JP2012522489A - 酵素を使用するｄｎａにおけるランダム二本鎖切断 - Google Patents

Abstract

非特異的ヌクレアーゼとＴ７エンドＩ突然変異体とを１：２００未満の単位比で含む酵素調製物を記載する。この酵素調製物は、ＤＮＡ配列決定に適したサイズの二本鎖ＤＮＡ断片を製造するために使用されうる。該断片の末端は、必要に応じて、該二本鎖ＤＮＡ断片の一方の鎖にアダプターまたは個々のヌクレオチドを連結するために容易に修飾されうる。

Description

より小さい異なるサイズの断片へのゲノムＤＮＡの切断は多数の配列決定技術における重要な段階である。現在の機械的断片化方法、例えば音波処理、適応合焦音響処理（ａｄａｐｔｉｖｅ−ｆｏｃｕｓｅｄ ａｃｏｕｓｔｉｃｓ）または噴霧化は、塩基切断の優先性を伴うことなくＤＮＡ断片を生成する。しかし、これらの方法は、ホスホジエステル結合以外の部位でＤＮＡを損傷する可能性を有し、酵素方法の場合より低いＤＮＡ回収効率を有する。一方、特異的認識配列を有する制限酵素に基づく方法のような酵素方法は、該認識配列の出現頻度に応じて大きく又は小さくなりうる一定の特異的サイズの断片を生成する。これまでのところ、非特異的ヌクレアーゼに関する研究は、認識および切断に必要な特異的配列は存在しないものの、これらの酵素が切断部位における或る塩基に対する優先性を示すことを示している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１３）：３０１５−２７（１９８１）；ＨｅｒｒｅｒａおよびＣｈａｉｒｅｓ，Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６（２）：４０５−１１（１９９４））。

Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１３）：３０１５−２７（１９８１） ＨｅｒｒｅｒａおよびＣｈａｉｒｅｓ，Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６（２）：４０５−１１（１９９４）

要旨
本発明の１つの実施形態においては、非特異的ヌクレアーゼおよびＴ７エンドＩ突然変異体を１：２００未満の単位比で含む調製物を提供する。１つの具体例においては、該非特異的ヌクレアーゼはビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）（Ｖｖｎ）ヌクレアーゼであり、これはＱ６９において突然変異を有する。

本発明のもう１つの実施形態においては、関心のあるＤＮＡを、非特異的ヌクレアーゼおよびＴ７エンドＩ突然変異体を１：２００未満の単位比で含有する調製物と混合することを含む、配列決定に適した、大きなＤＮＡからの断片の製造方法を提供する。該大きなＤＮＡを、配列決定に適したサイズの断片に切断する。直前に記載されているとおり、該方法において使用する非特異的ヌクレアーゼの一例はＶｖｎヌクレアーゼ、より詳細には、増加した特異的活性を有するＶｖｎヌクレアーゼ突然変異体、例えば、Ｑ６９において突然変異を有するＶｖｎヌクレアーゼ突然変異体である。該大きなＤＮＡの断片は１つ又は２つの平滑末端を有してよく、またＤＮＡの配列決定において使用されるタイプのアダプターに連結するために更に修飾されうる。

図１は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−Ｔ７エンドＩ突然変異体とＭＢＰ−Ｖｖｎとの組合せを使用するＤＮＡ断片化を示す。ＣＢ４は２容量のＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体（ＰＡ／Ａ）（０．１３単位／μｌ）と１容量のＭＢＰ−Ｖｖｎ（０．１４単位／μｌ）との混合物である。各レーンは３０μｌの反応を表し、該反応においては、５μｇのゲノムＤＮＡ（レーンの上部に示されている）を３μｌのＣＢ４混合物と３７℃で温置した。３０分、６０分および９０分の時間間隔の後、各反応を１５ｍＭ ＥＤＴＡで停止させた。ＤＮＡ断片をエタノール沈殿させ、ついで風乾させた。ＤＮＡペレットを５０μｌの１×ゲルローディング色素オレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＮＥＢ＃Ｂ７０２２）に再懸濁させ、２％ アガロースゲル上にローディングした。四角の枠は約１００〜２００ｂｐの断片を示す。図１ＡはＨｅｌａ（子宮頚腺癌）細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＣｐＧ Ｈｅｌａ細胞（ＮＥＢ＃４００７）からのゲノムＤＮＡの断片化を示す。図１Ｂはニシン精子、ラムダファージおよびＪｕｒｋａｔ（ヒト急性Ｔ細胞白血病）細胞からのゲノムＤＮＡの断片化を示す。 図２は、２つのＤＮＡラダーＭ１［２−Ｌｏｇ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ ＃Ｎ３２００，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）］およびＭ２［ＮＥＢ ＰＣＲマーカー（ＮＥＢ ＃Ｎ３２３４，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）］と比較した場合の、ＣＢ４混合物を使用するＤＮＡ断片の生成を示す。７つの反応を準備した。３μｌのＣＢ４混合物および５μｇのＤＮＡラダー（ＮＥＢ ＃Ｎ３２３１，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を含有するそれぞれ５０μｌの反応を種々の時間にわたり３７℃で温置し、ついで０、５、１０、２０、４０，８０、１６０分の時間間隔で１５ｍＭ ＥＤＴＡで停止させた。断片を１％ アガロースゲル上にローディングした。 図３Ａ〜３Ｂは、ヌクレアーゼ：ＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（野生型（ＷＴ））またはＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）の系列希釈物を使用する３０μｌの反応中の３７℃で３０分間にわたる１μｇのラムダＤＮＡからのＤＮＡ断片の生成を示す。図３Ａ：レーンＭはＮＥＢ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ＰＣＲマーカー（＃Ｎ３２３４）であり、レーン１〜９は、レーン１における２μｇのＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（ＷＴ）から出発する酵素の２倍希釈系列物である（希釈バッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．１μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）。レーン３において使用する酵素の量は１ゲル単位と定義され、ここで、該ＤＮＡ断片の９０％は１５０ｂｐ未満である。図３Ｂ：レーンＭはＮＥＢ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ＰＣＲマーカー（＃Ｎ３２３４）であり、レーン１〜９は、レーン１における１．５μｇのＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（突然変異体）から出発する酵素の２倍希釈系列物である（希釈バッファーは前記のとおり）。レーン６において使用する酵素の量は１ゲル単位と定義される。 図４は、ＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体およびＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）からなる混合物（ＣＢ４ｖ２）に関して種々の温置時間を用いた場合のＤＮＡ断片の生成を示す。ＣＢ４ｖ２は、２容量のＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体（０．１６単位／μｌ）と１容量のＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）との混合物（０．０４８ＴＣＡ単位／μｌ）である。各レーンは５０μｌの反応を表し、該反応においては、５μｇの種々のゲノムＤＮＡ（レーンの上に示されているもの）を同量の３μｌのＣＢ４ｖ２混合物と３７℃で温置した。３０分、６０分および９０分の時間間隔の後、各反応を１５ｍＭ ＥＤＴＡで停止させた。ＤＮＡ断片をエタノール沈殿させ、ついで風乾させた。ＤＮＡペレットを５０μｌの１×ゲルローディング色素オレンジ（ＮＥＢ＃Ｂ７０２２，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に再懸濁させ、２％ アガロースゲル上にローディングした。四角の枠は約１５０ｂｐの断片を示す。 図５はＶｖｎヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）突然変異体のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。該アミノ酸配列は１９位から始まる。なぜなら、ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）構築物にはシグナルペプチド（１−１８）がクローニングされていないからである。「^＊」は、ＱがＳへと突然変異している６９位を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、複数の異なるエンドヌクレアーゼを別々の反応容器内で使用し次いで断片化産物を合わせた場合（図６Ａ）、および２つのエンドヌクレアーゼを同じ反応容器内で一緒に使用した場合（図６Ｂ）の、或る時間範囲にわたる比較を示す。Ｍは２−Ｌｏｇ ＤＮＡラダーであり、Ｃは未消化ｐＵＣ１９である。「Ｎ」はｐＵＣ１９のニック化形態が泳動する位置を示す。「Ｌ」はｐＵＣ１９の直線形態が泳動する位置を示す。「Ｓ」はｐＵＣ１９のスーパーコイル形態が泳動する位置を示す。図６Ａは、ニック化酵素ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）およびＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体を別々に使用するランダム二本鎖切断を示す。８μｇのｐＵＣ１９を４８０μｌの反応において１．３７６ ＴＣＡ単位のＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）と共に温置した。もう１つの新たなチューブにおいて、８μｇのｐＵＣ１９を４８０μｌの反応において５．６単位のＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体と共に温置した。サンプルを３７℃で温置した。０、５、１０、１５、２０、３０、４０および６０分の時点で各温置混合物から３０μｌを取り出し、該反応をＥＤＴＡ（最終濃度１５ｍＭ）の添加により停止させた。同じ温置時間のサンプルを一緒に集め、０〜６０分の温置時間に対応するレーン１から８までの０．８％ アガロースゲル上にローディングした。図６Ｂは、ＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体およびＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）を一緒に使用するランダム二本鎖切断を示す。１６μｇのｐＵＣ１９を４８０μｌの反応において１．３７６ ＴＣＡ単位のＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）および５．６単位／μｌ ＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体（ＣＢ４Ｖ２）と共に温置した。サンプルを３７℃で温置した。０、５、１０、１５、２０、３０、４０および６０分の時点で各温置混合物から６０μｌを取り出し、該反応をＥＤＴＡ（最終濃度１５ｍＭ）の添加により停止させた。サンプルを、０〜６０分の温置時間に対応するレーン１から８までの０．８％ アガロースゲル上にローディングした。ＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体とニック化酵素ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）との相乗効果がランダムＤＮＡ断片の生成に際して見出された。 図７は、ヌクレアーゼの混合物に関する適当な単位比を決定するための滴定を示す。既存の切れ目（ニック）部位に対するＴ７エンドＩ突然変異体による特異的切断をゲル電気泳動により判定した。該酵素を２倍系列希釈した。１単位は、基質の９０％を２つの断片に変換しうる酵素の量と定義された。該系列希釈を、最も濃いもの（レーン１）から最も薄いもの（レーン９）まで示した。前記の基質調製中にＢｓａＩ／Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩにより生成された既存のニック化部位に対するＴ７エンドヌクレアーゼ突然変異体による特異的切断は線状ニック化２．４４Ｋｂ二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を２つの断片（１．３７Ｋｂおよび１．０７Ｋｂ）に変換した。したがって、Ｔ７エンドヌクレアーゼ突然変異体の１単位は、２０μｌの反応において５単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ、６０μＭ ＮＡＤ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーで３７℃で１時間にわたり該線状ニック化２．４４ｋｂ ｄｓＤＮＡの２μｇの９０％を２つの断片（１．３７Ｋｂおよび１．０７Ｋｂ）に変換するのに必要な酵素の量（レーン５に示されているとおり）と定義された。レーン「Ｍ」は２−ｌｏｇ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，＃３２００）である。 図８は、エンドヌクレアーゼ混合物を含む製品に付属しているデータカードを示す。 図８は、エンドヌクレアーゼ混合物を含む製品に付属しているデータカードを示す。 図８は、エンドヌクレアーゼ混合物を含む製品に付属しているデータカードを示す。

実施形態の詳細な説明
本発明の実施形態においては、ほぼ均一なサイズの二本鎖ＤＮＡ断片を製造するための調製物中の酵素の混合物に基づく組成物および方法を提供し、ここで、該均一サイズは、必要に応じて予め決定されることが可能であり、例えば温置時間を変化させることにより生成されうる。該酵素調製物は、抗ニック化活性を含めることにより、非特異的ヌクレアーゼ切断反応のみのｄｓＤＮＡ産物と比較してｄｓＤＮＡ断片における非生産性ニックの数を減少させる。該抗ニック化は、通常の解離条件下で解離し後続の操作のために平滑末端へと修復されうる一定の長さの突出部の生成を可能にする。修復は、３’突出部を逆方向へ砕き取ること、またはポリメラーゼを使用して５’突出部に対する相補的配列を合成することを含みうる。ついで、平滑末端または単一ヌクレオチド突出部を有するアダプターを該修飾断片に連結することが可能である。ついでこれらの断片を種々の配列決定法において使用することが可能である。

先行技術におけるランダム断片化法は突出部を生成するが、これらは個別にサイズ分けされず、少なくとも２つの問題を引き起こす。第１に、融解温度は該突出部の長さおよび塩基組成に左右されるため、該末端の解離は均一ではない。第２に、断片の解離に要求されるものを超える過剰のニック（切れ目）の存在は、増幅および／または実際の配列決定反応を含む後続工程に要求される重合の障害となる。該温度の物理的連続性を要する配列決定方法も悪影響を受けるであろう。

本発明の１つの実施形態においては、該調製物は非特異的ヌクレアーゼおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩまたはその突然変異体を含有する。ＡＴまたはＧＣ塩基対を優先的に切断するヌクレアーゼが使用されうるが、好ましくは、ＧＣまたはＡＴのいずれにも有意な優先性を有さないヌクレアーゼが選択される。この後者の範疇に属するヌクレアーゼの一例はビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）（Ｖｖｎ）から得られる（ＧＩ：２６２５６８４ Ｗｕら，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６７（１）：８２−８（２００１））。

該調製物において使用されうる他の細胞外ヌクレアーゼには、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）由来のＤｎｓ（ＦｏｃａｒｅｔａおよびＭａｎｎｉｎｇ，Ｇｅｎｅ ５３（１）：３１−４０（１９８７））、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のＮｕｃＭ（Ｍｏｕｌａｒｄら，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８（４）：６８５−９５（１９９３））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＥｎｄｏＩ（Ｊｅｋｅｌら，Ｇｅｎｅ １５４（１）：５５−５９（１９９５））、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）由来のＤｎｓおよびＤｎｓＨ（Ｃｈａｎｇら，Ｇｅｎｅ １２２（１）：１７５−８０（１９９２）およびＤｏｄｄら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １７３（１）：４１−６（１９９９）；Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５：５８４−９４（２００７）；ならびにＷａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：５８４−５９４（２００７））が含まれる。

該ヌクレアーゼに対する突然変異は特異的活性の改善をもたらしうることが本明細書に示されている。例えば、ＶｖｎエンドヌクレアーゼのＱ６９の突然変異は、増強した特異的活性を有するヌクレアーゼを与える。特に、実施例（具体例）においては、Ｑ６９Ｓを用いる。例えば、突然変異エンドヌクレアーゼの回収の改善のために周辺腔内に蓄積する融合タンパク質を得るために該遺伝子がＭＢＰの遺伝子と共役された場合、該突然変異ヌクレアーゼは宿主細胞において容易に産生されることが判明した。

非特異的ヌクレアーゼを含有する酵素調製物へのＴ７エンドＩ突然変異体の添加は、所望の特性を有する断片の生成に対して重要な有益な効果を及ぼした。変性条件下で種々のサイズの断片を与える非特異的ヌクレアーゼにより生成されるニックは、Ｔ７エンドＩ突然変異体の存在下では、その抗ニック化活性のため、有効に消失した。該抗ニック化活性は、ニック部位から好ましくは８ヌクレオチド以下を容易に解離しうる末端を有する断片を生成した。ｄｓＤＮＡに対する該酵素混合物の他の有益な効果には、ＤＮＡ配列決定法に要求されることがあるアダプターの結合を可能にする修復または除去に適した予測可能な突出部の性質および長さを有するＤＮＡ断片の生成が含まれた。

本発明のもう１つの実施形態においては、複数のヌクレアーゼを反応混合物において組合せる。この場合、少なくとも１つのヌクレアーゼは、いずれかの鎖上のＤＮＡ全体にわたってランダムなニックを導入しうるタイプのものであり、もう１つのヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖の反対鎖における、この最初のニックに直に隣接した部位において、抗ニック化をもたらすことが可能であり、したがって二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こす。

このアプローチは、それぞれ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）に由来する非特異的ヌクレアーゼ、および米国公開第２００７−００４２３７９に記載されているタイプのＴ７エンドＩの突然変異体、例えば、架橋領域に突然変異を有するＴ７エンドＩを用いて例示される。酵素断片は該ゲノムに沿って分布していると予想される。

プラスミドＤＮＡおよび種々のタイプのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、前記の酵素調製物を使用する配列決定法に適したサイズのＤＮＡ断片へと酵素的に切断した。該ＤＮＡの断片化の後、ＤＮＡ断片をゲル単離し、後続の配列決定のために加工した。

実施例２に記載されているアッセイは、いずれかの特定のＤＮＡに関する選択された温置時間にわたるヌクレアーゼの適量または選択されたヌクレアーゼ比に関する適当な温置時間を特定するために使用されうる。

それらの２つのヌクレアーゼの単位比（Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ突然変異体のようなニック化エンドヌクレアーゼ：Ｔ７エンドＩ突然変異体のような抗ニック化ヌクレアーゼ）は、好ましくは１：２００未満、例えば１：１００未満、例えば１：１０未満である。該範囲は１：２〜１：２００でありうる。

Ｔ７エンドＩまたはその突然変異体の１単位は、３７℃で１時間にわたり該線状ニック化２．４４ｋｂ ｄｓＤＮＡの２μｇの９０％を２つの断片（１．３７ｋｂおよび１．０７ｋｂ）に変換するのに必要な酵素の量と定義された。

Ｖｖｎヌクレアーゼおよびその突然変異体の１単位は、３７℃で３０分のうちに酸可溶性オリゴヌクレオチドの１ Ａ_２６０単位を遊離させるのに必要な酵素の量と定義される
本発明の１つの実施形態においては、該ＤＮＡ断片化反応のための温置の最適時間は、６０％を超えるＧＣ（高ＧＣ含量）、４０％〜６０％のＧＣ（標準的なＧＣ含量）または４０％未満のＧＣ（低ＧＣ含量）の範囲内に該ＤＮＡが含まれるかどうかに応じてアッセイされうる。例えば、該温置時間範囲は、典型的には１０分〜１２０分、例えば１５分〜６０分の範囲でありうる。

本明細書中で引用されている全ての参考文献ならびに２００９年２月３日付け出願の米国仮出願第６１／１４９，６７５号および２００９年３月１０日付け出願の第６１／１５８，８１５号および２００９年８月３１日付け出願の第６１／２７５、５３１号を参照により本明細書に組み入れることとする。

実施例
「大きな」は、配列決定のための断片化を要するサイズを有するＤＮＡに関して用いられる。

Ｔ７エンドＩ突然変異体は、２つの触媒ドメインの間の架橋領域に突然変異を有するＴ７エンドＩを意味する。

ＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体はＴ７エンドＩと同様に作用する。

ＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（ＷＴまたは突然変異体）はＶｖｎヌクレアーゼ（ＷＴまたは突然変異体）と同様に作用する。

非特異的ヌクレアーゼは、特異的ＤＮＡ配列を認識しない任意のＤＮＡヌクレアーゼを意味する。ＤＮＡ配列は、一定の順序の少なくとも２ヌクレオチドからなる。これは、特異的ＤＮＡ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを含まない。

Ｖｖｎまたはその突然変異体を含有する酵素混合物の調製
Ｖｖｎからのペリプラズム（周辺腔）ヌクレアーゼをコードする遺伝子を化学合成した。シグナルペプチドを有さないＶｖｎ遺伝子は図５におけるアミノ酸１９−２３１（配列番号５）に対応する。それを、プライマー１（５’−ＡＡＧＧＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴ ＧＣＣ−３’）（配列番号１）および２（５’−ＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＧ ＧＡＴＴＧＣＴＧ−３’）（配列番号２）のペアを使用するＰＣＲ増幅により合成し、該断片をｐＭＡＬｐ４ｘベクター（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，＃Ｎ８１０４）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間にクローニングした。融合タンパク質ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム区画において発現させ、均一になるまでアミロースアフィニティーカラムにより精製した。ＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（ＷＴ）をヘパリンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により更に精製した。タンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により決定した。

突然変異ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）を作製した。これは、ＭＢＰ−Ｖｖｎエンｄヌクレアーゼ（ＷＴ）より５〜１０倍高い特異的活性を示した（図４Ａ〜４Ｂ）。ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）突然変異体を製造するために、プライマー３（５’−Ｃ ＡＡＧＴＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＧＣＡＴ ＣＧ−３’）（配列番号３）および２（配列番号２）を使用してＶｖｎ遺伝子のＣ末端部分を増幅し、プライマー１（配列番号１）おより４（５’−ＴＧＣＧＣＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＡ ＣＴＴＧＧＴＡ−３’）（配列番号４）を使用して、シグナルペプチド配列以外のＶｖｎ遺伝子のＮ末端領域を増幅した。各反応からのＰＣＲ断片を混合し、プライマー１（配列番号１）および２（配列番号２）を使用して無傷Ｖｖｎ遺伝子から再増幅した。該ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ついで、タンパク質発現のために同じ酵素で切断されたｐＭＡＬ−ｐ４ｘベクター内にクローニングした。Ｖｖｎ突然変異エンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）のアミノ酸配列を図５に示す。融合タンパク質ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム（周辺腔）において発現させ、均一になるまでアミロースアフィニティーカラムにより精製した。タンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により決定した。該Ｖｖｎ突然変異エンドヌクレアーゼをＴ７エンドＩ突然変異体（ＣＢ４ｖ２）と組合せた場合、該混合物は種々の起源およびサイズのゲノムＤＮＡを時間依存的に効率的に断片化することが判明した。

該混合物における酵素に関する単位比の決定
（ａ）Ｔ７エンドＩ突然変異体の活性の決定
特異的ニック化部位を有する線状ｄｓＤＮＡを調製するために、ｐＮＢ１を使用した（２．４４Ｋｂ）。ｐＮＢ１は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩおよびＢｓａＩ切断のための単一部位を有するプラスミドである。ＢｓａＩでの切断は該プラスミドを線状化し、一方、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩはその認識部位に部位特異的ニックを導入する。プラスミドｐＮＢ１をＮｔ．ｂｓｔＮＢＩおよびＢｓｔＩ制限酵素で５０℃で１時間消化した。ついで子ウシ腸アルカリホスファターゼを該線状ニック化ｄｓＤＮＡに加え、３７℃で１時間温置した。この処理は後続アッセイ中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼによるＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニックの封着（ｓｅａｌｉｎｇ）を防ぐ。Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、断片化ｄｓＤＮＡを付随酵素から分離した。

Ｔ７エンドＩ突然変異体での該断片化ｐＮＢＩ ＤＮＡの処理は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩニックとはほぼ反対に、該ＤＮＡ鎖内に抗ニックを導入して、２つの断片を与えた（１．３７ｋｂおよび１．０７ｋｂ）（図７を参照されたい）。Ｔ７エンドＩ突然変異体の１単位は、５単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ、６０μＭ ＮＡＤ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーで３７℃で１時間にわたり該線状ニック化２．４４ｋｂ ｄｓＤＮＡの２μｇの９０％を２つの断片（１．３７Ｋｂおよび１．０７Ｋｂ）に変換するのに必要な酵素の量と定義された。図７のレーン５は、この定義を満たす反応を示す。

（ｂ）突然変異Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ活性の決定
音波処理された子ウシ胸腺ゲノムＤＮＡを基質として使用して、Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。５μｌのＶｖｎエンドヌクレアーゼ突然変異体を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ ＮａＣｌ、音波処理された子ウシ胸腺ｇＤＮＡ（３ｍｇ）およびＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有する３７℃の３ｍｌの反応混合物に加え、温置を３７℃で継続した。５００μｌの反応混合物を取り出し、１０、２０、３０、４０および５０分の時間間隔の後、５００μｌの５％ ＴＣＡで該エンドヌクレアーゼ活性を停止させた。ＴＣＡでクエンチされたこれらのサンプルを氷上で１時間温置し、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して無傷ＤＮＡをペレット化した。各チューブからの上清を注意深く取り出し、２６０ｎｍにおける該上清の吸光度を測定した。Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ突然変異体の１単位は、３７℃で３０分のうちに酸可溶性オリゴヌクレオチドの１ Ａ_２６０単位を遊離させるのに必要な酵素の量と定義される。

（ｃ）該ヌクレアーゼ混合物における突然変異Ｖｖｎエンドヌクレアーゼと突然変異Ｔ７エンドＩとの単位比の決定
所望量のＶｖｎヌクレアーゼおよびＴ７エンドＩ突然変異体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび５０％ グリセロールの保存バッファー中、種々の比で一緒にした。ＤＮＡ断片化バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有していた。

それらの２つのエンドヌクレアーゼの適当な比を決定するために、一方のエンドヌクレアーゼは一定量で維持し、他方のヌクレアーゼは濃度を変動させ、これらを、ＴＣＡアッセイを用いて、その他は同様の反応条件下で行った。

本明細書に例示されているヌクレアーゼの混合物においては、ＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体：ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）突然変異体の単位比は約３：１であった。該単位比を２：１に減少させたところ、前記のＴＣＡアッセイにより測定した場合にＤＮＡ分解の速度は５０％減少した。一方、該比を８：１に増加させた場合には、該速度は僅か１４％増加したに過ぎなかった。

酵素混合物においてヌクレアーゼをＴ７エンドＩ突然変異体と組合せることによる相乗効果
ＣＢ４は種々の起源および種々のサイズのゲノムＤＮＡを時間依存的に断片化することが示された（図２）。ＣＢ４は２容量のＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体（ＰＡ／Ａ）（０．２６ｍｇ／ｍｌ）と１容量のＭＢＰ−Ｖｖｎ（ＷＴ）（０．２ｍｇ／ｍｌ）との混合物である。ＣＢ４はまた、１００〜１５００ｂｐのサイズを有する小さな断片の混合物を１００〜１５０ｂｐの断片に変換し（図２）、サイズは幾つかの現在の次世代配列決定法に適している。

混合物中のＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）およびＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ突然変異体は、小さな二本鎖ＤＮＡ断片を産生するように相乗的に作用する。図６Ａおよび６Ｂは、漸増温置時間にわたるＭＢＰ−Ｖｖｎヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）またはＭＢＰ−Ｔ７エンドＩ ＰＡ／Ａでのプラスミドの処理がニック化環状ＤＮＡの蓄積の増加ならびにそれに続く線状プラスミドの形成およびより小さな断片へのこのＤＮＡの分解をもたらしたことを示している。しかし、同じ反応混合物中に両方の酵素が存在した場合には、開いた環状または線状ＤＮＡへの該スーパーコイル化プラスミドの変換およびその分解は、別々の酵素の同じ濃度で観察されたもの（図６Ａ）と比較して著しく増加した（図６Ｂ）。例えば、合わされたサンプル（すなわち、図６Ｂ）におけるレーン６は、分離したスーパーコイル化、ニック化または線状プラスミドを欠くが、個々の酵素との温置の後では、少なくともニック化および線状化プラスミドの豊富な残渣が存在していた（図６Ａ、レーン６）。

いずれかの特定のＤＮＡの所望の分解は、出発ＤＮＡのサイズ、所望の断片のサイズ、および該混合物中の選択された比のヌクレアーゼの存在下の温置の時間の関数である。

突然変異ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）を作製した。これは、ＭＢＰ−Ｖｖｎエンｄヌクレアーゼ（ＷＴ）より５〜１０倍高い特異的活性を示した（図３Ａ〜３Ｂ）。ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）突然変異体を製造するために、プライマー３（５’−Ｃ ＡＡＧＴＡＣＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＧＣＡＴ ＣＧ−３’）（配列番号３）および２（配列番号２）を使用してＶｖｎ遺伝子のＣ末端部分を増幅し、プライマー１（配列番号１）おより４（５’−ＴＧＣＧＣＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＡ ＣＴＴＧＧＴＡ−３’）（配列番号４）を使用して、シグナルペプチド配列以外のＶｖｎ遺伝子のＮ末端領域を増幅した。各反応からのＰＣＲ断片を混合し、プライマー１（配列番号１）および２（配列番号２）を使用して無傷Ｖｖｎ遺伝子から再増幅した。該ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ついで、タンパク質発現のために同じ酵素で切断されたｐＭＡＬ−ｐ４ｘベクター内にクローニングした。Ｖｖｎ突然変異エンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）のアミノ酸配列を図５に示す。融合タンパク質ＭＢＰ−Ｖｖｎエンドヌクレアーゼ（Ｑ６９Ｓ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム（周辺腔）において発現させ、均一になるまでアミロースアフィニティーカラムにより精製した。タンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により決定した。該Ｖｖｎ突然変異エンドヌクレアーゼをＴ７エンドＩ突然変異体（ＣＢ４ｖ２）と組合せた場合、該混合物は種々の起源およびサイズのゲノムＤＮＡを時間依存的に効率的に断片化することが判明した。

Claims (8)

1. 非特異的ヌクレアーゼとＴ７エンドＩ突然変異体とを１：２００未満の単位比で含む調製物。
2. 非特異的ヌクレアーゼがＶｖｎヌクレアーゼである、請求項１記載の調製物。
3. 該ＶｖｎヌクレアーゼがＱ６９において突然変異を有する、請求項１または２記載の調製物。
4. 大きな二本鎖ＤＮＡからの、配列決定に適した断片の製造方法であって、
   （ａ）該大きなＤＮＡを請求項１記載の調製物と混合し、
   （ｂ）該大きなＤＮＡを、配列決定に適したサイズの断片に切断することを含む製造方法。
5. 非特異的ヌクレアーゼがＶｖｎヌクレアーゼである、請求項４記載の製造方法。
6. 該ＶｖｎヌクレアーゼがＱ６９において突然変異を有する、請求項４または５記載の製造方法。
7. （ｂ）における切断により生じた断片上に平滑末端を作製することを更に含む、請求項４から６のいずれか１項記載の製造方法。
8. 平滑末端を有するアダプターまたは単一ヌクレオチド突出部を断片の末端の一方または両方に連結することを更に含む、請求項４から７のいずれか１項記載の製造方法。

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