義される用語は、本明細書において提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。本明細書において記載されるものと同様又は等価の任意の方法及び材料が、本発明の試験のための実施において使用され得るが、好ましい材料及び方法は、本明細書に記載されている。
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖−又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用する増幅法によって、ステップa)の前駆体を増幅するステップと、
c)ステップb)において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第1及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断された増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと
を含む方法に関係する。
i)増幅ステップb)と消化ステップc)の間に、
ii)消化ステップc)と変性ステップe)の間に、又は、
iii)変性ステップe)の後に
追加することによって達成される。
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び、
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のプライマーは、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーは、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、ステップa)の前駆体を増幅するステップであって、少なくとも第2のプライマーは、親和性タグを含む、ステップと(好ましくは、親和性タグは、第1のプライマーに存在しない)、
c)ステップb)において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第1のエンドヌクレアーゼで、及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
d)増幅された二本鎖核酸前駆体を、タグ付き相補的第2鎖の親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
f)固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む。
i)ステップa)、ステップb)、ステップc)、ステップd)、ステップe)及びステップf)、又は
ii)ステップa)、ステップb)、ステップd)、ステップc)、ステップe)及びステップf)、又は
iii)ステップa)、ステップb)、ステップc)、ステップe)、ステップd)及びステップf)。
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖−又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のプライマーは、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーは、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、前駆体を増幅するステップであって、第2のプライマーは、親和性タグを含み、好ましくは、親和性タグは、第1のプライマーに存在しない、ステップと、
d)増幅された二本鎖核酸前駆体を、タグ付き相補的第2鎖の親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
c)増幅された二本鎖前駆体を、第1のエンドヌクレアーゼで、及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
f)固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップ。
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び、
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のプライマーは、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーは、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、前駆体を増幅するステップであって、第2のプライマーは、親和性タグを含み、好ましくは、親和性タグは、第1のプライマーに存在しない、ステップと、
c)増幅された二本鎖前駆体を、第1のエンドヌクレアーゼで、及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
d)変性された増幅された二本鎖核酸前駆体のタグ付き相補的第2鎖を、親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
f)固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップ。
i)ステップa)、ステップb)、ステップc)、ステップd)、ステップe)及びステップf)、又は
ii)ステップa)、ステップb)、ステップd)、ステップc)、ステップe)及びステップf)、又は
iii)ステップa)、ステップb)、ステップc)、ステップe)、ステップd)及びステップf)。
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のプライマーは、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーは、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、ステップa)の前駆体を増幅するステップであって、第2のプライマーは、固相支持体に連結されている、ステップと、
c)ステップb)において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第1のエンドヌクレアーゼで、及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、及び任意選択で、
f)固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップ。
目的の配列を有するオリゴヌクレオチド
第1の態様では、本発明は、目的の配列を有する1つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する方法に関係する。一本鎖オリゴヌクレオチドは、短い一本鎖DNA又はRNA分子として本明細書において定義される。好ましい実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖DNA分子である。方法は、任意選択で、異なる配列、例えば、本発明の方法のステップa)において出発材料として、さらに本明細書において「核酸前駆体」の下で定義されるような、これらの任意選択で異なる配列を含む複数の前駆体オリゴヌクレオチドの初期プールを使用する、目的の異なる配列を有する多数のオリゴヌクレオチドのプールされた生成(すなわち、単一容器における生成)に特に適している。
本発明の方法の第1のステップは、第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供することである。核酸前駆体は、好ましくは、DNA分子である。
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含む、又はからなる。
本発明の方法は、第1のプライマー及び第2のプライマーを使用することで増幅法によって、本明細書において定義されるような核酸前駆体を増幅するステップを含む。核酸前駆体の増幅は、好ましくは、核酸前駆体の存在量(abundancy)の少なくとも100倍、好ましくは、少なくとも500、1000又はさらには少なくとも5000倍の増大をもたらす。本発明の方法における増幅ステップは、(増幅された)二本鎖核酸前駆体の生成をもたらす。
適したバッファー、核酸前駆体、第1及び第2のプライマー、ヘリカーゼ及びデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)を組み合わせるステップ、
好ましくは、プライマーの融解温度の下、約5摂氏度からプライマーの融解温度の上、約3摂氏度の間である温度で反応混合物をインキュベートするステップ、
増幅された鋳型核酸を得るステップ。
0〜60mM Tris、例えば、25mM Tris
50〜150mM 酢酸カリウム、例えば、100mM 酢酸カリウム
0.3〜7.5w/vポリエチレングリコール、例えば、5.46%w/v PEG 35kDa。
少なくとも1種のリコンビナーゼ(例えば、100〜350ng/μL uvsXリコンビナーゼ、例えば、260ng/μL、好ましくは、バクテリオファージT6 UvsXリコンビナーゼ)、
少なくとも1種の一本鎖DNA結合タンパク質(150〜800ng/μL gp32、例えば、254ng/μL、好ましくは、バクテリオファージRb69 gp32)、
少なくとも1種のDNAポリメラーゼ(例えば、30〜150ng/μL バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)Pol I(Bsu)ポリメラーゼ又はS.オーレウス(aureus)Pol I大フラグメント(Sauポリメラーゼ)、例えば、90ng/μL)、
dNTP又はdNTP及びddNTP混合物(150〜400μM dNTP、例えば、240μM)、
クラウディング剤(例えば、任意選択で、2.5%〜7.5%重量/容量のトレハロース、例えば、5.7%w/vのトレハロースと組み合わせた、ポリエチレングリコール、好ましくは、1.5〜5%w/v PEG 35kDa、例えば、2.28%w/v PEG 35kDa)、
バッファー(例えば、0〜60mM Trisバッファー、例えば、25mM Tris)、
還元剤(例えば、1〜10mM DTT、例えば、5mM DTT)、
ATP又はATP類似体(例えば、1.5〜3.5mM ATP、例えば、2.5mM ATP)、
任意選択で、少なくとも1種のリコンビナーゼローディングタンパク質(例えば、50〜200ng/μL uvsY、好ましくは、バクテリオファージRb69 uvsY、例えば、88ng バクテリオファージRb69 uvsY)、
ホスホクレアチン(例えば、20〜75mM、例えば、50mMホスホクレアチン)、
クレアチンキナーゼ(例えば、10〜200ng/μL、例えば、100ng/μL)。
親和性タグは、少なくとも第2のプライマーに存在し得る。親和性タグは、第1のプライマー及び第2のプライマーの両方に存在し得るということは本明細書においてさらに理解される。或いは、親和性タグは、第1のプライマーに存在しない、例えば、第2のプライマーにのみ存在する。
本発明の方法は、増幅された二本鎖前駆体を、第1のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する第1の制限又はニッキングエンドヌクレアーゼで、及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼで消化するステップを含む。第1及び第2のエンドヌクレアーゼでの消化は、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格の切断を有する増幅された二本鎖核酸前駆体の生成をもたらす。
本発明の方法の好ましい実施形態では、増幅された二本鎖核酸前駆体の第2鎖は、捕捉物質と接触される親和性タグを含み、前記捕捉物質は、好ましくは、固相支持体に含まれる。適した捕捉物質は、親和性タグに応じて変わる。例えば、核酸が、ビオチンタグを含む場合には、捕捉物質は、例えば、ストレプトアビジン又はアビジンであり得る。さらなるあり得るタグは、His−タグ、DNP(2,4−ジニトロフェニル−)又はジゴキシゲニン(DIG)であり得、捕捉物質は、それぞれ、抗His抗体、抗DNP抗体又は抗DIG抗体であり得る。同様に、親和性タグが、ポリヌクレオチドテールを含む場合には、捕捉物質は、その相補性配列であり得る。
本発明の好ましい実施形態では、増幅された、好ましくは、消化された二本鎖核酸前駆体は、変性される、例えば、第1鎖は第2の相補鎖から分離される。当業者は、二本鎖DNAを変性する種々の方法に精通している。このような方法として、それだけには限らないが、熱及び/又は化学物質に対する二本鎖DNAの曝露を挙げることができる。好ましくは、本発明の方法における変性は、化学的変性を含む。DNAを変性するための好ましい化学物質として、例えば、ホルムアミド、グアニジン、サリチル酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、プロピレングリコール、尿素又はアルカリ剤がある。好ましくは、化学的変性は、強塩基の添加によってpHを高めることによるものである。好ましくは、強塩基は、アルカリ水酸化物である。特に、pHを高めるための適した強塩基(又はその組合せ)は、好ましくは、NaOH、LiOH、KOH、RbOH、CsOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2、Sr(OH)2及びBa(OH)2からなる群から選択され得る。最も好ましくは、本発明の方法において二本鎖核酸前駆体を変性するための強塩基は、アルカリ水酸化物NaOHである。
目的の配列の逆相補体を含む第2鎖又はその一部が、目的の配列を含む第1鎖又はその一部から分離される本発明の好ましい方法は、固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップを含む。
固相支持体を除去した後に得られる一本鎖オリゴヌクレオチドを、任意選択で、さらに精製してもよい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、方法は、一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップg)をさらに含む。
本発明の方法において得られる一本鎖オリゴヌクレオチドは、その後、標識化され得る。例えば、生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは、フルオロフォア、ハプテン、親和性リガンド、又は放射活性部分を用いて標識化され得る。或いは、生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは標識化されない。
第2の態様において、本発明は、第1鎖を含む核酸前駆体に関係し、第1鎖は、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含む。
上記で本明細書において定義されるような、第2の(ニッキング)エンドヌクレアーゼと、任意選択で、第1のエンドヌクレアーゼを含む容器(1)、
上記で本明細書において定義されるような増幅ステップにおいて使用するための酵素を含む容器(2)、
上記で本明細書において定義されるようなアフィニティー精製のための固相支持体を含む容器(3)、及び
上記で本明細書において定義されるような変性のための化学物質を含む容器(4)。
プローブ前駆体
3912プローブ前駆体(平均長90nt)(978の固有の配列;配列番号1〜978を含む)を、LC Sciences製のプログラム可能なマイクロアレイで合成した。凍結乾燥(lypholised)サンプルに、25μLのヌクレアーゼ不含水を添加し、濃度0.064pmol/μLを作製した。
PCR:
PCR増幅を、0.05pmolのマルチプレックスプローブ前駆体(総量)、200μMのdNTP’、4μMのF−プライマー(配列番号979)、4μMのR−ビオチンプライマー(配列番号980)(非ビオチン化プライマーの配列は、配列番号981で示されている)、1×クローニングされたPfu反応バッファー_AD(Agilent)中の10ユニットのクローニングされたPfu DNAポリメラーゼ_ADを含有する200μLの総容量で実施した。以下のPCRプログラムを使用した:95℃で5分と、それに続く、95℃で30秒、55℃で2分、72℃で8分の20サイクルと、それに続く、72℃で10分。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)を、TwistDX製のTwistAmp Basicキット(注文番号TABAS01KIT)を使用して実施した。0.05pmolのマルチプレックスプローブ前駆体(総量)、700nMのF−プライマー(配列番号979)、700nMのR−ビオチンプライマー(配列番号980)及び29.5μLの再水和バッファーを含有する反応ミックスを調製した。反応混合物にMQを添加し、47.5μLの最終容量とした。2μLの280mM MgAcを添加して、反応を開始した後、混合物を38℃で40分間インキュベートした。
それぞれPCR及びRPAによって生成されたアンプリコンの品質及びサイズをAgilent D1000スクリーンテープを備えたTapestationで調べた(図7)。PCRは、低い特定のアンプリコン収量(RPAと比較して)をもたらし、これは、ヘテロ二本鎖形成による可能性が高い。
プローブ前駆体
3912プローブ前駆体(平均長90nt)(978の固有の配列;配列番号1〜978を含む)を、LC Sciences製のプログラム可能マイクロアレイで合成した。凍結乾燥サンプルに、25μLのヌクレアーゼ不含水を添加し、濃度0.064pmol/μLを作製した。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)を、TwistDX製のTwistAmp Basicキット(注文番号TABAS01KIT)を使用して実施した。0.01pmolのマルチプレックスプローブ前駆体(総量)、700nMのF−プライマー(配列番号979)、700nMのR−ビオチンプライマー(配列番号980)及び29.5μLの再水和バッファーを含有する単一RPA反応ミックスを調製した。反応混合物にMQを添加し、47.5μLの最終容量とした。この反応ミックスを、凍結乾燥Basic反応物に添加した。2μLの280mM MgAcを添加して、反応を開始した後、混合物を38℃で40分間インキュベートした。
(85〜93nt.)プローブ前駆体の隣接する配列は、標的化アームとの接合部でニッキング制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有していた。
QIAquick精製したニッキングされたRPA生成物の固定化のために、Dynabeads MyOne Streptavidin C1(カタログ番号65002)を、製造業者のプロトコールに従って使用した。160μLのQIAquick精製した生成物を、53.3μLの3つのアリコートにわけた。これらのアリコートの各々に、200μLの量のビーズを添加した。製造業者のプロトコールに従って、インキュベーションを実施し、洗浄を実施した。最終ステップにおいて、ビーズを、アリコートあたり20μLのEBバッファーに再懸濁した。
上記で得られた3つのアリコートの各々を、化学的変性に供した。化学的変性を実施するために、NaOHを0.9Mの最終濃度まで添加した。混合物を、室温で10分間インキュベートし、次いで、磁石の上に置いた。上清を取り、添加されたNaOHと当モル量でHClを添加することによって中和した。
本プローブ増幅法は、極めて少量の投入材料(0.01pmol)を用いて達成された高い正味のプローブ収量(550のプローブ収量の正味の増大倍数)をもたらした。この方法は、ヘテロ二本鎖分子を作出することなく高マルチプレックスレベルでのオリゴヌクレオチドの増幅を可能にする。精製のためのビオチンビーズの使用は、極めて迅速で、容易な方法を与えた。さらに、増幅されたオリゴヌクレオチドの放出のための化学的変性及び中和は、極めて効率的であるが、変性及び放出のために熱を使用すると、検出可能な量の生成物を得られない。
比較実験のセットでは、実施例2において詳細に記載された方法を、その時点で1つのパラメータを変更しながら実施した。実験は以下のとおりに設計した:
1.実施例2において詳述されたとおりであるが、実施例2において行われたような5μL(各50ユニット)の代わりに、2.5μLの各ニッキング酵素(各12.5ユニット)を用いる方法(図10「2つのニッキング酵素」)。
2.ニッキング酵素Nt.AlwIが、同容量及び1のもとに示されているようなユニットのAlwI(New England Biolabs)と置き換えられている、実施例2において詳述されたとおりの方法(図10:「1つの制限酵素及び1つのニッキング酵素」)。
実施例2において詳述されたような方法を使用することで生成された3912オリゴヌクレオチドプローブは、OLAアッセイにおいて、トウモロコシゲノム(トウモロコシ(Zea mays))において各々2つの対立遺伝子を有する326の異なるSNPを検出するように設計された(すなわち、326−プレックス)。実施例2において生成されたようなプローブを、F2トウモロコシマッピング集団から調製された5つの異なるトウモロコシゲノムDNAサンプルを遺伝子型同定するためのOLAアッセイにおいてそれらを試験することによって検証した。より特には、2連の5つの異なるトウモロコシゲノムDNAサンプルの各々の間で遺伝子型判定を比較することによって、これらのプローブを使用するOLAアッセイの再現性を試験した。さらに、これらの5つの異なるサンプル内の遺伝子型判定を、プローブが、326の遺伝子座のSNP対立遺伝子を検出するための326−プレックスプローブを含む既存の1056−プレックスOLAアッセイの個別に合成されたプローブ(IDT、Integrated DNA Technologies)によって置き換えられている、同一OLAアッセイ及び同一の5つの異なるトウモロコシゲノムDNAサンプルを使用する遺伝子型判定に対して比較することによって、これらのプローブを使用するOLAアッセイを検証した。
ライゲーション反応物を、以下のとおりに調製した:5μL中の100〜200ngのゲノムDNAを、1μlの10×Taq DNAリガーゼバッファー(200mM Tris−HCI pH7.6、250mM KAc、100mM MgAc、10mM NAD、100mMジチオトレイトール、1% Triton−X100)、4ユニットのTaq DNAリガーゼ(New England BioLabs)、1μlの実施例2において生成されたような326−プレックスプローブミックス(遺伝子座あたり3.4nM;合計1.12μM)又は1μLのLC Sciencesから注文され、その後リン酸化された1056−プレックスプローブミックス(遺伝子座あたり0.4nM;合計0.4μM)及びMilliQ水と組み合わせて、合計10μlにした。ライゲーション反応を、ゲノムDNAサンプルあたり4連で設定した。反応混合物を、94℃で1分間及び30秒間インキュベートし、60℃まで30秒あたり1.0℃の温度低下を続け、60℃でおよそ18時間インキュベーションを続けた。反応物は、さらなる使用まで4℃で維持した。ライゲーション反応物を、MilliQ水で4×希釈した。
合計5サンプル(5×326=1630遺伝子型の理論的合計数を含む)について、合計1452遺伝子型が判定され、99.8%の2連の間の再現性があった、すなわち、実施例2において生成されたプローブを用いる326−プレックスアッセイを使用して判定された遺伝子型のうち99.8%が、2連の間で同一である。個別に合成されたプローブを使用した場合には、合計1452遺伝子型が判定され、これは、実施例2において生成されたプローブを使用して判定された遺伝子型に対して97.5%同一であった。
Claims (23)
- 目的の配列を有する1つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
a)第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第1鎖が、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合部位
を5’から3’方向に含み、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
b)第1のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第1のプライマー及び第2のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第2のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、ステップa)の前駆体を増幅するステップであって、第2のプライマーが、第1のプライマーには存在しない親和性タグを含む、ステップと、
c)ステップb)において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第1及び第2のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
d)増幅された二本鎖核酸前駆体を、タグ付き相補的第2鎖の親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
e)増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
f)固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む方法。 - ステップc)及びステップd)が逆転される、又はステップd)及びステップe)が逆転される、請求項1に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップg)をさらに含む、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- ステップe)における変性が、化学的変性を含み、好ましくは、化学的変性が、強塩基の添加によって、好ましくは、約0.5〜1.5Mの濃度のアルカリ水酸化物の添加によってpHを高めることによるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸前駆体が、約20〜200ヌクレオチドからなり、好ましくは、核酸前駆体が、配列番号1〜配列番号978からなる群から選択される配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 目的の配列が、所定のゲノム配列に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 生成されたオリゴヌクレオチドが、マルチプレックスOLAアッセイにおいて使用するのに適しており、好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも300−プレックスOLAアッセイにおいて使用するのに適している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 生成されたオリゴヌクレオチドが、マルチプレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅アッセイにおいて使用するのに適しており、好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも300−プレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅アッセイにおいて使用するのに適している、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 生成されたオリゴヌクレオチドが、マルチプレックス捕捉ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するのに適しており、好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも300−プレックス捕捉ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するのに適している、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸前駆体が、一本鎖核酸前駆体である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)における増幅法が、等温増幅法であり、好ましくは、等温増幅法が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)又はヘリカーゼ依存性増幅(HDA)である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1及び第2のエンドヌクレアーゼが、2つの異なる酵素である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップc)における第1のエンドヌクレアーゼが、
i)第1のDNA鎖、又は
ii)第1及び第2のDNA鎖
を切断する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - ステップb)から得られた増幅された二本鎖前駆体が、ステップd)において固相支持体に結合する前に精製される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- タグがビオチンであり、固相支持体が、ストレプトアビジンを含み、好ましくは、固相支持体がビーズであり、より好ましくは、ビーズが磁性ビーズである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)において、別個の、目的の配列を有する2つ又はそれより多い核酸前駆体が提供され、好ましくは、核酸前駆体の配列が、配列番号1〜配列番号978からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 第1のプライマーが、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーが、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングできる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 目的の配列が、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 第1鎖と、任意選択で、第1鎖と相補的である第2鎖を含む一本鎖又は二本鎖核酸前駆体であって、第1鎖が、以下の要素:
(1)第1のプライマー結合部位、
(2)第1のエンドヌクレアーゼ認識部位、
(3)目的の配列、
(4)第2のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
(5)第2のプライマー結合配列
を5’から3’方向に含み、
好ましくは、第1のプライマーが、第1のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第2のプライマーが、第2のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
好ましくは、目的の配列が、第1及び第2のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第1のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第1のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第2のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第2のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第1鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、一本鎖又は二本鎖核酸前駆体。 - 前駆体が、第2鎖の5’末端に位置する親和性タグをさらに含み、好ましくは、親和性タグが、第2鎖の5’末端にのみある、請求項19に記載の二本鎖核酸前駆体。
- 親和性捕捉によって固相支持体に結合された請求項20に記載の二本鎖核酸前駆体を含む固相支持体。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットオブパーツであって、
第2のエンドヌクレアーゼと、任意選択で、第1のエンドヌクレアーゼを含む容器、
増幅ステップb)において使用するための酵素を、任意選択で、第1の及び/又はタグ付き第2のプライマーと組み合わせて含む容器、
アフィニティー精製のための固相支持体を含む容器、及び任意選択で
変性のための化学物質を含む容器
を含む、キットオブパーツ。 - 1つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの生成のための、請求項19若しくは請求項20に記載の核酸前駆体又は請求項22に記載のキットオブパーツの使用。
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