JPWO2021232023A5 - - Google Patents
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Description
配列表
本件出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年６月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、８５５６３－３３７８６４＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが３３，９８２バイトである。
本件出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年６月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、８５５６３－３３７８６４＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが３３，９８２バイトである。
次いで、Ｎｏｒｍａｌａｓｅを、既に開示された酵素的方法に改造を加えることなく実施することができ、参考のために以下に概説する。精製されたＰＣＲ生成物は、リガーゼ、および５’オーバーハングに相補的なプローブと組み合わされて第１の酵素反応混合物を生成し、プローブが所望の標的モル量と等しい量で各ライブラリーに添加され、第１の反応混合物は、増幅ライブラリー分子の５’オーバーハング部分にアニーリングすることによる３’末端へのプローブのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、プローブにライゲーションされた増幅ライブラリー分子の部分が、処理ライブラリー分子の標的モル量となる。次に、各ライブラリーは、処理ライブラリー分子の標的量が同じであるため、コシークエンシング対象の各ライブラリーの等体積プーリングが実施される。プローブは、エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗を与えるための改造型を含むため、ライブラリープールは、プローブにライゲーションされない処理ライブラリー分子を消化することによって、選択された標的量の処理ライブラリー分子を単離することを可能にするのに十分な条件下で、第２の酵素反応混合物におけるエクソヌクレアーゼと組み合わされる。次いで、第２の酵素反応混合物は、熱不活性化され、プールが、さらなる精製ステップを行うことなくフローセルローディングに利用可能となる。必要に応じて、プールのｑＰＣＲ定量を実施して、最適なシークエンシングフローセル上での特定クラスター密度を達成するための所望の最終モル濃度を確認することができる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分、および前記第２の３’末端部分に対して５’に位置し、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の５’部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分および前記第１の５’部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分および第１の５’部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目２）
ステップ（ｉ）～（ｖｉ）が単一密閉管において実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が１３塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が配列番号１２７（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣ－３’）の配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第１の３’末端部分および前記第２の３’末端部分が、それぞれ配列番号１２６（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）の配列を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、ライゲーション温度より高い融解温度（Ｔ ｍ ）を有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、第１のアニーリング温度より低いＴ ｍ を有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分のＴ ｍ が、前記ライゲーション温度より少なくとも１℃高く、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分のＴ ｍ が、前記第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低い、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、前記第１のアニーリング温度より低い融解温度（Ｔ ｍ ）を有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の３’末端部分が、前記第１のアニーリング温度より低いＴ ｍ を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約２０塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が２０塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ ｍ ）より少なくとも１℃低い、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ ｍ ）より低い、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第３の鎖および第４の鎖の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記第１の変性温度より低い、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ライゲーション持続時間が約２０分である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、３’～５’エクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分の融解温度（Ｔ ｍ ）が、それぞれ、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分のＴ ｍ より高い、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の変性温度、前記第２の変性温度および前記第３の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃である、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間および前記第３の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃である、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間および前記第３のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度および前記第３の伸長温度が、それぞれ独立して約６２℃から約７２℃である、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間および前記第３の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約２００ｎＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目１に記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ｉｉ）が、ブロッカーオリゴヌクレオチドを前記第１の反応混合物に添加することをさらに含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な５’部分を含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記ライゲーション温度より高く、前記第１のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より低い、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記Ｔ ｍ が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々のＴ ｍ より高い、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第１の鎖の前記第１の５’末端へのライゲーションおよび前記第２の鎖の前記第２の５’末端へのライゲーションを抑制するのに十分な量の前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが添加される、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの量の１倍、１．５倍、２倍、４倍または６倍の量添加される、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々にプレアニーリングされる、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的であり、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、５’部分に対して３’に位置する第１のさらなる部分を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
前記第１のさらなる部分と５’部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記５’部分と前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度とほぼ同じ、またはそれより高い、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記第１のさらなる部分と前記５’部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の前記Ｔ ｍ が、前記５’部分と前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度より少なくとも１℃高い、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記５’部分と前記第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含み、前記第２のさらなる部分が、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でなく、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、項目４６～４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
前記第２のさらなる部分が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目５２）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない前記配列が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目５４）
ポリメラーゼ伸長を阻害するための前記３’修飾が、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオチド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、またはポリＴ、ポリＡ、ポリＣおよびポリＧなどの、前記隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列であって、プルーフリーディングポリメラーゼ３’～５’エクソヌクレアーゼ活性が、前記隣接するプライマー配列に相補的でない前記ＤＮＡ配列を除去することを防止するためにヌクレアーゼ抵抗性結合をさらに含むＤＮＡ配列からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間のＴ ｍ より低い、項目４１に記載の方法。
（項目５６）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々との間の前記Ｔ ｍ が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間のＴ ｍ より少なくとも５℃低い、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号１２７の配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目５８）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基、および前記第１のさらなる部分に対して３’に位置するヘアピン部分をさらに含み、前記ヘアピン部分が、第１のヘアピン配列および第２のヘアピン配列を含み、前記第１のヘアピン配列が、前記第２のヘアピン配列に対して５’に位置し、前記第１のヘアピン配列および前記第２のヘアピン配列が相補的であり、前記ヘアピン部分が、前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より高い融解温度を有する、項目４６～５０のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
前記ヘアピン部分が、前記第１のヘアピン配列と前記第２のヘアピン配列との間に位置する第３のヘアピン配列をさらに含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記第３のヘアピン配列が、前記ヘアピン部分および前記第１のさらなる部分による安定なステムループ構造の形成を可能にするのに十分なループを形成する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記第３のヘアピン配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ヘアピン部分の融解温度が、前記５’部分と前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、前記さらなる部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々またはその両方との間の融解温度より高い、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記第２の条件集合は、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長ヘアピンブロッカーを生成するのにさらに十分である、項目５８～６０のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記伸長ヘアピンブロッカーが、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より高い融解温度（Ｔ ｍ ）を有する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記伸長ヘアピンブロッカーが、安定した第２の構造を有する、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記伸長ヘアピンブロッカーの融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記５’部分および前記第１のさらなる部分から前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々までのＴ ｍ より高い、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、配列番号８７の配列をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６８）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、配列番号７８の配列をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６９）
前記第５の鎖および第７の鎖または前記第６の鎖および前記第８の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第５の鎖および第６の鎖が、前記第５の鎖および第６の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第５の鎖および第７の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第６の鎖および第８の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖、第８の鎖、第２のリガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
前記正規化ＮＧＳライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分および第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が、相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が、前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が、前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列をそれぞれ含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、複数の５’アダプター、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第２の３’末端部分を含み、前記第２の３’末端配列が、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的であり、前記複数の５’アダプターの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第３の３’末端配列、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、前記第３の３’末端配列に対して５’に位置する第１の５’部分、前記第１の５’部分に対して５’に位置し、前記第１の５’部分に相補的である第２の５’部分、および前記第１の５’部分の５’末端に位置する前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーを含み、前記５’アダプターが、前記第１の５’部分を前記第２の５’部分にアニーリングすることによって形成されるヘアピンを形成することができること、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、１）前記第３の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、２）前記リガーゼが、前記複数の５’アダプターの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端および前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の５’アダプターの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の５’アダプターの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖、第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体、および前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分のリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体を含む、第３の反応混合物を生成するのに十分な、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、
ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記第１の３’末端部分が、前記第５の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、前記第６の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第４の反応混合物を生成するのに十分な、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすること、
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、
ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第７の鎖の前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第８の鎖の前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第７の鎖および第８の鎖の各々にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第７の鎖、前記第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を含む第５の反応混合物であって、前記第９の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第１０の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖および第９の鎖が相補的であり、前記第８の鎖および第１０の鎖が相補的である第５の反応混合物を生成するのに十分な、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすること、および
（ｖｉｉ）前記第５の反応混合物を、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、および前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第７の鎖、第９の鎖および第８の鎖および第１０の鎖を増幅させるのに十分な、第４の変性持続時間にわたる第４の変性温度、第４のアニーリング持続時間にわたる第４のアニーリング温度、および第４の伸長持続時間にわたる第４の伸長温度を含む第５の条件集合下でインキュベートすること
を含む、ライゲーションカップルドＰＣＲの方法。
（項目７３）
ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）が単一密閉管において実施される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記第１の５’部分および前記第２の５’部分が、それぞれ約１２塩基から約２０塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記複数の５’アダプターの各々が、前記第１の５’部分と前記第２の５’部分の間に介在配列をさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記介在配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記複製ブロッカーが、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記複数の５’アダプターの各々が、約２５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目７９）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８０）
それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８１）
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８２）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８３）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、１３塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８４）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、配列番号１２７の配列を含む、項目７２に記載の方法。
（項目８５）
前記複数の５’アダプターの各々の前記第３の３’末端部分が、配列番号１２６の配列を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８７）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分が、前記ライゲーション温度より高い融解温度を有する、項目７２に記載の方法。
（項目８８）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第２の３’末端部分および前記第２の共通ヌクレオチド配列が、前記第１のアニーリング温度より高い融解温度を有する、項目７２に記載の方法。
（項目８９）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分の融解温度が、前記ライゲーション温度より少なくとも１℃高く、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分の前記融解温度が、前記第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低い、項目７２に記載の方法。
（項目９０）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目９１）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約２０塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目９２）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、配列番号９５の配列を含む、項目７２に記載の方法。
（項目９３）
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度より低い、項目７２に記載の方法。
（項目９４）
前記第３および第４の鎖の融解温度が、前記第１の変性温度より低い、項目７２に記載の方法。
（項目９５）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目７２に記載の方法。
（項目９６）
前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、項目７２に記載の方法。
（項目９７）
前記ライゲーション持続時間が約２０分である、項目７２に記載の方法。
（項目９８）
前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目７２に記載の方法。
（項目９９）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目７２に記載の方法。
（項目１００）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記リガーゼが温度感受性であり、前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目７２に記載の方法。
（項目１０２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目１０３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目７２に記載の方法。
（項目１０４）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｄ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目７２に記載の方法。
（項目１０７）
前記第１の変性温度、前記第２の変性温度、前記第３の変性温度および前記第４の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃である、項目７２に記載の方法。
（項目１０８）
前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間、前記第３の変性持続時間および前記第４の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、項目７２に記載の方法。
（項目１０９）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目７２に記載の方法。
（項目１１０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約２００ｎＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目７２に記載の方法。
（項目１１１）
前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度、前記第３のアニーリング温度および前記第４のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃である、項目７２に記載の方法。
（項目１１２）
前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間、前記第３のアニーリング持続時間および前記第４のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、項目７２に記載の方法。
（項目１１３）
前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度、前記第３の伸長温度および前記第４の伸長温度が、それぞれ独立して約６０℃から約７２℃である、項目７２に記載の方法。
（項目１１４）
前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間、前記第３の伸長持続時間および前記第４の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、項目７２に記載の方法。
（項目１１５）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、配列番号８７の配列をさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目１１６）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、配列番号７８の配列をさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目１１７）
前記第７の鎖および第９の鎖または前記第８の鎖および前記第１０の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、項目７２～１１６のいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第９の鎖および第１０の鎖が、前記第９の鎖および第１０の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第９の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第８の鎖および第１０の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖、第１０の鎖、リガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目７２～１１７のいずれかに記載の方法。
（項目１１９）
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、前記第１の開始鎖の５’末端にユニバーサルプライマー配列を含み、前記ユニバーサルプライマー配列が、前記ユニバーサルプライマー配列の内部またはその３’末端にｄＵ塩基を含み、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、前記第２の開始鎖の５’末端に前記ユニバーサルプライマー配列を含むこと、
前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記ｄＵ塩基および開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を開裂することが可能な前記酵素を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２０）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能配列を含み、前記第１の５’開裂可能配列が、前記第１の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含み、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能配列を含み、前記第２の５’開裂可能配列が、前記第２の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含むこと、
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列のリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素ならびに前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることをステップ（ｉ）の前にさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２２）
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能配列を含み、前記第１の５’開裂可能配列が、前記第１の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含み、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能配列を含み、前記第２の５’開裂可能配列が、前記第２の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含むこと、
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素ならびに前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２４）
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、ｄＵ塩基および３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の鎖および第２の鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２６）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、リボヌクレオチドおよび３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
リボヌクレオチドを含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の開始鎖および第２の開始鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の鎖および第２の鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の鎖および前記第２の鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、イノシン塩基および３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
イノシン塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の鎖および第２の鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１および第２の鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションＰＣＲ反応混合物に添加すること、および
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１３０）
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が、５’末端および３’末端を含み、前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと、
各３’アダプター鎖が、３’末端ｄＵ塩基および３’ヒドロキシル基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
３’末端ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、前記相補鎖の１つを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記相補鎖が、相補鎖の内部にさらなるｄＵ塩基を含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３４）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が、５’末端および３’末端を含み、前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと、
各３’アダプター鎖が、３’末端Ｔ塩基、３’ヒドロキシル基およびｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
３’末端Ｔ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、前記相補鎖の１つを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１３５）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
標的ＤＮＡを断片化して、前記断片化ＤＮＡ基質分子を生成することをさらに含む、項目１２５～１３５のいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
ステップ（ｉ）～（ｖｉ）または（ｉ）～（ｖｉｉ）の間に精製が実施されない、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３８）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、前記第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、前記第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと、
（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第１のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、前記第１のプライマーが、前記第２の鎖の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分を含み、前記第１の３’ブロッキング基がポリメラーゼ連鎖伸長の能力がなく、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有すること、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、前記第１のプライマー、前記二本鎖ＤＮＡ基質、および前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、および
（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸長持続時間にわたる伸長温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを前記第２の反応混合物に施して、前記第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、前記第１のプライマーを前記二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む前記二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成すること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目１３９）
（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを前記第３の反応混合物に施して、前記二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含む、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記ライゲーション温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より低い、項目１３８に記載の方法。
（項目１４１）
前記ライゲーション温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１３８に記載の方法。
（項目１４２）
前記リガーゼが低マグネシウムＰＣＲ緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目１３８に記載の方法。
（項目１４３）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目１３８に記載の方法。
（項目１４４）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目１３８に記載の方法。
（項目１４６）
ステップ（ｉｉ）が、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、前記第５のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がない第２の３’ブロッキング基を含み、前記第５のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、および前記第４のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分をさらに含み、前記第１の条件集合は、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドが前記第５のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記リガーゼが、前記第４のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、前記第４のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のオリゴヌクレオチドを含む前記第２のプライマーを生成するのにさらに十分である、項目１３８に記載の方法。
（項目１４７）
前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記第２の３’ブロッキング基が、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、項目１４６に記載の方法。
（項目１４９）
前記第４のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、項目１４６に記載の方法。
（項目１５０）
前記第５のオリゴヌクレオチドが、約１０から約５０塩基の長さを有する、項目１４６に記載の方法。
（項目１５１）
前記第５のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低い、項目１４６に記載の方法。
（項目１５２）
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が同じ管で実施される、項目１３８～１５１のいずれかに記載の方法。
（項目１５３）
ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に精製が実施されない、項目１３８～１５１のいずれかに記載の方法。
（項目１５４）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１５３のいずれかに記載の方法。
（項目１５５）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１５４のいずれかに記載の方法。
（項目１５６）
前記第３のオリゴヌクレオチドが、約１０から約５０塩基の長さを有する、項目１３８～１５５のいずれかに記載の方法。
（項目１５７）
前記第１の３’ブロッキング基が、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、項目１３８～１５６のいずれかに記載の方法。
（項目１５８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１５９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１６０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性温度を上昇させる、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１６０に記載の方法。
（項目１６２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１６３）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目１３８～１６２のいずれかに記載の方法。
（項目１６４）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性温度が、独立して、約９５℃から約９８℃である、項目１３８～１６３のいずれかに記載の方法。
（項目１６５）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記アニーリング温度が、独立して、約５５℃から約６５℃である、項目１３８～１６４のいずれかに記載の方法。
（項目１６６）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記伸長温度が、独立して、約６２℃から約７２℃である、項目１３８～１６５のいずれかに記載の方法。
（項目１６７）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性持続時間が、独立して、約３０秒から約２分である、項目１３８～１６６のいずれかに記載の方法。
（項目１６８）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、前記第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、前記第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと、
（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第４のオリゴヌクレオチド、第５のオリゴヌクレオチド、第６のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有し、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第６のオリゴヌクレオチドが、前記第４のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、前記第５のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および第２の３’ブロッキング基を含み、前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がないこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第６のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、前記第５のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第４のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー、前記二本鎖ＤＮＡ基質、および前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、
（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸長持続時間にわたる伸長温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを前記第２の反応混合物に施して、前記第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、前記第１のプライマーを前記二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む前記二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成すること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目１６９）
（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを前記第３の反応混合物に施して、前記二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
前記ライゲーション温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より低い、項目１６８に記載の方法。
（項目１７１）
前記ライゲーション温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第５のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１６８に記載の方法。
（項目１７２）
前記リガーゼが、低マグネシウムＰＣＲ緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目１６８に記載の方法。
（項目１７３）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目１６８に記載の方法。
（項目１７４）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目１７３に記載の方法。
（項目１７５）
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目１６８に記載の方法。
（項目１７６）
前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、それぞれ独立して、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、項目１６８～１７５のいずれかに記載の方法。
（項目１７７）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低く、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドおよび前記第６のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低い、項目１６８～１７６のいずれかに記載の方法。
（項目１７８）
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が同じ管で実施される、項目１６８～１７７のいずれかに記載の方法。
（項目１７９）
ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に精製が実施されない、項目１６８～１７７のいずれかに記載の方法。
（項目１８０）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１７９のいずれかに記載の方法。
（項目１８１）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１８０のいずれかに記載の方法。
（項目１８２）
前記第３のオリゴヌクレオチドが、約１０塩基から約５０塩基の長さを有する、項目１３８～１８１のいずれかに記載の方法。
（項目１８３）
前記第４のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１８２のいずれかに記載の方法。
（項目１８４）
前記第５のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１８３のいずれかに記載の方法。
（項目１８５）
前記第６のオリゴヌクレオチドが、約１０塩基から約５０塩基の長さを有する、項目１３８～１４１のいずれかに記載の方法。
（項目１８６）
前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、それぞれ独立して、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基からなる群から選択される、項目１３８～１８５のいずれかに記載の方法。
（項目１８７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
（項目１８８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
（項目１８９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目１８８に記載の方法。
（項目１９０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
（項目１９２）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目１３８～１９１のいずれかに記載の方法。
（項目１９３）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性温度が、独立して、約９５℃から約９８℃である、項目１３８～１９２のいずれかに記載の方法。
（項目１９４）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記アニーリング温度が、独立して、約５５℃から約６５℃である、項目１３８～１９３のいずれかに記載の方法。
（項目１９５）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の伸長温度が、独立して、約６２℃から約７２℃である、項目１３８～１９４のいずれかに記載の方法。
（項目１９６）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の変性持続時間が、独立して、約３０秒から約２分である、項目１３８～１９５のいずれかに記載の方法。
（項目１９７）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの前記最初のサイクル時の変性温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より高い、項目１３８～１９６のいずれかに記載の方法。
（項目１９８）
ステップ（ｉｉ）が、第７のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、前記第８のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がない第３の３’ブロッキング基を含み、前記第８のオリゴヌクレオチドが、前記第７のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分をさらに含み、前記第１の条件集合は、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第８のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記リガーゼが、前記第７のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、前記第７のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のオリゴヌクレオチドを含む前記第２のプライマーを生成するのにさらに十分である、項目１３８～１９７のいずれかに記載の方法。
（項目１９９）
前記ライゲーション温度が、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１９８に記載の方法。
（項目２００）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの少なくとも前記最初のサイクル時の前記アニーリング温度および前記伸長温度が、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドの前記融解温度より高い、項目１９８～１９９のいずれかに記載の方法。
（項目２０１）
３’末端部分を含む第１のインデキシングプライマーと、
前記３’末端部分を含む第２のインデキシングプライマーと、
第１のリガーゼと、
第１のＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
（項目２０２）
前記３’末端部分に少なくとも部分的に相補的である５’部分を含むブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目２０１に記載のキット。
（項目２０３）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーにプレアニーリングされている、項目２０２に記載のキット。
（項目２０４）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーに相補的であり、前記第１のインデキシングプライマーに相補的でない前記５’部分の第１のさらなる部分３’を含む、項目２０２～２０３のいずれかに記載のキット。
（項目２０５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基、および前記第１のさらなる部分に対して３’に位置するヘアピン部分をさらに含み、前記ヘアピン部分が、第２のヘアピン配列の５’に位置する第１のヘアピン配列を含み、前記第１のヘアピン配列および前記第２のヘアピン配列が相補的であり、ヘアピンを形成することができる、項目２０４に記載のキット。
（項目２０６）
前記ヘアピン部分が、前記第１のヘアピン配列と前記第２のヘアピン配列の間に第３のヘアピン配列をさらに含む、項目２０５に記載のキット。
（項目２０７）
前記第３のヘアピン配列が、前記第１および第２のヘアピン配列と安定なステムループ構造を形成することを可能にするのに十分なループを形成する、項目２０６に記載のキット。
（項目２０８）
前記第３のヘアピン配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目２０６に記載のキット。
（項目２０９）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記５’部分と前記第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含み、前記第２のさらなる部分が、前記第１のインデキシングプライマーに相補的でなく、前記第２のさらなる部分が、前記第２のインデキシングプライマーに相補的でない、項目２０２～２０４のいずれかに記載のキット。
（項目２１０）
前記第２のさらなる部分が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、項目２０８に記載のキット。
（項目２１１）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含む、項目２０２～２０４および２０９～２１１のいずれかに記載のキット。
（項目２１２）
ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾が、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオシド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、ならびに前記第２のインデキシングプライマーに相補的でないＤＮＡ配列からなる群から選択される、項目２１１に記載のキット。
（項目２１３）
前記第１のインデキシングプライマーおよび前記第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立に、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目２０１～２１２のいずれかに記載のキット。
（項目２１４）
第１の３’末端部分を含む第１のインデキシングプライマーと、
前記第２の３’末端部分を含む第２のインデキシングプライマーと、
第３の３’末端部分を含む５’アダプターと、
第１のリガーゼと、
第１のＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
（項目２１５）
前記５’アダプターが、前記第１のインデキシングプライマーの前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、前記第３の３’末端部分に対して５’に位置する第１の５’部分、前記第１の５’部分に対して５’に位置し、前記第１の５’部分に相補的な第２の５’部分、および前記第１の５’部分の５’末端に位置する前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーをさらに含む、項目２１４に記載のキット。
（項目２１６）
前記第１の５’部分および前記第２の５’部分が、それぞれ約１２塩基から約２０塩基の長さを有する、項目２１５に記載のキット。
（項目２１７）
前記５’アダプターが、前記第１の５’部分と前記第２の５’部分の間に介在配列をさらに含む、項目２１４～２１６のいずれかに記載のキット。
（項目２１８）
前記介在配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目２１７に記載のキット。
（項目２１９）
前記複製ブロッカーが、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択される、項目２１４～２１８のいずれかに記載のキット。
（項目２２０）
前記５’アダプターが、約２５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目２１４～２１９のいずれかに記載のキット。
（項目２２１）
前記第１の５’部分および第２の５’部分が、ヘアピンを形成することができる、項目２１４～２２０のいずれかに記載のキット。
（項目２２２）
前記第１のリガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目２０１～２２１のいずれかに記載のキット。
（項目２２３）
前記第１のリガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目２２２に記載のキット。
（項目２２４）
前記第１のインデキシングプライマーが、配列番号１の配列を含む５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２０１～２２３のいずれかに記載のキット。
（項目２２５）
前記第２のインデキシングプライマーが、前記５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２０１～２２４のいずれかに記載のキット。
（項目２２６）
前記第１のインデキシングプライマーが、３つまたはそれより多いリボヌクレオチド塩基の５’側の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２０１～２２５のいずれかに記載のキット。
（項目２２７）
前記第２のインデキシングプライマーが、前記５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２２６に記載のキット。
（項目２２８）
前記５’テール配列に相補的であり、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むプローブオリゴヌクレオチド、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素、および第２のリガーゼをさらに含む、項目２２４～２２７のいずれかに記載のキット。
（項目２２９）
エクソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素がエクソヌクレアーゼＩＩＩである、項目２２８に記載のキット。
（項目２３０）
標的特異的プライマー対をさらに含む、項目２０１～２２９のいずれかに記載のキット。
（項目２３１）
複数の標的特異的プライマー対をさらに含む、項目２０１～２２９のいずれかに記載のキット。
（項目２３２）
ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含むユニバーサルプライマーをさらに含む、項目２０１～２３１のいずれかに記載のキット。
（項目２３３）
第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、項目２３０～２３２のいずれかに記載のキット。
（項目２３４）
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含む、項目２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
（項目２３５）
ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目２３４に記載のキット。
（項目２３６）
リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素をさらに含む、項目２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
（項目２３７）
リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目２３６に記載のキット。
（項目２３８）
イノシン塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含む、項目２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
（項目２３９）
イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶある、項目２３８に記載のキット。
（項目２４０）
前記第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼが、それぞれ独立して、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目２０１～２３９のいずれかに記載のキット。
（項目２４１）
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目２０１～２４０のいずれかに記載のキット。
（項目２４２）
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目２４１に記載のキット。
（項目２４３）
前記第１のインデキシングプライマーおよび前記第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立に、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目２１５～２４２のいずれかに記載のキット。
（項目２４４）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含み、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が、前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が、前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化させ、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じて前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目２４５）
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのｄＵ塩基を含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目２４６）
前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ＵＤＧとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目２４５に記載の方法。
（項目２４７）
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのリボヌクレオチドをそれぞれ含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目２４８）
前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目２４７に記載の方法。
（項目２４９）
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのイノシン塩基をそれぞれ含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目２５０）
前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、項目２４９に記載の方法。
（項目２５１）
前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子が、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の３’オーバーハングにアニーリングされた相補鎖を含む、項目２４５～２５０のいずれかに記載の方法。
（項目２５２）
前記相補鎖が、ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含む、項目２５２に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分、および前記第２の３’末端部分に対して５’に位置し、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の５’部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分および前記第１の５’部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分および第１の５’部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目２）
ステップ（ｉ）～（ｖｉ）が単一密閉管において実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が１３塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が配列番号１２７（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣ－３’）の配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第１の３’末端部分および前記第２の３’末端部分が、それぞれ配列番号１２６（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）の配列を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、ライゲーション温度より高い融解温度（Ｔ ｍ ）を有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、第１のアニーリング温度より低いＴ ｍ を有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分のＴ ｍ が、前記ライゲーション温度より少なくとも１℃高く、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分のＴ ｍ が、前記第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低い、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、前記第１のアニーリング温度より低い融解温度（Ｔ ｍ ）を有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の３’末端部分が、前記第１のアニーリング温度より低いＴ ｍ を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約２０塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が２０塩基の長さを有する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ ｍ ）より少なくとも１℃低い、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ ｍ ）より低い、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第３の鎖および第４の鎖の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記第１の変性温度より低い、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ライゲーション持続時間が約２０分である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、３’～５’エクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分の融解温度（Ｔ ｍ ）が、それぞれ、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分のＴ ｍ より高い、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の変性温度、前記第２の変性温度および前記第３の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃である、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間および前記第３の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃である、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間および前記第３のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度および前記第３の伸長温度が、それぞれ独立して約６２℃から約７２℃である、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間および前記第３の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約２００ｎＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目１に記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ｉｉ）が、ブロッカーオリゴヌクレオチドを前記第１の反応混合物に添加することをさらに含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な５’部分を含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記ライゲーション温度より高く、前記第１のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より低い、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記Ｔ ｍ が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々のＴ ｍ より高い、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第１の鎖の前記第１の５’末端へのライゲーションおよび前記第２の鎖の前記第２の５’末端へのライゲーションを抑制するのに十分な量の前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが添加される、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの量の１倍、１．５倍、２倍、４倍または６倍の量添加される、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々にプレアニーリングされる、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的であり、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、５’部分に対して３’に位置する第１のさらなる部分を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
前記第１のさらなる部分と５’部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記５’部分と前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度とほぼ同じ、またはそれより高い、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記第１のさらなる部分と前記５’部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の前記Ｔ ｍ が、前記５’部分と前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度より少なくとも１℃高い、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記５’部分と前記第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含み、前記第２のさらなる部分が、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でなく、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、項目４６～４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
前記第２のさらなる部分が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目５２）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない前記配列が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目５４）
ポリメラーゼ伸長を阻害するための前記３’修飾が、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオチド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、またはポリＴ、ポリＡ、ポリＣおよびポリＧなどの、前記隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列であって、プルーフリーディングポリメラーゼ３’～５’エクソヌクレアーゼ活性が、前記隣接するプライマー配列に相補的でない前記ＤＮＡ配列を除去することを防止するためにヌクレアーゼ抵抗性結合をさらに含むＤＮＡ配列からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間のＴ ｍ より低い、項目４１に記載の方法。
（項目５６）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々との間の前記Ｔ ｍ が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間のＴ ｍ より少なくとも５℃低い、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号１２７の配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目５８）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基、および前記第１のさらなる部分に対して３’に位置するヘアピン部分をさらに含み、前記ヘアピン部分が、第１のヘアピン配列および第２のヘアピン配列を含み、前記第１のヘアピン配列が、前記第２のヘアピン配列に対して５’に位置し、前記第１のヘアピン配列および前記第２のヘアピン配列が相補的であり、前記ヘアピン部分が、前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より高い融解温度を有する、項目４６～５０のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
前記ヘアピン部分が、前記第１のヘアピン配列と前記第２のヘアピン配列との間に位置する第３のヘアピン配列をさらに含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記第３のヘアピン配列が、前記ヘアピン部分および前記第１のさらなる部分による安定なステムループ構造の形成を可能にするのに十分なループを形成する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記第３のヘアピン配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ヘアピン部分の融解温度が、前記５’部分と前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、前記さらなる部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々またはその両方との間の融解温度より高い、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記第２の条件集合は、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長ヘアピンブロッカーを生成するのにさらに十分である、項目５８～６０のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記伸長ヘアピンブロッカーが、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より高い融解温度（Ｔ ｍ ）を有する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記伸長ヘアピンブロッカーが、安定した第２の構造を有する、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記伸長ヘアピンブロッカーの融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記５’部分および前記第１のさらなる部分から前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々までのＴ ｍ より高い、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、配列番号８７の配列をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６８）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、配列番号７８の配列をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６９）
前記第５の鎖および第７の鎖または前記第６の鎖および前記第８の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第５の鎖および第６の鎖が、前記第５の鎖および第６の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第５の鎖および第７の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第６の鎖および第８の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖、第８の鎖、第２のリガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
前記正規化ＮＧＳライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分および第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が、相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が、前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が、前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列をそれぞれ含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、複数の５’アダプター、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第２の３’末端部分を含み、前記第２の３’末端配列が、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的であり、前記複数の５’アダプターの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第３の３’末端配列、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、前記第３の３’末端配列に対して５’に位置する第１の５’部分、前記第１の５’部分に対して５’に位置し、前記第１の５’部分に相補的である第２の５’部分、および前記第１の５’部分の５’末端に位置する前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーを含み、前記５’アダプターが、前記第１の５’部分を前記第２の５’部分にアニーリングすることによって形成されるヘアピンを形成することができること、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、１）前記第３の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、２）前記リガーゼが、前記複数の５’アダプターの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端および前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の５’アダプターの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の５’アダプターの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖、第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体、および前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分のリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体を含む、第３の反応混合物を生成するのに十分な、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、
ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記第１の３’末端部分が、前記第５の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、前記第６の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第４の反応混合物を生成するのに十分な、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすること、
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、
ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第７の鎖の前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第８の鎖の前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第７の鎖および第８の鎖の各々にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第７の鎖、前記第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を含む第５の反応混合物であって、前記第９の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第１０の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖および第９の鎖が相補的であり、前記第８の鎖および第１０の鎖が相補的である第５の反応混合物を生成するのに十分な、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすること、および
（ｖｉｉ）前記第５の反応混合物を、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、および前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第７の鎖、第９の鎖および第８の鎖および第１０の鎖を増幅させるのに十分な、第４の変性持続時間にわたる第４の変性温度、第４のアニーリング持続時間にわたる第４のアニーリング温度、および第４の伸長持続時間にわたる第４の伸長温度を含む第５の条件集合下でインキュベートすること
を含む、ライゲーションカップルドＰＣＲの方法。
（項目７３）
ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）が単一密閉管において実施される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記第１の５’部分および前記第２の５’部分が、それぞれ約１２塩基から約２０塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記複数の５’アダプターの各々が、前記第１の５’部分と前記第２の５’部分の間に介在配列をさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記介在配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記複製ブロッカーが、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記複数の５’アダプターの各々が、約２５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目７９）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８０）
それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８１）
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８２）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８３）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、１３塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８４）
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、配列番号１２７の配列を含む、項目７２に記載の方法。
（項目８５）
前記複数の５’アダプターの各々の前記第３の３’末端部分が、配列番号１２６の配列を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目８７）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分が、前記ライゲーション温度より高い融解温度を有する、項目７２に記載の方法。
（項目８８）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第２の３’末端部分および前記第２の共通ヌクレオチド配列が、前記第１のアニーリング温度より高い融解温度を有する、項目７２に記載の方法。
（項目８９）
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分の融解温度が、前記ライゲーション温度より少なくとも１℃高く、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分の前記融解温度が、前記第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低い、項目７２に記載の方法。
（項目９０）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約１００塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目９１）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約２０塩基の長さを有する、項目７２に記載の方法。
（項目９２）
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、配列番号９５の配列を含む、項目７２に記載の方法。
（項目９３）
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度より低い、項目７２に記載の方法。
（項目９４）
前記第３および第４の鎖の融解温度が、前記第１の変性温度より低い、項目７２に記載の方法。
（項目９５）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目７２に記載の方法。
（項目９６）
前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、項目７２に記載の方法。
（項目９７）
前記ライゲーション持続時間が約２０分である、項目７２に記載の方法。
（項目９８）
前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目７２に記載の方法。
（項目９９）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目７２に記載の方法。
（項目１００）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記リガーゼが温度感受性であり、前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目７２に記載の方法。
（項目１０２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目１０３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目７２に記載の方法。
（項目１０４）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｄ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目７２に記載の方法。
（項目１０７）
前記第１の変性温度、前記第２の変性温度、前記第３の変性温度および前記第４の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃である、項目７２に記載の方法。
（項目１０８）
前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間、前記第３の変性持続時間および前記第４の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、項目７２に記載の方法。
（項目１０９）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目７２に記載の方法。
（項目１１０）
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約２００ｎＭで前記第１の反応混合物に添加される、項目７２に記載の方法。
（項目１１１）
前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度、前記第３のアニーリング温度および前記第４のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃である、項目７２に記載の方法。
（項目１１２）
前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間、前記第３のアニーリング持続時間および前記第４のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、項目７２に記載の方法。
（項目１１３）
前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度、前記第３の伸長温度および前記第４の伸長温度が、それぞれ独立して約６０℃から約７２℃である、項目７２に記載の方法。
（項目１１４）
前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間、前記第３の伸長持続時間および前記第４の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、項目７２に記載の方法。
（項目１１５）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、配列番号８７の配列をさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目１１６）
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、配列番号７８の配列をさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目１１７）
前記第７の鎖および第９の鎖または前記第８の鎖および前記第１０の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、項目７２～１１６のいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第９の鎖および第１０の鎖が、前記第９の鎖および第１０の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第９の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第８の鎖および第１０の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖、第１０の鎖、リガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目７２～１１７のいずれかに記載の方法。
（項目１１９）
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、前記第１の開始鎖の５’末端にユニバーサルプライマー配列を含み、前記ユニバーサルプライマー配列が、前記ユニバーサルプライマー配列の内部またはその３’末端にｄＵ塩基を含み、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、前記第２の開始鎖の５’末端に前記ユニバーサルプライマー配列を含むこと、
前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記ｄＵ塩基および開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を開裂することが可能な前記酵素を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２０）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能配列を含み、前記第１の５’開裂可能配列が、前記第１の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含み、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能配列を含み、前記第２の５’開裂可能配列が、前記第２の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含むこと、
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列のリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素ならびに前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることをステップ（ｉ）の前にさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２２）
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能配列を含み、前記第１の５’開裂可能配列が、前記第１の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含み、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能配列を含み、前記第２の５’開裂可能配列が、前記第２の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含むこと、
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素ならびに前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２４）
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、ｄＵ塩基および３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の鎖および第２の鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２６）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、リボヌクレオチドおよび３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
リボヌクレオチドを含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の開始鎖および第２の開始鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の鎖および第２の鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の鎖および前記第２の鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、イノシン塩基および３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
イノシン塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の鎖および第２の鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１および第２の鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションＰＣＲ反応混合物に添加すること、および
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１３０）
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が、５’末端および３’末端を含み、前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと、
各３’アダプター鎖が、３’末端ｄＵ塩基および３’ヒドロキシル基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
３’末端ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、前記相補鎖の１つを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記相補鎖が、相補鎖の内部にさらなるｄＵ塩基を含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３４）
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が、５’末端および３’末端を含み、前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと、
各３’アダプター鎖が、３’末端Ｔ塩基、３’ヒドロキシル基およびｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
３’末端Ｔ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、前記相補鎖の１つを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１３５）
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
標的ＤＮＡを断片化して、前記断片化ＤＮＡ基質分子を生成することをさらに含む、項目１２５～１３５のいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
ステップ（ｉ）～（ｖｉ）または（ｉ）～（ｖｉｉ）の間に精製が実施されない、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３８）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、前記第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、前記第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと、
（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第１のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、前記第１のプライマーが、前記第２の鎖の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分を含み、前記第１の３’ブロッキング基がポリメラーゼ連鎖伸長の能力がなく、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有すること、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、前記第１のプライマー、前記二本鎖ＤＮＡ基質、および前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、および
（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸長持続時間にわたる伸長温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを前記第２の反応混合物に施して、前記第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、前記第１のプライマーを前記二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む前記二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成すること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目１３９）
（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを前記第３の反応混合物に施して、前記二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含む、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記ライゲーション温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より低い、項目１３８に記載の方法。
（項目１４１）
前記ライゲーション温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１３８に記載の方法。
（項目１４２）
前記リガーゼが低マグネシウムＰＣＲ緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目１３８に記載の方法。
（項目１４３）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目１３８に記載の方法。
（項目１４４）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目１３８に記載の方法。
（項目１４６）
ステップ（ｉｉ）が、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、前記第５のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がない第２の３’ブロッキング基を含み、前記第５のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、および前記第４のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分をさらに含み、前記第１の条件集合は、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドが前記第５のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記リガーゼが、前記第４のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、前記第４のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のオリゴヌクレオチドを含む前記第２のプライマーを生成するのにさらに十分である、項目１３８に記載の方法。
（項目１４７）
前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記第２の３’ブロッキング基が、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、項目１４６に記載の方法。
（項目１４９）
前記第４のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、項目１４６に記載の方法。
（項目１５０）
前記第５のオリゴヌクレオチドが、約１０から約５０塩基の長さを有する、項目１４６に記載の方法。
（項目１５１）
前記第５のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低い、項目１４６に記載の方法。
（項目１５２）
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が同じ管で実施される、項目１３８～１５１のいずれかに記載の方法。
（項目１５３）
ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に精製が実施されない、項目１３８～１５１のいずれかに記載の方法。
（項目１５４）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１５３のいずれかに記載の方法。
（項目１５５）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１５４のいずれかに記載の方法。
（項目１５６）
前記第３のオリゴヌクレオチドが、約１０から約５０塩基の長さを有する、項目１３８～１５５のいずれかに記載の方法。
（項目１５７）
前記第１の３’ブロッキング基が、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、項目１３８～１５６のいずれかに記載の方法。
（項目１５８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１５９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１６０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性温度を上昇させる、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１６０に記載の方法。
（項目１６２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１６３）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目１３８～１６２のいずれかに記載の方法。
（項目１６４）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性温度が、独立して、約９５℃から約９８℃である、項目１３８～１６３のいずれかに記載の方法。
（項目１６５）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記アニーリング温度が、独立して、約５５℃から約６５℃である、項目１３８～１６４のいずれかに記載の方法。
（項目１６６）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記伸長温度が、独立して、約６２℃から約７２℃である、項目１３８～１６５のいずれかに記載の方法。
（項目１６７）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性持続時間が、独立して、約３０秒から約２分である、項目１３８～１６６のいずれかに記載の方法。
（項目１６８）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、前記第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、前記第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと、
（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第４のオリゴヌクレオチド、第５のオリゴヌクレオチド、第６のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有し、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第６のオリゴヌクレオチドが、前記第４のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、前記第５のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および第２の３’ブロッキング基を含み、前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がないこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第６のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、前記第５のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第４のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー、前記二本鎖ＤＮＡ基質、および前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、
（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸長持続時間にわたる伸長温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを前記第２の反応混合物に施して、前記第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、前記第１のプライマーを前記二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む前記二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成すること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目１６９）
（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを前記第３の反応混合物に施して、前記二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
前記ライゲーション温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より低い、項目１６８に記載の方法。
（項目１７１）
前記ライゲーション温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第５のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１６８に記載の方法。
（項目１７２）
前記リガーゼが、低マグネシウムＰＣＲ緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目１６８に記載の方法。
（項目１７３）
前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目１６８に記載の方法。
（項目１７４）
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、項目１７３に記載の方法。
（項目１７５）
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、項目１６８に記載の方法。
（項目１７６）
前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、それぞれ独立して、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、項目１６８～１７５のいずれかに記載の方法。
（項目１７７）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低く、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドおよび前記第６のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低い、項目１６８～１７６のいずれかに記載の方法。
（項目１７８）
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が同じ管で実施される、項目１６８～１７７のいずれかに記載の方法。
（項目１７９）
ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に精製が実施されない、項目１６８～１７７のいずれかに記載の方法。
（項目１８０）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１７９のいずれかに記載の方法。
（項目１８１）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１８０のいずれかに記載の方法。
（項目１８２）
前記第３のオリゴヌクレオチドが、約１０塩基から約５０塩基の長さを有する、項目１３８～１８１のいずれかに記載の方法。
（項目１８３）
前記第４のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１８２のいずれかに記載の方法。
（項目１８４）
前記第５のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目１３８～１８３のいずれかに記載の方法。
（項目１８５）
前記第６のオリゴヌクレオチドが、約１０塩基から約５０塩基の長さを有する、項目１３８～１４１のいずれかに記載の方法。
（項目１８６）
前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、それぞれ独立して、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基からなる群から選択される、項目１３８～１８５のいずれかに記載の方法。
（項目１８７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
（項目１８８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、項目１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
（項目１８９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目１８８に記載の方法。
（項目１９０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるのに十分である、項目１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
（項目１９２）
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、項目１３８～１９１のいずれかに記載の方法。
（項目１９３）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性温度が、独立して、約９５℃から約９８℃である、項目１３８～１９２のいずれかに記載の方法。
（項目１９４）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記アニーリング温度が、独立して、約５５℃から約６５℃である、項目１３８～１９３のいずれかに記載の方法。
（項目１９５）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の伸長温度が、独立して、約６２℃から約７２℃である、項目１３８～１９４のいずれかに記載の方法。
（項目１９６）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の変性持続時間が、独立して、約３０秒から約２分である、項目１３８～１９５のいずれかに記載の方法。
（項目１９７）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの前記最初のサイクル時の変性温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より高い、項目１３８～１９６のいずれかに記載の方法。
（項目１９８）
ステップ（ｉｉ）が、第７のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、前記第８のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がない第３の３’ブロッキング基を含み、前記第８のオリゴヌクレオチドが、前記第７のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分をさらに含み、前記第１の条件集合は、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第８のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記リガーゼが、前記第７のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、前記第７のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のオリゴヌクレオチドを含む前記第２のプライマーを生成するのにさらに十分である、項目１３８～１９７のいずれかに記載の方法。
（項目１９９）
前記ライゲーション温度が、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、項目１９８に記載の方法。
（項目２００）
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの少なくとも前記最初のサイクル時の前記アニーリング温度および前記伸長温度が、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドの前記融解温度より高い、項目１９８～１９９のいずれかに記載の方法。
（項目２０１）
３’末端部分を含む第１のインデキシングプライマーと、
前記３’末端部分を含む第２のインデキシングプライマーと、
第１のリガーゼと、
第１のＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
（項目２０２）
前記３’末端部分に少なくとも部分的に相補的である５’部分を含むブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目２０１に記載のキット。
（項目２０３）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーにプレアニーリングされている、項目２０２に記載のキット。
（項目２０４）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーに相補的であり、前記第１のインデキシングプライマーに相補的でない前記５’部分の第１のさらなる部分３’を含む、項目２０２～２０３のいずれかに記載のキット。
（項目２０５）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基、および前記第１のさらなる部分に対して３’に位置するヘアピン部分をさらに含み、前記ヘアピン部分が、第２のヘアピン配列の５’に位置する第１のヘアピン配列を含み、前記第１のヘアピン配列および前記第２のヘアピン配列が相補的であり、ヘアピンを形成することができる、項目２０４に記載のキット。
（項目２０６）
前記ヘアピン部分が、前記第１のヘアピン配列と前記第２のヘアピン配列の間に第３のヘアピン配列をさらに含む、項目２０５に記載のキット。
（項目２０７）
前記第３のヘアピン配列が、前記第１および第２のヘアピン配列と安定なステムループ構造を形成することを可能にするのに十分なループを形成する、項目２０６に記載のキット。
（項目２０８）
前記第３のヘアピン配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目２０６に記載のキット。
（項目２０９）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記５’部分と前記第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含み、前記第２のさらなる部分が、前記第１のインデキシングプライマーに相補的でなく、前記第２のさらなる部分が、前記第２のインデキシングプライマーに相補的でない、項目２０２～２０４のいずれかに記載のキット。
（項目２１０）
前記第２のさらなる部分が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、項目２０８に記載のキット。
（項目２１１）
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含む、項目２０２～２０４および２０９～２１１のいずれかに記載のキット。
（項目２１２）
ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾が、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオシド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、ならびに前記第２のインデキシングプライマーに相補的でないＤＮＡ配列からなる群から選択される、項目２１１に記載のキット。
（項目２１３）
前記第１のインデキシングプライマーおよび前記第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立に、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目２０１～２１２のいずれかに記載のキット。
（項目２１４）
第１の３’末端部分を含む第１のインデキシングプライマーと、
前記第２の３’末端部分を含む第２のインデキシングプライマーと、
第３の３’末端部分を含む５’アダプターと、
第１のリガーゼと、
第１のＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
（項目２１５）
前記５’アダプターが、前記第１のインデキシングプライマーの前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、前記第３の３’末端部分に対して５’に位置する第１の５’部分、前記第１の５’部分に対して５’に位置し、前記第１の５’部分に相補的な第２の５’部分、および前記第１の５’部分の５’末端に位置する前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーをさらに含む、項目２１４に記載のキット。
（項目２１６）
前記第１の５’部分および前記第２の５’部分が、それぞれ約１２塩基から約２０塩基の長さを有する、項目２１５に記載のキット。
（項目２１７）
前記５’アダプターが、前記第１の５’部分と前記第２の５’部分の間に介在配列をさらに含む、項目２１４～２１６のいずれかに記載のキット。
（項目２１８）
前記介在配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、項目２１７に記載のキット。
（項目２１９）
前記複製ブロッカーが、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択される、項目２１４～２１８のいずれかに記載のキット。
（項目２２０）
前記５’アダプターが、約２５塩基から約１００塩基の長さを有する、項目２１４～２１９のいずれかに記載のキット。
（項目２２１）
前記第１の５’部分および第２の５’部分が、ヘアピンを形成することができる、項目２１４～２２０のいずれかに記載のキット。
（項目２２２）
前記第１のリガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、項目２０１～２２１のいずれかに記載のキット。
（項目２２３）
前記第１のリガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、項目２２２に記載のキット。
（項目２２４）
前記第１のインデキシングプライマーが、配列番号１の配列を含む５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２０１～２２３のいずれかに記載のキット。
（項目２２５）
前記第２のインデキシングプライマーが、前記５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２０１～２２４のいずれかに記載のキット。
（項目２２６）
前記第１のインデキシングプライマーが、３つまたはそれより多いリボヌクレオチド塩基の５’側の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２０１～２２５のいずれかに記載のキット。
（項目２２７）
前記第２のインデキシングプライマーが、前記５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、項目２２６に記載のキット。
（項目２２８）
前記５’テール配列に相補的であり、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むプローブオリゴヌクレオチド、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素、および第２のリガーゼをさらに含む、項目２２４～２２７のいずれかに記載のキット。
（項目２２９）
エクソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素がエクソヌクレアーゼＩＩＩである、項目２２８に記載のキット。
（項目２３０）
標的特異的プライマー対をさらに含む、項目２０１～２２９のいずれかに記載のキット。
（項目２３１）
複数の標的特異的プライマー対をさらに含む、項目２０１～２２９のいずれかに記載のキット。
（項目２３２）
ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含むユニバーサルプライマーをさらに含む、項目２０１～２３１のいずれかに記載のキット。
（項目２３３）
第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、項目２３０～２３２のいずれかに記載のキット。
（項目２３４）
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含む、項目２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
（項目２３５）
ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目２３４に記載のキット。
（項目２３６）
リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素をさらに含む、項目２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
（項目２３７）
リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目２３６に記載のキット。
（項目２３８）
イノシン塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含む、項目２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
（項目２３９）
イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶある、項目２３８に記載のキット。
（項目２４０）
前記第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼが、それぞれ独立して、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目２０１～２３９のいずれかに記載のキット。
（項目２４１）
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、項目２０１～２４０のいずれかに記載のキット。
（項目２４２）
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、項目２４１に記載のキット。
（項目２４３）
前記第１のインデキシングプライマーおよび前記第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立に、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、項目２１５～２４２のいずれかに記載のキット。
（項目２４４）
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含み、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が、前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が、前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化させ、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じて前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（項目２４５）
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのｄＵ塩基を含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目２４６）
前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ＵＤＧとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、項目２４５に記載の方法。
（項目２４７）
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのリボヌクレオチドをそれぞれ含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目２４８）
前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、項目２４７に記載の方法。
（項目２４９）
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのイノシン塩基をそれぞれ含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、項目１～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目２５０）
前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、項目２４９に記載の方法。
（項目２５１）
前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子が、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の３’オーバーハングにアニーリングされた相補鎖を含む、項目２４５～２５０のいずれかに記載の方法。
（項目２５２）
前記相補鎖が、ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含む、項目２５２に記載の方法。
Claims (23)
- （ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分、および前記第２の３’末端部分に対して５’に位置し、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の５’部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分および前記第１の５’部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分および第１の５’部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。 - ステップ（ｉ）～（ｖｉ）が単一密閉管において実施される、請求項１に記載の方法。
- 前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有し、それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有し、前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有し、前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約５塩基から約３０塩基の長さを有し、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、ライゲーション温度より高い融解温度（Ｔｍ）を有し、前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ ｍ ）より低く、前記第３の鎖および第４の鎖の融解温度（Ｔ ｍ ）が、前記第１の変性温度より低く、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第１の３’末端部分および前記第２の３’末端部分が、第１のアニーリング温度より低いＴｍを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、請求項１に記載の方法。
- 前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、請求項１に記載の方法。
- 前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記リガーゼがＴ３ ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、請求項８に記載の方法。
- 前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、３’～５’エクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、請求項１に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、請求項１２に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
- 前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分の融解温度（Ｔｍ）が、それぞれ、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分のＴｍより高い、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の変性温度、前記第２の変性温度および前記第３の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃であり、前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間および前記第３の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃であり、前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間および前記第３のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度および前記第３の伸長温度が、それぞれ独立して約６２℃から約７２℃であり、前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間および前記第３の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、請求項１に記載の方法。
- 前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
- 前記第５の鎖および第７の鎖または前記第６の鎖および前記第８の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第５の鎖および第６の鎖が、前記第５の鎖および第６の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第５の鎖および第７の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第６の鎖および第８の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖、第８の鎖、第２のリガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 前記正規化ＮＧＳライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
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