JP2018535689A - ガイド核酸を作製および使用するための方法および組成物 - Google Patents

ガイド核酸を作製および使用するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

任意の供給源核酸から、ガイド核酸（ｇＮＡ）、ｇＮＡをコードする核酸、ｇＮＡの収集物、およびｇＮＡの収集物をコードする核酸を作製するための方法および組成物が、本明細書に提供される。種々の適用において、その結果生じたｇＮＡ、ｇＮＡをコードする核酸、ｇＮＡの収集物、およびｇＮＡの収集物をコードする核酸を使用するための方法および組成物も、本明細書に提供される。このようなｇＮＡおよびその収集物は、目的の標的配列の枯渇、分配、捕捉または濃縮、ゲノムワイド標識、ゲノムワイド編集、ゲノムワイド機能的スクリーニング、およびゲノムワイド調節を含む、種々の適用に有用である。

Description

相互参照
本出願は、２０１５年１２月７日に出願された米国仮出願番号第６２／２６４，２６２号、および２０１６年２月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／２９８，９６３号の利益を主張しており、これら仮出願の各々は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
配列表の参照による援用
本願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。この配列表は、２０１６年１２月５日に作成された、サイズが８１６，４５１バイトの、７５０５９２０００３４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供されている。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
ＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリー等、ヒト臨床ＤＮＡ試料および試料ライブラリーは、情報価値が殆どなく配列決定コストを増加させる、非常に豊富な配列を含有する。このような所望されない配列を枯渇させる方法（例えば、ハイブリダイゼーション捕捉による）が開発されたが、このような方法は時間がかかることが多く、非効率的であり得る。
ガイド核酸（ｇＮＡ）媒介性ヌクレアーゼ系（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）媒介性Ｃａｓ系等）は、任意の標的ＤＮＡを効率的に枯渇させることができるが、非常に多い数の特異なＤＮＡ分子の標的化された枯渇は実現不可能である。例えば、ヒト血液に由来する配列決定ライブラリーは、＞９９％ヒトゲノムＤＮＡを含有し得る。ヒト血液中を循環する感染病原体を検出するために、このゲノムＤＮＡを枯渇させようと、ｇＲＮＡ媒介性Ｃａｓ９系に基づく方法を使用するということは、３０〜５０塩基対（ｂｐ）毎にｇＲＮＡが存在し、標的ＤＮＡが見逃されないことを確実にするために、極めて多い数のｇＲＮＡ（約１千万〜１億個のｇＲＮＡ）を必要とするであろう。非常に多数のｇＲＮＡが計算によって予測され、次いで化学合成され得るが、これは法外に高いコストがかかる。
したがって、当技術分野には、例えば、その配列に関する予備知識なしで、目的のＤＮＡからの所望されないＤＮＡ配列のゲノムワイド枯渇を可能にする、任意のＤＮＡをｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ライブラリーへと変換する、対費用効果の高い方法を提供する必要がある。この必要に取り組む方法および組成物が、本明細書に提供される。
任意の供給源核酸からｇＮＡおよびｇＮＡの収集物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を生成するための組成物および方法が、本明細書に提供される。例えば、ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡの収集物は、ゲノムＤＮＡ等、供給源ＤＮＡから生成することができる。斯かるｇＮＡおよびその収集物は、目的の標的配列の枯渇、分配、捕捉または濃縮、ゲノムワイド標識、ゲノムワイド編集、ゲノムワイド機能的スクリーニング、およびゲノムワイド調節を含む、種々の適用に有用である。
一つの態様では、本明細書に記載されている本発明は、核酸の収集物であって、収集物中の複数の核酸が、調節領域を含む第１のセグメントと、標的化配列をコードする第２のセグメントと、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントとを含み、収集物中の核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する、核酸の収集物を提供する。別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、核酸の収集物であって、収集物中の複数の核酸が、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントであって、そのサイズが２１ｂｐを超える第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントとを含む、核酸の収集物を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、第２のセグメントのサイズが、核酸の収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ変動する。一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％が、２１ｂｐを超える。一部の実施形態では、第２のセグメントのサイズが、２０ｂｐではない。一部の実施形態では、第２のセグメントのサイズが、２１ｂｐではない。一部の実施形態では、核酸の収集物が、ＤＮＡの収集物である。一部の実施形態では、第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、調節領域が、転写因子に結合することができる領域である。一部の実施形態では、調節領域が、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、第２のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される。一部の実施形態では、収集物が、少なくとも１０２個の特異な核酸分子を含む。一部の実施形態では、標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、収集物が、生物のゲノムにわたって約１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である。一部の実施形態では、第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第３のセグメントの配列が、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、第３のセグメントの配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、収集物の複数の第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードし、収集物の複数の第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする。一部の実施形態では、収集物の第３のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列の複数の異なる結合配列をコードする。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、標的化配列を含む第１のＲＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のＲＮＡセグメントとを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の収集物であって、収集物中のｇＲＮＡの少なくとも１０％のサイズが変動する、収集物を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズが、ｇＲＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ変動する。一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％が、２１ｂｐを超える。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズが、２０ｂｐではない。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズが、２１ｂｐではない。一部の実施形態では、標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、第１のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される配列によってコードされるＲＮＡである。一部の実施形態では、収集物は、少なくとも１０２個の特異なｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、シトシン、グアニンおよびアデニンを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのサブセットは、チミンをさらに含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのサブセットは、ウラシルをさらに含む。一部の実施形態では、第１のセグメントは、目的の標的ゲノム配列に対し少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である。一部の実施形態では、第２のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列を含む。一部の実施形態では、第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第３のセグメントの配列が、配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、または配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含む。一部の実施形態では、第２のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列を含む。一部の実施形態では、収集物中のｇＲＮＡの少なくとも１０％は、その５’末端側の端の配列が変動する。一部の実施形態では、収集物は、生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む。一部の実施形態では、収集物の複数の第２のセグメントは、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、収集物の複数の第２のセグメントは、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む。一部の実施形態では、収集物の第２のセグメントは、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列を含む。一部の実施形態では、収集物の複数のｇＲＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、収集物の複数のｇＲＮＡは、標識を含む。一部の特定の実施形態では、収集物の複数のｇＲＮＡは、異なる標識を含む。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントであって、標的化配列が３０ｂｐを超える、第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする核酸をコードする第３のセグメントとを含む核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、核酸がＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、調節領域が、転写因子に結合することができる領域である。一部の実施形態では、調節領域が、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、豊富なまたは反復性ＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、第２のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される。一部の実施形態では、標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、目的の標的ゲノム配列が、ＰＡＭ配列の５’上流にある。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である。一部の実施形態では、第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第３のセグメントの配列が、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、標的化配列を含む第１のセグメントであって、そのサイズが３０ｂｐを超える第１のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のセグメントとを含むガイドＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、アデニン、グアニンおよびシトシンを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、チミンをさらに含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ウラシルをさらに含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡセグメントのサイズは、３０〜２５０ｂｐの間である。一部の実施形態では、標的化配列は、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列は、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている。一部の実施形態では、第１のセグメントは、目的の標的ゲノム配列に対し少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、第２のセグメントは、ｇＲＮＡステムループ配列を含む。一部の実施形態では、第２のセグメントの配列が、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、または配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含む。一部の実施形態では、第３のセグメントの配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列である。
別の態様では、本発明は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と、標的化配列を含む第１のセグメントであって、そのサイズが３０ｂｐを超える第１のセグメント；および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のセグメントを含むガイドＲＮＡとを含む複合体を提供する。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、試料における標的化された配列の枯渇および分配、非宿主核酸についての試料の濃縮、または試料における標的化された核酸の連続的な枯渇のための方法であって、試料から抽出された核酸を提供するステップと；（ｉ）本明細書に提供されているｇＲＮＡの収集物のうち任意の１種；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
別の態様では、本発明は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＰＡＭ配列に対し５’にある目的の配列および反対の鎖におけるその逆相補的配列をそれぞれ含む二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、（ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子において酵素消化反応を実行するステップであって、切断が、ＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列に生成されるが、二本鎖ＤＮＡからＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列を完全に除去しないステップと、（ｃ）認識配列を含むアダプタをステップｂの結果生じたＤＮＡ分子にライゲートするステップと、（ｄ）ステップｃの認識配列を認識する制限酵素とステップｃのＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、ＰＡＭ配列に対してすぐ接して５’にある平滑末端化された二本鎖切断を含むＤＮＡ断片を生成し、それによって、ＰＡＭ配列および酵素認識部位を含有するアダプタを除去するステップと、（ｅ）ステップｄの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。一部の実施形態では、収集物の出発ＤＮＡ分子が、ＰＡＭ配列に対し５’にある目的の配列の上流の調節配列をさらに含む。一部の実施形態では、調節配列が、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターが、Ｔ７、Ｓｐ６またはＴ３配列を含む。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡ、インタクトなＤＮＡまたは剪断されたＤＮＡである。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡが、ヒト、マウス、鳥類、魚類、植物、昆虫、細菌またはウイルスのものである。一部の実施形態では、標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、少なくとも２２ｂｐである。一部の実施形態では、標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、１５〜２５０ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、（１）ＣＣＤ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素とＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、ＤＮＡ分子が、ＣＣＤ部位においてニックを入れられるステップと、（２）エンドヌクレアーゼとニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、ＨＧＧおよび／またはＣＣＤ配列由来の残っているヌクレオチドが取り残されるステップとをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の認識配列を認識する制限酵素により切断する前のステップ（ｃ）由来の、アダプタがライゲートされたＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅をさらに含み、ＰＣＲ後に、認識配列が、ＰＡＭ配列の３’に位置し、調節配列が、ＰＡＭ配列の５’遠位端に位置する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の酵素反応が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素およびＴ７エンドヌクレアーゼＩ酵素の使用を含む。一部の実施形態では、ライゲートされるべき前記アダプタが、オーバーハングを含まない場合、ステップ（ｃ）が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端反応をさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の前記アダプタが、（１）前記アダプタがＹ字型であり、オーバーハングを含む場合、一方の鎖に制限酵素認識配列を、他方の鎖に調節配列を含む二本鎖である；または（２）前記アダプタがＹ字型でない場合、両方の鎖にパリンドローム酵素認識配列を有する、のいずれかである。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の制限酵素が、ＭｌｙＩである。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の制限酵素が、ＢａｅＩである。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）が、ＸｈｏＩ酵素とＤＮＡ分子とを接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡが、配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、目的の標的化された配列が、生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある。
別の態様では、本発明は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）目的の配列、ＮＧＧ部位およびその相補体ＣＣＮ部位をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、（ｂ）ＣＣＮ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＮＧＧ部位に対して５’に目的の配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位にニックを入れられるステップと、（ｃ）エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、前記断片が、末端オーバーハングを含むステップと、（ｄ）５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性がない酵素と前記二本鎖ＤＮＡ断片とを接触させるステップであって、前記二本鎖ＤＮＡ断片を平滑末端化し、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の平滑末端化二本鎖断片を生成するステップと、（ｅ）末端ＮＧＧ部位を切断する酵素とステップｄの前記平滑末端化二本鎖断片とを接触させるステップと、（ｆ）ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、ＮＧＧ部位の５’上流に調節配列を有する。一部の実施形態では、調節配列が、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３配列を含む。一部の実施形態では、ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡの剪断された断片を含む。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡが、哺乳動物、原核生物、真核生物、鳥類、細菌またはウイルスのものである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、少なくとも５００ｂｐである。一部の実施形態では、ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素である。一部の実施形態では、ステップｃにおける酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである。一部の実施形態では、ステップｄにおける酵素が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡが、配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ステップｅが、ＭｌｙＩ認識部位を保有するアダプタをライゲートするステップと、ＭｌｙＩ酵素により消化するステップとを追加で含む。一部の実施形態では、目的の配列が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある。
別の態様では、本発明は、標的化配列をコードするＤＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＮＧＧおよびＣＣＮ部位を含む複数の目的の配列を含むゲノムＤＮＡを提供するステップと、（ｂ）前記ゲノムＤＮＡにニックを作製することができる酵素と前記ゲノムＤＮＡとを接触させるステップであって、それによって、ＣＣＮ部位にニックを入れられたニックゲノムＤＮＡを生成するステップと、（ｃ）エンドヌクレアーゼと前記ニックゲノムＤＮＡとを接触させるステップであって、それによって、オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、（ｄ）ステップｃ由来のオーバーハングを有する前記ＤＮＡをＹ字型アダプタにライゲートステップであって、これによって、前記ＮＧＧ部位の３’のみに制限酵素認識配列を、前記目的の配列の５’に調節配列を導入するステップと、（ｅ）前記酵素認識配列を保有する前記アダプタと共に前記ＮＧＧ部位を切断除去する酵素とステップｄ由来の産物とを接触させるステップと、（ｆ）ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた目的の配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む。一部の実施形態では、調節配列が、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列が、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡの剪断された断片である。
一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡが、哺乳動物、原核生物、真核生物またはウイルスのものである。一部の実施形態では、断片が、少なくとも２００ｂｐである。一部の実施形態では、ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素である。一部の実施形態では、ステップｃにおける前記酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである。一部の実施形態では、ステップｄが、前記アダプタがライゲートされたＤＮＡのＰＣＲ増幅をさらに含む。一部の実施形態では、ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ステップｅにおいてＮＧＧ部位を除去する前記酵素が、ＭｌｙＩである。一部の実施形態では、収集物の前記目的の標的が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある。
別の態様では、本発明は、本明細書における実施形態に記載されている、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法の実施に有用なキットおよび／または試薬を提供する。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、核酸の収集物を含むキットであって、収集物中の複数の核酸が、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントとを含み、収集物中の核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する、キットを提供する。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、核酸の収集物を含むキットであって、収集物中の複数の核酸が、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントであって、そのサイズが２１ｂｐを超える第２のセグメントと；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントとを含む、キットを提供する。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、標的化配列を含む第１のＲＮＡセグメントと；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列を含む第２のＲＮＡセグメントとを含むガイドＲＮＡの収集物を含むキットであって、収集物中のｇＲＮＡの少なくとも１０％のサイズが変動する、キットを提供する。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、ａ．供給源試料における豊富な細胞を得るステップと、ｂ．前記豊富な細胞から核酸を収集するステップと、ｃ．前記核酸からガイド核酸（ｇＮＡ）の収集物を調製するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記豊富な細胞が、前記供給源試料における１または複数の最も豊富な細菌種由来の細胞を含む。一部の実施形態では、前記豊富な細胞が、２以上の種由来の細胞を含む。一部の実施形態では、前記豊富な細胞が、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、前記豊富な細胞が、動物細胞を含む。一部の実施形態では、前記豊富な細胞が、植物細胞を含む。一部の実施形態では、前記豊富な細胞が、細菌細胞を含む。一部の実施形態では、前記方法は、ｇＮＡの前記ライブラリーと核酸ガイド化ヌクレアーゼとを接触させるステップであって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を形成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法は、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を使用するステップをさらに含み、標的部位において標的核酸を切断し、前記ｇＮＡが、前記標的部位に対して相補的である。一部の実施形態では、前記標的核酸が、前記供給源試料に由来する。一部の実施形態では、前記標的核酸の種が、前記供給源試料の種と同じである。一部の実施形態では、前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、ヒトである。一部の実施形態では、前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、動物である。一部の実施形態では、前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、植物である。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、標的化配列をそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、ａ．供給源ＤＮＡを得るステップと、ｂ．ニッキング酵素認識部位においてニッキング酵素により前記供給源ＤＮＡにニックを入れるステップであって、これによって、近位ニックに二本鎖切断を生成するステップと、ｃ．前記二本鎖切断のオーバーハングを修復するステップであって、これによって、（ｉ）標的化配列および（ｉｉ）前記ニッキング酵素認識部位を含む二本鎖断片を生成するステップとを含む方法を提供する。別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、標的化配列をそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、ａ．供給源ＤＮＡを得るステップと、ｂ．ニッキング酵素認識部位においてニッキング酵素により前記供給源ＤＮＡにニックを入れるステップであって、これによって、ニックを生成するステップと、ｃ．前記ニックから新しい鎖を合成するステップであって、これにより、標的化配列を含む前記供給源ＤＮＡの一本鎖断片を生成するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、前記一本鎖断片から前記標的化配列を含む二本鎖断片を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記二本鎖断片を生成するステップが、ランダムプライミングおよび伸長を含む。一部の実施形態では、前記ランダムプライミングが、ランダムｎ−ｍｅｒ領域およびプロモーター領域を含むプライマーにより行われる。一部の実施形態では、前記ランダムｎ−ｍｅｒ領域が、ランダムヘキサマー領域である。一部の実施形態では、前記ランダムｎ−ｍｅｒ領域が、ランダムオクタマー領域である。一部の実施形態では、前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーター領域である。一部の実施形態では、この方法は、ヌクレアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ認識部位核酸を前記二本鎖断片にライゲートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記ニッキング酵素認識部位の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＭｌｙＩ認識部位である。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＢａｅＩ認識部位である。一部の実施形態では、この方法は、前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含み、これによって、前記二本鎖断片から前記ニッキング酵素認識部位を除去する。一部の実施形態では、この方法は、前記二本鎖断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位核酸にライゲートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位が、ガイドＲＮＡステムループ配列を含む。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記標的化配列の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する。一部の実施形態では、前記標的化配列の前記長さが、２０塩基対である。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＭｍｅＩ認識部位である。一部の実施形態では、この方法は、前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記標的化配列の長さプラス前記ニッキング酵素認識部位の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する。一部の実施形態では、前記標的化配列の前記長さプラス前記ニッキング酵素認識部位の長さが、２３塩基対である。一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位である。一部の実施形態では、この方法は、前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、前記二本鎖断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位核酸にライゲートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位が、ガイドＲＮＡステムループ配列を含む。
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、本明細書に記載されている態様の方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書を含むキットを提供する。
図１は、ゲノムＤＮＡからｇＲＮＡの収集物（ｇＲＮＡライブラリー）を生成するための例示的なスキームを図解する。
図２は、ゲノムＤＮＡからｇＲＮＡの収集物（ｇＲＮＡライブラリー）を生成するための別の例示的なスキームを図解する。
図３は、ＤＮＡをニッキングし、その後にポリメラーゼ処理して平滑末端を生成するための例示的なスキームを図解する。
図４は、３種のアダプタを使用した、ｇＮＡのライブラリーの逐次生成のための例示的なスキームを図解する。
図５は、１種のアダプタおよび１種のオリゴ（oligo）を使用した、ｇＮＡのライブラリーの逐次生成のための例示的なスキームを図解する。
図６は、ニッキング酵素媒介性ＤＮＡ増幅（ＮＥＭＤＡ）を使用した、平滑末端を有するＤＮＡ断片の大規模プールの生成のための例示的なスキームを図解する。
図７は、ニッキング酵素媒介性ＤＮＡ増幅（ＮＥＭＤＡ）を使用した、ｇＮＡの大規模プールの生成のための例示的なスキームを図解する。
発明の詳細な説明
当技術分野には、種々の下流適用のための多数の多様なガイド核酸（ｇＮＡ）（例えば、ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡ）を生成するための、拡大縮小が可能な（scalable）低コストアプローチの必要がある。
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。
本明細書を解釈する目的で、次の定義が適用されるが、適切であれば、単数形で使用されている用語は、複数形も含み、その逆もまた真であり得る。下に示す任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合、示されている定義が優先されるものとする。
本明細書で使用するように、単数形である「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、他に断りがなければ、複数形の参照を含む。
本明細書に記載されている本発明の態様および実施形態が、「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
本明細書で使用する用語「約」は、当技術分野の当業者には直ちに分かる、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における、「約」によるある値またはパラメータの参照は、当該値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。
本明細書で使用する用語「核酸」は、１個または複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、ならびにこれらの改変バージョンから選択される１個または複数のサブユニットを含むことができる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、これらの組合せまたは誘導体を含む。核酸は、一本鎖および／または二本鎖であってよい。
核酸は、「ヌクレオチド」を含み、これは、本明細書で使用するように、プリンおよびピリミジン塩基、ならびにこれらの改変バージョンを含有する部分を含むことが意図される。そのような改変には、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」にはハプテンまたは蛍光標識を含有する部分が含まれ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有することができる。改変ヌクレオシド、改変ヌクレオチドまたは改変ポリヌクレオチドには、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられるか、エーテル、アミンなどとして官能基化される、糖部分の改変も含まれる。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、任意の長さ、例えば、約２塩基より大きい、約１０塩基より大きい、約１００塩基より大きい、約５００塩基より大きい、１０００塩基より大きい、最高約１０，０００またはそれより多くの塩基の核酸ポリマーを記載するために使用され、酵素的または合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中の引用文献に記載されるＰＮＡ）、それは２つの天然に存在する核酸のそれに類似した配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミン（それぞれＧ、Ｃ、ＡおよびＴ）が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡはデオキシリボースおよびリボース糖骨格をそれぞれ有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されている反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。しばしばアクセス不可能なＲＮＡと呼ばれるロックト核酸（ＬＮＡ）は、改変ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分の橋で改変される。橋は３’−エンド（北（Ｎｏｒｔｈ））コンフォメーションでリボースを「ロック」し、それはＡ形二重鎖でしばしば見出される。所望のときはいつでも、ＬＮＡヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合していてもよい。用語「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸は、Ｇ’残基およびＣ’残基を含有することができ、ここで、これらの残基は、低い安定性で互いと塩基対を形成するが、天然に存在するＣおよびＧの残基とそれぞれ塩基対を形成する能力を保持する、ＧおよびＣの天然に存在しない形、すなわち類似体に対応する。非構造化核酸は米国特許出願公開第２００５０２３３３４０号に記載され、それはＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。
特に明記しない限り、核酸は左から右に５’から３’の向きで記述される。アミノ酸配列は、左から右にそれぞれアミノからカルボキシの向きで記述される。
本明細書で使用するように、用語「切断する」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖における２つの隣接したヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断し、それによってＤＮＡ分子において二本鎖切断をもたらす反応を指す。
本明細書で使用する用語「ニッキング」は、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖のみにおける２個の隣接するヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断し、これにより、ＤＮＡ分子の一方の鎖における切断をもたらす反応を指す。
本明細書で使用するように、用語「切断部位」は、二本鎖ＤＮＡ分子が切断された部位を指す。
「核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体」は、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質とガイド核酸（ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）とを含む複合体を指す。例えば、「Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む複合体を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼは、野生型核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを非限定的に含む、任意のタイプの核酸ガイド化ヌクレアーゼであってよい。
用語「核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドＮＡ」は、ガイド核酸（ガイドＮＡ）を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドＮＡは、単離された核酸として、または核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の一部として存在することができる。
用語「捕捉」および「濃縮」は、本明細書で互換的に使用され、目的の配列、目的の標的化部位、目的外の配列または目的外の標的化部位を含有する核酸領域を選択的に単離するプロセスを指す。
用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野で公知のように、核酸鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセスを指す。その２つの配列が中等度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下でお互いと特異的にハイブリダイズするならば、核酸は参照核酸配列と「選択的にハイブリダイゼーションが可能である」と考えられる。中等度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ１９９５年およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。高ストリンジェンシー条件の１つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ中で約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける２回の洗浄と４２℃での０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける２回の追加の洗浄を含む。
本明細書で使用する用語「二重鎖」または「二重鎖の（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）」は、塩基対を形成した、すなわち一緒にハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチドを記載する。
本明細書で使用するように用語「増幅する」は、鋳型として標的核酸を使用して標的核酸の１つまたは複数のコピーを生成することを指す。
本明細書で使用するように、用語「ゲノム領域」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。
本明細書で使用するように、用語「ゲノム配列」は、ゲノムに存在する配列を指す。ＲＮＡはゲノムから転写されるので、この用語は、生物体の核ゲノムに存在する配列、ならびにそのようなゲノムから転写されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡコピーに存在する配列を包含する。
本明細書で使用するように、用語「ゲノム断片」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ゲノム断片は、染色体全体または染色体の断片であってもよい。ゲノム断片は、アダプタでライゲートされても（この場合、それは断片の片方もしくは両方の末端に、または分子の少なくとも５’末端にライゲートされたアダプタを有する）、またはアダプタでライゲートされなくてもよい。
ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有する試料を使用するアッセイにおいて用いることができ、ここで試験ゲノムはオリゴヌクレオチドのための結合部位を含有する。
本明細書で使用するように、用語「ライゲートする」は、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドと第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドとの、酵素によって触媒される結合を指す。
２つの核酸が「相補的である」場合は、核酸のうち１つの各塩基は他の核酸の中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する。用語「相補的な」および「完全に相補的な」は、本明細書において同義的に使用される。
本明細書で使用するように、用語「分離する」は、２つのエレメントの（例えば、サイズまたは親和性等による）物理的分離、ならびに１つのエレメントが分解し、他はインタクトなまま残ることを指す。例えば、切断された標的化配列を含む核酸を分離するために、サイズ排除を用いることができる。
細胞では、ＤＮＡは通常二本鎖の形態で存在し、このように、本明細書において「トップ」および「ボトム」鎖と呼ばれる２つの相補的な核酸鎖を有する。ある特定の場合には、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第１」および「第２」の鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ぶことができる。トップまたはボトム鎖への鎖の割り当ては恣意的であり、いかなる特定の配向、機能または構造も意味しない。それらが共有結合するまで、第１および第２の鎖は別個の分子である。記載の容易さのために、トップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖核酸の「トップ」および「ボトム」鎖は、「トップ」および「ボトム」鎖としてなお記載される。言い換えると、この開示のために、二本鎖ＤＮＡのトップおよびボトム鎖は分離された分子である必要はない。いくつかの例示的な哺乳動物の染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体等）の第１の鎖のヌクレオチド配列が公知であり、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる。
本明細書で使用する用語「トップ鎖」は、核酸の両方の鎖でなく核酸のいずれかの鎖を指す。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「トップ鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１つの鎖だけに結合し、他には結合しない。本明細書で使用する用語「ボトム鎖」は、「トップ鎖」に相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「１本の鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１本の鎖だけ、例えば第１または第２の鎖だけに結合し、他の鎖には結合しない。オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に結合またはアニールする場合は、オリゴヌクレオチドは２つの領域を有することができ、第１の領域は二本鎖ＤＮＡのトップ鎖とハイブリダイズし、第２の領域は二本鎖ＤＮＡのボトム鎖とハイブリダイズする。
用語「二本鎖ＤＮＡ分子」は、トップおよびボトム鎖が共有結合していない二本鎖ＤＮＡ分子、ならびにトップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖ＤＮＡ分子の両方を指す。二本鎖ＤＮＡのトップおよびボトム鎖は、ワトソン−クリック相互作用により互いと塩基対を形成する。
本明細書で使用するように、用語「変性する」は、適する変性条件に二重鎖を置くことによる、核酸二重鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は、当技術分野で周知である。一実施形態では、核酸二重鎖を変性させるために、二重鎖を二重鎖のＴｍより上の温度に曝露させ、それによって二重鎖の１本の鎖を他から解放することができる。ある特定の実施形態では、適する時間（例えば、少なくとも３０秒から３０分まで）、少なくとも９０℃の温度にそれを曝露させることによって、核酸を変性させることができる。ある特定の実施形態では、二重鎖の塩基対を完全に分離するために、完全変性条件を使用することができる。他の実施形態では、二重鎖のある特定の部分の塩基対を分離するために（例えば、Ａ−Ｔ塩基対が濃縮された領域は分離することができ、Ｇ−Ｃ塩基対が濃縮された領域は対を形成したままでいることができる）、部分的変性条件（例えば、完全変性条件より低い温度による）を使用することができる。核酸は、化学的に変性させることもできる（例えば、尿素またはＮａＯＨを使用する）。
本明細書で使用するように、用語「遺伝子型決定」は、核酸配列の任意のタイプの分析を指し、配列決定、多型（ＳＮＰ）分析および再配列を同定するための分析を含む。
本明細書で使用するように、用語「配列決定」は、ポリヌクレオチドの連続するヌクレオチドの同一性が得られる方法を指す。
用語「次世代配列決定」は、いわゆる並行化された合成による配列決定またはライゲーションによる配列決定プラットホーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＲｏｃｈｅ等によって現在用いられるものを指す。次世代配列決定方法は、ナノポア配列決定方法または電子検出に基づく方法、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術を含むこともできる。
用語「相補的ＤＮＡ」またはｃＤＮＡは、ＲＮＡの（ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーなどのプライマーを使用した）逆転写と、続くＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの消化およびＤＮＡポリメラーゼによる合成による第２の鎖の合成によってＲＮＡ試料から生成された二本鎖ＤＮＡ試料を指す。
用語「ＲＮＡプロモーターアダプタ」は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６などからのＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含有するアダプタである。
用語の他の定義は、明細書全体で出現することがある。
本明細書に記載されている構造的および機能的特徴のいずれかに関して、これらの特徴を決定する方法は、当技術分野で公知である。
ガイド核酸（ｇＮＡ）
任意の核酸供給源から得ることができるガイド核酸（ｇＮＡ）が、本明細書に提供される。ｇＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であってよい。核酸供給源は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。単一の生物由来のＤＮＡ、または複数の生物由来のＤＮＡの混合物、または複数の種由来のＤＮＡの混合物、または臨床試料由来のＤＮＡ、または法医学的試料由来のＤＮＡ、または環境試料由来のＤＮＡ、またはメタゲノムＤＮＡ試料（例えば、２以上の生物種を含有する試料）由来のＤＮＡを含む、任意の供給源核酸からｇＮＡを生成するための方法が、本明細書に提供される。任意の供給源ＤＮＡの例は、任意のゲノム、任意のゲノム断片、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＤＮＡ収集物（例えば、ＳＮＰ収集物、ＤＮＡライブラリー）を非限定的に含む。本明細書に提供されているｇＮＡは、ゲノムワイド適用に使用することができる。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、ゲノム配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、哺乳動物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、真核生物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、原核生物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、ウイルスゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、細菌ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、植物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、微生物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、寄生生物、例えば、真核寄生生物由来のゲノム配列に由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、反復性ＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、豊富なＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、リボソームＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、セントロメアＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、Ａｌｕエレメントを含むＤＮＡ（Ａｌｕ ＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、長鎖散在核要素を含むＤＮＡ（ＬＩＮＥ ＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、短鎖散在核要素を含むＤＮＡ（ＳＩＮＥ ＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、リボソームＤＮＡを含む。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、宿主ＤＮＡ（例えば、宿主ゲノムＤＮＡまたは全宿主ＤＮＡ）を含む。一例では、宿主ＤＮＡ（例えば、ヒト、動物、植物）を枯渇させて、存在する他のＤＮＡ（例えば、細菌、ウイルスまたは他のメタゲノムＤＮＡ）のより容易な解析を可能にするために、ｇＮＡは、宿主ＤＮＡに由来し得る。別の例では、ｇＮＡは、メタゲノム試料中の１または複数の最も豊富な細菌種等、混合試料中の１または複数の最も豊富な型（例えば、種）に由来し得る。１または複数の最も豊富な型（例えば、種）は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える最も豊富な型（例えば、種）を含むことができる。最も豊富な型は、最も豊富な界、門（phylumまたはdivision）、綱、目、科、属、種または他の分類であり得る。最も豊富な型は、上皮細胞、骨細胞、筋肉細胞、血液細胞、脂肪細胞または他の細胞型等、最も豊富な細胞型であり得る。最も豊富な型は、非がん性細胞であり得る。最も豊富な型は、がん性細胞であり得る。最も豊富な型は、動物、ヒト、植物、真菌、細菌またはウイルスであり得る。ｇＮＡは、ヒトＤＮＡおよび１または複数の最も豊富な細菌種のＤＮＡの両方に由来等、試料中の宿主および１または複数の最も豊富な非宿主型（例えば、種）の両方に由来し得る。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、試料中のより豊富な方のまたは最も豊富な細胞由来のＤＮＡを含む。例えば、特異的な試料のため、非常に豊富な細胞を抽出することができ、そのＤＮＡを使用して、ｇＮＡを生成することができる；このようなｇＮＡを使用して、枯渇ライブラリーを生成し、本来の試料に適用して、低存在量標的の配列決定または検出を可能にまたは増強することができる。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、短い末端反復（ＳＴＲ）を含むＤＮＡに由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノムそれ自体に由来する。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、真核生物または原核生物の生物体；哺乳動物の生物体または非哺乳動物の生物体；動物または植物；細菌またはウイルス；動物寄生生物；または病原体に由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意の哺乳動物の生物体に由来する。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は畜産動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバである。別の実施形態では、哺乳動物の生物体は、家庭用ペット、例えばネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物はサルの一種である。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意のトリまたは鳥類の生物体に由来する。鳥類の生物体には、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガチョウが限定されずに含まれる。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、植物に由来する。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、細菌の種に由来する。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、ウイルスに由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、真菌類の種に由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、藻類の種に由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意の哺乳動物寄生生物に由来する。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意の哺乳動物寄生生物に由来する。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、核酸標的に由来する。企図される標的は、病原体；一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、タンデム反復もしくは転座；ヒトＳＮＰもしくはＳＴＲ；潜在的な毒素；または動物、真菌および植物を非限定的に含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、病原体に由来し、病原体特異的ｇＮＡである。
一部の実施形態では、本発明のガイドＮＡは、１５〜２５０ｂｐである標的化配列を含む、第１のＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含む、第２のＮＡセグメントとを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、２１ｂｐを超える、２２ｂｐを超える、２３ｂｐを超える、２４ｂｐを超える、２５ｂｐを超える、２６ｂｐを超える、２７ｂｐを超える、２８ｂｐを超える、２９ｂｐを超える、３０ｂｐを超える、４０ｂｐを超える、５０ｂｐを超える、６０ｂｐを超える、７０ｂｐを超える、８０ｂｐを超える、９０ｂｐを超える、１００ｂｐを超える、１１０ｂｐを超える、１２０ｂｐを超える、１３０ｂｐを超える、１４０ｂｐを超える、またはさらには１５０ｂｐを超える。例示的な実施形態では、標的化配列は、３０ｂｐを超える。一部の実施形態では、本発明の標的化配列は、サイズが３０〜５０ｂｐに及ぶ。一部の実施形態では、本発明の標的化配列は、サイズが３０〜７５ｂｐに及ぶ。一部の実施形態では、本発明の標的化配列は、サイズが３０〜１００ｂｐに及ぶ。例えば、標的化配列は、少なくとも１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐまたは２５０ｂｐであり得る。特定の実施形態では、標的化配列は、少なくとも２２ｂｐである。特定の実施形態では、標的化配列は、少なくとも３０ｂｐである。
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質によって認識され得る、ＰＡＭ配列に対し５’にある標的化された核酸配列の反対の鎖における領域と相補的な核酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、標的化された核酸配列は、ＰＡＭ配列に対しすぐ接して５’にある。特異的な実施形態では、標的核酸における領域と相補的なｇＮＡの核酸配列は、１５〜２５０ｂｐである。特異的な実施形態では、標的核酸における領域と相補的なｇＮＡの核酸配列は、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０または１００ｂｐである。
一部の特定の実施形態では、標的化配列は、２０ｂｐではない。一部の特定の実施形態では、標的化配列は、２１ｂｐではない。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意のプリンまたはピリミジン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、ウラシル、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシル（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、標識を含むか、標識に付着されるか、または標識され得る。一部の実施形態では、ｇＮＡは、標識にさらに付着されることができる部分を含む。標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団（lumiphore）、フルオロフォア、色素原、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基（酸化還元反応を起こすことができる）、アプタマー、結合ペアの一方のメンバー、ＦＲＥＴペアのメンバー（ドナーまたはアクセプターフルオロフォアのいずれか）およびこれらの組合せを非限定的に含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材に付着されている。基材は、ガラス、プラスチック、シリコン、シリカベースの材料、官能化ポリスチレン、官能化ポリエチレングリコール、官能化有機ポリマー、ニトロセルロースまたはナイロン膜、紙、綿および合成に適した材料でできていてよい。基材は、平坦である必要はない。一部の実施形態では、基材は、２次元アレイである。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦である。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦でなく、例えば、アレイは、波状アレイである。基材は、球形（例えば、ビーズ）を含む任意の型の形状を含む。基材に付着される材料は、基材の任意の部分に付着されてよい（例えば、多孔性基材材料の内側部分に付着されてよい）。一部の実施形態では、基材は、３次元アレイ、例えば、マイクロスフェアである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、磁性である。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ガラスである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ポリスチレンでできている。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、シリカベースである。一部の実施形態では、基材は、内側表面を有するアレイであり、例えば、ストロー、チューブ、キャピラリー、円柱状またはマイクロ流体チャンバーアレイである。一部の実施形態では、基材は、複数のストロー、キャピラリー、チューブ、シリンダーまたはチャンバーを含む。
ｇＮＡをコードする核酸
ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）をコードする核酸も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸の転写に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の転写のための鋳型であることを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡをコードする核酸の逆転写に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡの逆転写のための鋳型であることを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡをコードする核酸の増幅に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡの増幅のための鋳型であることを意味する。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列を含む第２のセグメントであって、１５ｂｐ〜２５０ｂｐに及び得る第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第１のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、調節領域は、転写因子に結合することができる領域である。一部の実施形態では、調節領域は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。
ｇＮＡの収集物
ｇＮＡの収集物（ライブラリーと互換的に称される）が、本明細書に提供される。
本明細書で使用するように、ｇＮＡの収集物は、少なくとも１０２個の特異なｇＮＡを含有するｇＮＡの混合物を意味する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個の特異なｇＮＡを含有する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、総計で少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個のｇＮＡを含有する。
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含み、収集物中のｇＮＡの少なくとも１０％のサイズが変動する。一部の実施形態では、第１および第２のセグメントは、５’から３’への順序である。
一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、ｇＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ、または３０〜１００ｂｐ、または２２〜３０ｂｐ、または１５〜５０ｂｐ、または１５〜７５ｂｐ、または１５〜１００ｂｐ、または１５〜１２５ｂｐ、または１５〜１５０ｂｐ、または１５〜１７５ｂｐ、または１５〜２００ｂｐ、または１５〜２２５ｂｐ、または１５〜２５０ｂｐ、または２２〜５０ｂｐ、または２２〜７５ｂｐ、または２２〜１００ｂｐ、または２２〜１２５ｂｐ、または２２〜１５０ｂｐ、または２２〜１７５ｂｐ、または２２〜２００ｂｐ、または２２〜２２５ｂｐ、または２２〜２５０ｂｐ変動する。
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２１ｂｐを超える。
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２５ｂｐを超える。
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０ｂｐを超える。
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、１５〜５０ｂｐである。
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０〜１００ｂｐである。
一部の特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、２０ｂｐではない。
一部の特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、２１ｂｐではない。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの収集物中のｇＮＡおよび／またはｇＮＡの標的化配列は、特異な５’端を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に可変性を呈する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％の可変性または少なくとも７５％可変性を呈する。
一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、任意のプリンまたはピリミジン（および／またはこれらの改変バージョン）であってよい。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、アデニンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、グアニンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、シトシンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、ウラシルである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、チミンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、シトシンではない。
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、標的化されたＤＮＡと塩基対形成することができる標的化配列を含み、目的の標的は、目的のゲノムにわたって、少なくとも１ｂｐ毎の、少なくとも２ｂｐ毎の、少なくとも３ｂｐ毎の、少なくとも４ｂｐ毎の、少なくとも５ｂｐ毎の、少なくとも６ｂｐ毎の、少なくとも７ｂｐ毎の、少なくとも８ｂｐ毎の、少なくとも９ｂｐ毎の、少なくとも１０ｂｐ毎の、少なくとも１１ｂｐ毎の、少なくとも１２ｂｐ毎の、少なくとも１３ｂｐ毎の、少なくとも１４ｂｐ毎の、少なくとも１５ｂｐ毎の、少なくとも１６ｂｐ毎の、少なくとも１７ｂｐ毎の、少なくとも１８ｂｐ毎の、少なくとも１９ｂｐ毎の、２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ毎の、少なくとも３０ｂｐ毎の、少なくとも４０ｂｐ毎の、少なくとも５０ｂｐ毎の、少なくとも１００ｂｐ毎の、少なくとも２００ｂｐ毎の、少なくとも３００ｂｐ毎の、少なくとも４００ｂｐ毎の、少なくとも５００ｂｐ毎の、少なくとも６００ｂｐ毎の、少なくとも７００ｂｐ毎の、少なくとも８００ｂｐ毎の、少なくとも９００ｂｐ毎の、少なくとも１０００ｂｐ毎の、少なくとも２５００ｂｐ毎の、少なくとも５０００ｂｐ毎の、少なくとも１０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１５，０００ｂｐ毎の、少なくとも２０，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５，０００ｂｐ毎の、少なくとも５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１００，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも５００，０００ｂｐ毎の、少なくとも７５０，０００ｂｐ毎のまたはさらには少なくとも１，０００，０００ｂｐ毎の間隔にある。
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含み、収集物中のｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のタンパク質メンバーに対し様々な特異性を有する種々の第２のＮＡセグメントを有することができる。例えば、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、その第２のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含むメンバーを含むことができ；また、その第２のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含むメンバーも含み、この場合、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質は、同じものではない。一部の実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９またはさらには少なくとも２０種の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。特異的な一実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、Ｃａｓ９タンパク質、ならびにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される別のタンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。
一部の実施形態では、収集物の複数のｇＮＡメンバーは、標識に付着されるか、標識を含むか、または標識され得る。一部の実施形態では、ｇＮＡは、標識にさらに付着されることができる部分を含む。標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色素原、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基（酸化還元反応を起こすことができる）、アプタマー、結合ペアの一方のメンバー、ＦＲＥＴペアのメンバー（ドナーまたはアクセプターフルオロフォアのいずれか）およびこれらの組合せを非限定的に含む。
一部の実施形態では、収集物の複数のｇＮＡメンバーは、基材に付着される。基材は、ガラス、プラスチック、シリコン、シリカベースの材料、官能化ポリスチレン、官能化ポリエチレングリコール、官能化有機ポリマー、ニトロセルロースまたはナイロン膜、紙、綿、および合成に適した材料でできていてよい。基材は、平坦である必要はない。一部の実施形態では、基材は、２次元アレイである。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦である。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦でなく、例えば、アレイは、波状アレイである。基材は、球形（例えば、ビーズ）を含む任意の型の形状を含む。基材に付着される材料は、基材の任意の部分に付着されてよい（例えば、多孔性基材材料の内側部分に付着されてよい）。一部の実施形態では、基材は、３次元アレイ、例えば、マイクロスフェアである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、磁性である。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ガラスである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ポリスチレンでできている。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、シリカベースである。一部の実施形態では、基材は、内側表面を有するアレイであり、例えば、ストロー、チューブ、キャピラリー、円柱状またはマイクロ流体チャンバーアレイである。一部の実施形態では、基材は、複数のストロー、キャピラリー、チューブ、シリンダーまたはチャンバーを含む。
ｇＮＡをコードする核酸の収集物
ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）をコードする核酸の収集物（ライブラリーと互換的に称される）が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡをコードする核酸の転写に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡの転写のための鋳型であることを意味する。
本明細書で使用するように、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、少なくとも１０２個の特異な（unique）核酸を含有する核酸の混合物を意味する。一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個の特異なｇＮＡをコードする核酸を含有する。一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、総計で少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個の、ｇＮＡをコードする核酸を含有する。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列を含む第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含み、収集物中の核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する。
一部の実施形態では、第１、第２および第３のセグメントは、５’から３’への順序である。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第１のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、調節領域は、転写因子に結合することができる領域である。一部の実施形態では、調節領域は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメント（標的化配列）のサイズは、ｇＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ、または３０〜１００ｂｐ、または２２〜３０ｂｐ、または１５〜５０ｂｐ、または１５〜７５ｂｐ、または１５〜１００ｂｐ、または１５〜１２５ｂｐ、または１５〜１５０ｂｐ、または１５〜１７５ｂｐ、または１５〜２００ｂｐ、または１５〜２２５ｂｐ、または１５〜２５０ｂｐ、または２２〜５０ｂｐ、または２２〜７５ｂｐ、または２２〜１００ｂｐ、または２２〜１２５ｂｐ、または２２〜１５０ｂｐ、または２２〜１７５ｂｐ、または２２〜２００ｂｐ、または２２〜２２５ｂｐ、または２２〜２５０ｂｐ変動する。
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２１ｂｐを超える。
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２５ｂｐを超える。
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０ｂｐを超える。
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、１５〜５０ｂｐである。
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０〜１００ｂｐである。
一部の特定の実施形態では、第２のセグメントのサイズは、２０ｂｐではない。
一部の特定の実施形態では、第２のセグメントのサイズは、２１ｂｐではない。
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物中のｇＮＡおよび／またはｇＮＡの標的化配列は、特異な５’端を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に可変性を呈する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％の可変性または少なくとも７５％可変性を呈する。
一部の実施形態では、核酸の収集物は、標的化配列を含み、目的の標的は、目的のゲノムにわたって、少なくとも１ｂｐ毎の、少なくとも２ｂｐ毎の、少なくとも３ｂｐ毎の、少なくとも４ｂｐ毎の、少なくとも５ｂｐ毎の、少なくとも６ｂｐ毎の、少なくとも７ｂｐ毎の、少なくとも８ｂｐ毎の、少なくとも９ｂｐ毎の、少なくとも１０ｂｐ毎の、少なくとも１１ｂｐ毎の、少なくとも１２ｂｐ毎の、少なくとも１３ｂｐ毎の、少なくとも１４ｂｐ毎の、少なくとも１５ｂｐ毎の、少なくとも１６ｂｐ毎の、少なくとも１７ｂｐ毎の、少なくとも１８ｂｐ毎の、少なくとも１９ｂｐ毎の、２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ毎の、少なくとも３０ｂｐ毎の、少なくとも４０ｂｐ毎の、少なくとも５０ｂｐ毎の、少なくとも１００ｂｐ毎の、少なくとも２００ｂｐ毎の、少なくとも３００ｂｐ毎の、少なくとも４００ｂｐ毎の、少なくとも５００ｂｐ毎の、少なくとも６００ｂｐ毎の、少なくとも７００ｂｐ毎の、少なくとも８００ｂｐ毎の、少なくとも９００ｂｐ毎の、少なくとも１０００ｂｐ毎の、少なくとも２５００ｂｐ毎の、少なくとも５０００ｂｐ毎の、少なくとも１０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１５，０００ｂｐ毎の、少なくとも２０，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５，０００ｂｐ毎の、少なくとも５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１００，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも５００，０００ｂｐ毎の、少なくとも７５０，０００ｂｐ毎のまたはさらには少なくとも１，０００，０００ｂｐ毎の間隔にある。
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントを含み、収集物中のこのセグメントは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のタンパク質メンバーに対するその特異性が変動する。例えば、本明細書に提供されているｇＮＡをコードする核酸の収集物は、その第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードするメンバーを含むことができ；また、その第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードするメンバーも含み、この場合、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質は、同じものではない。一部の実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡをコードする核酸の収集物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９またはさらには少なくとも２０種の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。特異的な一実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡをコードする核酸の収集物は、Ｃａｓ９タンパク質、ならびにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される別のタンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。
目的の配列
濃縮、枯渇、捕捉、分配、標識、調節および編集を非限定的に含む種々の適用のため、試料における目的の配列の標的化に使用することができる、任意の供給源ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工ＤＮＡ、ＤＮＡライブラリー）に由来するｇＮＡおよびｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。ｇＮＡは、目的の配列へと向けられた標的化配列を含む。
一部の実施形態では、目的の配列は、ゲノム配列（ゲノムＤＮＡ）である。一部の実施形態では、目的の配列は、哺乳動物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、真核生物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、原核生物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、ウイルスゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、細菌ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、植物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、微生物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、寄生生物、例えば、真核寄生生物由来のゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、宿主ゲノム配列（例えば、マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）、寄生生物または病原体の宿主生物）である。一部の実施形態では、目的の配列は、豊富なゲノム配列（例えば、試料中の１または複数の最も豊富な種のゲノム由来の配列）である。
一部の実施形態では、目的の配列は、反復性ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、豊富なＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、ミトコンドリアＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、リボソームＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、セントロメアＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、Ａｌｕエレメントを含むＤＮＡ（Ａｌｕ ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、目的の配列は、長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、目的の配列は、短鎖散在核要素（ＳＩＮＥ ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、リボソームＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、目的の配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入、欠失、構造的変種、エクソン、遺伝的突然変異または調節領域を含む。
一部の実施形態では、目的の配列は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノムそれ自体であり得る。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
一部の実施形態では、目的の配列は、真核生物または原核生物の生物体；哺乳動物の生物体または非哺乳動物の生物体；動物または植物；細菌またはウイルス；動物寄生生物；または病原体からである。
一部の実施形態では、目的の配列は、任意の哺乳動物の生物体からである。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は畜産動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバである。別の実施形態では、哺乳動物の生物体は、家庭用ペット、例えばネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物はサルの一種である。
一部の実施形態では、目的の配列は、任意のトリまたは鳥類の生物体からである。鳥類の生物体には、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガチョウが限定されずに含まれる。
一部の実施形態では、目的の配列は、植物からである。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
一部の実施形態では、目的の配列は、細菌の種からである。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
一部の実施形態では、目的の配列は、ウイルスからである。
一部の実施形態では、目的の配列は、真菌類の種からである。
一部の実施形態では、目的の配列は、藻類の種からである。
一部の実施形態では、目的の配列は、任意の哺乳動物寄生生物からである。
一部の実施形態では、目的の配列は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
一部の実施形態では、目的の配列は、病原体からである。
標的化配列
本明細書で使用するように、標的化配列は、ｇＮＡを試料中の目的の配列に向ける配列である。例えば、標的化配列は、特定の目的の配列を標的とし、例えば、標的化配列は、目的のゲノム配列を標的とする。
標的化配列を含むセグメントを含むｇＮＡおよびｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。標的化配列をコードするセグメントを含むｇＮＡをコードする核酸およびｇＮＡをコードする核酸の収集物も、本明細書に提供される。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含み、ＲＮＡが、チミンの代わりにウラシルを含むことを除いて、目的の配列におけるＰＡＭ配列に対し５’にある配列に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含み、目的の配列におけるＰＡＭ配列に対し５’にある配列に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含み、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。
一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含み、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列をコードするＤＮＡは、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列をコードするＤＮＡは、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的であり、目的の配列におけるＰＡＭ配列に対し５’にある配列に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである。
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含むセグメントを含む、ｇＮＡおよびｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードするセグメントを含む、ｇＮＡをコードする核酸およびｇＮＡをコードする核酸の収集物も、本明細書に提供される。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、ＲＮＡガイド化ヌクレアーゼ系であってよい。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、ＤＮＡガイド化ヌクレアーゼ系であってよい。
本開示の方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用し得る。本明細書で使用する場合、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断し、特異性を付与するために１つまたは複数の核酸ガイド核酸（ｇＮＡ）を使用する任意のヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ならびに非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が含まれる。
本明細書で提供される核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＤＮＡによって誘導されるＤＮＡヌクレアーゼ；ＤＮＡによって誘導されるＲＮＡヌクレアーゼ；ＲＮＡによって誘導されるＤＮＡヌクレアーゼ；またはＲＮＡによって誘導されるＲＮＡヌクレアーゼであってよい。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼであり得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系の任意のタンパク質メンバーに結合する核酸配列である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の任意のタンパク質メンバーに結合する核酸配列である。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＣＡＳクラスＩ Ｉ型、ＣＡＳクラスＩ ＩＩＩ型、ＣＡＳクラスＩ ＩＶ型、ＣＡＳクラスＩＩ ＩＩ型およびＣＡＳクラスＩＩ Ｖ型からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ ＩＩＩ型系由来のタンパク質を含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＮｇＡｇｏからなる群から選択される。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）は、任意の細菌または古細菌種由来であってよい。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ由来の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）由来であるまたはこれに由来する。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質の例は、天然に存在するまたは操作されたバージョンであってよい。
一部の実施形態では、天然に存在する核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５を含む。斯かるタンパク質の操作されたバージョンを用いることもできる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質の操作された例は、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む。用語「触媒活性がない」は一般に、失活したヌクレアーゼ（例えば、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼ）を有する核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を指す。斯かるタンパク質は、任意の核酸における標的部位に結合することができる（標的部位が、ガイドＮＡによって決定される場合）が、このタンパク質は、標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を切断するまたはこれにニックを入れることができない。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系の触媒活性がないタンパク質は、触媒活性がないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）等、触媒活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。したがって、ｄＣａｓ９は、混合物を非結合核酸およびｄＣａｓ９結合断片へと分離することを可能にする。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。結合したｄＣａｓ９は、他のマニピュレーションを進める間、Ｃａｓ９による切断を防止することができる。別の実施形態では、ｄＣａｓ９は、トランスポサーゼ等、別の酵素に融合して、該酵素の活性を特異的部位へと標的化することができる。天然に存在する触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を用いることもできる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質の操作された例は、核酸ガイド化ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓニッカーゼ）も含む。核酸ガイド化ニッカーゼは、単一の不活性触媒ドメインを含有する、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の改変バージョンを指す。一実施形態では、核酸ガイド化ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ等、Ｃａｓニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、単一の不活性触媒ドメイン、例えば、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインのいずれかを含有することができる。１個のみの活性ヌクレアーゼドメインにより、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作製する。どちらの突然変異体が使用されるかに応じて、ガイドＮＡハイブリダイズ鎖または非ハイブリダイズ鎖を切断することができる。反対の鎖を標的とする２個のｇＮＡに結合した核酸ガイド化ニッカーゼは、標的二本鎖ＤＮＡに二本鎖切断を作製するであろう。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ／ｇＮＡ（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）複合体が、二本鎖切断が形成される前に、部位に特異的に結合することを必要とするため、切断の特異性を増加させることができる。天然に存在するニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を用いることもできる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の操作された例は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系融合タンパク質も含む。例えば、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質は、別のタンパク質、例えば、活性化因子、リプレッサー、ヌクレアーゼ、蛍光分子、放射性タグまたはトランスポサーゼに融合されてよい。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）（配列番号３）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４）を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする一本鎖ＤＮＡ配列は、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）（配列番号１）を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ）（配列番号５）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号６）を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする一本鎖ＤＮＡ配列は、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号６）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ）（配列番号２）を含む。
一部の実施形態では、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後に、ＮＡ（例えば、ＲＮＡ）ステムループ配列を生じる、単一の転写構成成分を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、二本鎖であり、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）（配列番号３）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、一本鎖であり、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、単一の転写構成成分からの転写後に、その結果生じるｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）（配列番号１）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、二本鎖であり、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ）（配列番号５）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号６）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、一本鎖であり、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号６）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、単一の転写構成成分からの転写後に、生じたｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ）（配列番号２）を含む。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする２個のサブセグメントを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、Ｎ２０、およびｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる余分な配列を含まない。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる余分な配列を含む。一部の実施形態では、２個のサブセグメントは、独立して転写される。一部の実施形態では、２個のサブセグメントは、単一の単位として転写される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｎ標的ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧ（配列番号７）を含み、式中、Ｎ標的は、標的化配列を表す。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列、ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８）を含む。
一部の実施形態では、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後に、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質に結合することができるｇＲＮＡステムループ配列を生じるＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、二本鎖であってよい。一部の実施形態では、第３のセグメント二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）（配列番号３）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４）を含む。一部の実施形態では、第３のセグメント二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ）（配列番号５）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号６）を含む。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、一本鎖であってよい。一部の実施形態では、第３のセグメント一本鎖ＤＮＡは、次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、第３のセグメント一本鎖ＤＮＡは、次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号６）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後に、第２のＲＮＡ配列とハイブリッドを形成することができる第１のＲＮＡ配列を生じるＤＮＡ配列を含み、このハイブリッドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合が可能である。一部の実施形態では、第３のセグメントは、一方の鎖にＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧ）（配列番号９）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号１０）を含む二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、（５’＞３’、ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号１０）のＤＮＡ配列を含む一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントおよび第３のセグメントは共に、ｃｒＲＮＡ配列をコードする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸の第３のセグメントによってコードされる第１のＲＮＡ配列とハイブリッドを形成することができる第２のＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列（５’＞３’、ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、（５’＞３’、ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）（配列番号８）の配列を含む二本鎖ＤＮＡによってコードされ、任意選択で、その５’端において調節配列と融合される。一部の実施形態では、調節配列は、転写因子が結合し得る。一部の実施形態では、調節配列は、プロモーターである。一部の実施形態では、調節配列は、（５’＞３’、ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧ）（配列番号１２）の配列を含むＴ７プロモーターである。
一部の実施形態では、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含むｇＮＡをコードする核酸が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後切断後に、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントを生じる、ＲＮＡ配列をコードする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡを含み、第２のＲＮＡセグメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含み、これらは、ハイブリッドを形成し、共に、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合をもたらすことができる。一部の実施形態では、第３のセグメントは、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントの転写単位の間にスペーサーをさらに含み、このスペーサーは、酵素切断部位を含む。
一部の実施形態では、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、３０ｂｐを超える。一部の実施形態では、第２のセグメントは、ｇＲＮＡステムループ配列を含む単一のセグメントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）（配列番号１）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ）（配列番号２）を含む。一部の実施形態では、第２のセグメントは、２個のサブセグメントを含み、第１のＲＮＡサブセグメント（ｃｒＲＮＡ）は第２のＲＮＡサブセグメント（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリッドを形成し、これらは共に、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合を向けるように作用する。一部の実施形態では、第２のサブセグメントの配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧを含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントは共に、ｃｒＲＮＡ配列を形成する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡセグメントとハイブリッドを形成するであろう他のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’＞３’、ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１１）の配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書に提供されている実施形態において使用される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ ＩＩＩ型系由来のタンパク質を含む。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種に由来し得る。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離される、組換えにより産生されるか、または合成による。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからであるか、またはこれらに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の例は、天然に存在し得るか、または操作されたバージョンであってよい。
一部の実施形態では、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＩＩＩもしくはＩＶ、またはＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩもしくはＶに属することができ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＣｐｆ１を含むことができる。
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９を含む。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％または９０％同一、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡ」は、ガイドＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡは、単離されたＮＡとして、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
Ｃａｓ９
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であるかまたはそれを含む。本発明のＣａｓ９は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。
本明細書の実施形態において使用することができるＣａｓ９タンパク質の例は、Ｆ．Ａ． Ｒａｎ、Ｌ． Ｃｏｎｇ、Ｗ．Ｘ． Ｙａｎ、Ｄ． Ａ． Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｓ． Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｊ． Ｋｒｉｚ、Ｂ． Ｚｅｔｓｃｈｅ、Ｏ． Ｓｈａｌｅｍ、Ｘ． Ｗｕ、Ｋ．Ｓ． Ｍａｋａｒｏｖａ、Ｅ．Ｖ． Ｋｏｏｎｉｎ、Ｐ．Ａ． ＳｈａｒｐおよびＦ． Ｚｈａｎｇ；「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９」、Ｎａｔｕｒｅ５２０巻、１８６〜１９１頁（２０１５年４月９日）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９、に見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、ＰＡＭ配列は、標的特異的ガイド配列の３’末端に直に位置するＮＧＧである。例示的な細菌種からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列は、以下を含むこともできる：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ）、Ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＮＮＮＧＡ
ＴＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡ）およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＮＡＡＡＡＣ）、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
例示的な一実施形態では、Ｃａｓ９配列は、例えば、細菌で発現させ、組換え６Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製するために、ＰＣＲによって再増幅され、次にｐＥＴ３０（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）にクローニングされる、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）から得ることができる。
「Ｃａｓ９−ｇＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＮＡを含む複合体を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質と、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
用語「Ｃａｓ９関連ガイドＮＡ」は、前記のようなガイドＮＡを指す。Ｃａｓ９関連ガイドＮＡは、単離されて、またはＣａｓ９−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからのものであるかまたはそれに由来する。
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、天然に存在するものまたは操作されたバージョンであってよい。
一部の実施形態では、天然に存在する非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉからのアルゴノート）である。
「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
用語「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡ」は、ガイドＮＡを指す。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡは、単離されたＮＡとして、または非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが（標的部位はガイドＮＡによって決定される）、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
したがって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、未結合の核酸および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼに結合した断片への混合物の分離を可能にする。例示的な一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。ｄＣａｓ９結合はＣａｓ９による切断を阻止できるが、他の操作は進行する。
別の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、トランスポザーゼなどの別の酵素に融合させて、その酵素の活性を特異的部位に標的化させることができる。
一部の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ〜ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２またはｄＮｇＡｇｏである。
例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質は、ｄＣａｓ９である。
核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（ニッカーゼ−核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる）が含まれる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、単一の不活性触媒ドメインを含有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼが含まれる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ〜ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼまたはＮｇＡｇｏニッカーゼである。
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＮＡに結合した核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、核酸において二本鎖切断を起こすことができる。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ／ｇＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加させる。
例示的な実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、単一の不活性触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインを含有する、Ｃａｓ９タンパク質の改変バージョンを指す。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＲＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を起こす。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加することができる。
ＤＮＡの捕捉は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを使用して実行することができる。例示的な一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは二本鎖核酸の１本の鎖を切断し、二本鎖の領域はメチル化ヌクレオチドを含む。
解離可能および耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される（耐熱性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも７５℃で少なくとも１分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも５０％の活性、少なくとも５５％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも６５％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも７５％の活性、少なくとも８０％の活性、少なくとも８５％の活性、少なくとも９０％の活性、少なくとも９５％の活性、少なくとも９６％の活性、少なくとも９７％の活性、少なくとも９８％の活性、少なくとも９９％の活性または１００％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で、少なくとも８０℃で、少なくとも８５℃で、少なくとも９０℃で、少なくとも９１℃で、少なくとも９２℃で、少なくとも９３℃で、少なくとも９４℃で、少なくとも９５℃、９６℃で、少なくとも９７℃で、少なくとも９８℃で、少なくとも９９℃で、または少なくとも１００℃で少なくとも１分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で少なくとも１分、２分、３分、４分または５分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、２５℃〜５０℃に低下させたとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、２５℃に、３０℃に、３５℃に、４０℃に、４５℃に、または５０℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、９５℃で１分間の後に少なくとも９０％の活性を保持する。
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、耐熱性Ｃａｓ９、耐熱性Ｃｐｆ１、耐熱性Ｃａｓ３、耐熱性Ｃａｓ８ａ〜ｃ、耐熱性Ｃａｓ１０、耐熱性Ｃｓｅ１、耐熱性Ｃｓｙ１、耐熱性Ｃｓｎ２、耐熱性Ｃａｓ４、耐熱性Ｃｓｍ２、耐熱性Ｃｍ５、耐熱性Ｃｓｆ１、耐熱性Ｃ２Ｃ２または耐熱性ＮｇＡｇｏである。
一部の実施形態では、耐熱性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、耐熱性Ｃａｓ９である。
耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、単離すること、例えば、高温菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムにおける配列相同性によって同定することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターに次にクローニングすることができる。例示的な一実施形態では、耐熱性のＣａｓ９タンパク質は単離される。
別の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、非耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ進化によって得ることができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼの配列は、その耐熱性を改善するために変異誘発させられ得る。
ｇＮＡの収集物を作製する方法
任意の供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）からの多数の多様なｇＲＮＡ、ｇＮＡの収集物の生成を可能にする方法が、本明細書に提供される。本明細書に提供されている方法は、消化、ライゲーション、伸長、オーバーハングを埋めること、転写、逆転写、増幅を非限定的に含む、酵素による方法を用いることができる。
一般に、本方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を提供するステップと；ＰＡＭ配列由来の残っているヌクレオチド配列が残るような仕方で、核酸におけるＰＡＭ配列の部分で切断する第１の酵素（または第１の酵素の組合せ）を用いるステップと；ＰＡＭ配列を排除するための距離に制限酵素ＩＩＳ型部位（その認識モチーフの外側だがその近傍を切断する酵素）が位置しているアダプタをライゲートするステップと；第２のＩＩＳ型酵素（または第２の酵素の組合せ）を用いるステップであって、アダプタと共にＰＡＭ配列を排除するステップと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系のタンパク質メンバーによって認識され得る配列、例えば、ｇＲＮＡステムループ配列を融合させるステップとを含むことができる。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列由来の残っているヌクレオチド配列が残り、ＰＡＭ配列に対しすぐ接して５’にあるヌクレオチド配列が、単にＰＡＭ配列に対し５’にあるシトシンを有するものではなく、例えば、単にＣ／ＮＧＧまたはＣ／ＴＡＧ等であるものではなく、任意のプリンまたはピリミジンであり得るような仕方で、第１の酵素反応は、ＰＡＭ配列の部分を切断する。
表１は、異なる制限酵素を使用して、任意の供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）をｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物へと変換するための例示的な戦略／プロトコールを示す。
表２は、異なる制限酵素を使用して、任意の供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）をｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物へと変換するためのさらなる例示的な戦略／プロトコールを示す。
本明細書に記載されている組成物および方法の例示的な適用は、図１、図２、図３、図４、図５、図６および図７に提示されている。これらの図面は、ゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）等、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築する方法を含む、本発明の非限定的な例示的な実施形態を描写する。
図１において、出発材料は、断片化されたゲノムＤＮＡ（例えば、ヒト）または他の供給源ＤＮＡであってよい。このような断片は、ライブラリーを構築する前に平滑末端化される（１０１）。Ｔ７プロモーターアダプタが、平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲートされ（１０２）、次いでこれはＰＣＲ増幅される。次に、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩを使用して、ＣＣＤ配列に対しすぐ接して５’に、ＰＣＲ産物の一方の鎖にニックを生成する（１０３）。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、反対の鎖において、ニックの１、２または３ｂｐ ５’を切断する（１０４）。その結果生じるＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片の末端にＨＧＧ配列を残しつつ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化される（１０５）。その結果生じるＤＮＡは、ビーズにおいて浄化および回収される。ＭｌｙＩ認識部位を保有するアダプタが、ＨＧＧ配列のすぐ接して３’に、平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲートされる（１０６）。ＭｌｙＩは、ＨＧＧ配列に対しすぐ接して５’に平滑末端切断を生成し、アダプタ配列と共にＨＧＧを除去する（１０７）。その結果生じるＤＮＡ断片は、再度ビーズにおいて浄化および回収される。次に、ｇＲＮＡステムループ配列が、ＭｌｙＩによって切断された平滑末端にライゲートされ、ヒトゲノムを網羅するｇＲＮＡライブラリーを形成する（１０８）。次に、このＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲ増幅され、ビーズにおいて浄化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の準備が整う。
図２において、出発材料は、インタクトなゲノムＤＮＡ（例えば、ヒト）または他の供給源ＤＮＡであってよい（２０１）。Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩを使用して、ヒトゲノムＤＮＡの各鎖にニックを生成し、より小型のＤＮＡ断片をもたらす（２０２）。２００〜６００ｂｐのＤＮＡ断片が、ビーズにおいてサイズ選択され、次いで、５’にＧＧオーバーハングを保有するＹ字型アダプタとライゲートされる。Ｙ字型アダプタの一方の鎖は、ＭｌｙＩ認識部位を含有し、他方の鎖は、突然変異したＭｌｙＩ部位およびＴ７プロモーター配列を含有する（２０３）。これらの特色のため、ＰＣＲ増幅後に、Ｔ７プロモーター配列は、ＨＧＧ配列の遠位端にあり、ＭｌｙＩ配列は、ＨＧＧの後端（rear end）にある（２０４）。ＭｌｙＩによる消化は、ＨＧＧ配列のすぐ接して５’に切断を生成する（２０５）。ＭｌｙＩは、ＨＧＧ配列に対しすぐ接して５’に平滑末端切断を生成し、アダプタ配列と共にＨＧＧを除去する（２０６）。次に、ｇＲＮＡステムループ配列が、ＭｌｙＩによって切断された平滑末端にライゲートされ、ヒトゲノムを網羅するｇＲＮＡライブラリーを形成する。次に、このＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲ増幅され、ビーズにおいて浄化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の準備が整う。
図３において、例えば、ニッキング酵素により、供給源ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）にニックを入れることができる（３０１）。場合によっては、ニッキング酵素は、３個またはそれよりも少ない塩基の長さである認識部位を有することができる。場合によっては、ＣＣＤ（式中、Ｄは、Ｃ以外の塩基を表す）の配列を認識し、そこにニックを入れることができるＣｖｉＰＩＩが使用される。ニックは、ガイドＲＮＡ Ｎ２０配列を得るために使用され得る、配列（より太い線によって表す）を含有する領域を囲む近位であってよい。ニックが近位である場合、二本鎖切断が生じ、５’または３’オーバーハングをもたらすことができる（３０２）。これらのオーバーハングは、例えば、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ポリメラーゼ）により修復され得る。場合によっては、例えば５’鎖がある場合、修復は、相補鎖の合成を含むことができる。場合によっては、例えば３’鎖がある場合、修復は、オーバーハングの除去を含むことができる。修復は、Ｎ２０ガイド配列と、ニック認識配列に相補的な配列（例えば、ＨＧＧ、式中、Ｈは、Ｇ以外の塩基を表す）を含む平滑末端をもたらすことができる。
図４において、例えば、図３の終わりから続けて、所望の切断を可能にするために、アダプタの異なる組合せがＤＮＡにライゲートされ得る。この部位から３塩基対を切断するヌクレアーゼ酵素の認識部位を有するアダプタ（例えば、ＭｌｙＩ）が、ライゲートされてよく（４０１）、該部位における消化を使用して、ＨＧＧ配列等、余剰の配列を除去することができる（４０２）。この部位から２０塩基対を切断するヌクレアーゼの認識部位を有するアダプタ（例えば、ＭｍｅＩ）（４０３）。これらのアダプタは、後に第１の認識部位（例えば、ＢｓａＸＩ）を除去するためにこの部位から適正な数のヌクレオチドを切断するヌクレアーゼの第２の認識部位を含んでいてもよい。第１の酵素を使用して、２０ヌクレオチドを切り出し、これにより、Ｎ２０配列を維持することができる（４０４）。次に、プロモーターアダプタ（例えば、Ｔ７）をＮ２０配列の隣にライゲートすることができる（４０５）。次に、第２の認識部位（例えば、ＢｓａＸＩ）に対応するヌクレアーゼを使用して、２０ヌクレオチドを切断する部位のためのアダプタを除去することができる（例えば、ＭｍｅＩ）（４０６）。最後に、ガイドＲＮＡステムループ配列アダプタは、Ｎ２０配列にライゲートして（４０７）、ガイドＲＮＡ生成に備えることができる。
あるいは、図５に示すプロトコールは、図３に示すもの等のプロトコールの終わりに続くことができる。この部位から２５ヌクレオチドを切断するヌクレアーゼ酵素の認識部位を有するアダプタ（例えば、ＥｃｏＰ１５Ｉ）を、ＤＮＡにライゲートすることができる（５０１）。このようなアダプタは、後に第１の認識部位（例えば、ＢａｅＩ）およびＨＧＧ等の任意の他の余剰の配列を除去するためにこの部位から適正な数のヌクレオチドを切断するヌクレアーゼの第２の認識部位を含んでいてもよい。次に、第１の認識部位（例えば、ＥｃｏＰ１５Ｉ）に対応する酵素を使用して、Ｎ２０配列の後を切断することができる（５０２）。次に、プロモーターアダプタ（例えば、Ｔ７）を、Ｎ２０配列の隣にライゲートすることができる（５０３）。次に、第２の認識部位（例えば、ＢａｅＩ）に対応する酵素を使用して、認識部位および残っている任意の配列（例えば、ＨＧＧ）を除去することができる（５０４）。最後に、ガイドＲＮＡステムループ配列アダプタを、Ｎ２０配列にライゲートすることができる（例えば、一本鎖ライゲーションによって）（５０５）。
図３に示すもの等のプロトコールの代替として、図６に示すプロトコールを、図４または図５に示すもの等のプロトコールの調製において使用することができる。ニッキング酵素（例えば、ＣｖｉＰＩＩ）によってニックを導入することができる（６０１）。場合によっては、ニック認識部位は、３個またはそれよりも少ない塩基の長さである。場合によっては、ＣＣＤの配列を認識し、そこにニックを入れることができるＣｖｉＰＩＩが使用される。次に、ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、古い鎖を置換しつつ、ニックから開始する新しいＤＮＡ鎖を合成することができる（６０２）。ＤＮＡ合成により、ニックが塞がれ、再度ニックを入れるために利用することができる（６０３）。ニッキングおよび合成のその後のサイクルを使用して、大量の標的配列を得ることができる（６０４）。例えば、ランダムプライミングおよび伸長によって、標的配列のこれらの一本鎖コピーを二本鎖にすることができる。次に、図４または図５に示すもの等、本明細書に開示されている方法によって、Ｎ２０配列を含むこれらの二本鎖核酸をさらに処理することができる。
図３または図６に示すもの等のプロトコールの別の代替として、図７に示すプロトコールを、図４または図５に示すもの等のプロトコールの調製において使用することができる。ニッキング酵素（例えば、ＣｖｉＰＩＩ）によってニックを導入することができる（７０１）。場合によっては、ニッキング酵素認識部位は、３個またはそれよりも少ない塩基の長さである。場合によっては、ＣＣＤの配列を認識し、そこにニックを入れることができるＣｖｉＰＩＩが使用される。次に、ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、古い鎖を置換しつつ、ニックから開始する新しいＤＮＡ鎖を合成することができる（例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ媒介性鎖置換ＤＮＡ増幅（ＮＥＭＤＡ））。反応パラメータを調整して、生成される一本鎖ＤＮＡのサイズを制御することができる。例えば、ニッカーゼ：ポリメラーゼ比（例えば、ＣｖｉＰＩＩ：Ｂｔｓ大断片ポリメラーゼ比）を調整することができる。反応温度を調整することもできる。次に、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）（７０２）に続いてランダムｎ−ｍｅｒ（例えば、ランダム６−ｍｅｒ、ランダム８−ｍｅｒ）（７０３）を（５’＞３’方向で）有するオリゴヌクレオチドを付加することができる（７０４）。ランダムｎ−ｍｅｒ領域は、以前に生成された一本鎖ＤＮＡの領域に結合することができる。例えば、結合は、高温で変性させ、続いて急速にクールダウンさせることにより行うことができ、これにより、ランダムｎ−ｍｅｒ領域に、ＮＥＭＤＡによって生成された一本鎖ＤＮＡに結合させることができる。場合によっては、ＤＮＡは、９８℃で７分間変性され、次いで１０℃まで急速にクールダウンされる。伸長および／または増幅を使用して、二本鎖ＤＮＡを生成することができる。例えば、酵素により（例えば、２０℃におけるＤＮＡポリメラーゼＩ処理によって）、平滑末端を生成することができる。これは、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）で終わる一端と、任意のニッキング酵素認識部位（例えば、任意のＣＣＤ部位）で終わる他端とをもたらすことができる。次に、例えば、サイズ選択（例えば、ゲル精製、キャピラリー電気泳動または他の断片分離技法による）によって、このような断片を精製することができる。場合によっては、標的断片は、約５０塩基対の長さである（アダプタ配列（例えば、Ｔ７アダプタ）＋標的Ｎ２０配列＋ニッキング酵素認識部位または相補体（例えば、ＨＧＧ））。次に、断片は、適切な距離を切断してニッキング酵素認識部位を除去するヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を含むアダプタにライゲートすることができる（７０５）。例えば、３ヌクレオチド長のニッキング酵素認識部位（例えば、ＣｖｉＰＩＩのＣＣＤ）のため、ＢａｅＩを使用することができる。次に、適切なヌクレアーゼ（例えば、ＢａｅＩ）を使用して、ヌクレアーゼ認識部位およびニッキング酵素認識部位を除去することができる（７０６）。次に、残る核酸配列（例えば、Ｎ２０部位）は、ガイドＲＮＡのための最終ステムループ配列にライゲートすることができる（７０７）。増幅（例えば、ＰＣＲ）を行うことができる。ガイドＲＮＡを生成することができる。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）標的配列を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質を向かわせるために使用することができる、ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を標的とするｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物が作製される。一部の実施形態では、このｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物の標的化配列は、表３（ＮＧＧ配列がプラス鎖に存在する場合）および表４（ＮＧＧ配列がマイナス鎖に存在する場合）の右から２番目の段に提示されている少なくとも２０ｎｔ配列を含むＤＮＡ配列によってコードされる。一部の実施形態では、ヒトミトコンドリアＤＮＡに対する特異性を有する、本明細書に提供されているｇＲＮＡ核酸の収集物は、複数のメンバーを含み、メンバーは、表３の右の段から２番目の段および／または表４の右から２番目の段に提示されている複数の標的化配列を含む。





























































































適用
本明細書に提供されるｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）およびｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物は、目的の標的配列の枯渇、分配、捕捉または濃縮；ゲノムワイド標識；ゲノムワイド編集；ゲノムワイド機能スクリーニング；およびゲノムワイド調節を含む、種々の適用に有用である。
一実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料における宿主核酸に対して選択的であるが、宿主由来の試料における非宿主核酸に対して選択的ではない。一実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料由来の非宿主核酸に対して選択的であるが、試料における宿主核酸に対して選択的ではない。一実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料における宿主核酸および非宿主核酸のサブセットの両方に対して選択的である。例えば、複合生体試料が、宿主核酸および２以上の非宿主生物由来の核酸を含む場合、ｇＲＮＡは、非宿主種のうち２以上に対して選択的であってよい。斯かる実施形態では、ｇＮＡは、目的外の配列を連続的に枯渇または分配するために使用される。例えば、ヒト由来の唾液は、ヒトＤＮＡと共に、２以上の細菌種のＤＮＡを含有するが、未知の病原生物のゲノム材料を含有する場合もある。斯かる実施形態では、ヒトＤＮＡおよび公知細菌へと向けられたｇＮＡを使用して、ヒトＤＮＡおよび公知細菌のＤＮＡを連続的に枯渇させ、これにより、未知の病原生物のゲノム材料を含む試料をもたらすことができる。
例示的な実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料から得られるヒト宿主ＤＮＡに対して選択的であるが、試料から同様に得られる未知の病原体（単数または複数）由来のＤＮＡとハイブリダイズしない。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された配列の枯渇および分配、非宿主核酸についての試料の濃縮、または試料における標的化された核酸の連続的な枯渇に有用であり、これらの方法は、試料から抽出された核酸を提供するステップと；（ｉ）本明細書に記載されているｇＮＡの収集物のうち任意の１種、および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された配列の枯渇および分配方法であって、試料から抽出された核酸を提供するステップであって、抽出された核酸が、枯渇および分配の一方のための目的の配列および標的化された配列を含むステップと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、試料における核酸を切断する条件下で、（ｉ）本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む方法に有用である。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、非宿主核酸についての試料の濃縮であって、宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、試料における宿主核酸を切断する条件下で、（ｉ）宿主核酸へと向けられた標的化配列を含む本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させ、これにより、宿主核酸の試料を枯渇させ、非宿主核酸の濃縮を可能にするステップとを含む濃縮に有用である。
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された核酸の連続的な枯渇のための一方法であって、宿主核酸および非宿主核酸を含む宿主由来の生体試料を提供するステップであって、非宿主核酸が、少なくとも１つの公知非宿主生物由来の核酸および未知の非宿主生物由来の核酸を含むステップと；（ｉ）宿主核酸へと向けられた本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体を提供するステップと；宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズするように構成されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体（例えば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体）と生体試料由来の核酸とを混合するステップであって、複合体の少なくとも一部分が、宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズし、宿主核酸の少なくとも一部分が切断されるステップと；少なくとも１つの公知非宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズするように構成されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と生体試料由来の残る核酸とを混合するステップであって、複合体の少なくとも一部分が、少なくとも１つの非宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズし、非宿主核酸の少なくとも一部分が切断されるステップと；未知の非宿主生物から残る核酸を単離し、さらなる解析に備えるステップとを含む方法に有用である。
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、細胞集団におけるゲノムワイドまたは標的化された機能的スクリーニングの実行に使用される。斯かる実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）のライブラリーまたはｇＮＡをコードするベクターは、ｇＮＡ指向性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質編集が、ゲノム全体にわたる配列またはゲノムの特異的領域に対して達成され得るような仕方で、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質と共に、トランスフェクションまたは当技術分野で公知の他の実験室技法により細胞集団に導入することができる。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＤＮＡとして導入され得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ｍＲＮＡとして導入され得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、タンパク質として導入され得る。例示的な一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、目的の核酸配列の選択的な捕捉および／または濃縮に使用される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、複数の核酸を含む試料を提供するステップと；（ｉ）本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む、標的核酸配列の捕捉に使用される。目的の配列が捕捉されると、さらにこれをライゲートして、例えば、配列決定ライブラリーを作製することができる。
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、（ａ）複数の核酸断片を含む試料を提供するステップと；（ｂ）（ｉ）本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質−ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９−ニッカーゼ）を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップであって、ｇＮＡが、核酸断片における標的化された目的の部位に対して相補的であり、これにより、標的化された目的の部位に複数のニック核酸断片を生成するステップと；（ｃ）ニック部位において核酸合成を開始させることができる酵素および標識されたヌクレオチドと複数のニック核酸断片とを接触させるステップであって、これにより、標的化された目的の部位に標識されたヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップとを含む、標的化された目的の部位における標識されたヌクレオチドの導入に使用される。
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、（ａ）複数のアダプタライゲート核酸を含む試料を提供するステップであって、核酸が、一端において第１のアダプタにライゲートされ、他端において第２のアダプタにライゲートされているステップと；（ｂ）複数の活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）を含むｇＮＡの収集物と試料とを接触させるステップであって、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）が、トランスポサーゼに融合されており、ｇＮＡが、核酸のサブセットに含有される標的化された目的の部位に対して相補的であり、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡトランスポサーゼ複合体（例えば、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡトランスポサーゼ複合体）が、複数の第３のアダプタをロードされており、一端に第１または第２のアダプタのいずれかを、他端に第３のアダプタを含む複数の核酸断片を生成するステップとを含む、目的の標的核酸配列の捕捉に使用される。一実施形態では、本方法は、第１または第２のアダプタおよび第３のアダプタ特異的ＰＣＲを使用して、ステップ（ｂ）の産物を増幅するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、細胞集団におけるゲノムワイドまたは標的化された活性化または抑圧の実行に使用される。斯かる実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）のライブラリーまたはｇＮＡをコードするベクターは、ｇＮＡ指向性の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の活性化または抑圧が、ゲノム全体にわたる配列においてまたはゲノムの特異的領域に対して達成され得るような仕方で、活性化因子またはリプレッサードメインに融合された触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質（触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質）と共に、トランスフェクションまたは当技術分野で公知の他の実験室技法により、細胞集団に導入され得る。一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質は、ＤＮＡとして導入され得る。一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質は、ｍＲＮＡとして導入され得る。一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質は、タンパク質として導入され得る。一部の実施形態では、ｇＮＡまたはｇＮＡをコードする核酸の収集物は、２種以上の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する特異性を呈する。例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。
一部の実施形態では、収集物は、Ｃａｓ９、ならびにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される１種または複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に対する特異性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、収集物は、例えば、異なるゲノムまたはゲノムの部分の標識および／または可視化における使用のための、異なる染色体領域の標識および／または可視化における使用のための、またはゲノムへのウイルス遺伝子／ゲノムの組込みの標識および／または可視化における使用のための、異なるフルオロフォアに融合された、触媒活性がない様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に対する特異性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡ（またはｇＮＡをコードする核酸）の収集物は、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質に対する特異性を有し、例えば、異なる種に由来する異なる目的の配列を標的とする。例えば、第１の種由来のゲノムを標的とする、ｇＮＡ（または斯かるｇＮＡをコードする核酸の集団から転写される）の収集物由来のｇＮＡの第１のサブセットは、先ず、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質メンバー（または操作されたバージョン）と混合することができ；第２の種由来のゲノムを標的とする、ｇＮＡ（または斯かるｇＮＡをコードする核酸の集団から転写される）の収集物由来のｇＮＡの第２のサブセットは、第２の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質メンバー（または操作されたバージョン）と混合することができる。一実施形態では、異なる目的の標的化された配列、例えば、異なる種のゲノムまたはある一種の異なる染色体が、異なる蛍光標識によって標識され得るように、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、異なるフルオロフォアと融合された、触媒活性がないバージョン（例えば、ｄＣａｓ９）であってよい。例えば、異なる染色体領域は、遺伝的転座の可視化のため、異なるｇＲＮＡ標的化ｄＣａｓ９−フルオロフォアによって標識することができる。例えば、異なるウイルスゲノムは、宿主ゲノムへの異なるウイルスゲノムの組込みの可視化のため、異なるｇＲＮＡ標的化ｄＣａｓ９−フルオロフォアによって標識することができる。別の実施形態では、異なる目的の標的化された配列、例えば、ゲノムの異なる染色体が、差次的に調節され得るように、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、活性化または抑圧ドメインのいずれかと融合されたｄＣａｓ９であってよい。別の実施形態では、異なる目的の標的化された配列、例えば、試料混合物内の異なるＤＮＡ配列が、差次的に単離され得るように、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、異なる抗体によって認識され得る異なるタンパク質ドメインと融合されたｄＣａｓ９であってよい。
本発明の例示的組成物
一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。そのような実施形態では、核酸はＤＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、例えばビオチンで標識することができる。ヌクレオチドは、抗体−コンジュゲート対の一部であってよい。
一実施形態では、核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を含む組成物であって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、ＤＮＡ断片およびｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を含む組成物であって、ｄＣａｓ９はトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。
一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体、およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、ニッカーゼＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。
一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＤＮＡが本明細書で提供される。例示的な実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＮｇＡｇｏである。
一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＤＮＡが本明細書で提供される。
一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＲＮＡが本明細書で提供される。
一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＲＮＡが本明細書で提供される。一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２を含む。
キットおよび製造品
本願は、アダプタ、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）、ｇＮＡ収集物（例えば、ｇＲＮＡ収集物）、ｇＮＡ収集物をコードする核酸分子その他に限定されない、本明細書に記載されている組成物のうち任意の１種または複数を含むキットを提供する。
例示的な一実施形態では、キットは、ｇＲＮＡのライブラリーとなるように転写することができるＤＮＡ分子の収集物を含み、ｇＲＮＡは、ヒトゲノムまたは他の供給源のＤＮＡ配列へと標的化される。
一実施形態では、キットは、ｇＮＡの収集物を含み、ｇＮＡは、ヒトゲノムまたは他の供給源のＤＮＡ配列へと標的化される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｇＮＡをコードする核酸の収集物のいずれかを含むキットが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているｇＮＡの収集物のいずれかを含むキットが、本明細書に提供される。
本願は、本明細書に記載されているｇＮＡおよびｇＮＡをコードする核酸の収集物を作製する方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書も提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている個々のｇＮＡおよびｇＮＡの収集物を作製する方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書を含むキットが、本明細書に提供される。
本明細書で生成されるｇＮＡ収集物と試料とを接触させる前後の情報をモニターするためのコンピュータソフトウェアも、本明細書に提供されている。例示的な一実施形態では、ソフトウェアは、オフターゲット標的化が生じないこと確実にするために、ｇＮＡ収集物を提供する前後の試料における非標的配列の存在量を算出および報告することができ、ソフトウェアは、試料へとｇＮＡ収集物を提供する前後の標的配列の存在量を比較することにより、標的化された枯渇／濃縮／捕捉／分配／標識／調節／編集の有効性をチェックすることができる。
以下の実施例は例示目的のために含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
Ｔ７プロモーターヒトＤＮＡライブラリーからのｇＲＮＡライブラリーの構築
Ｔ７プロモーターライブラリー構築
Ｓ２ Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器（Ｃｏｖａｒｉｓ）を８サイクル使用して、ヒトゲノムＤＮＡ（４００ｎｇ）を断片化して、２００〜３００ｂｐの長さの断片を得た。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を使用して、断片化されたＤＮＡを修復し、２５℃で３０分間インキュベートし、次いで７５℃で２０分間熱失活させた。Ｔ７プロモーターアダプタを作製するために、オリゴＴ７−１（５’ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ＊Ｔ＊Ａ＊ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧ３’、＊は、ホスホロチオエート骨格連結を表示）（配列番号４３９７）およびＴ７−２（配列５’Ｐｈｏｓ−ＣＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ３’）（配列番号４３９８）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで３０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。次に、Ｔ７プロモーター平滑アダプタ（総計１５ｐｍｏｌ）を、平滑末端化されたヒトゲノムＤＮＡ断片に添加し、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）と共に２５℃で３０分間インキュベートした（図１中の（２））。１０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６３℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）のため、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（ＮＥＢ）を使用して、２μＭオリゴＴ７−１によりライゲーションを増幅した。アガロースゲル電気泳動において少量のアリコートを泳動することにより、増幅を検証した。ＰＣＲ増幅された産物は、製造業者の説明書に従って０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
ＤＮＡの消化
ＰＣＲ増幅されたＴ７プロモーターＤＮＡ（消化につき総計２μｇ）を、１０μＬのＮＥＢバッファー２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ）における０．１μＬのＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ）により１０分間３７℃で消化し（図１中の（３））、次に、７５℃で２０分間熱失活させた。さらなる１０μＬのＮＥＢバッファー２と１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）を反応液に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした（図１中の（４））。ＤＮＡの酵素消化をアガロースゲル電気泳動によって検証した。製造業者の説明書に従って、０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を添加することにより、消化されたＤＮＡを回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
アダプタのライゲーションおよびＨＧＧの除去
次に、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を２０分間２５℃で使用して、ＤＮＡを平滑末端化し、続いて熱失活を７５℃で２０分間行った（図１中の（５））。
ＭｌｙＩアダプタを作製するために、オリゴＭｌｙＩ−１（配列５’＞３’、５’Ｐｈｏｓ−ＧＧＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＧ）（配列番号４３９９）およびＭｌｙＩ−２（配列５’＞３’、ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＣ）（配列番号４４００）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで３０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。次に、ＭｌｙＩアダプタ（総計１５ｐｍｏｌ）を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ平滑末端化ＤＮＡに添加し、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）と共に２５℃で３０分間インキュベートした（図１中の（６））。ライゲーションを７５℃で２０分間熱失活させ、次に、ＨＧＧモチーフが排除できるように、ＭｌｙＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）により１時間３７℃で消化した（図１中の（７））。次に、０．８×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して、消化物を浄化し、ＤＮＡを１０μＬの１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
ＳｔｌｇＲアダプタを作製するために、オリゴｓｔｌｇＲ（配列５’＞３’、５’Ｐｈｏｓ−ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＣ）（配列番号４４０１）およびｓｔｌｇＲｅｖ（配列５’＞３’、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）（配列番号４４０２）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで６０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。ＳｔｌｇＲアダプタ（総計５ｐｍｏｌ）を、ＨＧＧ除去ＤＮＡ断片に添加し、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）と共に２５℃で３０分間インキュベートした（図１中の（８））。次に、２μＭの両方のオリゴＴ７−１およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）（配列番号４４０３）を使用して、ライゲーションをＨｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（ＮＥＢ）と共にインキュベートし、２０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）を使用して増幅させた。アガロースゲル電気泳動において少量のアリコートを泳動することにより、増幅を検証した。ＰＣＲ増幅された産物は、製造業者の説明書に従って０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
次に、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写キット（ＮＥＢ）を使用して、ＰＣＲ産物のＴ７／ｇＲＵ増幅されたライブラリーを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用した。製造業者の説明書に従って、５００〜１０００ｎｇの鋳型を一晩３７℃でインキュベートした。ガイドライブラリーをｇＲＮＡへと転写するために、次のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物をアセンブルした：１０μＬの精製されたライブラリー（ほぼ５００ｎｇ）、６．５μＬのＨ２Ｏ、２．２５μＬのＡＴＰ、２．２５μＬのＣＴＰ、２．２５μＬのＧＴＰ、２．２５μＬのＵＴＰ、２．２５μＬの１０×反応バッファー（ＮＥＢ）および２．２５μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼミックス。反応液を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、ＲＮＡクリーンアップ（cleanup）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、１００μＬのＲＮａｓｅフリーの水により溶出し、定量化し、使用まで−２０℃で貯蔵した。
（実施例２）
インタクトなヒトゲノムＤＮＡからのｇＲＮＡライブラリーの構築
ＤＮＡの消化
ヒトゲノムＤＮＡ（図２中の（１）；消化につき総計２０μｇ）を、４０μＬのＮＥＢバッファー２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ）における０．１μＬのＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ）により１０分間３７℃で消化し、次いで７５℃で２０分間熱失活させた。さらなる４０μＬのＮＥＢバッファー２および１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）を反応液に添加し、３７℃で２０分間インキュベーションを行った（例えば、図２中の（２））。アガロースゲル電気泳動によって、少量のアリコートによりゲノムＤＮＡの断片化を検証した。０．３×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を添加し、２５℃で５分間インキュベートし、磁気スタンドにおいてビーズを捕捉し、上清を新しいチューブに移すことにより、２００〜６００ｂｐの間のＤＮＡ断片を回収した。６００ｂｐを下回るＤＮＡ断片は、このビーズ／ＤＮＡ比ではビーズに結合せず、上清中に残る。次に、０．７×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を上清に添加し（これは、２００ｂｐよりも長い全ＤＮＡ分子に結合し得る）、５分間結合させた。ビーズを磁気スタンドにおいて捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、風乾した。次に、ＤＮＡを１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。Ｑｂｉｔアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＤＮＡ濃度を決定した。
アダプタのライゲーション
Ｔ７／ＭｌｙＩアダプタを作製するために、オリゴＭｌｙＩ−１（配列５’＞３’、５’Ｐｈｏｓ−ＧＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＧ）（配列番号４４０４）およびＴ７−７（配列５’＞３’、ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ＊Ｔ＊Ａ＊ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣ、＊は、ホスホロチオエート骨格連結を表示）（配列番号４４０５）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで３０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。次に、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）を２５℃で３０分間使用して、精製された、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ／Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ消化ＤＮＡ（１００ｎｇ）を、１５ｐｍｏｌのＴ７／ＭｌｙＩアダプタにライゲートした（図２中の（３））。次に、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（ＮＥＢ）、ならびに２μＭの両方のオリゴＴ７−１７（ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ＊Ｔ＊Ａ＊ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ、＊は、ホスホロチオエート骨格連結を表示）（配列番号４４０６）およびＦｌａｇ（配列５’＞３’、ＣＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡ）（配列番号４４０７）を使用して、１０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）によってライゲーションを増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの収量を増加させ、使用したＹ字型アダプタの性質を考慮すると、常に、ＨＧＧ部位に対し遠位に付加されたＴ７プロモーターと、ＨＧＧモチーフの隣に付加されたＭｌｙＩ部位をもたらした（図２中の（４））。
次に、ＰＣＲ産物をＭｌｙＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）により１時間３７℃で消化し、７５℃で２０分間熱失活させた（図２中の（５））。その後に、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）を２５℃で３０分間使用して、５ｐｍｏｌのアダプタＳｔｌｇＲ（実施例１における）をライゲートした（図２中の（６））。次に、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（ＮＥＢ）、２μＭの両方のオリゴＴ７−７およびｇＲＵ（実施例１における）ならびに２０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）を使用したＰＣＲによって、ライゲーションを増幅した。アガロースゲル電気泳動において少量のアリコートを泳動することにより、増幅を検証した。ＰＣＲ増幅された産物は、製造業者の説明書に従って０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
次に、実施例１に記載されている通り、試料をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用した。
（実施例３）
ＣｖｉＰＩＩによる直接的切断
３０μｇのヒトゲノムＤＮＡを、２ユニットのＮｔＣｖｉＰＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により１時間３７℃で消化し、続いて、７５℃で２０分間熱失活を行った。断片分析計装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、断片のサイズを２００〜１，０００塩基対であると検証した。１００ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１００μＭ ｄＮＴＰを添加し、１２℃で３０分間インキュベートすることにより、５’または３’突出末端（例えば、図３に示す通り）を平滑末端に変換した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用して、ＤＮＡを回収し、２０μＬ溶出バッファー中に溶出した。次に、ＤＮＡを、ＭｌｙＩアダプタ（例えば、実施例４を参照）またはＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ（例えば、実施例４を参照）またはＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ（例えば、実施例５を参照）にライゲートした。
（実施例４）
ＭｌｙＩアダプタの使用
４０μＬの水において２μモルのＭｌｙＩ Ａｄ１およびＭｌｙ Ａｄ２を組み合わせることにより、アダプタＭｌｙＩを作製した。４０μＬの水において２μモルのオリゴＢｓＭｍ−Ａｄ１および２μモルのオリゴＢｓＭｍ−Ａｄ２を組み合わせることにより、アダプタＢｓａＸＩ／ＭｍｅＩを作製した。１００μＬの水において１．５μモルのＴ７−Ａｄ１およびＴ７−Ａｄ２オリゴを組み合わせることにより、Ｔ７アダプタを作製した。１００μＬの水において１．５μモルのｇＲ−ｔｏｐおよびｇＲ−ｂｏｔオリゴを組み合わせることにより、ステムループアダプタを作製した。全ての事例において、混合後に、アダプタを９８℃で３分間加熱し、次いでサーマルサイクラーにおいて１℃／分の冷却速度で室温まで冷却した。
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＣＣＤ平滑末端を含有するＤＮＡ（先のセクションから）を５０ｐモルのアダプタＭｌｙＩにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、小型の（＜１００ヌクレオチド）ＤＮＡおよびＭｌｙＩアダプタ二量体を排除する。
次に、２０ユニットのＭｌｙＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。０．６×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを３０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、消化物からＤＮＡを回収した。
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、精製されたＤＮＡを５０ｐモルのアダプタＢｓａＸＩ／ＭｍｅＩにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次に、２０ユニットのＭｍｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および４０ｐｍｏｌ／μＬのＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を添加して３７℃で１時間放置し、続いて７５℃で２０分間熱失活させることにより、ＤＮＡを消化した。次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを３０ｐモルのＴ７アダプタにライゲートした。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬのバッファー４中に溶出し、次いで２０ユニットのＢｓａＸＩにより１時間３７℃で消化した。１５ｐモルのステムループアダプタを添加し、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用することにより、ガイドＲＮＡステムループ配列を付加した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬの溶出バッファー中に溶出し、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ１およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）（配列番号４４１９）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間を３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲクリーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
（実施例５）
ＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタの使用
４０μＬの水において２μモルのＢＥ Ａｄ１およびＢＥ Ａｄ２を組み合わせることにより、アダプタＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉを作製した。１００μＬの水において１．５μモルのＴ７−Ａｄ３およびＴ７−Ａｄ４オリゴを組み合わせることにより、Ｔ７−Ｅアダプタを作製した。全ての事例において、混合後に、アダプタを９８℃で３分間加熱し、次いでサーマルサイクラーにおいて１℃／分の冷却速度で室温まで冷却した。
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＣＣＤ平滑末端を含有するＤＮＡ（先のセクションから）を５０ｐモルのアダプタＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次に、回収されたＤＮＡを２０ユニットのＰｍｅＩにより３０分間３７℃で消化し；次いで、１．２×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、小型の（＜１００ヌクレオチド）ＤＮＡおよびＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ多量体を排除する。
次に、２０ユニットのＥｃｏＰ１５Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１ｍＭ ＡＴＰを添加して３７℃で１時間放置し、続いて７５℃で２０分間熱失活させることにより、ＤＮＡを消化した。次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを３０ｐモルのＴ７−Ｅアダプタにライゲートした。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬのバッファー４中に溶出した。
次に、２０ユニットのＢａｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、４０ｐｍｏｌ／μＬのＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
次に、２０μＬのｓｓライゲーションバッファー（１０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７、２５℃で）における２０ユニットのリガーゼ、２０ｐｍｏｌのｓｔｌｇＲオリゴを添加し、６５℃で１時間インキュベートし、続いて９０℃で５分間熱失活させることにより、熱安定性５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、回収されたＤＮＡをｓｔｌｇＲオリゴにライゲートした。次に、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ３およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）（配列番号４４１９）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間を３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲクリーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
（実施例６）
ＮＥＭＤＡ方法
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して、ＮＥＭＤＡ（ニッキングエンドヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ増幅）を実行した。０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、４０ユニットのＢｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼおよび０．１ユニットのＮｔＣｖｉＰＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した１００μＬのサーモ（thermo）ポリメラーゼバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）において、ＤＮＡをサーマルサイクラーにおいて５５℃で４５分間、続いて６５℃で３０分間、最後に８０℃で２０分間インキュベートした。
次に、２００ｐモルのＴ７−ＲＮＤ８オリゴ（配列５’＞３’、ｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇｎｎｎｎｎｎｎｎ）（配列番号４４２０）を補充した３００μＬのバッファー４でＤＮＡを希釈し、９８℃で１０分間煮沸し、続いて１０℃まで５分間急速に冷却した。次に、反応液に、４０ユニットのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび０．１ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充し、室温で２０分間インキュベートし、続いて７５℃で２０分間熱失活させた。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、３０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを５０ｐモルのアダプタＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次に、回収されたＤＮＡを２０ユニットのＰｍｅＩにより３０分間３７℃で消化し；次いで、１．２×Ｋａｐａ ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、小型の（＜１００ヌクレオチド）ＤＮＡおよびＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ多量体を排除する。
次に、２０ユニットのＢａｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、４０ｐｍｏｌ／μＬのＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
次に、２０μＬのｓｓライゲーションバッファー（１０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７、２５℃で）における２０ユニットのリガーゼ、２０ｐｍｏｌのｓｔｌｇＲオリゴを添加し、６５℃で１時間インキュベートし、続いて９０℃で５分間熱失活させることにより、熱安定性５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、回収されたＤＮＡをｓｔｌｇＲオリゴにライゲートした。次に、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ３（配列５’＞３’、ｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇ）（配列番号１２）およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）（配列番号４４１９）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間を３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲクリーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。

Claims (235)

  1. 核酸の収集物であって、前記収集物中の複数の前記核酸が、
    ａ．調節領域を含む第１のセグメントと、
    ｂ．標的化配列をコードする第２のセグメントと、
    ｃ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントと
    を含み、前記収集物中の前記核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する、核酸の収集物。
  2. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１に記載の収集物。
  3. 前記第２のセグメントのサイズが、前記核酸の収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ変動する、請求項１に記載の収集物。
  4. 前記収集物中の前記第２のセグメントの少なくとも１０％が、２１ｂｐを超える、請求項１に記載の収集物。
  5. 前記第２のセグメントのサイズが、２０ｂｐではない、請求項１に記載の収集物。
  6. 前記第２のセグメントのサイズが、２１ｂｐではない、請求項１に記載の収集物。
  7. 前記核酸の収集物が、ＤＮＡの収集物である、請求項１に記載の収集物。
  8. 前記第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、請求項７に記載の収集物。
  9. 前記第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、請求項７に記載の収集物。
  10. 前記第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、請求項７に記載の収集物。
  11. 前記第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、請求項７に記載の収集物。
  12. 前記調節領域が、転写因子に結合することができる領域である、請求項１に記載の収集物。
  13. 前記調節領域が、プロモーターを含む、請求項１に記載の収集物。
  14. 前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される、請求項１３に記載の収集物。
  15. 前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、請求項１に記載の収集物。
  16. 前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、請求項１に記載の収集物。
  17. 前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている、請求項１に記載の収集物。
  18. 前記第２のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される、請求項１に記載の収集物。
  19. 少なくとも１０２個の特異な核酸分子を含む、請求項１に記載の収集物。
  20. 前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、請求項１に記載の収集物。
  21. 生物のゲノムにわたって約１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む、請求項１に記載の収集物。
  22. 前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、請求項２０に記載の収集物。
  23. 前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、請求項２０に記載の収集物。
  24. 前記第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の収集物。
  25. 前記第３のセグメントの配列が、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項１に記載の収集物。
  26. 前記第３のセグメントの配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、請求項１に記載の収集物。
  27. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、請求項１に記載の収集物。
  28. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、請求項１に記載の収集物。
  29. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、請求項２に記載の収集物。
  30. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、請求項２に記載の収集物。
  31. 前記第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の収集物。
  32. 前記収集物の複数の第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードし、前記収集物の複数の前記第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする、請求項１に記載の収集物。
  33. 前記収集物の前記第３のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列をコードする、請求項１に記載の収集物。
  34. 核酸の収集物であって、前記収集物中の複数の前記核酸が、
    ａ．調節領域を含む第１のセグメントと、
    ｂ．標的化配列をコードする第２のセグメントであって、そのサイズが２１ｂｐを超える第２のセグメントと、
    ｃ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントと
    を含む、核酸の収集物。
  35. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項３４に記載の収集物。
  36. 前記収集物中の前記核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する、請求項３４に記載の収集物。
  37. 前記第２のセグメントのサイズが、前記核酸の収集物にわたって２２〜２５０ｂｐ変動する、請求項３４に記載の収集物。
  38. 前記収集物中の前記第２のセグメントの少なくとも１０％が、３０ｂｐを超える、請求項３４に記載の収集物。
  39. 前記核酸の収集物が、ＤＮＡの収集物である、請求項３４に記載の収集物。
  40. 前記第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、請求項３９に記載の収集物。
  41. 前記第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、請求項３９に記載の収集物。
  42. 前記第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、請求項３９に記載の収集物。
  43. 前記第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、請求項３９に記載の収集物。
  44. 前記調節領域が、転写因子に結合することができる領域である、請求項３４に記載の収集物。
  45. 前記調節領域が、プロモーターを含む、請求項３４に記載の収集物。
  46. 前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される、請求項４５に記載の収集物。
  47. 前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、請求項３４に記載の収集物。
  48. 前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、請求項３４に記載の収集物。
  49. 前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている、請求項３４に記載の収集物。
  50. 前記第２のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される、請求項３４に記載の収集物。
  51. 少なくとも１０２個の特異な核酸分子を含む、請求項３４に記載の収集物。
  52. 生物のゲノムにわたって約１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む、請求項３３に記載の収集物。
  53. 前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、請求項３４に記載の収集物。
  54. 前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、請求項５３に記載の収集物。
  55. 前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、請求項５３に記載の収集物。
  56. 前記第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む、請求項３４に記載の収集物。
  57. 前記第３のセグメントが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項３４に記載の収集物。
  58. 前記第３のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、請求項３４に記載の収集物。
  59. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、請求項３４に記載の収集物。
  60. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、請求項３４に記載の収集物。
  61. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、請求項３５に記載の収集物。
  62. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、請求項３５に記載の収集物。
  63. 前記第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む、請求項３４に記載の収集物。
  64. 前記収集物の複数の第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードし、前記収集物の複数の前記第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする、請求項３４に記載の収集物。
  65. 前記収集物の前記第３のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列をコードする、請求項３４に記載の収集物。
  66. ａ．標的化配列を含む第１のＲＮＡセグメントと、
    ｂ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のＲＮＡセグメントと
    を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の収集物であって、前記収集物中の前記ｇＲＮＡの少なくとも１０％のサイズが変動する、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の収集物。
  67. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項６６に記載の収集物。
  68. 前記第１のセグメントのサイズが、前記ｇＲＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ変動する、請求項６６に記載の収集物。
  69. 前記収集物中の前記第１のセグメントの少なくとも１０％が、２１ｂｐを超える、請求項６６に記載の収集物。
  70. 前記第１のセグメントのサイズが、２０ｂｐではない、請求項６６に記載の収集物。
  71. 前記第１のセグメントのサイズが、２１ｂｐではない、請求項６６に記載の収集物。
  72. 前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、請求項６６に記載の収集物。
  73. 前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、請求項６６に記載の収集物。
  74. 前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている、請求項６６に記載の収集物。
  75. 前記第１のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される配列によってコードされるＲＮＡである、請求項６６に記載の収集物。
  76. 少なくとも１０２個の特異なｇＲＮＡを含む、請求項６６に記載の収集物。
  77. 前記ｇＲＮＡが、シトシン、グアニンおよびアデニンを含む、請求項６６に記載の収集物。
  78. 前記ｇＲＮＡのサブセットが、チミンをさらに含む、請求項７７に記載の収集物。
  79. 前記ｇＲＮＡのサブセットが、ウラシルをさらに含む、請求項７７に記載の収集物。
  80. 前記第１のセグメントが、目的の標的ゲノム配列に対し少なくとも８０％相補的である、請求項６６に記載の収集物。
  81. 前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、請求項６６に記載の収集物。
  82. 前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、請求項６６に記載の収集物。
  83. 前記第２のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列を含む、請求項６６に記載の収集物。
  84. 前記第２のセグメントの配列が、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含む、請求項６６に記載の収集物。
  85. 前記第２のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項６６に記載の収集物。
  86. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、請求項６６に記載の収集物。
  87. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、請求項６６に記載の収集物。
  88. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、請求項６７に記載の収集物。
  89. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼならびにそれらの操作されたバージョンからなる群から選択される、請求項６７に記載の収集物。
  90. 前記第２のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列を含む、請求項６６に記載の収集物。
  91. 前記収集物中の前記ｇＲＮＡの少なくとも１０％が、それらの５’末端の配列が変動する、請求項６６に記載の収集物。
  92. 生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む、請求項６６に記載の収集物。
  93. 前記収集物の複数の第２のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、前記収集物の複数の前記第２のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む、請求項６６に記載の収集物。
  94. 前記収集物の前記第２のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列を含む、請求項６６に記載の収集物。
  95. 前記収集物の複数の前記ｇＲＮＡが、基材に付着された、請求項６６に記載の収集物。
  96. 前記収集物の複数の前記ｇＲＮＡが、標識を含む、請求項６６に記載の収集物。
  97. 前記収集物の前記複数のｇＲＮＡが、異なる標識を含む、請求項９６に記載の収集物。
  98. ａ．調節領域を含む第１のセグメントと、
    ｂ．標的化配列をコードする第２のセグメントであって、前記標的化配列が、３０ｂｐを超える、第２のセグメントと、
    ｃ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする核酸をコードする第３のセグメントと
    を含む核酸。
  99. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項９８に記載の核酸。
  100. ＤＮＡである、請求項９８に記載の核酸。
  101. 前記第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、請求項９８に記載の核酸。
  102. 前記第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、請求項９８に記載の核酸。
  103. 前記第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、請求項９８に記載の核酸。
  104. 前記第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、請求項９８に記載の核酸。
  105. 前記調節領域が、転写因子に結合することができる領域である、請求項９８に記載の核酸。
  106. 前記調節領域が、プロモーターを含む、請求項９８に記載の核酸。
  107. 前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される、請求項１０６に記載の収集物。
  108. 前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、請求項９８に記載の核酸。
  109. 前記標的化配列が、豊富なまたは反復性ＤＮＡへと向けられている、請求項９８に記載の核酸。
  110. 前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている、請求項９８に記載の核酸。
  111. 前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、請求項９８に記載の収集物。
  112. 目的の標的ゲノム配列が、ＰＡＭ配列の５’上流にある、請求項１１１に記載の核酸。
  113. 前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、請求項１１２に記載の核酸。
  114. 前記第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む、請求項９８に記載の核酸。
  115. 前記第３のセグメントの配列が、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項９８に記載の核酸。
  116. 前記第３のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、請求項９８に記載の核酸。
  117. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、請求項９８に記載の核酸。
  118. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、請求項９８に記載の核酸。
  119. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、請求項９９に記載の核酸。
  120. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、請求項９９に記載の核酸。
  121. 前記第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む、請求項９８に記載の核酸。
  122. ａ．標的化配列を含む第１のセグメントであって、そのサイズが３０ｂｐを超える第１のセグメントと
    ｂ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のセグメントと
    を含むガイドＲＮＡ。
  123. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  124. アデニン、グアニンおよびシトシンを含む、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  125. チミンをさらに含む、請求項１２３に記載のガイドＲＮＡ。
  126. ウラシルをさらに含む、請求項１２３に記載のガイドＲＮＡ。
  127. 前記第１のＲＮＡセグメントのサイズが、３０〜２５０ｂｐの間である、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  128. 前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  129. 前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  130. 前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ ＤＮＡ、ＬＩＮＥ ＤＮＡまたはＳＴＲ ＤＮＡへと向けられている、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  131. 前記第１のセグメントが、目的の標的ゲノム配列に対し少なくとも８０％相補的である、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  132. 前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  133. 前記第２のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列を含む、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  134. 前記第２のセグメントの配列が、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含む、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  135. 前記第２のセグメントの配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  136. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  137. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  138. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、請求項１２３に記載のガイドＲＮＡ。
  139. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼ、ならびにそれらの操作されたバージョンからなる群から選択される、請求項１２３に記載のガイドＲＮＡ。
  140. 前記第２のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列である、請求項１２２に記載のガイドＲＮＡ。
  141. Ｃａｓ９タンパク質と、請求項１２２に記載のｇＲＮＡとを含む複合体。
  142. 試料における標的化された配列の枯渇および分配、非宿主核酸についての試料の濃縮、または試料における標的化された核酸の連続的な枯渇のための方法であって、
    ａ．試料から抽出された核酸を提供するステップと、
    ｂ．（ｉ）請求項６６に記載のｇＲＮＡの収集物、および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複数の複合体と前記試料とを接触させるステップと
    を含む方法。
  143. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を含む、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９を含む、請求項１４３に記載の方法。
  145. 核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
    ａ．ＰＡＭ配列に対し５’にある目的の配列および反対の鎖におけるその逆相補的配列をそれぞれ含む二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、
    ｂ．前記二本鎖ＤＮＡ分子において酵素消化反応を実行するステップであって、切断が、前記ＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列に生成されるが、前記二本鎖ＤＮＡから前記ＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列を完全に除去しないステップと、
    ｃ．認識配列を含むアダプタをステップ（ｂ）の結果生じたＤＮＡ分子にライゲートするステップと、
    ｄ．ステップ（ｃ）の前記認識配列を認識する制限酵素とステップ（ｃ）の前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＰＡＭ配列に対してすぐ接して５’にある平滑末端化された二本鎖切断を含むＤＮＡ断片を生成し、それによって、前記ＰＡＭ配列および酵素認識部位を含有する前記アダプタを除去するステップと、
    ｅ．ステップ（ｄ）の結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
    を含む方法。
  146. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記収集物の出発ＤＮＡ分子が、前記ＰＡＭ配列に対し５’にある前記目的の配列の上流の調節配列をさらに含む、請求項１４５に記載の方法。
  148. 前記調節配列が、プロモーターを含む、請求項１４６に記載の方法。
  149. 前記プロモーターが、Ｔ７、Ｓｐ６またはＴ３配列を含む、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡ、インタクトなＤＮＡまたは剪断されたＤＮＡである、請求項１４５に記載の方法。
  151. 前記ゲノムＤＮＡが、ヒト、マウス、鳥類、魚類、植物、昆虫、細菌またはウイルスである、請求項１５０に記載の方法。
  152. 標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、少なくとも２２ｂｐである、請求項１４５に記載の方法。
  153. 標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、１５〜２５０ｂｐのサイズ範囲である、請求項１４５に記載の方法。
  154. 前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、請求項１４５に記載の方法。
  155. 前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、請求項１４５に記載の方法。
  156. ステップ（ｂ）が、（１）ＣＣＤ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位においてニックを入れられるステップと、（２）エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、ＨＧＧおよび／またはＣＣＤ配列由来の残っているヌクレオチドが取り残されるステップとをさらに含む、請求項１４５に記載の方法。
  157. ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の前記認識配列を認識する前記制限酵素により切断する前のステップ（ｃ）由来の、前記アダプタがライゲートされたＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅をさらに含み、ＰＣＲ後に、前記認識配列が、前記ＰＡＭ配列の３’に位置し、調節配列が、前記ＰＡＭ配列の５’遠位端に位置する、請求項１４５に記載の方法。
  158. ステップ（ｂ）の酵素反応が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素およびＴ７エンドヌクレアーゼＩ酵素の使用を含む、請求項１４５に記載の方法。
  159. ライゲートされるべき前記アダプタが、オーバーハングを含まない場合、ステップ（ｃ）が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端反応をさらに含む、請求項１４５に記載の方法。
  160. ステップ（ｃ）の前記アダプタが、（１）前記アダプタがＹ字型であり、オーバーハングを含む場合、一方の鎖に制限酵素認識配列を、他方の鎖に調節配列を含む二本鎖である；または（２）前記アダプタがＹ字型でない場合、両方の鎖にパリンドローム酵素認識配列を有する、のいずれかである、請求項１４５に記載の方法。
  161. ステップ（ｄ）の前記制限酵素が、ＭｌｙＩである、請求項１４５に記載の方法。
  162. ステップ（ｄ）が、ＸｈｏＩ酵素と前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップをさらに含む、請求項１４５に記載の方法。
  163. ステップ（ｅ）において、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項１４５に記載の方法。
  164. 前記目的の標的化された配列が、生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、請求項１４５に記載の方法。
  165. 核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
    ａ．目的の配列、ＮＧＧ部位およびその相補体ＣＣＮ部位をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、
    ｂ．ＣＣＮ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＮＧＧ部位に対して５’に目的の配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位にニックを入れられるステップと、
    ｃ．エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、前記断片が、末端オーバーハングを含むステップと、
    ｄ．５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性がない酵素と前記二本鎖ＤＮＡ断片とを接触させるステップであって、前記二本鎖ＤＮＡ断片を平滑末端化し、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の平滑末端化二本鎖断片を生成するステップと、
    ｅ．末端ＮＧＧ部位を切断する酵素とステップｄの前記平滑末端化二本鎖断片とを接触させるステップと、
    ｆ．ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
    を含む方法。
  166. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、前記ＮＧＧ部位の５’上流に調節配列を有する、請求項１６５に記載の方法。
  168. 調節配列が、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３配列を含む、請求項１６６に記載の方法。
  169. ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む、請求項１５３に記載の方法。
  170. 目的の配列をそれぞれ含む前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡの剪断された断片を含む、請求項１６５に記載の方法。
  171. 前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物、原核生物、真核生物、鳥類、細菌またはウイルスである、請求項１７０に記載の方法。
  172. ステップ（ａ）における前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、少なくとも５００ｂｐである、請求項１６５に記載の方法。
  173. ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素である、請求項１６５に記載の方法。
  174. ステップｃにおける前記酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、請求項１６５に記載の方法。
  175. ステップｄにおける前記酵素が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１６５に記載の方法。
  176. ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項１６５に記載の方法。
  177. 前記ステップｅが、ＭｌｙＩ認識部位を保有するアダプタをライゲートするステップと、ＭｌｙＩ酵素により消化するステップとを追加で含む、請求項１６５に記載の方法。
  178. 前記目的の配列が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、請求項１６５に記載の方法。
  179. 標的化配列をコードするＤＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
    ａ．ＮＧＧおよびＣＣＮ部位を含む複数の目的の配列を含むゲノムＤＮＡを提供するステップと、
    ｂ．前記ゲノムＤＮＡにニックを作製することができる酵素と前記ゲノムＤＮＡとを接触させるステップであって、それによって、ＣＣＮ部位にニックを入れられたニックゲノムＤＮＡを生成するステップと、
    ｃ．エンドヌクレアーゼと前記ニックゲノムＤＮＡとを接触させるステップであって、それによって、オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、
    ｄ．ステップｃ由来のオーバーハングを有する前記ＤＮＡをＹ字型アダプタにライゲートステップであって、これによって、前記ＮＧＧ部位の３’のみに制限酵素認識配列を、前記目的の配列の５’に調節配列を導入するステップと、
    ｅ．前記酵素認識配列を保有する前記アダプタと共に前記ＮＧＧ部位を切断除去する酵素とステップｄ由来の産物とを接触させるステップと、
    ｆ．ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた目的の配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
    を含む方法。
  180. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１７９に記載の方法。
  181. 前記ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む、請求項１７９に記載の方法。
  182. 前記調節配列が、プロモーター配列を含む、請求項１７９に記載の方法。
  183. 前記プロモーター配列が、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３配列を含む、請求項１８２に記載の方法。
  184. 前記ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡの剪断された断片である、請求項１７９に記載の方法。
  185. 前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物、原核生物、真核生物またはウイルスである、請求項１７９に記載の方法。
  186. 前記断片が、少なくとも２００ｂｐである、請求項１７９に記載の方法。
  187. ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素である、請求項１７９に記載の方法。
  188. ステップｃにおける前記酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、請求項１７９に記載の方法。
  189. ステップｄが、前記アダプタがライゲートされたＤＮＡのＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項１７９に記載の方法。
  190. ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項１７９に記載の方法。
  191. ステップｅにおいてＮＧＧ部位を除去する前記酵素が、ＭｌｙＩである、請求項１７９に記載の方法。
  192. 前記収集物の前記目的の標的が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、請求項１７９に記載の方法。
  193. 請求項１に記載の核酸の収集物を含むキット。
  194. 請求項３４に記載の核酸の収集物を含むキット。
  195. 請求項６６に記載のガイドＲＮＡの収集物を含むキット。
  196. ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
    ａ．供給源試料における豊富な細胞を得るステップと、
    ｂ．前記豊富な細胞から核酸を収集するステップと、
    ｃ．前記核酸からガイド核酸（ｇＮＡ）の収集物を調製するステップと
    を含む方法。
  197. 前記豊富な細胞が、前記供給源試料における１または複数の最も豊富な細菌種由来の細胞を含む、請求項１９６に記載の方法。
  198. 前記豊富な細胞が、２以上の種由来の細胞を含む、請求項１９６に記載の方法。
  199. 前記豊富な細胞が、ヒト細胞を含む、請求項１９６に記載の方法。
  200. 前記豊富な細胞が、動物細胞を含む、請求項１９６に記載の方法。
  201. 前記豊富な細胞が、植物細胞を含む、請求項１９６に記載の方法。
  202. 前記豊富な細胞が、細菌細胞を含む、請求項１９６に記載の方法。
  203. ｇＮＡの前記ライブラリーと核酸ガイド化ヌクレアーゼとを接触させるステップであって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を形成するステップをさらに含む、請求項１９６に記載の方法。
  204. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を使用するステップをさらに含み、標的部位において標的核酸を切断し、前記ｇＮＡが、前記標的部位に対して相補的である、請求項２０３に記載の方法。
  205. 前記標的核酸が、前記供給源試料に由来する、請求項２０４に記載の方法。
  206. 前記標的核酸の種が、前記供給源試料の種と同じである、請求項２０４に記載の方法。
  207. 前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、ヒトである、請求項２０６に記載の方法。
  208. 前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、動物である、請求項２０６に記載の方法。
  209. 前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、植物である、請求項２０６に記載の方法。
  210. 標的化配列をそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
    ａ．供給源ＤＮＡを得るステップと、
    ｂ．ニッキング酵素認識部位においてニッキング酵素により前記供給源ＤＮＡにニックを入れるステップであって、これによって、近位ニックに二本鎖切断を生成するステップと、
    ｃ．前記二本鎖切断のオーバーハングを修復するステップであって、これによって、（ｉ）標的化配列および（ｉｉ）前記ニッキング酵素認識部位を含む二本鎖断片を生成するステップと
    を含む方法。
  211. 標的化配列をそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
    ａ．供給源ＤＮＡを得るステップと、
    ｂ．ニッキング酵素認識部位においてニッキング酵素により前記供給源ＤＮＡにニックを入れるステップであって、これによって、ニックを生成するステップと、
    ｃ．前記ニックから新しい鎖を合成するステップであって、これにより、標的化配列を含む前記供給源ＤＮＡの一本鎖断片を生成するステップと
    を含む方法。
  212. 前記一本鎖断片から前記標的化配列を含む二本鎖断片を生成するステップをさらに含む、請求項２１１に記載の方法。
  213. 前記二本鎖断片を生成するステップが、ランダムプライミングおよび伸長を含む、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記ランダムプライミングが、ランダムｎ−ｍｅｒ領域およびプロモーター領域を含むプライマーにより行われる、請求項２１３に記載の方法。
  215. 前記ランダムｎ−ｍｅｒ領域が、ランダムヘキサマー領域である、請求項２１４に記載の方法。
  216. 前記ランダムｎ−ｍｅｒ領域が、ランダムオクタマー領域である、請求項２１４に記載の方法。
  217. 前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーター領域である、請求項２１４に記載の方法。
  218. ヌクレアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ認識部位核酸を前記二本鎖断片にライゲートするステップをさらに含む、請求項２１０または２１２に記載の方法。
  219. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記ニッキング酵素認識部位の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する、請求項２１８に記載の方法。
  220. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＭｌｙＩ認識部位である、請求項２１９に記載の方法。
  221. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＢａｅＩ認識部位である、請求項２１９に記載の方法。
  222. 前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含み、これによって、前記二本鎖断片から前記ニッキング酵素認識部位を除去する、請求項２１９に記載の方法。
  223. 前記二本鎖断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位核酸にライゲートするステップをさらに含む、請求項２２２に記載の方法。
  224. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位が、ガイドＲＮＡステムループ配列を含む、請求項２２３に記載の方法。
  225. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記標的化配列の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する、請求項２１８に記載の方法。
  226. 前記標的化配列の前記長さが、２０塩基対である、請求項２２５に記載の方法。
  227. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＭｍｅＩ認識部位である、請求項２２５に記載の方法。
  228. 前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含む、請求項２２５に記載の方法。
  229. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記標的化配列の長さプラス前記ニッキング酵素認識部位の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する、請求項２１８に記載の方法。
  230. 前記標的化配列の前記長さプラス前記ニッキング酵素認識部位の長さが、２３塩基対である、請求項２２９に記載の方法。
  231. 前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位である、請求項２２９に記載の方法。
  232. 前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含む、請求項２２９に記載の方法。
  233. 前記二本鎖断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位核酸にライゲートするステップをさらに含む、請求項２１２に記載の方法。
  234. 前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位が、ガイドＲＮＡステムループ配列を含む、請求項２３３に記載の方法。
  235. 請求項１４５、１６５、１７９、１９６、２１０または２１１に記載の方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書を含むキット。
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