JP2023525880A

JP2023525880A - ライゲーションカップルドｐｃｒの方法

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Publication number: JP2023525880A
Application number: JP2022569537A
Authority: JP
Inventors: ブラディミルマカロフ，; ジョーダンローズフィグラ，; ビタラハン，; ロバートディー．ステットフェルド，
Original assignee: インテグレイテッドディーエヌエーテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2023-06-19
Also published as: KR20230012554A; AU2021270596A1; CA3178211A1; CN116249775A; WO2021232023A3; US20230257805A1; WO2021232023A2; EP4150106A2

Abstract

本開示は、ライゲーションカップルドＰＣＲの方法およびキットを提供する。ライゲーションおよびＰＣＲ、ならびに必要に応じて酵素消化を単一密閉管で実施する方法が提供される。スプリント媒介プライマーアセンブリおよびライゲーションカップルドＰＣＲの方法およびキットも提供される。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）による分析のための重要な要件は、ＮＧＳライブラリーの調製である。このプロセス時に、目的の核酸をまず断片化することができ、ＲＮＡから開始する場合はｃＤＮＡを生成することができ、多くの標的化シークエンシングワークフローについて目的の遺伝子座に特異的な多重ＰＣＲを実施することができる。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，７３８号の利益を主張する。

配列表
本件出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年５月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、８５５６３－３３７８６４＿ＳＬ＿０５１６２１ａ．ｔｘｔと命名され、サイズが３３，９５３バイトである。

背景
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）による分析のための重要な要件は、ＮＧＳライブラリーの調製である。このプロセス時に、目的の核酸をまず断片化することができ、ＲＮＡから開始する場合はｃＤＮＡを生成することができ、多くの標的化シークエンシングワークフローについて目的の遺伝子座に特異的な多重ＰＣＲを実施することができる。次に、基質末端を修復し、ＮＧＳアダプターにライゲーションして、ライブラリー合成を完了する。ＮＧＳアダプターは、ライブラリー増幅、フローセル上でのライブラリー分子のクローン増幅、およびシークエンシングプライマーのアニーリングを可能にする。ＮＧＳアダプターは、ライブラリーの多重化シークエンシングを可能にするために試料特異的インデックスをも組み込む一方で、ランダムヌクレオチド（６つまたはそれより多いＮ塩基）を含むタグを必要に応じて使用することによって各ライブラリー分子の固有の分子バーコーディングが可能になる。ライゲーションステップ時に、完全長のインデキシングされたアダプターを使用してＮＧＳライブラリーを構築することが可能であり、あるいはＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングでは、基質に最も近い近隣アダプターを含むトランケーションされたアダプターをライゲーションすることが可能であり、次いで試料特異的インデックスおよびさらなる末端アダプター配列を、トランケーションされたアダプター配列にアニーリングする５’テールドインデキシングＰＣＲプライマーを使用してライブラリー増幅時に組み込む。

断片化ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは多重化ＰＣＲアンプリコンからのＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製のための伝統的方法は、１）ＤＮＡポリシング、末端修復、および基質の３’末端に対するＡテーリング、２）３’末端にＴヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖領域および２つの異なる一本鎖アダプター配列を含むＹ状またはステムループアダプターの両基質ＤＮＡ鎖へのライゲーション、ならびに３）２つのアダプター配列に相補的なプライマー対によるＰＣＲ増幅を含む３つのステップを必要とする。この方法は、現在、ＴｒｕＳｅｑナノＤＮＡライブラリーキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＮＥＢＮｅｘｔＵｌｔｒａＩＩＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＫｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）およびＫＡＰＡＨｙｐｅｒＰｒｅｐＫｉｔｓ（Ｒｏｃｈｅ）などの多くの市販のキットで利用されている。ＤＮＡ基質ＡテーリングおよびＴオーバーハングアダプターライゲーションを使用すると、２つの挿入物およびアダプター二量体を含むキメラライブラリー分子などの望ましくない生成物の減少が促され、非対称性Ｙ状またはステムループアダプターを使用すると、ライブラリーのコンプレクシティを失うことなく単一ステップの反応でのＡテールド基質の両鎖に対するアダプターの接続が可能になる。

特定の他の方法は、平滑末端化アダプターを使用し、基質の１つのＤＮＡ鎖のみにライゲーションするアダプターを使用することによりアダプター二量体の形成を回避するが、キメラライブラリー分子を防止する手段を有さないためＤＮＡ投入量を５０ｎｇに制限する。例えば、ＳＭＡＲＴｅｒＴｈｒｕＰＬＥＸＤＮＡ－Ｓｅｑ（Ｔａｋａｒａ）、およびＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＤＮＡライブラリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）など、ＡｍｐｌｉＳｅｑ標的化多重ＰＣＲライブラリー構築に使用されるキットにおいて使用される方法では、２つの平坦末端アダプターが基質ＤＮＡ分子の５’末端にライゲーションし、ＤＮＡ基質の３’末端は、ライゲーションされずに残留し、次いでＰＣＲ増幅の前に、次のステップでＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。それらのキットは、２つの異なる二本鎖アダプターの混合物を使用するため、完全にライゲーションされたＤＮＡ断片の５０％のみが、シークエンシングに必要とされる２つの異なるアダプターを含み、完全にライゲーションされたＤＮＡ断片の５０％が、シークエンシングできない同様のアダプターの２つをライゲーションすることによって失われるため、収率およびライブラリーコンプレクシティが１／２に減少したＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは標的化アンプリコンライブラリーが生成する。

ＣｌｅａｎＰｌｅｘ（ＰａｒａｇｏｎＧｅｎｏｍｉｃｓ）などの他の標的化シークエンシングライブラリー調製方法は、第１の標的特異的多重ＰＣＲステップの後に第２のインデキシングＰＣＲステップが続くように、各フォワード標的特異的プライマーが、第１のトランケーションされたアダプター配列を含む５’テールを有し、各リバース標的特異的プライマーが、第２のトランケーションされたアダプターを含む５’テールを有し、インデキシングプライマー対が試料特異的インデックスおよび末端アダプター配列を５’テールに含み、第１および第２のＮＧＳアダプター配列を完了するように使用される５’テールド標的特異的プライマーを利用する。これは、簡素なワークフローであるが、プライマー二量体を除去するためにさらなるバックグラウンド浄化ステップを組み込まなければ、多重ＰＣＲステップ時に、シークエンシングのコストを増加させる高い割合のプライマー二量体を生成することが可能であり、その方法は、単に一方向から各ライブラリー鎖をシークエンシングする方向性ライブラリーをも生成する。体系的なシークエンシング誤差により、変異体コーリングのための最高精度配列データ品質のために、両方向からの各鎖の対合末端シークエンシングを実施することが望ましい。この方法と同様に、上記ＡｍｐｌｉＳｅｑ方法にも、いくつかの多重ＰＣＲ後酵素的ステップを導入する、末端ポリシングによりＮＧＳライブラリーの完了前にプライマー二量体を除去するためのさらなるステップ、アダプターライゲーションおよび必要に応じたＰＣＲ増幅ステップの組み込みが必要である。

標的化シークエンシングの理想的な方法は、最小数の酵素的ステップから、非方向性の高コンプレクシティライブラリーを生成し、最終的なライブラリーにおけるプライマー二量体含有物を防止する。Ａｃｃｅｌ－ＡｍｐｌｉｃｏｎおよびＳｗｉｆｔＡｍｐｌｉｃｏｎパネルとして商品化されている既に開示された標的化多重化ＰＣＲライブラリー調製（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，３１６，３５９号に記載）では、このワークフローが、二本鎖アダプターライゲーションのライブラリーコンプレクシティの限界を克服し、非方向性ライブラリーを生成し、ワークフローにさらなるステップを組み込むことなくプライマー二量体の蓄積をさらに防止する。この方法は、ＡｍｐｌｉＳｅｑ、ＣｌｅａｎＰｌｅｘ、および重複するアンプリコンを生成するプライマー対を２つの管に分ける必要がある他の多重化ＰＣＲ標的化シークエンシングワークフローと異なり、単一管多重化ＰＣＲ反応で重複するアンプリコンを生成するプライマー対を使用する連続カバレッジをも可能にする。ＳｗｉｆｔＡｍｐｌｉｃｏｎ法は、単一管ワークフローを利用することによって多数の試料を処理する場合の試料トラッキング誤差を減少させるだけでなく、より重要なこととして、投入材料が限定され、低頻度変異体を検出するための感度が必要である、血液および他の流体からの液体生検／無細胞ＤＮＡなどの試料に適する。単一管アッセイは、個別の管を必要とするアッセイと比較して、より高感度で、限定的な試料から投入ＤＮＡ分子のより多くのコピー数を可能にする。

Ｓｗｉｆｔ多重化ＰＣＲに続いて、精製ステップを実施することが可能であり、完全にライゲーションされた分子が１００％の機能性および非方向性を有し、Ｙ状アダプターに類似する精製多重化ＰＣＲアンプリコン上でアダプターライゲーションステップを実施することが可能であるが、この方法は、標的特異的アンプリコンの各鎖の５’末端および３’末端に独立してライゲーションする個別の５’および３’アダプターを使用する。これは、効率的かつ簡易なワークフローであるが、さらなるＰＣＲ増幅ステップが存在しないため、Ｑｕｂｉｔなどの蛍光分析法は、完全にライゲーションされた機能性分子から部分的にライゲーションされたものを区別できないことにより、ライブラリーをｑＰＣＲでしか高精度に定量できない。また、Ｙ状アダプターと同様に、５’および３’一本鎖アダプターテールは、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）などの電気泳動チップ上に泳動アーチファクトをもたらすため、これらの方法を使用しても定量が不正確になる。したがって、より高いライブラリー収率を可能にするためのＳｗｉｆｔＡｍｐｌｉｃｏｎ法の改造型が望まれる。また、高スループット用途では、シークエンシングの前に高精度の定量のためにｑＰＣＲを必要とするライブラリーをもたらさないその方法の改造型も望まれる。しかし、これらの改造型は、好ましくは、多重化ＰＣＲを使用する標的化ライブラリー調製のための当該技術分野における好適な標準である二インキュベーション法を維持するために、さらなる酵素的または精製ステップをワークフローに導入しない。本明細書に開示する新規の方法は、これらの提案されたワークフローの改善に対する解決策を提供する。

ＤＮＡＮＧＳライブラリー調製のための理想的な方法には、酵素的ステップの数が最小限であること（３つまたはそれより少ない）、精製ステップの数が最小限であること（ＰＣＲ後の精製を含めて２つまたはそれより少ない）、ＤＮＡ利用率が１００％に近いこと、ＤＮＡ投入量の範囲が広いこと（望ましくは、ピコグラムからフェムトグラム範囲の低閾値およびマイクログラムの投入量範囲の高閾値）、アダプター－アダプター二量体およびＤＮＡキメラがないこと、ならびに多くの現在利用可能なキットに存在するアダプター濃度調整が不要であることが必要とされる。

その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，３１６，３５７号に記載のＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡライブラリーキットとして商品化されている既に開示されたＮＧＳライブラリー調製方法では、ワークフローが、ＳＭＡＲＴｅｒ、ＴｈｒｕＰＬＥＸおよびＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＤＮＡライブラリーキットに特有の二本鎖アダプターライゲーションライブラリーのライブラリーコンプレクシティの限界を克服し、さらに、低および高投入量ＤＮＡ試料に同様のアダプター濃度を使用しながら広範囲のＤＮＡ濃度でアダプター二量体およびＤＮＡキメラの形成を防止するため、ＴｒｕＳｅｑＮａｎｏ、ＮＥＢＮｅｘｔＵｌｔｒａＩＩおよびＫＡＰＡＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットに存在するアダプター濃度調整の必要性を排除する。ＡＴ／ＧＣバイアスが他のキットと比較して実質的に低いことも実証される。したがって、Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓは、ＣｈＩＰＳｅｑ実験によるＤＮＡおよび無細胞ＤＮＡなどの少量かつ貴重な試料に最適な方法であるが、多数の酵素的ステップおよび精製ステップを有する。
他の方法に対して競合力があり、多くの用途にとって魅力的であるためには、酵素反応および精製ステップの数を実質的に減少させるためにＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓ法の改造型が望ましい。本明細書に開示する新規の方法は、これらの提案されたワークフローの改善に対する解決策を提供する。

米国特許第１０，３１６，３５９号明細書米国特許第１０，３１６，３５７号明細書

概要
本開示は、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法およびキット、ならびにスプリント媒介プライマー生成の方法およびキットを提供する。

以上で参照したＳｗｉｆｔＡｍｐｌｉｃｏｎ多重化ＰＣＲ標的化シークエンシング法および他の方法を使用する場合にライブラリーの収率を増加させ、ｑＰＣＲ定量の必要性を克服するように設計された新規の方法を本明細書に開示する。それらの方法は、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応にインデキシングプライマーを使用する。それぞれが当該技術分野で広く使用される２つの異なるインデキシングプライマー設計、すなわち各アダプターに固有のすべての配列を含むが、３’末端が両アダプターに共通の配列を除くインデキシングプライマー、および３’末端が両アダプターに共通の配列を含めて各アダプターの完全な完全長配列を含むインデキシングプライマーのうちの１つを利用する２つの方法が存在する。設計は、短くなるとオリゴヌクレオチド合成コストが減少し、長くなると、変性ライブラリー分子をプライミングする場合に共通のアダプター配列およびそのリバース相補体によって形成される二次構造を破壊し得るためＰＣＲ効率が高くなる。

いずれの方法についても、Ｓｗｉｆｔ多重化ＰＣＲステップを、ユニバーサルアダプター配列、およびユニバーサルアダプター配列に相補的なユニバーサルプライマーであって、それを後のアダプターライゲーションステップに必要となるエンドヌクレアーゼにより開裂させやすくする修飾を含むユニバーサルプライマーを含む５’テール配列をそれぞれ含む複数の標的特異的プライマー対を利用して、改造することなく既に開示されたように、かつ参考のために以下に概説するように実施することができる。ＰＣＲは、修飾塩基に寛容な高性能プルーフリーディングポリメラーゼを利用し、第１のＰＣＲサイクルが、ユニバーサルアダプター標識アンプリコンをそれらの標的配列から作成するために、それぞれ低濃度である標的特異的プライマー対の高コンプレクシティを可能にするようにアニーリング時間を長くした。多重サイクル（２またはそれより多い）に続いて、各標的特異的アンプリコンに隣接するユニバーサルアダプターにアニーリングするユニバーサルプライマーを使用する第２フェーズの増幅のアニーリング時間を短くしながらＰＣＲを継続する。ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーと比較して比較的高濃度で使用されるため、ユニバーサルプライマーは、さらなるプライマー二量体の形成を生じることなく増幅反応を支える。限定された多重化サイクルの間に蓄積するプライマー二量体は、長さが所望のアンプリコンより有意に短いため、かつそれらの相補的なユニバーサルアダプター配列により、プライマー二量体が、プライマーアニーリング温度で安定な二次構造になって、単一ユニバーサルプライマーによる増幅の効率が低下する。同様に、重複アンプリコンを生成する標的特異的プライマー対が使用される場合は、第１の標的特異的アンプリコンのリバースプライマーおよび第２の標的特異的アンプリコンのフォワードプライマーにより生じる望ましくない短アンプリコンも、プライマー二量体と類似の単一ユニバーサルプライマーによる増幅の効率が低下する。これは、プライマーアニーリング温度でのそれらの相補的ユニバーサルアダプター配列による同様の安定な二次構造によるものであるため、均一な標的カバレッジで単一管アッセイが可能になる。この特別な特徴がなければ、短アンプリコンは、最初の鋳型からそれぞれ意図する第１および第２のアンプリコンならびに短アンプリコンをプライミングできるのでＰＣＲ反応において優勢になってしまい、アンプリコン生成物の不均衡によるカバレッジ均一性の喪失、および大幅なシークエンシングコストの上昇をもたらす。この理由により、競合技術は、重複アンプリコンを生成するプライマー対を２つの多重ＰＣＲ管に分離して、均一な標的カバレッジを達成する上でのこの欠陥を回避する。

Ｓｗｉｆｔ多重化ＰＣＲに続いて、未使用のプライマーを除去し、緩衝液を、それぞれ開裂可能なユニバーサルプライマーを各５’末端に含む複数の多重化ＰＣＲアンプリコンと交換するためにビーズベースの精製ステップを実施することができる。図１Ａに示されるように、既に開示された、インデキシングされたアダプターライゲーションを続ける代わりに、一実施形態において、精製された多重化ＰＣＲ生成物をエンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むＰＣＲマスターミックス、ならびに両アダプターに共通の３’末端配列を含む完全長ライブラリーインデキシングプライマー対と組み合わせる。完全長インデキシングプライマーを使用することにより、５’アダプターに対応するプライマーを、ライゲーションのためのアダプターおよびＰＣＲ増幅のためのプライマーの両方として、同一のライゲーションカップルドＰＣＲ反応に使用できる。加えて、３’アダプターに対応するインデキシングプライマーの３’末端に相補的な必要に応じたブロッカーオリゴヌクレオチドをこのプライマーにプレアニーリングできる。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、このプライマーが第１のインキュベーション温度で初期の５’アダプターライゲーションステップに関与するのを防止するが、ＰＣＲアニーリング温度未満の温度Ｔ_ｍを有する、または不活性化されるため、ＰＣＲ時にプライミング活性を阻害しない（図２および４参照）。この方法において、反応混合物は、アンプリコン基質の５’末端上の組み込まれたユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂を可能にすることにより、５’アダプター配列を含む完全長インデキシングプライマーの３’末端がユニバーサルアダプターのリバース相補体の５’末端にアニーリングし、アンプリコン基質の５’末端にライゲーションすることを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、エンドヌクレアーゼ反応およびライゲーション反応の両方が、両酵素の活性に好適な第１の温度にてＰＣＲ反応混合物中で行われる。次いで、反応混合物を高温に加熱してエンドヌクレアーゼおよびリガーゼを不活性化させ、ＰＣＲのためにＤＮＡ基質を変性させ、ホットスタートポリメラーゼを使用する場合はポリメラーゼを活性化させる。次いで、トランケーションされた３’アダプター配列を含むユニバーサルアダプターのリバース相補体、および完全長５’アダプターのリバース相補体にアニーリングするインデキシングプライマーを使用して、ＰＣＲ熱サイクリングを必要なサイクル数だけ実施して所望のライブラリー収率を達成する。

ライゲーションカップルドＰＣＲに続いて、ビーズベースの精製ステップを実施することができ、次いでライブラリー定量、プーリングおよびシークエンシングを実施することができる。この新規の方法は、ライブラリー収率を増加させて、低キロベースの標的領域を有するコピー数の小さい試料に好適なものとする。この方法は、ｑＰＣＲに加えて、Ｑｕｂｉｔなどの蛍光分析法またはバイオアナライザーなどの電気泳動チップによって容易に定量できる二本鎖アダプターを有する完全にライゲーションされた機能性分子が富化されたライブラリーをももたらす。単一密閉管にてアダプターライゲーションをＰＣＲ増幅と組み合わせることにより、アダプターライゲーションとＰＣＲの間に通常必要とされるさらなる精製ステップが回避されるとともに、精製ステップが必要でなければライゲーション反応に続くＰＣＲ試薬の添加が回避される。この点において、新規のワークフローは、２つの酵素的インキュベーションおよび２つの精製ステップの最初のワークフローを維持する。

図１Ｂに示される代替的な実施形態において、精製された多重化ＰＣＲ生成物を、それぞれが両アダプターに共通の３’末端配列を欠くエンドヌクレアーゼ、トランケーションされた５’アダプター、リガーゼ、ＰＣＲマスターミックスおよびライブラリーインデキシングプライマー対と組み合わせる。この実施形態において、インデキシングプライマーが、シークエンシングプライマーのアニーリングに必要とされるアダプターの共通の配列を欠いているため、ライゲーションに個別の５’アダプターが必要になる。反応混合物は、多重ＰＣＲ時にアンプリコンの５’末端上に組み込まれたユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂を可能にすることにより、ユニバーサルアダプターのリバース相補体の５’部分に５’トランケーションされたアダプターの３’位をアニーリングし、アンプリコン基質の５’末端にライゲーションすることを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、エンドヌクレアーゼ反応およびライゲーション反応の両方が、両酵素の活性に好適な第１の温度にてＰＣＲ反応混合物中で行われる。次いで、反応混合物を高温に加熱して、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを不活性化させ、ＰＣＲのためのＤＮＡ基質を変性させ、ホットスタートポリメラーゼを使用する場合はポリメラーゼを活性化させる。次いで、トランケーションされた３’アダプター配列を含むユニバーサルアダプターのリバース相補体、およびトランケーションされた５’アダプターのリバース相補体にアニーリングするインデキシングプライマーを使用して、ＰＣＲ熱サイクリングを必要なサイクル数だけ実施して所望のライブラリー収率を達成する。また、トランケーションされた５’アダプターは、それがライゲーションに関与することを可能にするが、それが、完成されたライブラリー分子から完全長５’アダプター配列をトランケーションすることができないように、ＰＣＲ時にプライマーとして活性化することを防止する二次構造を含む（図３Ａ、３Ｄ～３Ｌ、５Ａ～５Ｃ参照）。

ライゲーションカップルドＰＣＲに続いて、精製ステップを実施することができ、次いでライブラリー定量、プーリングおよびシークエンシングを実施することができる。この新規の方法は、ライブラリー収率を増加させるとともに、ｑＰＣＲに加えて、Ｑｕｂｉｔなどの蛍光分析法またはバイオアナライザーなどの電気泳動チップによって容易に定量できる二本鎖アダプターを有する完全にライゲーションされた機能性分子が富化されたライブラリーをもたらす。単一密閉管にてアダプターライゲーションをＰＣＲ増幅と組み合わせることにより、アダプターライゲーションとＰＣＲの間に通常必要とされるさらなる精製ステップが回避されるとともに、精製ステップが必要でなければライゲーション反応に続くＰＣＲ試薬の添加が回避される。この点において、このワークフローは、２つの酵素反応および２つの精製ステップの最初のワークフローを維持する。

また、上記で開示された新規のライゲーションカップルドＰＣＲ方法は、いずれもＮｏｒｍａｌａｓｅとして商品化されている（かつその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，９６１，５６２号に記載されている）簡素な酵素的ライブラリー正規化方法と組み合わせることが可能である。Ｎｏｒｍａｌａｓｅを添加すると、個々のライブラリー濃度の定量および個々のライブラリー濃度に基づく試料プーリング体積の変更を回避することにより、多重化シークエンシングのためのライブラリープーリングステップが簡素化される。それに対して、この方法は、等モルのライブラリー収率をもたらすため、シークエンシングの前の簡素な高スループットのライブラリー処理後ステップのための各ライブラリーの等体積のプーリングを可能にする。この方法を上記の２つのライゲーションカップルドＰＣＲ方法に組み込むための唯一の要件は、１）各インデキシングプライマーが、限定することなく例としてｒＵであり得る、３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチド塩基、および３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチド塩基の５’側の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む５’テール配列をさらに含む必要があること、および２）増幅ステップで使用されるＤＮＡポリメラーゼが、ＰＣＲ増幅時に５’オーバーハングを生成するために３’から５’のエクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する必要がある（図１Ｃおよび１Ｄ参照）ことである。また、それぞれが末端５’Ｐ５および３’Ｐ７アダプター配列に対応する、５’テール上の３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチド塩基、および３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチド塩基の５’側の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドをやはり含むプライマー対を含めてＰＣＲ効率を高める（表１の１８－２２１、１８－２２２、図１Ｃおよび１Ｄに不図示）。その結果、ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に得られた処理済みのライブラリー分子は、各プライマーの２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドおよび３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含む５’オーバーハングをそれぞれ含む。開始量から所望の標的モル量の各ＮＧＳライブラリーを得るためには、開始量が標的量より大きいことが必要であるため、適用されるＰＣＲサイクルの数は、標的量より大きいライブラリー収率を達成するものである必要がある。ＰＣＲに続いて、ビーズベースの精製ステップを実施する。

次いで、Ｎｏｒｍａｌａｓｅを、既に開示された酵素的方法に改造を加えることなく実施することができ、参考のために以下に概説する。精製されたＰＣＲ生成物は、リガーゼ、および５’オーバーハングに相補的なプローブと組み合わされて第１の酵素反応混合物を生成し、プローブが所望の標的モル量と等しい量で各ライブラリーに添加され、第１の反応混合物は、増幅ライブラリー分子の５’オーバーハング部分にアニーリングすることによる３’末端へのプローブのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、プローブにライゲーションされた増幅ライブラリー分子の部分が、処理ライブラリー分子の標的モル量となる。次に、各ライブラリーは、処理ライブラリー分子の標的量が同じであるため、コシークエンシング対象の各ライブラリーの等体積プーリングが実施される。プローブは、エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗を与えるための改造型を含むため、ライブラリープールは、プローブにライゲーションされない処理ライブラリー分子を消化することによって、選択された標的量の処理ライブラリー分子を単離することを可能にするのに十分な条件下で、第２の酵素反応混合物におけるエクソヌクレアーゼと組み合わされる。次いで、第２の酵素反応混合物は、熱不活性化され、プールが、さらなる精製ステップを行うことなくフローセルローディングに利用可能となる。必要に応じて、プールのｑＰＣＲ定量を実施して、最適なシークエンシングフローセル上での特定クラスター密度を達成するための所望の最終モル濃度を確認することができる。

個別の実施形態において、標的基質の増幅時にさらなる配列を導入するのに使用されるロングＰＣＲプライマーを基質の増幅前にスプリント媒介ライゲーションによってアセンブルすることができるライゲーションカップルドＰＣＲ反応を実施することができる。（図６Ａ～６Ｄ参照）。例えば、その後の上記酵素的ライブラリー正規化と相溶性を有するＮＧＳライブラリーインデキシングプライマーをスプリントライゲーションによってアセンブルすることで、オリゴ合成コストを減少させることができる。対の各プライマーについて短い試料特異的インデックス配列のみが異なる、それぞれ長さが最大９０塩基長またはそれより長い完全長プライマーを整える代わりに、ユニバーサル５’および３’プライマーサブユニットが合成され、次いで各々の固有の試料特異的インデックスを含む短いオリゴヌクレオチドサブユニットのみが合成され、２つのユニバーサルスプリントオリゴヌクレオチドが、５’インデックスおよび３’プライマーサブユニットをライゲーションのために結合させる。スプリントは、５’サブユニットの３’末端をインデックスサブユニットの５’末端に、インデックスサブユニットの３’末端を３’サブユニットの５’末端に繋ぐための２つのプライマーサブユニットの部分に相補的な配列を含む。この実施形態において、アダプターライゲーション、または５’テールドプライマーを使用するＰＣＲによる組み込みを含む任意の方法によって導入された両方のトランケーションされたアダプターを含む任意のＮＧＳライブラリーが、各インデキシングプライマー、リガーゼおよびＰＣＲマスターミックスについて３つのサブユニットおよび２つのスプリントオリゴヌクレオチドと組み合わされる。この方法において、反応混合物は、第１の温度でＰＣＲ反応混合物におけるプライマーサブユニットのアニーリングおよびライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、次いで反応混合物を高温に加熱して、リガーゼを不活性化させ、ＰＣＲのためにＮＧＳライブラリー基質を変性させ、ホットスタートポリメラーゼを使用する場合はポリメラーゼを活性化させる。次いで、トランケーションされたＮＧＳライブラリーの２つのアダプター配列にアニーリングするインデキシングプライマーライゲーション生成物を使用して、ＰＣＲ熱サイクリングを必要なサイクル数だけ実施して、アダプター配列のインデックスおよび残りを組み込み、所望のライブラリー収率を達成する。２つのスプリントオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ時のプライミング活性を防止するための３’ブロッキング基を含み、インデキシングおよび３’プライマーサブユニットは、スプリントライゲーションのための５’ホスフェートを必要とする。限定することなく、この方法は、単一密閉管での任意の所望のＤＮＡ基質の増幅のために任意の数のサブユニットおよびスプリントから任意のプライマーをアセンブルするために使用できる。

さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドスプリントライゲーションによってアセンブルされた任意の生成物が、個々のオリゴヌクレオチド合成の長さ限界より大きいロングＤＮＡ生成物の合成などの単一密閉管でのＰＣＲ増幅のための基質でもあるライゲーションカップルドＰＣＲ反応を実施することができる。この方法では、個々のオリゴヌクレオチドサブユニットを所望の生成物の一本鎖に対してタンデム合成し、次いで、タンデムサブユニットの接合部における３’部分および５’部分に相補的な配列を含むスプリントオリゴヌクレオチドを合成してタンデム一本鎖設計を繋ぐ。この方法において、サブユニットおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、リガーゼ、ＰＣＲマスターミックス、ならびに最５’サブユニットの５’部分と同一の配列を含むフォワードプライマー、および最３’サブユニットの３’末端に相補的なリバースプライマーと組み合わされる。反応混合物は、第１の温度でのＰＣＲ反応混合物におけるオリゴヌクレオチドサブユニットのアニーリングおよびライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされる。次いで、反応混合物を高温に加熱して、リガーゼを不活性化させ、ホットスタートポリメラーゼを使用する場合はポリメラーゼを活性化させる。フォワードおよびリバースプライマーを使用してＰＣＲ熱サイクリングを必要なサイクル回数だけ実施して、二本鎖生成物の所望の収率を達成する。スプリントオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ時のプライミング活性を防止するための３’ブロッキング基を含み、オリゴヌクレオチドサブユニットは、スプリントライゲーションのための５’ホスフェートを必要とする。サブユニットは、未使用のサブユニットオリゴヌクレオチドがＰＣＲ時のプライミングにより完全にアセンブルされた生成物をトランケーションするのを防止するために、フォワードおよびリバースプライマーのみが生成物を増幅させるように、ＰＣＲを支えることができないくらいの低濃度で反応物に添加され得る。

以上で参照したＳｗｉｆｔＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓにおいてステップの数を減少させ、ＤＮＡ投入量を低下させることもできる新規のＮＧＳライブラリー方法を本明細書に開示するが、それらに限定されるものと解釈されるべきではない。それらの方法は、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応にインデキシングプライマーを使用し、それぞれが当該技術分野で広く使用される２つの異なるインデキシングプライマー設計、すなわち各アダプターに固有のすべての配列を含むが、３’末端が両アダプターに共通の配列を除くインデキシングプライマー、ならびに３’末端が両アダプターに共通の配列を含めて完全な完全長アダプターおよび各アダプターの２つの異なる配列を含むインデキシングプライマー、ならびに当該技術分野で使用される２つの異なるアダプターライゲーション化学作用、すなわちアダプターライゲーション効率およびライブラリー収率を向上させるために使用される平滑基質への平滑末端アダプターのライゲーション、ならびにＤＮＡキメラおよびアダプター二量体の形成を防止するために使用される、単一Ａ塩基オーバーハングを有する基質への単一Ｔ塩基オーバーハングを有する、アダプターのライゲーションのうちの１つを利用する、少なくとも４つの方法が存在する。インデキシングプライマーの設計は、短くなるとオリゴヌクレオチド合成コストが減少し、長くなると、変性ライブラリー分子をプライミングする場合に共通の３’アダプター配列およびそのリバース相補体によって形成される二次構造を破壊し得るためＰＣＲ効率が高くなる。ライゲーションカップルドＰＣＲ反応で第２の５’アダプターライゲーションが行われる順次的な２ステップアダプターライゲーションのワークフローにおいて第１の３’アダプターライゲーションステップ時にＴ／Ａアダプターライゲーション化学作用を使用すると、アダプター二量体の形成がほぼ完全に排除され、ＤＮＡ投入量閾値がフェムトグラムレベルまで減少し、平滑末端アダプターライゲーション化学作用を使用すると、ＡＴ／ＧＣバイアスを小さくすることが可能になる。

１つの例示的な方法では、Ｃｏｖａｒｉｓ、およびプルーフリーディングＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた最適化末端ポリシングプロトコルなどの標準的な音波ＤＮＡ断片化方法を利用して、ＤＮＡ断片化および末端修復が実施され、その後に６５℃で熱不活性化が行われる。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの熱不活性化後、ＤＮＡは、ウラシル塩基、および５’末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチド２を含むオリゴヌクレオチド１をアニーリングすることによって形成された平滑末端３’アダプター、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびライゲーション緩衝液と組み合わされ、第１のライゲーション反応が実施される。アダプター二量体の形成を防ぐために、前に開示されたように、オリゴヌクレオチド１の３’末端の塩基を修飾してＤＮＡの５’末端へのそのライゲーションを防止する。当該修飾塩基の例としては、ｄｄＴなどの、リボース内の２’および３’位の２つのヒドロキシル基が欠失したジデオキシヌクレオチド、ならびに３’－ｄＴなどの、３’位の１つのヒドロキシル基が欠失している３’－誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。ＤＮＡの３’末端にライゲーションされた３’アダプターは、ＤＮＡの非ライゲーション５’末端と切れ目を形成する。３’アダプターの第２の末端は、アダプター設計、すなわち５’リン酸基を除外し、突出する３’末端にブロッキング基またはライゲーション不能な塩基修飾を配置することによってライゲーションから完全に保護される。

別の例示的方法では、Ｃｏｖａｒｉｓ、およびプルーフリーディングＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた最適化末端ポリシングプロトコルなどの標準的な音波ＤＮＡ断片化方法を利用して、ＤＮＡ断片化および末端修復を実施し、その後に６５℃でＴａｑＤＮＡポリメラーゼとインキュベートして、単一Ａ塩基３’オーバーハングを両ＤＮＡ末端に添加し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを熱不活性化させる。ＡテールドＤＮＡは、ウラシル塩基、および５’末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチド２を含み、３’末端に単一Ｔ（またはＵ）塩基オーバーハングを含むオリゴヌクレオチド１をアニーリングすることによって形成された３’アダプター、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびライゲーション緩衝液と組み合わされ、第１のライゲーション反応が実施される。その結果、単一塩基オーバーハングを有する３’アダプターが両ＤＮＡ鎖に接合する。３’アダプターの第２の末端は、３’ アダプター設計、すなわち５’リン酸基を除外し、突出する３’末端にブロッキング基またはライゲーション不能な塩基修飾を配置することによってライゲーションから完全に保護される。

平滑または単一塩基オーバーハングを有する３’アダプターのライゲーションに続いて、ビーズベース精製ステップを実施して、未使用のアダプター、酵素および交換緩衝液を除去することができる。図１Ｅおよび図１Ｆに示されるように、既に開示された５’アダプターライゲーション、ＳＰＲＩビーズ精製およびインデキシングＰＣＲを続ける代わりに、一実施形態において、精製ＤＮＡ生成物が、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ＰＣＲマスターミックス、両３’アダプターに共通の３’末端配列を含む完全長ライブラリーインデキシングプライマー対と組み合わされる。完全長インデキシングプライマーを使用することによって、５’アダプターに対応するプライマーをライゲーションのためのアダプターおよびＰＣＲ増幅のためのプライマーの両方として同じライゲーションカップルドＰＣＲ反応に使用できる。加えて、３’アダプターに対応するインデキシングプライマーの３’末端に相補的な必要に応じたブロッカーオリゴヌクレオチドが、このプライマーにプレアニーリングされてもよい。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、このプライマーが第１のインキュベーション温度での初期５’アダプターライゲーションステップに関与することを防止するが、ＰＣＲアニーリング温度未満の温度Ｔ_ｍを有する、または不活性化されるため、ＰＣＲ時にプライミング活性を阻害しない（図２Ｂ～２Ｇおよび４Ａ～４Ｅ参照）。この方法において、反応混合物は、ウラシル塩基を含む３’アダプターオリゴヌクレオチド８または９のエンドヌクレアーゼ開裂を可能にすることにより、５’アダプター配列を含む完全長インデキシングプライマーの３’末端がユニバーサルアダプター（第１の共通ヌクレオチド配列）のリバース相補体の５’末端にアニーリングし、ＤＮＡ断片の５’末端にライゲーションすることを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、エンドヌクレアーゼ反応およびライゲーション反応の両方が、両酵素の活性に好適な第１の温度にてＰＣＲ反応混合物中で行われる。次いで、反応混合物を高温に加熱してエンドヌクレアーゼおよびリガーゼを不活性化させ、ＰＣＲのためにＤＮＡ基質を変性させ、ホットスタートポリメラーゼを使用する場合はポリメラーゼを活性化させる。次いで、トランケーションされた３’アダプター配列を含むユニバーサルアダプターのリバース相補体、および完全長５’アダプターのリバース相補体にアニーリングするインデキシングプライマーを使用して、ＰＣＲ熱サイクリングを必要なサイクル数だけ実施して所望のライブラリー収率を達成する。

ライゲーションカップルドＰＣＲに続いて、ビーズベースの精製ステップを実施することができ、次いでライブラリーの定量、プーリングおよびシークエンシングを実施することができる。この新規の方法は、ＤＮＡ転換率が高いこと、アダプター二量体が少ないこと、ＤＮＡ投入量の範囲が広いこと、および可変投入量による試料に対するアダプター濃度調整が不要であることなどのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡワークフローの主たる利点を維持しながらステップの数を減少させる。加えて、ＵまたはＴ塩基オーバーハングを有する３’アダプターを利用するこの方法では、市場で入手可能ないずれのキットによっても提供されないフェムトグラムのＤＮＡ投入量によるライブラリー調製が可能である。アダプターライゲーションを単一密閉管でのＰＣＲ増幅と組み合わせることによって、アダプターライゲーションとＰＣＲとの間に通常必要とされるさらなる精製ステップが回避されるとともに、精製ステップが必要でなければライゲーション反応に続くＰＣＲ試薬の添加が回避される。この点において、新規のワークフローは、酵素的インキュベーションおよび精製ステップの数が、最も一般的なＤＮＡライブラリーキットと類似している。

図１Ｇおよび図１Ｈに示される他の実施形態において、精製３’アダプターライゲーション生成物は、それぞれが両アダプターに共通の３’末端配列を欠くエンドヌクレアーゼ、トランケーションされた５’アダプター、リガーゼ、ＰＣＲマスターミックスおよびライブラリーインデキシングプライマー対と組み合わされる。これらの実施形態において、インデキシングプライマーが、シークエンシングプライマーのアニーリングに必要であるアダプターの共通の配列を欠くため個別の５’アダプターがライゲーションに必要とされる。反応混合物は、ウラシル塩基を含む３’アダプターオリゴヌクレオチド８または９のエンドヌクレアーゼ開裂を可能にすることにより、ＤＮＡの３’末端に接合される３’アダプターオリゴヌクレオチド７の５’部分への５’トランケーションされたアダプターの３’部分のアニーリング、そのＤＮＡ基質の５’末端へのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ、エンドヌクレアーゼおよびライゲーション反応の両方が、両酵素の活性に好適な第１の温度にてＰＣＲ反応混合物中で行われる。次いで、反応混合物を高温に加熱してエンドヌクレアーゼおよびリガーゼを不活性化させ、ＰＣＲのためにＤＮＡ基質を変性させ、ホットスタートポリメラーゼを使用する場合はポリメラーゼを活性化させる。次いで、トランケーションされた３’アダプター配列を含む配列７にアニーリングするインデキシングプライマーを使用して、ＰＣＲ熱サイクリングを必要なサイクル数だけ実施して所望のライブラリー収率を達成する。また、トランケーションされた５’アダプターは、それがライゲーションに関与することを可能にするが、完成ライブラリー分子から完全長５’アダプター配列をトランケーションすることができないように、ＰＣＲ時のプライマーとしてのその活性を防止するための二次構造を含む（図３および５参照）。

ライゲーションカップルドＰＣＲに続いて、精製ステップを実施することができ、次いでライブラリーの定量、プーリングおよびシークエンシングを実施することができる。この新規の方法は、ＤＮＡ転換率が高いこと、アダプター二量体が少ないこと、ＤＮＡ投入量の範囲が広いこと、および可変投入量による試料に対するアダプター濃度調整が不要であることなどのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡワークフローの主たる利点を維持しながらステップの数を減少させる。加えて、ＵまたはＴ塩基オーバーハングを有する３’アダプターを利用するこの方法では、市場で入手可能ないずれのキットによっても提供されないフェムトグラムのＤＮＡ投入量によるライブラリー調製が可能である。アダプターライゲーションを単一密閉管でのＰＣＲ増幅と組み合わせることによって、アダプターライゲーションとＰＣＲとの間に通常必要とされるさらなる精製ステップが回避されるとともに、精製ステップが必要でなければライゲーション反応に続くＰＣＲ試薬の添加が回避される。この点において、新規のワークフローは、酵素的インキュベーションおよび精製ステップの数が、最も一般的なＤＮＡライブラリーキットと類似している。

上記で開示されたＤＮＡＮＧＳライブラリーの調製のためのライゲーションカップルドＰＣＲ方法をＮｏｒｍａｌａｓｅとして商業化されている（かつその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，９６１，５６２号に記載されている）簡素な酵素的ライブラリー正規化方法と組み合わせることができる。Ｎｏｒｍａｌａｓｅを添加すると、個々のライブラリー濃度の定量、および個々のライブラリー濃度に基づく試料プーリング体積の変更を回避することによって、多重化シークエンシングのためのライブラリープーリングステップが簡素化される。それに対して、この方法は、等モルのライブラリー収率をもたらすため、シークエンシングの前の簡素な高スループットのライブラリー処理後ステップのための各ライブラリーの等体積のプーリングを可能にする。この方法を上記の２つのライゲーションカップルドＰＣＲ方法に組み込むための唯一の要件は、１）各インデキシングプライマーが、３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチド塩基、および３つまたはそれより多い連続的なリボヌクレオチドの５’側の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドをさらに含むことが必要であること、２）増幅ステップで使用されるＤＮＡポリメラーゼが、ＰＣＲ増幅時に５’オーバーハングを生成するために３’から５’のエクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する必要がある（図１Ｃおよび１Ｄに示されるアンプリコンライブラリーに類似）ことである。

図１Ａは、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、標的特異的なプライマーおよびユニバーサルプライマーをｄＵ塩基と使用した多重ＰＣＲ、ならびに３’オーバーハングを生成するエンドヌクレアーゼ開裂、続いて５’アダプターライゲーション、および３’オーバーハング（第１の共通ヌクレオチド配列）の５’部分に相補的である３’末端部分を各々有する２つのインデキシングプライマーを使用したインデキシングＰＣＲによって生成され、インデキシングプライマーの１つは５’アダプターとして機能することができ、他はブロッカーオリゴヌクレオチドにアニーリングされるのでそうすることができない、例示的なワークフローを表す。同上。同上。

図１Ｂは、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、標的特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーをｄＵ塩基と使用した多重ＰＣＲ、ならびに３’オーバーハングを生成するエンドヌクレアーゼ開裂、続いて３’オーバーハング（第１の共通ヌクレオチド配列）の５’部分に相補的である３’末端配列を有するヘアピンアダプターを使用した５’アダプターライゲーション、および３’オーバーハング（第１の共通ヌクレオチド配列）の５’部分に相補的である３’末端部分を含まない２つのインデキシングプライマーを使用したインデキシングＰＣＲによって生成されるが、第２のインデキシングプライマーは第１の共通ヌクレオチド配列の３’側の第２の共通ヌクレオチド配列に相補的である３’末端部分を有する、例示的なワークフローを表す。ヘアピンは、第１のＰＣＲサイクルの後に第１のインデキシングプライマーを使用した以降のＰＣＲを可能にする第１のインデキシングプライマーの部分を含む。同上。同上。

図１Ｃは、インデキシングプライマーがライゲーションカップルドＰＣＲの後にライブラリー正規化を可能にする５’正規化テールを含む、例示的なワークフローを表す。図１Ｃは、配列番号１として（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４を開示する。

図１Ｄは、インデキシングプライマーがライゲーションカップルドＰＣＲの後にライブラリー正規化を可能にする５’正規化テールを含む、例示的なワークフローを表す。図１Ｄは、配列番号１として（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４を開示する。

図１Ｅは、ＤＮＡ修復、平滑末端を有する３’アダプターのライゲーション、ならびにフルサイズインデキシングプライマーおよびプライマーブロッカーによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製方法を表す。

図１Ｆは、ＤＮＡ修復、Ａテーリング、Ｕオーバーハングを有する３’アダプターのライゲーション、ならびにフルサイズインデキシングプライマーおよびプライマーブロッカーによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製方法を表す。

図１Ｇは、ＤＮＡ修復、平滑末端を有する３’アダプターのライゲーション、ならびにトランケーションされたインデキシングプライマーおよびヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製方法を表す。

図１Ｈは、ＤＮＡ修復、Ａテーリング、Ｕオーバーハングを有する３’アダプターのライゲーション、ならびにトランケーションされたインデキシングプライマーおよびヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製方法を表す。

図１Ｉは、異なるＮＧＳライブラリープロトコールでのアダプター－二量体形成の比較を表す。

図２Ａは、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、３’オーバーハングを生成するエンドヌクレアーゼ開裂、続いて５’アダプターライゲーション、および３’オーバーハング（第１の共通ヌクレオチド配列）の５’部分に相補的である３’末端部分を各々有する２つのインデキシングプライマーを使用したインデキシングＰＣＲによって生成され、インデキシングプライマーのいずれかが５’アダプターとして機能することができる、例示的なワークフローを表す。同上。同上。

図２Ｂは、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、３’オーバーハングを生成するエンドヌクレアーゼ開裂、続いて５’アダプターライゲーション、および３’オーバーハング（第１の共通ヌクレオチド配列）の５’部分に相補的である３’末端部分を各々有する２つのインデキシングプライマーを使用したインデキシングＰＣＲによって生成され、インデキシングプライマーの１つは５’アダプターとして機能することができ、他はブロッカーオリゴヌクレオチドにアニーリングされるのでそうすることができない、例示的なワークフローを表す。

図２Ｃは、（ａ）低いＴ_ｍを含むためＰＣＲ時に不活性となる線状ブロッカー、または（ｂ）ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプターを使用するときにＰＣＲの間不活性化されるヘアピンブロッカーのさらなる詳細を表す。図２Ｃは、配列番号７８～８０、７８～８０、７８～７９、８１～８２、７８～７９および８３～８４をそれぞれ出現順に開示する。

図２Ｄは、多重ＰＣＲ、組み込まれたユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂、３’アダプターインデキシングプライマー（ｉ７）にプレアニーリングされた３つのミスマッチを有する線状ブロッカー５、および基質アンプリコンのユニバーサルアダプター配列のリバース相補体の５’部分への５’アダプターインデキシングプライマー（ｉ５）の３’末端のライゲーションの態様についてのＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプター配列を表す。図２Ｄは、配列番号８５、８５～８７、４２、７８～７９、８９、８６、７８～７９、８９、８７、４２および８６をそれぞれ出現順に開示する。

図２Ｅは、多重ＰＣＲ、組み込まれたユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂、３’アダプターインデキシングプライマー（ｉ７）にプレアニーリングされた６Ｔ挿入を有する線状ブロッカー５、および基質アンプリコンの５’末端への５’アダプターインデキシングプライマー（ｉ５）の３’末端のライゲーションの態様についてのＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプター配列を表す。図２Ｅは、配列番号８５、８５～８７、４２、７８～７９、８９、８６、７８～７９、８９、８７、４２および８６をそれぞれ出現順に開示する。

図２Ｆは、Ｔｍ還元性Ｔ＊Ｇミスマッチに加えて３つの分解可能なＵ塩基を有する線状ブロッカーを表す。図２Ｆは、配列番号７８～７９、４９、７８～７９、９０、７８～７９および９１をそれぞれ出現順に開示する。

図２Ｇは、ＤＮＡ修復、平滑末端３’アダプターのライゲーション、ならびにフルサイズインデキシングプライマーおよび１つのミスマッチおよびいくつかの分解可能なｄＵ塩基を含有するｉ７プライマーブロッカーによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製を表す。図２Ｇは、配列番号９２、９２～９３、９３、８７、４２、７８～７９、９０、９３、７８～７９、９０、８７、４２および９３をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ａは、３’末端の１３塩基を欠くトランケーションされたインデキシングプライマーｉ５およびｉ７ならびに線状５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲ反応を表す。

３’末端の１３塩基を欠くトランケーションされたインデキシングプライマーｉ５およびｉ７ならびにトランケーションされたヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲ反応。

図３Ｃは、ステムループがトランケーションされたアダプター５が、ループ配列の中で黒色の円によって表される複製不可能修飾をさらに含み、したがって完全に複製されたヘアピン生成物の形成が防止されることをさらに表す。

図３Ｄは、ステムループがトランケーションされたアダプターがループ配列の中の複製不可能修飾を欠く場合の望ましくない結果を表す。

図３Ｅは、内部の複製不可能Ｃ３スペーサーを含む、ヘアピンがトランケーションされたアダプターがライゲーションカップルドＰＣＲのために使用されるときのＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを使用した具体的な実施形態を表す。図３Ｅは、配列番号８５、８５～８６、９４、４２、８７、９５、７８、９６～９７、８６～８７、９５、７８、９６～９７、９４、４２、７８、９６および９３をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｆは、内部の複製不可能Ｃ３スペーサーを有する、ヘアピンがトランケーションされたアダプターがライゲーションカップルドＰＣＲのために使用される、ＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを使用した代わりの実施形態を表す。図３Ｆは、配列番号９８、９８、８６、９４、５３、８７、９５、７８、９６～９７、８６～８７、９５、７８、９６～９７、９４、４２、７８、９６および９３をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｇは、ＮｅｘｔｅｒａＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローが、ライゲーションカップルドＰＣＲのためにヘアピンがトランケーションされたアダプター、完全長インデキシングプライマーおよび線状ブロッカーと使用されることを表す。図３Ｇは、配列番号９９、９９～１０２、８７、１０３、７８、１０４～１０５、１００、８７、１０３、７８、１０４～１０５、１０１、１０３および１００をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｈは、ヘアピンがトランケーションされたアダプターが、ライゲーションカップルドＰＣＲのための共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマーと使用される、別のＮｅｘｔｅｒａＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを表す。この例では、ｄＵ塩基を含有するユニバーサルアンプリコンプライマーがすべての５つのＴデオキシヌクレオチドを置き換えるが、３’末端の９つの塩基配列は、ＵＳＥＲ開裂が実施されるときのＴ塩基の不在のために保持される。図３Ｈは、配列番号９９、９９～１０２、８７、１０６、７８、１０７～１０８、１００、８７、１０６、７８、１０７～１０８、１０１、１０３、７８、１０７および１０９をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｉは、ＤＮＡ修復、Ａテーリング、Ｕ塩基オーバーハングを有する３’アダプターのライゲーション、ならびにトランケーションされたインデキシングプライマーおよび１３ｂ３’オーバーハングを有するヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製を表す。図３Ｉは、配列番号５１、５１、２４、９３～９４、４２、８７、９５、７８、９６、９３、８７、９５、９４、４２、７８、９６および９３をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｊは、ＤＮＡ修復、平滑末端３’アダプターのライゲーション、ならびにトランケーションされたインデキシングプライマーおよび１３ｂ３’オーバーハングを有するヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製を表す。図３Ｊは、配列番号９２、９２～９３、９３～９４、４２、８７、９５、７８、９６、９３、８７、９５、９４、４２、７８、９６および９３をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｋは、ＤＮＡ修復、Ａテーリング、Ｔ塩基オーバーハングを有する３’アダプターのライゲーション、ならびにトランケーションされたインデキシングプライマーおよび１１ｂ３’オーバーハングを有するヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製を表す。図３Ｋは、配列番号５２、５２、２４、９３～９４、５３、８７、９５、７８、９６、９３、８７、９５、９４、４２、７８、９６および９３をそれぞれ出現順に開示する。

図３Ｌは、ＤＮＡ修復、Ａテーリング、Ｔ塩基オーバーハングを有する３’アダプターのライゲーション、ならびにフルサイズのインデキシングプライマー、１つのミスマッチおよびいくつかの分解可能なＵ塩基を含有するブロッカー、および１０ｂオーバーハングを有するヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲを含む、ＮＧＳライブラリー調製を表す。図３Ｌは、配列番号１１０、１１０～１１１、１１１、１０１～１０２、８７、１０３、７８、１０４～１０５、１１２、８７、１０３、７８、１０４～１０５、１０１、１０３および１００をそれぞれ出現順に開示する。

図４Ａは、線状ブロッカーおよびヘアピンブロッカーの例示的な構造を表す。

図４Ｂは、ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用したワークフローを表す。

図４Ｃは、ブロッカーおよびインデキシングプライマーの１つを表す。

図４Ｄは、ヘアピンブロッカーを使用したワークフローを表す。

図４Ｅは、伸長ステムが伸長ヘアピンの融解温度を上昇させることができることを示す、ヘアピンブロッカーの例示的なワークフローを表す。

図５Ａは、ヘアピンアダプターおよび第１のインデキシングプライマーを表す。

図５Ｂは、ヘアピンアダプターを使用したワークフローを表す。

図５Ｃは、ヘアピンアダプターを使用したワークフローを表す。

図６Ａは、スプリント媒介プライマーアセンブリの例示的なワークフローを表す。

図６Ｂは、それらの５’末端に（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）を含むＮｏｒｍａｌａｓｅ適合プライマーがアセンブルされる方法の詳細を表す。図６Ｂは、配列番号１として（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４を開示する。

図６Ｃは、下流の酵素正規化に適合する（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）配列を有するＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａインデキシングプライマーのアセンブリを表す。図６Ｃは、配列番号１１３～１１８および１１６～１１７をそれぞれ出現順に開示する。

図６Ｄは、上の４Ｃのｉ５ＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａインデキシングプライマーのプライマーアセンブリが、３’アダプター配列を含む対応するｉ７インデキシングプライマーのアセンブリ、ｉ７プライマーへのヘアピンブロッカーのアニーリング、およびトランケーションされた３’アダプターを含むアンプリコン基質へのｉ５プライマーのライゲーション（エンドヌクレアーゼ開裂に続く、示さず）と組み合わされるときの、ライゲーションカップルドＰＣＲワークフローを表す。図６Ｄは、配列番号１１３～１１７、１１９～１２２、８３、８２、９３、１１８、１１６～１１８、１１６～１１７、９３、１２３、１２２、８３および８２をそれぞれ出現順に開示する。

図７は、実験実施例１の結果を表す。フォワードプライマーから始まるリードが上部にプロットされ、リバースプライマーからのリードはＩＧＶプロットの下部にプロットされる、ＩＧＶで観察されたＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓのためのＩＴＳ１ｒＲＮＡアンプリコンカバレージ。

図８は、実験実施例３の結果を表す。ＰＣＲのために最適化された条件の下でスプリントライゲーションのためのＴ３ＤＮＡリガーゼを使用して、ライゲーションによるインデキシングプライマーの９０％を超えるアセンブリが観察されたが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは非効率であった。

図９は、配列番号４４、４９、４４、５０、４４、１２４、４４、１２５、４４および４６をそれぞれ出現順に開示する。

図９は、実施例５に記載される異なるプライマーブロッカーを有するインデキシングプライマーｉ７によって形成された二本鎖ＤＮＡ構造を表す。

図１０Ａは、実施例６に記載されるＮＧＳライブラリーの３’および５’アダプターの構造を表す。図１０Ａは、配列番号５２、５１、２４、２４、４５、５３、４５および４２をそれぞれ出現順に開示する。

図１０Ｂは、実施例６に記載されるＮＧＳライブラリーのためのピカードプロットを表す（ＮＧＳライブラリープレップＡ５０ｎｇ）。

図１０Ｃは、実施例６に記載されるＮＧＳライブラリーのためのピカードプロットを表す（ＮＧＳライブラリープレップＡ２５０ｎｇ）。

図１０Ｄは、実施例６に記載されるＮＧＳライブラリーのためのピカードプロットを表す（ＮＧＳライブラリープレップＢ５０ｎｇ）。

図１０Ｅは、実施例６に記載されるＮＧＳライブラリーのためのピカードプロットを表す（ＮＧＳライブラリープレップＢ２５０ｎｇ）。

図１１Ａは、実施例６に記載される方法によってＤＮＡのピクトグラム量から調製されたライブラリーのためのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒトレースを表す。

図１１Ｂは、実施例６に記載される方法によってＤＮＡのピクトグラム量から調製されたライブラリーのためのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒトレースを表す。

図１１Ｃは、実施例６に記載される方法によってＤＮＡのピクトグラム量から調製されたライブラリーのためのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒトレースを表す。

図では、反応が単一密閉管で起こることが示され、ブラケットが図の連続したページにある場合、ブラケットのすべてのステップのすべては同じ密閉管で起こると理解されることを理解すべきである。例として、図１Ａは３ページにまたがるが、多重ＰＣＲの後のステップのすべては、別々のブラケットが各ページに出現するとしても、同じ「単一密閉管」にあることを理解すべきである。

詳細な説明
本開示は、特定の実施形態について、特定の図面を参照しながら説明するが、対象事項はそれらに限定されない。記載の図面は、概略的であり、限定的でない。図面において、一部の要素の大きさは、例示を目的として誇張または改変され、実規模で描かれていない場合もある。本開示の要素は、そうでないことが具体的に指示されていなければ、最初の出現で「１つの（a）」または「１つの（an）」が割り当てられ、二回目またはその後の出現で定冠詞「その（the）」または「前記（said）」が割り当てられる。

本開示は、本開示の対象事項のすべてではなく一部の実施形態が示される添付の図面に対する説明を提供する。実際、対象事項は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろこれらの実施形態は、本開示がすべての法的要件を満たすように提供される。

定義
特定の用語類は、単に便宜のために以下の説明に使用されており、限定するものではない。本明細書に使用される特定の用語は、参照される図面において方向を指定する。本明細書に具体的に記載されていなければ、「１つの（a）」、「１つの(an)」および「その（the）」という用語は、１つの要素に限定されず、「少なくとも１つ」を意味するものとして捉えられるべきである。本明細書に用いられる場合、「別の」とは、少なくとも第２またはそれ以降を意味する。用語類は、以上に言及した用語、それらの派生語、および類似の重要性を有する用語を含む。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替のみを指すことが明示される場合、または代替が互いに排他的である場合を除いて「および／または」を意味するように使用される。

数値とともに使用される場合の「約」という用語の使用は、＋／－１０％を含むことを意図する。例えば、アミノ酸の数が約２００であると特定される場合、これは１８０～２２０（プラスまたはマイナス１０％）を含む。

本明細書に使用される場合、「低マグネシウム緩衝液」は、ＰＣＲに好適であるのに十分に低いマグネシウムレベルを有する任意の緩衝液であり得る。例として、限定することなく、低マグネシウム緩衝液は、１～２ｍＭまたはそれより少なくマグネシウムを有することができる。

別段の定義がなければ、本明細書に使用されるすべての技術および科学用語は、当業者に広く理解されているのと同様の意味を有する。

本開示は、ライゲーションカップルドＰＣＲの方法を提供する。当該方法を使用して、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）および他の用途のためにアダプターをＤＮＡ基質に添加することができる。ライゲーションカップルドＰＣＲによるスプリント媒介プライマーのアセンブリおよび使用のための方法も提供する。本開示の方法を実施するためのキットも提供する。

本明細書に開示される方法は、２つの３’オーバーハングを含む、もしくは含むように処理可能である任意の開始ＤＮＡ基質、または２つの３’オーバーハングを有する任意の部分的に二本鎖のＤＮＡ基質とともに使用できることが理解されるべきである。次いで、これにより、その後の５’アダプターのライゲーション、およびライゲーションされた二本鎖ＤＮＡ基質のプライマーによるＰＣＲ増幅が可能になる。本明細書に開示される実施形態は、一部の事例において、特定の上流処理方法に関して開示されるが、それらは、それらの方法のみに限定されるものと解釈されるべきではない。

ｉ）ＰＣＲ基質がライゲーションによりＤＮＡサブユニットからアセンブルされ、ＰＣＲにより増幅される、ｉｉ）ＰＣＲプライマーがライゲーションによりＤＮＡサブユニットからアセンブルされ、ＰＣＲによる増幅のために使用される、またはライゲーション反応および増幅反応が単一密閉管にて行われるそれらの組合せであるライゲーションカップルドＰＣＲの方法を開示する。ｉ）に関しては、ＰＣＲ基質が、相補的スプリントオリゴヌクレオチドにより結合されたタンデムオリゴヌクレオチドのライゲーションによって生成される。あるいは、ＰＣＲ基質が、開裂可能な塩基を有する第１のアダプターを含むトランケーションされたＮＧＳライブラリーであり、エンドヌクレアーゼが第１のアダプターの１つの鎖を開裂して、第２のアダプターのアニーリングおよびライゲーションを可能にする。ｉｉ）に関しては、ＰＣＲプライマーも相補的スプリントオリゴヌクレオチドにより結合されたタンデムオリゴヌクレオチドのライゲーションによってアセンブルされる。

一実施形態において、共通アダプター配列をそれらの３’末端に含む完全長インデキシングプライマー３（第１のインデキシングプライマー）および４（第２のインデキシングプライマー）を利用するライゲーションカップルドＰＣＲのための多重化アンプリコンワークフローを示す（図１Ａ）。（多数のプライマー対を代表する）ユニバーサルテールド標的特異的プライマーＰ１およびＰ２を、多重化ＰＣＲにおいて開裂可能ｄＵ塩基を含む、Ｐ１およびＰ２のユニバーサルテールに相補的なユニバーサルプライマー１とともに示す。第２の反応は、単一密閉管において、組み込まれたユニバーサルプライマー１をＵＳＥＲ酵素によりエンドヌクレアーゼ開裂して、第１の鎖１１および第２の鎖１２を含む部分的に二本鎖の基質ＤＮＡ分子１０を生成すること、ユニバーサルプライマー配列２のリバース相補体の少なくとも一部分、すなわち両３’オーバーハングにおいてオーバーハングの５’末端に存在する第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングした後の５’アダプターインデキシングプライマー３（第１のインデキシングプライマー）を基質ＤＮＡ１０の５’末端にライゲーションすること、ならびに必要に応じて、プレアニーリングされた線状ブロッカー５により、３’アダプターインデキシングプライマー４（第２のインデキシングプライマー）がライゲーション反応に関与するのを防止すること（ユニバーサルプライマー１が、３’アダプター４（第２のインデキシングプライマー）の３’部分と同じ配列を含むため）を同時に行った後に、ＰＣＲをインデキシングして、ライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。５’アダプター３（第１のインデキシングプライマー）は、ライゲーションされると、第３の鎖１３および第４の鎖１４を生成することができる。ブロッカーは、第２のインデキシングプライマー４のライゲーションを防止するという理由、例えばライゲーション反応時の温度より高い融解温度（Ｔ_ｍ）を有することができるという理由により、基質ＤＮＡ分子１０への第２のインデキシングプライマー４のライゲーションが生じない。最初のＰＣＲサイクルにおいて、第１のインデキシングプライマー３または第２のインデキシングプライマー４は、ユニバーサルプライマー配列（第１の共通ヌクレオチド配列を含む）２のリバース相補体の少なくとも一部分にアニーリングできるが、第１のインデキシングプライマー３がアニーリングして伸長されると、それは、さらなるＰＣＲサイクルで抑制され得る、第１のインデキシングプライマーおよびその相補体が反対側の末端にある生成物を生成する。したがって、第２のインデキシングプライマー４がユニバーサルプライマー配列２のりバース相補体の少なくとも一部分にアニーリングする場合は、それは、鋳型としての第３の鎖１３から第５の鎖１５を、鋳型としての第４の鎖１４から第６の鎖１６を生成する。第５の鎖１５および第６の鎖１６の両方がそれぞれ第１のインデキシングプライマー３のリバース相補体を有するため、第１のインデキシングプライマー３は、次のＰＣＲサイクルにて各々にアニーリングし、伸長して、それぞれ第５の鎖１５および第６の鎖１６に相補的である第７の鎖１７および第８の鎖１８を生成することができる。さらなるＰＣＲサイクルにおいて、これらの二本鎖生成物を第１のインデキシングプライマー３および第２のインデキシングプライマー４によってさらに増幅させることができる。図１Ａは、単一密閉管で行われるインデキシングＰＣＲを通じたエンドヌクレアーゼ開裂からのすべてのステップを示すが、インデキシングＰＣＲを通じた５’アダプターライゲーションからのステップは、エンドヌクレアーゼ開裂（または他の酵素的処理）も実施されるかどうかに関わらず単一密閉管で実施できることが理解されるべきである。いずれの図および実施形態についても、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するための開裂ステップを、ライゲーションおよびＰＣＲとともに単一密閉管で行うこともできるし、ライゲーションカップルドＰＣＲの前に別途実施することもできることが理解されるべきである。一部の実施形態において、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を得るための酵素的処理を事前のステップで実施することもできるし、図１Ａに示されるように単一密閉管でワークフローの一部として実施することもできる。

別の実施形態において、それらの３’末端における共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマー３および４を利用するライゲーションカップルドＰＣＲのための標的化アンプリコンワークフローを示す（図１Ｂ）。（多数のプライマー対を代表する）ユニバーサルテールド標的特異的プライマーＰ１およびＰ２を、多重化ＰＣＲにおける開裂可能ｄＵ塩基を含むユニバーサルプライマー１とともに示す。第２の反応は、単一密閉管において、組み込まれたユニバーサルプライマー１をＵＳＥＲ酵素によりエンドヌクレアーゼ開裂すること、ユニバーサルプライマー配列２のリバース相補体の少なくとも一部分（例えば第１の共通ヌクレオチド配列）にアニーリングした後のトランケーションされた５’ヘアピンアダプター６をアンプリコンＤＮＡの末端にライゲーションすることを同時に行った後に、インデキシングプライマー３および４を使用してＰＣＲをインデキシングして、ライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。ヘアピン５’アダプターの二次構造は、ＰＣＲ時のプライマーとしてのその活性を、それが完成したライブラリー分子から５’アダプターをトランケーションしないように防止する。

図１Ａの方法を、５’テール配列をさらに含むインデキシングプライマー３および４を利用することにより下流の酵素的ライブラリー正規化のために改造することができ、５’テール配列は、４つの連続的Ｕリボヌクレオチド（ｒＵ）塩基を含むことができ、１２Ｔデオキシヌクレオチド（配列番号２）に隣接する５’を含むことができる（図１Ｃ）。ＰＣＲ効率を高めるために、５’（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４テール（配列番号１）を含むさらなる正規化プライマーの対ならびに末端Ｐ５およびＰ７アダプター配列を反応に含めることもできる（オリゴヌクレオチド１８～２２１、表１の１８～２２２、図１Ｃに不図示のプライマー）。

図１Ｂの方法を、５’テール配列をさらに含むインデキシングプライマー３および４を利用することにより下流の酵素的ライブラリー正規化のために改造することができ、５’テール配列は、４つの連続的Ｕリボヌクレオチド（ｒＵ）塩基を含むことができ、１２Ｔデオキシヌクレオチド（配列番号２）に隣接する５’を含むことができる（図１Ｄ）。ＰＣＲ効率を高めるために、５’（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４テール（配列番号１）を含むさらなる５’正規化プライマーの対ならびに末端Ｐ５およびＰ７アダプター配列を反応に含めることもできる（オリゴヌクレオチド１８～２２１、表１の１８～２２２、図１Ｄに不図示のプライマー）。

一実施形態において、ライゲーションカップルドＰＣＲのためのトランケーションされたＮＧＳライブラリーワークフローは、完全長インデキシングプライマー３および４を利用している（図１Ｅ）。このワークフローにおいて、断片化ＤＮＡは、Ｔ４またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼなどのポリシングＤＮＡポリメラーゼによる末端修復、ならびに平滑末端を有するオリゴヌクレオチド７および８によって形成された、平滑末端を有する３’アダプターのライゲーションが施され、オリゴヌクレオチド８は、Ｕ塩基などの１つまたは複数の開裂可能塩基、およびライゲーション反応に関与しない、平滑末端の３’末端における修飾ヌクレオチド（例えば、リボースが３’ヒドロキシルまたは３’および２’ヒドロキシル基の両方から欠失した修飾）を有し、オリゴヌクレオチド７は、ライゲーション反応に関与する、平滑末端の５’末端におけるホスフェートを有する。ビーズ精製後、最終的反応は、単一密閉管において、オリゴヌクレオチド８をＵＳＥＲ酵素によりエンドヌクレアーゼ開裂すること、３’アダプターオリゴヌクレオチド７のリバース相補体にアニーリングした後の５’アダプター（インデキシングプライマー３）をＤＮＡの５’末端にライゲーションすること、ならびに必要に応じて、プレアニーリングされた線状ブロッカー５により、インデキシングプライマー４がライゲーション反応に関与するのを防止すること（インデキシングプライマー４がインデキシングプライマー３の３’部分と同じ配列を含むため）を同時に行った後に、ＰＣＲをインデキシングして、ライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。

図１Ｅの方法を、ＡテールドＤＮＡに使用するように改造することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの（３’エクソ）クレノウ断片などの、３’プルーフリーディング活性を欠くＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートした後に、オリゴヌクレオチド７および８により形成されたＵ塩基オーバーハングを３’末端に有する３’アダプターをライゲーションすることによって３’末端Ａテーリングを達成することができ、オリゴヌクレオチド９は、ライゲーション反応に関与する、Ｕ塩基を３’末端に含む少なくとも２つの開裂可能Ｕ塩基を有し、オリゴヌクレオチド７は、やはりライゲーション反応に関与するホスフェートを平滑末端の５’末端に有する。ビーズ精製後、最終的反応は、図１Ｆに示されるように、単一密閉管において、オリゴヌクレオチド９をＵＳＥＲ酵素によりエンドヌクレアーゼ開裂すること、３’アダプターオリゴヌクレオチド７のリバース相補体にアニーリングした後の５’アダプターインデキシングプライマー３をＤＮＡの５’末端にライゲーションすること、ならびに必要に応じて、プレアニーリングされた線状ブロッカー５により、インデキシングプライマー４がライゲーション反応に関与するのを防止すること（インデキシングプライマー４がインデキシングプライマー３の３’部分と同じ配列を含むため）を同時に行った後に、ＰＣＲをインデキシングして、ライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。

別の実施形態において、ライゲーションカップルドＰＣＲのためのトランケーションされたＮＧＳライブラリーワークフローは、それらの３’末端における共通アダプター配列を各インデキシングプライマー３および４を利用している（図１Ｇ）。このワークフローにおいて、断片化ＤＮＡは、Ｔ４またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼなどのポリシングＤＮＡポリメラーゼによる末端修復、ならびにオリゴヌクレオチド７および８によって形成された、平滑末端を有する３’アダプターのライゲーションが施され、オリゴヌクレオチド８は、Ｕ塩基などの１つまたは複数の開裂可能塩基、およびライゲーション反応に関与しない、平滑末端の３’末端における修飾ヌクレオチド（例えば、リボースが３’ヒドロキシルまたは３’および２’ヒドロキシル基の両方から欠失した修飾）を有し、オリゴヌクレオチド７は、ライゲーション反応に関与する、平滑末端の５’末端におけるホスフェートを有する。ビーズ精製後、最終的反応は、単一密閉管において、オリゴヌクレオチド８をＵＳＥＲ酵素によりエンドヌクレアーゼ開裂すること、３’アダプターオリゴヌクレオチド７のリバース相補体にアニーリングした後のトランケーションされたヘアピン５’アダプター６をＤＮＡの５’末端にライゲーションすることを同時に行った後に、インデキシングプライマー３および４を使用してＰＣＲをインデキシングして、ライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。ヘアピン５’アダプターの二次構造は、それが、完成したライブラリー分子から５’アダプターをトランケーションしないように、ＰＣＲ時にプライマーとしてのその活性を防止する。

図１Ｇの方法を、ＡテールドＤＮＡに使用するように改造することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの（３’エクソ）クレノウ断片などの、３’プルーフリーディング活性を欠くＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートした後に、オリゴヌクレオチド７および８により形成された、Ｕ塩基オーバーハングを３’末端に有する３’アダプターをライゲーションすることによって３’末端Ａテーリングを達成することができ、オリゴヌクレオチド８は、ライゲーション反応に関与する、Ｕ塩基を３’末端に含む少なくとも２つの開裂可能Ｕ塩基を有し、オリゴヌクレオチド７は、やはりライゲーション反応に関与するホスフェートを平滑末端の５’末端に有する。ビーズ精製後、最終的反応は、図１Ｈに示されるように、単一密閉管において、オリゴヌクレオチド８をＵＳＥＲ酵素によりエンドヌクレアーゼ開裂すること、３’アダプターオリゴヌクレオチド７のリバース相補体にアニーリングした後のトランケーションされた５’ヘアピンアダプター６をＤＮＡの５’末端にライゲーションすることを同時に行った後に、ＰＣＲをインデキシングして、ライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。ヘアピン５’アダプターの二次構造は、それが、完成したライブラリー分子から５’アダプターをトランケーションしないように、ＰＣＲ時にプライマーとしてのその活性を防止する。

平滑末端を有する３’アダプターおよびライゲーションカップルドＰＣＲステップを利用するＮＧＳライブラリー調製方法（図１Ｅおよび図１Ｇ）は、ライブラリー収率が高いこと、ＤＮＡ投入量を変更する際のアダプター濃度の調整が不要であること、およびＡＴ／ＧＣバイアスが非常に低いことなどの、他の利用可能なキットと比較した場合のＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡライブラリー調製の主たる利点を維持しながら、酵素ステップの数を５から３に減少させ、精製ステップの数を５から２に減少させることにより、Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡライブラリーワークフローに対する実質的な改良をもたらす。記載の方法の唯一の制限は、５０～１００ｎｇを超えるＤＮＡ投入濃度でキメラＤＮＡを形成することである。

ＵまたはＴオーバーハングを有する３’アダプターおよびライゲーションカップルドＰＣＲステップを利用するＮＧＳライブラリー調製方法（図１Ｆおよび図１Ｈ）は、ライブラリー収率が高いこと、ＤＮＡキメラが欠如していること、ＤＮＡ投入量範囲が非常に広いこと、およびＤＮＡ投入量を変更する際のアダプター濃度の調整が不要であることなどのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡライブラリーのすべての利点を維持しながら、酵素ステップの数を５から３に減少させ、精製ステップの数を５から２に減少させることにより、Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ２ＳＤＮＡライブラリーワークフローに対する実質的な改良をもたらす。アダプター二量体が欠如し、その結果としてＤＮＡの極めて低いヘムトグラム量で機能できることは、既に記載されたすべてのＮＧＳライブラリー方法からそれらを大いに差別化する、図１Ｆおよび１Ｈに示されるワークフローの独自の特性である。図１Ｉ（ａ）に示されるように、図１Ｇ（ならびに１Ｈ）に示されるプロトコルにおけるアダプター二量体形成の強い抑制は、プライマーオリゴヌクレオチド３にアニーリングした後の３’アダプターライゲーションおよび精製後に残留する任意のオリゴヌクレオチド７が、低濃度で存在する場合は自己ライゲーションできないＴ塩基オーバーハングを有するアダプターを形成することに由来する。図１Ｉ（ｂ、ｃ）に示されるように、Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓ（ｂ）、およびＹアダプターを利用するＮＧＳライブラリープロトコル（ｃ）でもアダプター二量体の形成が可能であり、Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓライブラリーの場合は、（キャリー・オーバー３’アダプター２およびアダプタープライマー３のアニーリングによって形成される）平滑アダプターの自己ライゲーションが比較的低いアダプター濃度でも生じ得るため、第２のライゲーション反応時にアダプター二量体の形成が起こり、（ｃ）の場合は、アダプター末端間のＴ^＊Ｔミスマッチにかかわらず、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＹアダプターの濃度が高いためアダプター二量体の形成が生じる。

ＴまたはＵ塩基オーバーハングを有するアンプリコンおよびＮＧＳライブラリーなどのいくつかの実施形態において、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応に使用されるエンドヌクレアーゼは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓのＵＳＥＲ酵素もしくはＱｉａｇｅｎのＵｒａｃｉｌＣｌｅａｖａｇｅＳｙｓｔｅｍ、またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの任意の他のミックスである。３’アダプターオリゴヌクレオチドの３’末端とＤＮＡの５’末端の間に共有結合が存在しない、ｄｄＴ、３’－ｄＴ、ｄｄＧまたは３’－ｄＧ塩基を３’末端に有する平滑末端３’アダプターを利用するＮＧＳライブラリーの実施形態において、ＵＤＧ酵素のみとのインキュベーションによってアダプターオリゴヌクレオチドの不安定化および放出を達成することができる。ＵＤＧ酵素は、オリゴヌクレオチド１内に途切れを生じさせないが、アニーリング温度を３７℃未満に低下させ、オリゴヌクレオチド８を相補的３’アダプターオリゴヌクレオチド７から解離させて、ＤＮＡ末端への５’アダプターインデキシングプライマー３のアニーリングおよびライゲーションを可能にするのに十分な多くの脱塩基部位を生成する（図１Ｇ）。

ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する方法
図２Ａに示される一実施形態において、図１Ａに提示されるワークフローを必要に応じたブロッカーの非存在下で実施することができる。示されるように、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質分子１０は、第２の鎖１２に部分的に相補的な第１の鎖１１を含み、第１の鎖１１および第２の鎖１２の各々が、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質分子１０の各末端で３’オーバーハング２を形成する。相補的部分に関して、かつ用語の一貫性のために、この相補的部分を第１の鎖の第１の部分および第２の鎖の第３の部分とすることができる。本開示全体を通じて、第１の鎖の第１の部分および第２の鎖の第３の部分は、その部分ならびにその配列を指すことが理解されるべきである。したがって、ＰＣＲ生成物は、最初の第１の部分を含まないが、第１の部分の配列を含む可能性があるため、本明細書では第１の部分を含むと見なされる。各オーバーハングも各３’オーバーハング２の５’末端に第１の共通ヌクレオチド配列を含む。限定することを意図するものではないが、図２Ａにおいて、二本鎖ＤＮＡ生成物を、例えば、エンドヌクレアーゼによって開裂して部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成することができるユニバーサルプライマー１からのｄＵ塩基を含めるための、ｄＵ塩基を含むユニバーサルプライマーによる多重ＰＣＲ増幅によって生成することができる。そのような場合は、３’オーバーハング２をユニバーサルプライマー１のリバース相補体とすることができる。その対のインデキシングプライマー３（第１のインデキシングプライマー）および４（第２のインデキシングプライマー）の各々が、ライゲーション反応温度より高いＴ_ｍを有する基質アンプリコン上の３’オーバーハング２の５’末端に第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な同一の３’末端配列を有するため、両プライマーをアダプターライゲーションステップに利用することができる。このアニーリング特異性の欠如により、５’および３’アダプターの両方を必要とする機能性ライブラリー分子の形成を低減することができる。５’アダプタープライマー３（第１のインデキシングプライマー）のライゲーションのみにより機能性ライブラリーが生成される。３’アダプタープライマー４（第２のインデキシングプライマー）がライゲーションする場合は、ユニバーサルアダプターがトランケーションされた３’アダプターを含むため、両末端に同様のアダプターを有する非機能性ライブラリーが生成される。

図２Ａにさらに示されるように、ライゲーションステップの後に、５’から３’方向に、第１のインデキシングプライマー３の１つ、（第３の鎖１３では）第１の部分または（第４の鎖１４では）第３の部分、および第１の共通ヌクレオチド配列を含む３’オーバーハング２を含む第３の鎖１３および第２のオリゴヌクレオチド１４を得ることができる。ＰＣＲのさらなるサイクルにおいて、第２のインデキシングプライマー４は、第３の鎖１３または第４の鎖１４の第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、５’から３’方向に、第２のインデキシングプライマーの１つ、（第６の鎖１６では）第１の部分または（第５の鎖１５では）第３の部分、および第１のインデキシングプライマー３’のリバース相補体を含むそれぞれ第５の鎖１５および第６の鎖１６を生成することができる。ＰＣＲのさらなるサイクルにおいて、第１のインデキシングプライマー３は、第５の鎖１５または第６の鎖１６上の第１のインデキシングプライマー３’のリバース相補体にアニーリングし、次いでＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、５’から３’方向に、第１のインデキシングプライマー３、（第７の鎖１７では）第１の部分または（第８の鎖１８では）第３の部分および第２のインデキシングプライマー４’のリバース相補体を含む第７の鎖１７および第８の鎖１８を生成することができる。第７の鎖１７および第８の鎖１８は、それぞれ第５の鎖１５および第６の鎖１６に相補的である。さらなるＰＣＲサイクルは、第１のインデキシングプライマーおよび第２のインデキシングプライマーが、二本鎖の第７の鎖１７および第５の鎖１５ならびに二本鎖の第８の鎖１８および第６の鎖１６を増幅させて、最終的なライブラリーを生成することを可能にすることができる。図２Ａにさらに示されるように、一方の末端上に第１のインデキシングプライマーを、もう一方の末端上にその相補体を有するオリゴヌクレオチドが生成される場合、例えば第１のインデキシングプライマーがライゲーションし、そのライゲーションされた鎖をプライミングした場合は、ＰＣＲ時のこれらの末端の相補性が、これらの望ましくない生成物の増幅を抑制する。一方の末端上に第２のインデキシングプライマーを、もう一方の末端上にその相補体を有するオリゴヌクレオチドが生成される場合も同様である。

代替的な実施形態において、ライゲーション反応に添加される前に完全長３’アダプターインデキシングプライマー４にプレアニーリングされる線状ブロッカー５が使用される（図２Ｂ）。それにより、このプライマーの３’末端が、ライゲーションインキュベーション温度で配列２にアニーリングされた後にアンプリコン基質にライゲーション可能になることが防止される。しかし、ブロッカーＴ_ｍはＰＣＲアニーリング温度より低い、またはブロッカーは不活性化されるため、３’アダプターインデキシングプライマー４が、ＰＣＲ時に効率的にアニーリングすることができる。図２Ｃは、（ａ）低いＴ_ｍを含むためＰＣＲ時に不活性となる線状ブロッカー、または（ｂ）ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプターを使用する場合にＰＣＲ時に不活性化するヘアピンブロッカーをさらに詳細に示す。ｉ７インデキシングプライマー４、および、不活性化されているためライゲーション反応時の３’アダプターインデキシングプライマーへのアニーリングは可能であるが、ＰＣＲ時にアニーリングしない、より低いＴ_ｍを有する線状ブロッカー５ａまたはヘアピンブロッカー５ｂ：（ａ）線状ブロッカー５ａは、インデキシングプライマー４上のユニバーサルアダプター配列に対して１つまたは複数のミスマッチを含む（３つのミスマッチが示される）、または限定することなく、いずれもブロッカーがインデキシングプライマーのプライミングを阻害できないようにそのＴ_ｍをＰＣＲアニーリング温度未満に低下させる１つまたは複数のＴデオキシヌクレオチド（６つ示される）を含む非相補的塩基の挿入を含む。ブロッカーミスマッチまたは挿入は、共通アダプター配列に相補的な配列の３’に位置し、ブロッカーが、ライゲーションステップ時にプライマーの３’末端にアニーリングすることを可能にし、線状ブロッカーも、伸長を防止するための３’Ｃ３スペーサーブロッキング基を含む。（ｂ）に関しては、ヘアピンブロッカー５ｂは、ブロッカーの５’オーバーハングが、ライゲーションステップ時にプライマーの３’末端にハイブリダイズすることを可能にするステムループヘアピンを含むが、ポリメラーゼのホットスタート活性化に際して、ヘアピンブロッカーはその３’末端から伸長されて、ＰＣＲアニーリング温度でのその安定な二次構造のためにＰＣＲ時にアニーリングすることができない完全に二本鎖のヘアピンを生成する。図２Ｄは、アダプター配列に対するミスマッチにより、より低いＴ_ｍを有する線状ブロッカーを使用する方法をさらに説明するために、多重ＰＣＲ、組み込まれたユニバーサルプライマー１のエンドヌクレアーゼ開裂、３’アダプターインデキシングプライマー（ｉ７）４にプレアニーリングされた、３つのミスマッチを有する線状ブロッカー５、および基質アンプリコン上のユニバーサルアダプター配列２のリバース相補体の５’部分への５’アダプターインデキシングプライマー（ｉ５）３の３’末端のライゲーションの態様についてのＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプター配列を示す。この実施形態において、線状ブロッカーは、ポリメラーゼによる伸長を防止するための非相補的３’テール配列を有する。図２Ｅは、６Ｔデオキシヌクレオチドループの挿入により、より低いＴ_ｍを有する線状ブロッカーを使用する方法をさらに説明するために、多重ＰＣＲ、組み込まれたユニバーサルプライマー１のエンドヌクレアーゼ開裂、３’アダプターインデキシングプライマー（ｉ７）４にプレアニーリングされた、６Ｔ挿入物を有する線状ブロッカー５、および基質アンプリコンの５’末端への５’アダプターインデキシングプライマー（ｉ５）３の３’末端のライゲーションの態様についてのＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプター配列を示す。

図２Ｆは、Ｔ_ｍを低下させるＴ^＊Ｇミスマッチに加えて、３つの分解性Ｕ塩基を有する線状ブロッカーを示す。ウラシルグリコシラーゼとのインキュベーションは、ブロッカー内に３つの脱塩基部位を生成することによりそのインデキシングプライマー４との相互作用を、５’アダプターインデキシングプライマー３ライゲーションステップ時のインデキシングプライマー４からのその解離には不十分であるが、ＰＣＲ時の熱によるその分解には十分にさらに不安定化させる。図２Ｇは、平滑末端アダプターライゲーション、ＤＮＡ３’アダプターオリゴヌクレオチド８にアニーリングするが、共有接合しないＵＤＧ開裂および不安定化、３’アダプターインデキシングプライマー（ｉ７）４にプレアニーリングされた、Ｔ^＊Ｇミスマッチおよび３つのウラシルヌクレオチドを有する線状ブロッカー５のＵＤＧ開裂および不安定化、ならびに基質ＤＮＡの５’末端への５’アダプターインデキシングプライマー（ｉ５）３の３’末端のライゲーションの態様についてのＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプター配列を示す。

ヘアピンアダプターを使用する方法
一部の代替的な実施形態は、ライゲーションカップルドＰＣＲのためのトランケーションされたアダプターを利用する。トランケーションされたアダプターは、それらの３’末端における共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマーを使用する場合に必要とされる。図３Ａに示されるように、線状のトランケーションされたアダプター１００を使用する場合と、エンドヌクレアーゼ開裂およびアダプターライゲーションステップは効率的に進行するが、５’アダプターインデキシングプライマーアニーリングのための特異性を付与するために、線状のトランケーションされた５’アダプターは、ＰＣＲサイクル時のアニーリングおよび伸長に十分なＴ_ｍ温度をも有することで、一部の完成された５’アダプターのトランケーションおよびライブラリー収率の低下がもたらされる。図３Ｂは、３’末端における共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマー３および４を使用する場合にライゲーションカップルドＰＣＲのためにヘアピンがトランケーションされたアダプター５が使用されるこの問題の解決策を示す。エンドヌクレアーゼ開裂の後に、共通アダプター配列の少なくとも一部分を含むヘアピンアダプターの３’一本鎖オーバーハングのアニーリングおよびライゲーションが続く。その後の５’アダプターインデキシングプライマーアニーリングのための特異性を付与するために、ヘアピンアダプターは、５’アダプターの独自の配列、およびＴループ配列をも含むヘアピンを生成するためのブロッカーの５’末端におけるこの配列のリバース相補体を含む。この二次構造は、その自己相補性とのアニーリング競合によりＰＣＲ時のプライマーとしてのその活性を低下させ、ＰＣＲ時に、ヘアピンアダプターが完成されたアダプターをトランケーションすることができないため、増幅ライブラリー収率を高める。図３Ｃは、ステムループがトランケーションされたアダプター６が、ループ配列内に黒丸で表される複製不可能修飾をも含むため、完全に複製されたヘアピン生成物の形成が防止されることをさらに示す。インデキシングＰＣＲがインデキシングプライマー４によって開始されると、ヘアピンの複製が、複製ブロックによってトランケーションされる。これは、その二次構造により、ヘアピンアダプターからのアニーリングの競合のないインデキシングプライマー３の効率的なアニーリング、および効率的なインデキシングＰＣＲを可能にする。図３Ｄは、ステムループがトランケーションされたアダプター６がループ配列内に複製不可能修飾を欠く場合の望ましくない結果を示す。この場合は、インデキシングＰＣＲがインデキシングプライマー４によって開始されると、完全ヘアピンの複製が生じる。その結果、複製ヘアピンの３’末端がアニーリングし、さらに伸長して、非機能性である完全に二本鎖のヘアピンライブラリー分子を生成する。したがって、トランケーションされたヘアピンアダプターを使用する場合は非複製修飾の使用が必要になる。

内部複製不可能Ｃ３スペーサーを含むヘアピンがトランケーションされたアダプターがライゲーションカップルドＰＣＲに使用される場合にＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを使用する具体的な実施形態を図３Ｅに提示する。この例において、ｄＵ塩基を含むユニバーサルアンプリコンは、すべての６Ｔデオキシヌクレオチドに取って代わるため、プライマー配列１全体がＵＳＥＲによって開裂および除去される。したがって、ヘアピンがトランケーションされたアダプター６は、基質へのライゲーションのための３’オーバーハングとしてのＴｒｕＳｅｑ共通アダプター配列のすべての１３の塩基を含む。加えて、それらの３’末端における共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマー３および４が使用されるため、ＰＣＲ時にインデキシングプライマー４のために十分なアニーリング配列を提供するために、３’アダプターの一部分であるオリゴ６が、インデキシングプライマー４にアニーリングされると同時に、各アンプリコン上の配列２の３’末端にライゲーションされる。図３Ｆは、内部複製不可能Ｃ３スペーサーを有するヘアピンがトランケーションされたアダプターがライゲーションカップルドＰＣＲに使用されるＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを使用する代替的な実施形態を示す。この例において、ｄＵ塩基を含むユニバーサルアンプリコンプライマー１は、３’最末端Ｔ塩基を除いてすべてのＴデオキシヌクレオチドに取って代わるため、共通アダプター配列の一部分のみがＵＳＥＲ開裂により開裂および除去される。したがって、ヘアピンがトランケーションされたアダプターが、基質へのライゲーションのための３’オーバーハングとしての共通アダプター配列の１３の塩基のうちの１１のみを含む。これは、変更された塩基組成を含むアンプリコン末端に隣接するＵ塩基を開裂しないことによりエンドヌクレアーゼ開裂におけるバイアスを低減することができる。加えて、それらの３’末端における共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマー３および４が使用されるため、ユニバーサルプライマーがトランケーションされた３’アダプター配列を含むと、ＰＣＲ時にインデキシングプライマー４のために十分なアニーリング配列を提供するために、３’アダプターの一部分であるオリゴ２２がインデキシングプライマー４にアニーリングされると同時に、各アンプリコン上の配列２の３’末端にライゲーションされる。

別の代替的な実施形態において、ライゲーションカップルドＰＣＲにヘアピンがトランケーションされたアダプター、完全長インデキシングプライマーおよび線状ブロッカーを用いたＮｅｘｔｅｒａＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローが使用される（図３Ｇ）。Ｎｅｘｔｅｒａアダプターは、両アダプターに共通の１９塩基配列を含む。この例において、ｄＵ塩基を含むユニバーサルアンプリコンプライマーは、すべての５つのＴデオキシヌクレオチドに取って代わるが、ＵＳＥＲ開裂が実施される場合は、Ｔ塩基が不在であることにより３’末端９塩基配列が保持される。したがって、ヘアピンがトランケーションされたアダプター５は、３’オーバーハングとしての共通アダプター配列の残留する１０の塩基を含み、ヘアピンアダプターの５’オーバーハングも同様に、５’アダプターに独自のさらなる配列、そのリバース相補体、および複製不可能スペーサーを含むＴループを含む。この例において、完全長Ｎｅｘｔｅｒａインデキシングプライマー３および４が使用されるが、ＵＳＥＲによる開裂後に残留するユニバーサル配列１の部分によりライゲーションに適応しない。加えて、インデキシングプライマー４が、ヘアピンアダプター６によるアニーリングおよびライゲーションについて競合することを防止するために、線状ブロッキングオリゴヌクレオチド２２が使用される。別の実施形態において、図３Ｈは、ライゲーションカップルドＰＣＲのために、ヘアピンがトランケーションされたアダプターが、共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマーとともに使用される別のＮｅｘｔｅｒａＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを示す。この例において、ｄＵ塩基を含むユニバーサルアンプリコンプライマー１は、すべての５つのＴデオキシヌクレオチドに取って代わるが、ＵＳＥＲ開裂が実施される場合は、Ｔ塩基が不在であることにより３’末端９塩基配列が保持される。したがって、ヘアピンがトランケーションされたアダプター６は、３’オーバーハングとしての共通アダプター配列の残留する１０の塩基を含み、ヘアピンアダプターの５’オーバーハングも同様に、５’アダプターに独自のさらなる配列、そのリバース相補体、および複製不可能スペーサーを含むＴループを含む。この例において、それらの３’末端における１９塩基共通アダプター配列を欠くＮｅｘｔｅｒａインデキシングプライマー３および４が利用されるため、さらに、ＰＣＲ時にインデキシングプライマー４のための十分なアニーリング配列を提供するために、３’アダプターの一部分を含むオリゴ２２が、インデキシングプライマー４にアニーリングされると同時に、各アンプリコン上の配列２の３’末端にライゲーションされる。異なるインデックス配列を有するアダプターにアニーリングするユニバーサルなトランケーションされたアダプターを生成するために、トランケーションされたアダプター６は、試料特異的インデックス配列をスパンして効果的なアニーリング温度を達成する必要があるため、試料特異的インデックス配列が、ユニバーサルＴループに置き換えられる。

次の４つの実施形態は、ＮＧＳライブラリーワークフローのライゲーションカップルドＰＣＲステップにおけるヘアピン５’アダプターの使用を説明する。内部複製不可能Ｃ３スペーサーを含むヘアピンがトランケーションされたアダプターがライゲーションカップルドＰＣＲに使用される場合にＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを使用する２つの具体的な実施形態を図３Ｉおよび図３Ｊに提示する。図３Ｉに示される例において、ｄＵ塩基を含む３’アダプターオリゴヌクレオチド９は、すべての６つのＴデオキシヌクレオチドに取って代わるため、配列９全体がＵＳＥＲによって開裂および除去される。図３Ｊに示される例において、３’アダプターオリゴヌクレオチド１とＤＮＡの間の共有結合が不在であることにより、オリゴヌクレオチド９のＴ_ｍを、ＵＤＧとのインキュベーションおよび６つの脱塩基部位の生成により、オリゴヌクレオチド９の３’アダプターオリゴヌクレオチド７からの解離およびヘアピンアダプター６へのアニーリングのために十分に実質的に低下させることができる。両実施形態において、ヘアピンがトランケーションされたアダプター６は、基質へのライゲーションのための３’オーバーハングとしてのＴｒｕＳｅｑ共通アダプター配列のすべての１３の塩基を含む。

図３Ｋは、内部複製不可能Ｃ３スペーサーを有するヘアピンがトランケーションされたアダプター５がライゲーションカップルドＰＣＲに使用されるＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローを使用する代替的な実施形態を示す。この例において、ｄＵ塩基を含む３’アダプターオリゴヌクレオチド９は、３’最末端Ｔ塩基を除くすべてのＴデオキシヌクレオチドに取って代わるため、共通アダプター配列の一部分のみが、ＵＳＥＲ開裂によって開裂および除去される。したがって、ヘアピンがトランケーションされたアダプター６は、基質へのライゲーションのための３’オーバーハングとしての共通のアダプター配列の１３の塩基のうちの１１のみを含む。これは、変更された塩基組成を含むＤＮＡ末端に隣接するＵ塩基を開裂しないことによりエンドヌクレアーゼ開裂におけるバイアスを低減することができる。

別の代替的な実施形態において、ライゲーションカップルドＰＣＲにヘアピンがトランケーションされたアダプター、完全長インデキシングプライマーおよび線状ブロッカーを用いたＮｅｘｔｅｒａＩｌｌｕｍｉｎａアダプターワークフローが使用される（図３Ｌ）。Ｎｅｘｔｅｒａアダプターは、両アダプターに共通の１９塩基配列を含む。この例において、ｄＵ塩基を含む３’アダプターオリゴヌクレオチド９は、すべての５つのＴデオキシヌクレオチドに取って代わるが、ＵＳＥＲ開裂が実施される場合は、Ｔ塩基が不在であることにより３’末端９塩基配列が保持される。したがって、ヘアピンがトランケーションされたアダプター６は、３’オーバーハングとしての共通アダプター配列の残留する１０の塩基を含み、ヘアピンアダプターの５’オーバーハングも同様に、５’アダプターに独自のさらなる配列、そのリバース相補体、および複製不可能スペーサーを含むＴループを含む。この例において、この例において、完全長Ｎｅｘｔｅｒａインデキシングプライマー３および４が使用されるが、ＵＳＥＲによる開裂後に残留するユニバーサル配列１の部分によりライゲーションに適応しない。加えて、インデキシングプライマー４が、ヘアピンアダプター６によるアニーリングおよびライゲーションについて競合することを防止するために、線状ブロッキングオリゴヌクレオチド２２が使用される。

ブロッカーの説明
それぞれそれらの３’末端に同じ共通アダプター配列を含む完全長インデキシングプライマーを使用すると、開示されるブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’アダプターインデキシングプライマーの３’部分と二本鎖構造を形成して、それが５’アダプターインデキシングプライマーライゲーション時にアンプリコン基質にアニーリングおよびライゲーションすることを防止することができる。これは、ＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａアダプターが（第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な）１３塩基共通アダプター配列を有し、ＮｅｘｔｅｒａＩｌｌｕｍｉｎａアダプターが１９塩基共通アダプター配列を有し、これらの共通アダプター配列の各々のＴ_ｍが、熱不安定なリガーゼのインキュベーション温度より有意に高いため、両プライマーの存在下で１つのプライマーをアニーリングおよびライゲーションするための特異性がブロッカーにより達成されるためである。ブロッカーは、設計および機能についての以下の３つの基準を含む。ｉ）３’アダプターインデキシングプライマーへのブロッカーのアニーリングは、５’アダプターインデキシングプライマーの特異的ライゲーションおよび機能性ＮＧＳライブラリーの形成を可能にするため、５’および３’アダプターインデキシングプライマーの両方を含む、ライゲーション生成物の混合物、ならびに機能性ＮＧＳライブラリー構築の減少が防止されること、ｉｉ）５’アダプターインデキシングプライマーの共通アダプター配列へのブロッカーオリゴヌクレオチドのアニーリングが、３’アダプターインデキシングプライマーへのアニーリングと比較して低減されること、ならびにｉｉｉ）全体的なブロッカーのＴ_ｍがＰＣＲアニーリング温度未満であるため、ＰＣＲ時に３’アダプターインデキシングプライマーのアニーリングを阻害できない、またはブロッカーは、ＰＣＲ時に、それが３’アダプターインデキシングプライマーのアニーリングを阻害できないようにポリメラーゼによって不活性化されること。本開示では、これらの基準を満たす２つのブロッカー設計、すなわち線状ブロッカーおよびヘアピンブロッカーについて記載する。

線状ブロッカーは、結合ドメイン３１、ブロッカーの５’末端に存在する結合ドメイン３２、リンカードメイン３３、および３’末端ドメイン３４を含む（図４Ａ参照）。結合ドメイン３２は、両インデキシングプライマーの共通アダプター配列（ＴｒｕＳｅｑでは１３塩基およびＮｅｘｔｅｒａでは１９塩基）の少なくとも一部分に相補的である。結合ドメイン３１は、３’アダプターインデキシングプライマーの共通アダプター配列の５’に位置する独自のアダプター配列の少なくとも一部分に相補的であるが、試料特異的インデックス配列を含まない。結合ドメイン３１は、５’アダプターインデキシングプライマーより３’アダプターインデキシングプライマーへの選択的アニーリングを促進するより高い相補性を提供する。結合ドメイン３１の融解温度は、結合ドメイン３２の融解温度と少なくとも等しいか、または好ましくはそれより高く、その差は、少なくとも１℃またはそれより大きい。リンカードメイン３３は、インデキシングプライマーのいずれの部分にも相補的でないため、全体的なＴ_ｍ、およびＰＣＲ時の３’アダプターインデキシングプライマーへのブロッカー結合効率を低下させるために使用されるミスマッチドメインである。リンカーは、ポリＴ、ポリＡもしくはポリＣ配列、またはＡ、Ｔ、ＣおよびＧ塩基の任意の組合せの挿入物を含む。その長さは、１から５０ヌクレオチドに変化することができる。リンカードメインは、さらなるヌクレオチドの挿入物でない２つまたはそれより多い連続ミスマッチヌクレオチドのミスマッチまたはストレッチを含むこともできる。３’末端ドメイン３４は、ライゲーションカップルドＰＣＲのＰＣＲフェーズ時のポリメラーゼによる伸長を阻害するために使用される。それは、限定することなく、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオチド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、またはポリＴ、ポリＡ、ポリＣおよびポリＧなどの、隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列であって、プルーフリーディングポリメラーゼ３’－５’エクソヌクレアーゼ活性が、隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列を除去することを防止するためにヌクレアーゼ抵抗性結合をさらに含むＤＮＡ配列を含む３’修飾を含むことができる。図４Ｂに示されるように、結合ドメイン３１は、５’アダプターインデキシングプライマーに対する３’アダプターインデキシングプライマーへのブロッカーのアニーリングのための特異性を付与する。必須ではないが、最良の結果は、ブロッカーをライゲーション反応への添加の前に３’アダプターインデキシングプライマーにプレアニーリングすることによって達成される。しかし、ドメイン３２のＴ_ｍは、３７℃のインキュベーション温度より高温（Ｔ_ｍ：約４８℃）であるため、任意の過剰のブロッカー、または３’アダプターインデキシングプライマーからのブロッカーの解離物が、ドメイン３２により５’アダプターインデキシングプライマーにアニーリングし得る。しかし、ドメイン３１により、アニーリングは、５’アダプターインデキシングプライマーへのアニーリング（図４Ｂ（ａ））より３’アダプターインデキシングプライマー（図４Ｂ（ｂ））が熱力学的に優先されるため、エンドヌクレアーゼ開裂の後に５’アダプターインデキシングプライマーがアンプリコン基質に効率的にライゲーションされ、３’アダプターインデキシングプライマーのライゲーションが生じない、または最小限に抑えられる。図４Ｃに示されるように、ＰＣＲ時に、線状ブロッカーは、非相補的ドメイン３３が、ドメイン３１と３２の間の塩基スタッキング相互作用を妨害し、その結果として、ブロッカーの全体的安定性およびＴ_ｍが、ＰＣＲアニーリング温度より低く、３’アダプターインデキシングプライマーに完全相補的な競合アンプリコン基質より有意に低いことにより、３’アダプターインデキシングプライマーにアニーリングしない。

代替的なヘアピンブロッカーは、線状ブロッカーと類似の結合ドメイン３１および３２を含むが、非相補的リンカードメイン３３、およびポリメラーゼによる伸長を防止するための封鎖３’末端を欠く。その代わり、ヘアピンブロッカーは、ステムドメイン３５および３６ならびにループドメイン３４によって形成されたステムループ構造をその３’末端に有する（図４Ｄ）。ライゲーション反応時に、ヘアピンブロッカーは、ブロッカーおよびプライマーの両ドメイン３１と３２の間の相補性により、熱力学的に優先されて３’アダプターインデキシングプライマーにアニーリングし（Ｔ_ｍ：約６５～７０℃、図４Ｄ（ｂ））、ブロッカーとプライマーの間のドメイン３２のみとに相補性が低下することにより、５’アダプターインデキシングプライマーへのアニーリングが低減される（Ｔ_ｍ：約４８℃、図４Ｄ（ａ））。したがって、５’アダプターインデキシングプライマーのためのライゲーション特異性は、インデキシングプライマーがそれらの３’末端に同一の共通アダプター配列を有していても、両方のインデキシングプライマー存在下で達成される。ライゲーションカップルドＰＣＲのＰＣＲフェーズ時に、ブロックされないため、ヘアピンブロッカーのステムドメイン３６の３’末端は、ヘアピンブロッカーオリゴヌクレオチドの自己複製を開始するＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能である。自己複製により、ＰＣＲアニーリング温度で維持される約９０℃の高Ｔ_ｍ二次構造が生成されるため、ドメイン３１および３２の全体的なＴ_ｍがＰＣＲアニーリング温度を超える約７３℃であっても、３’アダプターインデキシングプライマーにアニーリングし、それを阻害するブロッカーの能力が不活性化される（図４Ｅ参照）。その結果、３’アダプターインデキシングプライマーは、ＰＣＲ時に鋳型を効率的に増幅させることができ、ライゲーション反応においてのみ阻害されて、５’アダプターインデキシングプライマーによるアンプリコン基質へのライゲーションに対する特異性を付与する。ステムドメイン３５および３６の長さは、３’ヘアピン安定性およびＰＣＲアニーリング温度でのプライミングを提供するのに十分であるべきであり、望ましくは、その融解温度が、ＰＣＲ反応とブロッカードメイン３１および３２の両方のアニーリング温度より高くあるべきである。この場合、ブロッカーが既に不活性化されている場合により低い温度で生じるインデキシングプライマーアニーリングの前に、より高い温度でヘアピンブロッカーオリゴヌクレオチドの自己複製を遂行することができる。ループドメイン３４の長さおよび塩基組成は、順応性を有し、１から６またはそれより多いＴ、Ａ、ＣもしくはＧデオキシヌクレオチド、またはそれらの組合せを含むことで、ブロッカードメイン３５および３６による安定なステムループ構造の形成を可能にする（図４Ｄ）。

ブロッカー内の１つまたは複数のＴヌクレオチドをｄＵ塩基に置き換えることによって、ブロッカーと３’アダプターインデキシングプライマーとの相互作用のさらなる不安定化を達成することができる。５’アダプターライゲーション反応時のＵＤＧ酵素とのインキュベーションの結果、ｄＵ塩基が除去され、最初のＰＣＲサイクル時にブロッカーオリゴヌクレオチドの断片化を促進させる脱塩基部位を生成する。

ヘアピンアダプターの説明
インデキシングプライマーをライゲーションのためのアダプターとしても使用できない場合の２つの例が存在する。第１の例は、不十分なアダプター配列を含むものとして、独自のアダプター配列のみを含み、それらの３’末端における共通のアダプター配列を欠くインデキシングプライマーを使用する場合である。他の例において、アンプリコン上のユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂がユニバーサルプライマー配列全体を除去する開裂のパターンを生成せず、アンプリコン接合部にプライマーの非消化の３’部分を残す場合は、インデキシングプライマー３’末端が、（共通アダプター配列を欠くインデキシングプライマーを使用するか、または共通アダプター配列を含む完全長インデキシングプライマーを使用するかに応じて）その３’末端に不十分または過剰のアダプター配列含有量を有するため、５’アダプターとしての使用に適合しない。その方法のこれらの２つの実施形態では、ライゲーションカップルドＰＣＲにトランケーションされた５’アダプターが補充される。図５Ａに示されるように、完全長アダプター（ａ）と比較したトランケーションされた５’アダプターは、線状であること（ｂ）、またはステムループ構造を有するヘアピンを含むこと（ｃ）が可能であり、ヘアピンが、その安定な自己相補性との競合によりＰＣＲ時にアダプターのアニーリングおよび伸長を防止する。これにより、ヘアピンアダプターが、ＰＣＲ時に、完成された５’アダプターをトランケーションすることを防止して、それをトランケーションされた５’アダプターについての好ましい実施形態とする。これに対して、線状のトランケーションされたアダプターは、ＰＣＲ時に、完成された５’アダプター分子を効率的にアニーリング、伸長およびトランケーションすることができ、増幅ライブラリー収率を低下させる。両方のトランケーションされた５’アダプターは、リバース相補体においてではあるが、いずれもブロッカーオリゴヌクレオチドに類似するドメイン４１および４２を含み、その結果、ドメイン４２が共通アダプター配列の少なくとも一部分と同一であり、ドメイン４１が、共通アダプター配列に隣接する独自の５’アダプター配列５’の少なくとも一部分と同一である。それに応じて、ドメイン４２は、トランケーションされたアダプターの３’末端に存在する。図５Ａ（ｃ）に示されるトランケーションされたヘアピンアダプターは、一本鎖ドメイン４２、ドメイン４５に少なくとも部分的に相補的な二本鎖ドメイン４１、複製ブロッキングドメイン４３、およびステムループ構造が形成されるループドメイン４４の５つのドメインを有する。ドメイン４２の長さおよび塩基組成は、多重ＰＣＲステップに使用されるユニバーサルプライマー内の最３’開裂可能塩基の位置によって示される。ユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂がプライマーの３’末端、またはアンプリコン挿入物との接合部で生じる場合（図５Ｂ（ａ））は、ドメイン４２が、共通アダプター配列全体（ＴｒｕＳｅｑアダプターでは１３塩基およびＮｅｘｔｅｒａアダプターでは１９塩基）を含む。ユニバーサルプライマーのエンドヌクレアーゼ開裂が内部で生じる場合（図５Ｂ（ｂ））は、重複塩基または間隙を配列に導入することなく連続的共通アダプター配列を回復するために、開裂可能プライマーの残留３’部分に対応するようにドメイン４２の長さが低減され、次いでリガーゼが切れ目を封止する。ループドメイン４４の長さおよび塩基組成は、順応性を有し、１から６またはそれより多いＴ、Ａ、ＣもしくはＧデオキシヌクレオチド、またはそれらの組合せを含むことで、アダプタードメイン４１および４５による安定なステムループ構造の形成を可能にする。ライゲーションカップルドＰＣＲのライゲーション時およびＰＣＲフェーズ時の両方において、トランケーションされたヘアピンアダプターは、ＰＣＲアニーリング温度より高いその高ステムＴｍによりステムループヘアピン立体構造を維持し、その結果、プライマーとしてのライブラリー増幅に関与しないため、線状のトランケーションされたアダプターでは生成されるトランケーションされたライブラリー生成物を生成しない。本出願において既に言及したように（図３ＣおよびＤ）、複製ブロッキングドメイン４３は、ＰＣＲ時におけるライゲーションされたステムループ構造の複製および非増幅性の長いヘアピン構造の形成を防止する。図５Ｃに示されるように、インデキシングＰＣＲは、３’アダプターインデキシングプライマーｉ７によって開始され、複製は、複製ブロッキング基で停止し、５’アダプターインデキシングプライマーｉ５のアニーリングが、アニーリングおよび伸長を行ってインデキシングＰＣＲサイクルを完了することを可能にする。

プライマーアセンブリの方法
ライゲーションカップルドＰＣＲの異なる実施形態において、プライマーサブユニットおよびスプリントが、長いインデキシングプライマーをアセンブルするために使用され、ＮＧＳライブラリー増幅と組み合わされる方法を開示する。これは、個々の完全長インデキシングプライマーを合成する代わりに、短いインデックス特異的オリゴヌクレオチドサブユニットのみをユニバーサルプライマーサブユニットと組み合わせるため、プライマー合成コストを減少させるために使用される。図６Ａに示されるように、ユニバーサルプライマーサブユニット５１、５３、５６および５８ならびにユニバーサルスプリント５４、５５、５９および６０を独自のインデキシングサブユニット５２および５７と組み合わせる。プライマーサブユニット５１、５２、５６および５７は、ライゲーションのための５’ホスフェートを含み、スプリントオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ時のプライミング活性を防止するための３’ブロッキング基を含む。ライゲーションに好適な第１の温度で、スプリントオリゴヌクレオチドを有するプライマーサブユニットをアニーリングおよびライゲーションした後に、熱サイクリングを行って、トランケーションされたＮＧＳアダプターを含むＮＧＳライブラリーを増幅し、アダプター配列を完成させ、試料特異的インデックス配列を組み込む。図６Ｂは、それらの５’末端に（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）を含むＮｏｒｍａｌａｓｅ適応プライマーをアセンブルする方法の詳細を示す。下流の酵素的正規化に必要とされる５’配列５２および５７は、スプリント５３および５８を有するインデキシングプライマー５１および５６にライゲーションされたスプリントである。プライマー５１および５６は、ライゲーションのために５’ホスフェートを必要とし、スプリント５３および５８は、ＰＣＲ時のプライミング活性を防止するための３’ブロッキング基を有する。ライゲーションに好適な第１の温度でプライマーサブユニットおよびスプリントをアニーリングおよびライゲーションした後に、熱サイクリングを行って、トランケーションされたＮＧＳアダプターを含むＮＧＳライブラリーを増幅させ、アダプター配列を完成させる。その方法の具体的な実施形態において、図６Ｃは、下流の酵素的正規化に適応する（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）配列を有するＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａインデキシングプライマーのアセンブリを示す。５’アダプター配列を含むインデキシングプライマーｉ５は、３’サブユニット５１（２２塩基）、インデックス配列を含む中間サブユニット５２（３０塩基）、末端配列（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）を含む５’サブユニット５３（３４塩基）の３つのオリゴヌクレオチドサブユニット、ならびに２つの３’封鎖スプリントオリゴヌクレオチド５４および５５からアセンブルされる。この実施形態をさらに説明するために、図６Ｄは、上記の４Ｃのｉ５ＴｒｕＳｅｑＩｌｌｕｍｉｎａインデキシングプライマーのプライマーアセンブリを、３’アダプター配列を含む対応するｉ７インデキシングプライマーのアセンブリ、ｉ７プライマーへのヘアピンブロッカーのアニーリング、および（不図示のエンドヌクレアーゼ開裂に続く）トランケーションされた３’アダプターを含むアンプリコン基質へのｉ５プライマーのライゲーションと組み合わせる場合のライゲーションカップルドＰＣＲワークフローを示す。

酵素および反応条件の説明
ライゲーションカップルドＰＣＲは、ライゲーションのためのＤＮＡ基質、リガーゼ、ポリメラーゼ、ＤＮＡサブユニットの生成物であってもよいＰＣＲ増幅のためのプライマー対および基質、ならびに必要に応じてエンドヌクレアーゼを含むことができる。ポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどの熱安定なホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、または好ましくは、ＮＧＳライブラリー増幅のために、ポリメラーゼは、３’－５’エクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する高性能ポリメラーゼである。３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングポリメラーゼは、（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４５’テール配列（配列番号１）を含む、下流の酵素的正規化のためのプライマーと組み合わされる場合は、ＰＣＲ時に５’オーバーハングを生成することが必要である。市販の酵素としては、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられるが、それらに限定されない。ＰＣＲ反応条件は、ビーズベースの精製による２０ｕＬのライブラリー溶出物、ならびに２倍マスターミックスＰＣＲ配合物を使用する場合のプライマーおよびアダプターの添加に対する５ｕＬを可能にするための５０ｕＬの反応体積において、改造することなくポリメラーゼ販売元が推奨する通りに実施される。リガーゼは、Ｔ３ＤＮＡリガーゼを含む、低マグネシウムＰＣＲ反応緩衝液にて高効率ライゲーションが可能な任意の熱不安定性リガーゼとすることができ、最小で３０～３００またはそれより多い酵素ユニットを５０ｕＬのライゲーションカップルドＰＣＲ反応に使用することができる。開裂可能ｄＵ塩基を含む第１のＮＧＳアダプターの鎖を除去するためのエンドヌクレアーゼは、ＵＤＧ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡＧｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＮＥＢ）とのブレンドを含むＵＳＥＲ酵素であり、５０ｕＬのライゲーションカップルドＰＣＲ反応に１つの酵素ユニットが使用される。

単一密閉管ライゲーションカップルドＰＣＲは、ライゲーションおよびＰＣＲに必要なすべての試薬を含み、２つの個別のインキュベーションを含み、第１のインキュベーションは、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ活性を可能にするが、ポリメラーゼ活性を可能にしない温度で行い、次いで反応物が高温に加熱して、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを不活性化させ、ホットスタートポリメラーゼを活性化させ、ＰＣＲ熱サイクリングのために基質を変性させる。第１の反応は、熱不安定酵素と２５～３７℃の温度で実施され、２５度がＴ３リガーゼに最適であり、３７度がＵＳＥＲ酵素に最適であるが、いずれもこの温度範囲内で実施できる。このインキュベーションは、ＰＣＲの前に反応を確実に完了させるために、理想的には２０分実施されるが、５～６０分の範囲で実施できる。熱不活性化温度およびインキュベーション時間は、その方法に使用されるポリメラーゼのホットスタート要件によって規定され、典型的には３０秒から２分またはそれより長い時間にわたって９５～９８℃であり、次いでアニーリングおよび伸長温度およびインキュベーション時間は、本開示の方法に基づいて特定の改造をすることなく、当業者に公知のように、プライマーＴ_ｍ、使用されるポリメラーゼ、および増幅される生成物の長さに依存する。

これらの開示されるライゲーションカップルドＰＣＲの方法の範囲内において、ＰＣＲ時のプライマーとしてのみ、またはライゲーション時のアダプターおよびＰＣＲ時のプライマーの両方として使用されるインデキシングプライマーを、必要とされるＰＣＲサイクルの数に応じて、それぞれ１００ｎＭからそれぞれ１ｕＭまたはそれより多い反応濃度で使用することができる。インデキシングプライマーまたは他の長いプライマーをアセンブルする場合は、スプリントオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドサブユニットに対して０．７５倍のより低モル比率または１．５倍までのモル過剰比率で使用され、最終的なプライマーアセンブリにおいてより５’にあるプライマーサブユニットは、最終的なプライマーアセンブリに対してより３’にあるプライマーサブユニットと比較して２倍またはそれより高いモル濃度である。これにより、ＰＣＲ時にプライマーとして機能し、完成されたアダプターをトランケーションする、ライゲーションされていない３’プライマーサブユニットが過剰になることが防止される。最終的なプライマーアセンブリの５’末端における過剰のプライマーサブユニットは、それらが個々のプライマーとして機能する場合に最終的なライブラリーをトランケーションしないため、ＰＣＲ生成物の最終的な収率を低下させない。線状またはヘアピンブロッカーが利用される場合は、ブロッカーモル濃度は、それがライゲーション反応時に阻害しているインデキシングプライマー濃度に等しいまたはそれより大きく、プライマーに対するブロッカーの比率は、１：１、１．５：１、２：１、４：１、６：１、またはそれより大きいモル比率である。ヘアピンがトランケーションされたアダプターが利用される場合は、反応物に存在する基質の量に応じて、５０～２００ｎＭまたはそれより大きい反応濃度で使用できる。同時にさらなる部分をアンプリコン基質の３’末端上のトランケーションされた３’アダプターの３’末端にライゲーションする場合は、同様の５０～２００ｎＭまたはそれより大きいオリゴヌクレオチド濃度が使用される。

ライゲーションカップルドＰＣＲの方法－両インデキシングプライマーは、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な共通３’末端配列を含む
一部の実施形態において、（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分および第４の部分を含み、第１の鎖の第１の部分および第２の鎖の第３の部分が相補的であり、二本鎖部分を形成し、第１の鎖の第２の部分が第１の３’オーバーハングを形成し、第２の鎖の第４の部分が第２の３’オーバーハングを形成し、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分が、それぞれ、第１の３’オーバーハングおよび第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含むこと、（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して第１の反応混合物を生成することであって、複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分を含むこと、（ｉｉｉ）第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、第１の条件集合は、１）複数の第１のインデキシングプライマーの第１の３’末端部分が、第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、２）リガーゼが、複数の第１のインデキシングプライマーの１つを第１の鎖の第１の５’末端に、複数の第１のインデキシングプライマーの１つを第２の鎖の第２の５’末端にライゲーションして、５’から３’方向に、複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、第１の部分および第２の部分を含む第３の鎖と、５’から３’方向に、複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、第３の部分および第４の部分を含む第４の鎖とを含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、（ｉｖ）第２の反応混合物を、１）リガーゼを不活性化させ、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、２）複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分が、第３の鎖の第２の部分の第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、第４の鎖の第４の部分の第１の共通ヌクレオチドにアニーリングし、３）ＤＮＡポリメラーゼが、第３の鎖の第２の部分の第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、および第４の鎖の第４の部分の第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、第３の鎖、第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、第５の鎖が、５’から３’方向に、複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、第３の部分、および複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、第６の鎖が、５’から３’方向に、複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、第１の部分、および複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分である、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすること、（ｖ）第３の反応混合物を、１）二本鎖ＤＮＡを変性し、２）複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、第５の鎖または第６の鎖の複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体にアニーリングし、３）ＤＮＡポリメラーゼが、第５の鎖の複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体にアニーリングされた複数の第１のインデキシングプライマー、および第６の鎖の複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体にアニーリングされた複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、第７の鎖が、５’から３’方向に、複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、第１の部分、および複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、第８の鎖が、５’から３’方向に、複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、第３の部分、および複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、第７の鎖が第５の鎖に相補的であり、第８の鎖が第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分である、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすること、および（ｖｉ）複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、第５のオリゴヌクレオチドおよび第７のオリゴヌクレオチドまたは第６のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドを増幅させるのに十分である、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることを含む方法が提供される。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｉ）～（ｖｉ）を単一密閉管で実施することができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、方法は、ステップ（ｉ）～（ｖｉ）の間に任意の精製ステップを含むことができない。

前述の実施形態のいずれかにおいて、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、約２４塩基から約６０００塩基、約２４塩基から約５５００塩基、約２４塩基から約５０００塩基、約２４塩基から約４５００塩基、約２４塩基から約４０００塩基、約２４塩基から約３５００塩基、約２４塩基から約３０００塩基、約２４塩基から約２５００塩基、約２４塩基から約２０００塩基、約２４塩基から約１５００塩基、約２４塩基から約１０００塩基、約２４塩基から約７５０塩基、約２４塩基から約５００塩基、約２４塩基から約２５０塩基、約２４塩基から約２００塩基、約２４塩基から約１００塩基、約２４塩基から約５０塩基、約１００塩基から約６０００塩基、約１００塩基から約５５００塩基、約１００塩基から約５０００塩基、約１００塩基から約４５００塩基、約１００塩基から約４０００塩基、約１００塩基から約３５００塩基、約１００塩基から約３０００塩基、約１００塩基から約２５００塩基、約１００塩基から約２０００塩基、約１００塩基から約１５００塩基、約１００塩基から約１０００塩基、約１００塩基から約７５０塩基、約１００塩基から約５００塩基、約１００塩基から約２５０塩基、約１００塩基から約２００塩基、約２００塩基から約６０００塩基、約２００塩基から約５５００塩基、約２００塩基から約５０００塩基、約２００塩基から約４５００塩基、約２００塩基から約４０００塩基、約２００塩基から約３５００塩基、約２００塩基から約３０００塩基、約２００塩基から約２５００塩基、約２００塩基から約２０００塩基、約２００塩基から約１５００塩基、約２００塩基から約１０００塩基、約２００塩基から約７５０塩基、約２００塩基から約５００塩基、約２００塩基から約２５０塩基、約２５０塩基から約６０００塩基、約２５０塩基から約５５００塩基、約２５０塩基から約５０００塩基、約２５０塩基から約４５００塩基、約２５０塩基から約４０００塩基、約２５０塩基から約３５００塩基、約２５０塩基から約３０００塩基、約２５０塩基から約２５００塩基、約２５０塩基から約２０００塩基、約２５０塩基から約１５００塩基、約２５０塩基から約１０００塩基、約２５０塩基から約７５０塩基、約２５０塩基から約５００塩基、約５００塩基から約６０００塩基、約５００塩基から約５５００塩基、約５００塩基から約５０００塩基、約５００塩基から約４５００塩基、約５００塩基から約４０００塩基、約５００塩基から約３５００塩基、約５００塩基から約３０００塩基、約５００塩基から約２５００塩基、約５００塩基から約２０００塩基、約５００塩基から約１５００塩基、約５００塩基から約１０００塩基、約５００塩基から約７５０塩基、約７５０塩基から約６０００塩基、約７５０塩基から約５５００塩基、約７５０塩基から約５０００塩基、約７５０塩基から約４５００塩基、約７５０塩基から約４０００塩基、約７５０塩基から約３５００塩基、約７５０塩基から約３０００塩基、約７５０塩基から約２５００塩基、約７５０塩基から約２０００塩基、約７５０塩基から約１５００塩基、約７５０塩基から約１０００塩基、約１０００塩基から約６０００塩基、約１０００塩基から約５５００塩基、約１０００塩基から約５０００塩基、約１０００塩基から約４５００塩基、約１０００塩基から約４０００塩基、約１０００塩基から約３５００塩基、約１０００塩基から約３０００塩基、約１０００塩基から約２５００塩基、約１０００塩基から約２０００塩基、約１０００塩基から約１５００塩基、約１５００塩基から約６０００塩基、約１５００塩基から約５５００塩基、約１５００塩基から約５０００塩基、約１５００塩基から約４５００塩基、約１５００塩基から約４０００塩基、約１５００塩基から約３５００塩基、約１５００塩基から約３０００塩基、約１５００塩基から約２５００塩基、約１５００塩基から約２０００塩基、約２０００塩基から約６０００塩基、約２０００塩基から約５５００塩基、約２０００塩基から約５０００塩基、約２０００塩基から約４５００塩基、約２０００塩基から約４０００塩基、約２０００塩基から約３５００塩基、約２０００塩基から約３０００塩基、約２０００塩基から約２５００塩基、約２５００塩基から約６０００塩基、約２５００塩基から約５５００塩基、約２５００塩基から約５０００塩基、約２５００塩基から約４５００塩基、約２５００塩基から約４０００塩基、約２５００塩基から約３５００塩基、約２５００塩基から約３０００塩基、約３０００塩基から約６０００塩基、約３０００塩基から約５５００塩基、約３０００塩基から約５０００塩基、約３０００塩基から約４５００塩基、約３０００塩基から約４０００塩基、約３０００塩基から約３５００塩基、約３５００塩基から約６０００塩基、約３５００塩基から約５５００塩基、約３５００塩基から約５０００塩基、約３５００塩基から約４５００塩基、約３５００塩基から約４０００塩基、約４０００塩基から約６０００塩基、約４０００塩基から約５５００塩基、約４０００塩基から約５０００塩基、約４０００塩基から約４５００塩基、約４５００塩基から約６０００塩基、約４５００塩基から約５５００塩基、約４５００塩基から約５０００塩基、約５０００塩基から約６０００塩基、約５０００塩基から約５５００塩基、約５５００塩基から約６０００塩基、約２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００または６０００塩基の長さを有することができる。部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の長さは例示であること、および他のサイズも本開示の範囲内であることが理解されるべきである。部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の長さは、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第１の鎖または第２の鎖の長さ、すなわち第１の５’末端から第１の３’オーバーハングの３’末端の長さまたは第２の５’末端から第２の３’オーバーハングの３’末端の長さを指すことが理解されるべきである。

前述の実施形態のいずれかにおいて、それぞれ第１の鎖および第２の鎖の第１の部分および第３の部分は、約２０塩基から約６０００塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、第１のオリゴヌクレオチドの第１の部分および第２のオリゴヌクレオチドの第３の部分は、それぞれ、約２０塩基から約６０００塩基、約２０塩基から約５５００塩基、約２０塩基から約５０００塩基、約２０塩基から約４５００塩基、約２０塩基から約４０００塩基、約２０塩基から約３５００塩基、約２０塩基から約３０００塩基、約２０塩基から約２５００塩基、約２０塩基から約２０００塩基、約２０塩基から約１５００塩基、約２０塩基から約１０００塩基、約２０塩基から約７５０塩基、約２０塩基から約５００塩基、約２０塩基から約２５０塩基、約２０塩基から約２００塩基、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約５０塩基、約１００塩基から約６０００塩基、約１００塩基から約５５００塩基、約１００塩基から約５０００塩基、約１００塩基から約４５００塩基、約１００塩基から約４０００塩基、約１００塩基から約３５００塩基、約１００塩基から約３０００塩基、約１００塩基から約２５００塩基、約１００塩基から約２０００塩基、約１００塩基から約１５００塩基、約１００塩基から約１０００塩基、約１００塩基から約７５０塩基、約１００塩基から約５００塩基、約１００塩基から約２５０塩基、約１００塩基から約２００塩基、約２００塩基から約６０００塩基、約２００塩基から約５５００塩基、約２００塩基から約５０００塩基、約２００塩基から約４５００塩基、約２００塩基から約４０００塩基、約２００塩基から約３５００塩基、約２００塩基から約３０００塩基、約２００塩基から約２５００塩基、約２００塩基から約２０００塩基、約２００塩基から約１５００塩基、約２００塩基から約１０００塩基、約２００塩基から約７５０塩基、約２００塩基から約５００塩基、約２００塩基から約２５０塩基、約２５０塩基から約６０００塩基、約２５０塩基から約５５００塩基、約２５０塩基から約５０００塩基、約２５０塩基から約４５００塩基、約２５０塩基から約４０００塩基、約２５０塩基から約３５００塩基、約２５０塩基から約３０００塩基、約２５０塩基から約２５００塩基、約２５０塩基から約２０００塩基、約２５０塩基から約１５００塩基、約２５０塩基から約１０００塩基、約２５０塩基から約７５０塩基、約２５０塩基から約５００塩基、約５００塩基から約６０００塩基、約５００塩基から約５５００塩基、約５００塩基から約５０００塩基、約５００塩基から約４５００塩基、約５００塩基から約４０００塩基、約５００塩基から約３５００塩基、約５００塩基から約３０００塩基、約５００塩基から約２５００塩基、約５００塩基から約２０００塩基、約５００塩基から約１５００塩基、約５００塩基から約１０００塩基、約５００塩基から約７５０塩基、約７５０塩基から約６０００塩基、約７５０塩基から約５５００塩基、約７５０塩基から約５０００塩基、約７５０塩基から約４５００塩基、約７５０塩基から約４０００塩基、約７５０塩基から約３５００塩基、約７５０塩基から約３０００塩基、約７５０塩基から約２５００塩基、約７５０塩基から約２０００塩基、約７５０塩基から約１５００塩基、約７５０塩基から約１０００塩基、約１０００塩基から約６０００塩基、約１０００塩基から約５５００塩基、約１０００塩基から約５０００塩基、約１０００塩基から約４５００塩基、約１０００塩基から約４０００塩基、約１０００塩基から約３５００塩基、約１０００塩基から約３０００塩基、約１０００塩基から約２５００塩基、約１０００塩基から約２０００塩基、約１０００塩基から約１５００塩基、約１５００塩基から約６０００塩基、約１５００塩基から約５５００塩基、約１５００塩基から約５０００塩基、約１５００塩基から約４５００塩基、約１５００塩基から約４０００塩基、約１５００塩基から約３５００塩基、約１５００塩基から約３０００塩基、約１５００塩基から約２５００塩基、約１５００塩基から約２０００塩基、約２０００塩基から約６０００塩基、約２０００塩基から約５５００塩基、約２０００塩基から約５０００塩基、約２０００塩基から約４５００塩基、約２０００塩基から約４０００塩基、約２０００塩基から約３５００塩基、約２０００塩基から約３０００塩基、約２０００塩基から約２５００塩基、約２５００塩基から約６０００塩基、約２５００塩基から約５５００塩基、約２５００塩基から約５０００塩基、約２５００塩基から約４５００塩基、約２５００塩基から約４０００塩基、約２５００塩基から約３５００塩基、約２５００塩基から約３０００塩基、約３０００塩基から約６０００塩基、約３０００塩基から約５５００塩基、約３０００塩基から約５０００塩基、約３０００塩基から約４５００塩基、約３０００塩基から約４０００塩基、約３０００塩基から約３５００塩基、約３５００塩基から約６０００塩基、約３５００塩基から約５５００塩基、約３５００塩基から約５０００塩基、約３５００塩基から約４５００塩基、約３５００塩基から約４０００塩基、約４０００塩基から約６０００塩基、約４０００塩基から約５５００塩基、約４０００塩基から約５０００塩基、約４０００塩基から約４５００塩基、約４５００塩基から約６０００塩基、約４５００塩基から約５５００塩基、約４５００塩基から約５０００塩基、約５０００塩基から約６０００塩基、約５０００塩基から約５５００塩基、約５５００塩基から約６０００塩基、約２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００または６０００塩基の長さを有することができる。第１の鎖の第１の部分および第２の鎖の第３の部分の長さは例示的であること、および他のサイズも本開示の範囲内であることが理解されるべきである。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分、すなわちそれぞれ第１の３’オーバーハングおよび第２の３’オーバーハングは、それぞれ約４塩基から約１００塩基を含むことができる。例として、限定することなく、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分は、それぞれ約４塩基から約１００塩基、約４塩基から約９０塩基、約４塩基から約８０塩基、約４塩基から約７５塩基、約４塩基から約７０塩基、約４塩基から約６０塩基、約４塩基から約５０塩基、約４塩基から約４０塩基、約４塩基から約３０塩基、約４塩基から約２５塩基、約４塩基から約２０塩基、約４塩基から約１５塩基、約４塩基から約１０塩基、約４塩基から約５塩基、約５塩基から約１００塩基、約５塩基から約９０塩基、約５塩基から約８０塩基、約５塩基から約７５塩基、約５塩基から約７０塩基、約５塩基から約６０塩基、約５塩基から約５５塩基、約５塩基から約５０塩基、約５塩基から約４０塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約１００塩基、約１０塩基から約９０塩基、約１０塩基から約８０塩基、約１０塩基から約７５塩基、約１０塩基から約７０塩基、約１０塩基から約６０塩基、約１０塩基から約５０塩基、約１０塩基から約４０塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約１００塩基、約１５塩基から約９０塩基、約１５塩基から約８０塩基、約１５塩基から約７５塩基、約１５塩基から約７０塩基、約１５塩基から約６０塩基、約１５塩基から約５０塩基、約１５塩基から約４０塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７５塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２０塩基から約２５塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７５塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７５塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７５塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７５塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７５塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約７０塩基から約７５塩基、約７５塩基から約１００塩基、約７５塩基から約９０塩基、約７５塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３３、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０または１００塩基を含むことができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の共通ヌクレオチド配列は、約１塩基から約５０塩基を含むことができる。例として、限定することなく、第１の共通ヌクレオチド配列は、約１塩基から約５０塩基、約１塩基から約４５塩基、約１塩基から約４０塩基、約１塩基から約３５塩基、約１塩基から約３０塩基、約１塩基から約２５塩基、約１塩基から約２０塩基、約１塩基から約１５塩基、約１塩基から約１０塩基、約５塩基から約５０塩基、約５塩基から約４５塩基、約５塩基から約４０塩基、約５塩基から約３５塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約５０塩基、約１０塩基から約４５塩基、約１０塩基から約４０塩基、約１０塩基から約３５塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約５０塩基、約１５塩基から約４５塩基、約１５塩基から約４０塩基、約１５塩基から約３５塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４５塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３５塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４５塩基、約３０塩基から約４０塩基、約３０塩基から約３５塩基、約３５塩基から約５０塩基、約３５塩基から約４５塩基、約３５塩基から約４０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約４０塩基から約４５塩基、約４５塩基から約５０塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３３、３５、４０または５０塩基を含むことができる。好ましくは、第１の共通ヌクレオチド配列は１３塩基を含む。一部の実施形態において、第１の共通ヌクレオチド配列は、配列番号１２７（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣ－３’）の配列を含む。第１の共通ヌクレオチド配列が、配列番号１２７の配列を含む場合は、第１の３’末端部分および第２の３’末端部分は、それぞれ配列番号１２６（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）を含むことができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分は、それぞれ第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列をさらに含むことができる。ある特定の態様において、第２の共通ヌクレオチド配列は、約３塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、第２の共通ヌクレオチド配列は、約１塩基から約１００塩基、約１塩基から約９０塩基、約１塩基から約８０塩基、約１塩基から約７５塩基、約１塩基から約７０塩基、約１塩基から約６０塩基、約１塩基から約５０塩基、約１塩基から約４０塩基、約１塩基から約３０塩基、約１塩基から約２５塩基、約１塩基から約２０塩基、約１塩基から約１５塩基、約１塩基から約１０塩基、約１塩基から約５塩基、約５塩基から約１００塩基、約５塩基から約９０塩基、約５塩基から約８０塩基、約５塩基から約７５塩基、約５塩基から約７０塩基、約５塩基から約６０塩基、約５塩基から約５０塩基、約５塩基から約４０塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約１００塩基、約１０塩基から約９０塩基、約１０塩基から約８０塩基、約１０塩基から約７５塩基、約１０塩基から約７０塩基、約１０塩基から約６０塩基、約１０塩基から約５０塩基、約１０塩基から約４０塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約１００塩基、約１５塩基から約９０塩基、約１５塩基から約８０塩基、約１５塩基から約７５塩基、約１５塩基から約７０塩基、約１５塩基から約６０塩基、約１５塩基から約５０塩基、約１５塩基から約４０塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７５塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２０塩基から約２５塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７５塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７５塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７５塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７５塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７５塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約７０塩基から約７５塩基、約７５塩基から約１００塩基、約７５塩基から約９０塩基、約７５塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分が第２の共通ヌクレオチド配列をさらに含む実施形態において、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、第２の３’末端部分に対して５’に位置し、第２の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の５’部分を含むことができる。そのような実施形態では、ステップ（ｉｖ）（ｂ）における第２の条件集合は、複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分および第１の５’部分が、第３の鎖の第２の部分または第４の鎖の第４の部分上の少なくとも第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングするのに十分であり得る。そのような実施形態では、第１の３’末端配列から第１の共通ヌクレオチド配列の融解温度は、第１のアニーリング温度より低くてもよい。さらなる例として、限定することなく、第１の３’末端配列から第１の共通ヌクレオチド配列の融解温度は、第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より低くてもよい。そのような実施形態では、第１のインデキシングプライマーの各々は、第２の共通ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むことができない。そのような実施形態では、第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列と第２のインデキシングプライマーの各々の第２の３’末端部分および第１の５’部分の間の融解温度は、第１のアニーリング温度より高くてもよい。そのような実施形態では、第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列から複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度は、第１のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より高くてもよい。

前述の実施形態のいずれかにおいて、複数の第１のインデキシングプライマーの各々と第２の部分または第４の部分の間の融解温度は、複数の第２のインデキシングプライマーの各々と第２または第４の部分の間の融解温度より低い。

前述の実施形態のいずれかにおいて、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、配列番号８７の配列をさらに含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、配列番号７８の配列をさらに含むことができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分は、ライゲーション温度より高い融解温度（Ｔ_ｍ）を有することができる。例として、限定することなく、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分の融解温度は、ライゲーション温度より１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃または４０℃高い温度であり得る。さらなる例として、限定することなく、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分は、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃もしくは８０℃より高い、または約４０℃から約８０℃、約４０℃から約７０℃、約４０℃から約６０℃、約４０℃から約５０℃、約５０℃から約８０℃、約５０℃から約７０℃、約５０℃から約６０℃、約６０℃から約８０℃、約６０℃から約７０℃もしくは約７０℃から約８０℃のＴ_ｍを有することができる。第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分は、第１の変性温度、第２の変性温度および第３の変性温度未満のＴ_ｍを有することが理解されるべきである。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ライゲーション温度は、リガーゼが、複数の第１のインデキシングプライマーの１つを第１の鎖の第１の５’末端または第２の鎖の第２の５’末端にライゲーションするのに十分な任意の温度であり得る。ライゲーション温度は、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質のＴ_ｍより高くなり得ないことがさらに理解されるべきである。ライゲーション温度が部分的に二本鎖のＤＮＡ基質のＴ_ｍより高いと、複数の第１のインデキシングプライマーが、ライゲーションされた５’アダプタではなくプライマーとして作用することが可能となる。例として、限定することなく、ライゲーション温度は、約２５℃から約４０℃であり得る。さらなる例として、限定することなく、ライゲーション温度は、約２５℃から約４０℃、約２５℃から約３７℃、約２５℃から約３５℃、約２５℃から約３０℃、約３０℃から約４０℃、約３０℃から約３５℃、約３５℃から約４０℃、約２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ライゲーション持続時間は、複数の第１のインデキシングプライマーの１つを第１の鎖の第１の５’末端または第２の鎖の第２の５’末端にライゲーションするのに十分な任意の時間であってよい。前述の実施形態のいずれかにおいて、ライゲーション持続時間は、約５分から約６０分であり得る。例として、限定することなく、ライゲーション持続時間は、約５分から約６０分、約５分から約５０分、約５分から約４０分、約５分から約３０分、約５分から約２０分、約５分から約１０分、約１０分から約６０分、約１０分から約５０分、約１０分から約４０分、約１０分から約３０分、約１０分から約２０分、約２０分から約６０分、約２０分から約５０分、約２０分から約４０分、約２０分から約３０分、約３０分から約６０分、約３０分から約５０分、約３０分から約４０分、約４０分から約６０分、約４０分から約５０分、約５０分から約６０分、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、任意の好適なリガーゼを使用することができる。リガーゼは、低マグネシウム緩衝液にてライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼであり、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度で不活性化されるべきであることが理解されるべきである。当該低マグネシウム緩衝液条件は、ＰＣＲに好適なものであることが理解されるべきである。例として、限定することなく、リガーゼは、Ｔ３ＤＮＡリガーゼであり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、例として、限定することなく、リガーゼを第１の反応混合物１μＬ当たり約３０から約３００の酵素ユニットで添加することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、任意の好適なポリメラーゼを使用することができる。一部の実施形態において、ポリメラーゼは、ライゲーション温度で活性でない。例として、限定することなく、ポリメラーゼは、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ポリメラーゼは、活性化温度を有するホットスタートポリメラーゼであることができ、活性化温度は、第１の変性温度より低い。例として、限定することなく、活性化温度は、第１の変性温度、第２の変性温度および第３の変性温度より低い温度であり得る。例として、限定することなく、ポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、３’－５’エクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させるホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができる。そのような実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の変性持続時間、第２の変性持続時間および第３の変性持続時間は、それぞれ約３０秒から約２分であり得る。例として、限定することなく、第１の変性持続時間、第２の変性持続時間および第３の変性持続時間は、それぞれ約３０秒から約２分、約３０秒から約１．５分、約３０秒から約１分、約１分から約２分、約１分から約１．５分、約１．５分から約２分、約３０秒、４５秒、１分、１．５分または２分であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の変性温度、第２の変性温度および第３の変性温度は、それぞれ約９５℃から約９８℃であり得る。各ＰＣＲサイクルでアニーリングされる二本鎖ＤＮＡを変性するための任意の好適な温度を使用できることが理解されるべきである。第１の変性温度は、第１の鎖および第２の鎖の融解温度より高くなるのに十分であるべきことが理解されるべきである。当業者は、当該技術分野における通常の実験および／または知識を通じて当該温度および必要時間を容易に決定することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度は、それぞれ約５５℃から約６５℃であり得る。例として、限定することなく、第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度は、それぞれ約５５℃から約６５℃、５５℃から約６０℃、約６０℃から約６５℃、約５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のアニーリング持続時間、第２のアニーリング持続時間および第３のアニーリング持続時間は、それぞれ約１０秒から約６０秒であり得る。第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度、ならびに第１のアニーリング持続時間、第２のアニーリング持続時間および第３のアニーリング持続時間は、それぞれのＰＣＲステップで必要とされるアニーリングを行うのに十分であるべきことが理解されるべきである。当業者は、当該技術分野における通常の実験および／または知識を通じて当該温度および必要時間を容易に決定することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の伸長温度、第２の伸長温度および第３の伸長温度は、それぞれ約６０℃から約７２℃であり得る。例として、限定することなく、第１の伸長温度、第２の伸長温度および第３の伸長温度は、約６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃または７２℃であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１の伸長持続時間、第２の伸長持続時間および第３の伸長持続時間は、それぞれ約３０秒から約５分であり得る。第１の伸長温度、第２の伸長温度および第３の伸長温度、ならびに第１の伸長持続時間、第２の伸長持続時間および第３の伸長持続時間は、それぞれのＰＣＲステップで必要とされる伸長を行うのに十分であるべきことが理解されるべきである。当業者は、当該技術分野における通常の実験および／または知識を通じて当該温度および必要時間を容易に決定することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、複数の第１のインデキシングプライマーおよび複数の第２のインデキシングプライマーを約１００ｎＭから約１μＭで第１の反応混合物に添加することができる。例として、限定することなく、複数の第１のインデキシングプライマーおよび複数の第２のインデキシングプライマーを約１００ｎＭから約２００ｎＭで第１の反応混合物に添加することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡ、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、多重ＰＣＲまたは合成ＤＮＡに由来し得る。

ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する方法
前述の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｉｉ）は、ブロッカーオリゴヌクレオチドを第１の反応混合物に添加することであって、ブロッカーオリゴヌクレオチドが、複数の第２のインデキシングプライマーの各々の第２の３’末端部分の少なくとも一部分に少なくとも部分的に相補的な５’部分を含み、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度が、ライゲーション温度より高く、第１のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より低いことをさらに含むことができる。そのような実施形態では、ブロッカーオリゴヌクレオチドを、第１の鎖の第１の５’末端および第２の鎖の第２の５’末端への複数の第２のインデキシングプライマーの各々のライゲーションを抑制するのに十分な量で添加することができる。一部の実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、複数の第２のインデキシングプライマーの各々の第２の３’末端部分の少なくとも一部分に完全に相補的な５’部分を含む。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度は、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のインデキシングプライマーの各々の融解温度より高くてもよい。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｉｉ）で添加される複数の第２のインデキシングプライマーの量の１倍、１．５倍、２倍、４倍または６倍の量で添加することができる。例として、限定することなく、ブロッカーオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｉｉ）で添加される複数の第２のインデキシングプライマーの量の１倍から約６倍、約１．５倍から約６倍、約２倍から約６倍、約４倍から約６倍、１倍から４倍、約１．５倍から約４倍、約２倍から約４倍、１倍から約２倍、１倍から約１．５倍または約１．５倍から約２倍の量で添加することができる。あるいは、ステップ（ｉｉ）で複数の第２のインデキシングプライマーを添加する前に、複数の第２のインデキシングプライマーをブロッカーオリゴヌクレオチドにプレアニーリングすることができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的であり、複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、５’部分に対して３’に位置する第１のさらなる部分をさらに含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、約１４塩基から約２００塩基を含むことができる。例として、限定することなく、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、約１４塩基から約２００塩基、約１４塩基から約１５０塩基、約１４塩基から約１００塩基、約１４塩基から約５０塩基、約１４塩基から約２５塩基、約２５塩基から約２００塩基、約２５塩基から約１５０塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約５０塩基、約５０塩基から約２００塩基、約５０塩基から約１５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約１００塩基から約２００塩基、約１００塩基から約１５０塩基、約１５０塩基から約２００塩基、約１４、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００塩基の長さを有することができる。これらの長さは例示的であること、およびブロッカーオリゴヌクレオチドは任意の好適な長さであり得ることが理解されるべきである。

前述の実施形態のいずれかにおいて、第１のさらなる部分と複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度は、５’部分と複数の第１のインデキシングプライマーの各々および複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度とほぼ同じまたはそれより高い温度であり得る。例として、限定することなく、第１のさらなる部分と複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度は、５’部分と複数の第１のインデキシングプライマーの各々および複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度より少なくとも１℃高い温度であり得る。例として、限定することなく、第１のさらなる部分と複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度は、５’部分と複数の第１のインデキシングプライマーの各々および複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃または２０℃高い温度であり得る。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、５’部分と第１のさらなる部分の間に位置する第２のさらなる部分を含むことができ、第２のさらなる部分は、複数の第１のインデキシングプライマーの各々と相補的でなく、複数の第２のプライマーの各々と相補的でない。例として、限定することなく、第２のさらなる部分は、約１塩基から約３０塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、第２のさらなる部分は、約１塩基から約３０塩基、約１塩基から約２５塩基、約１塩基から約２０塩基、約１塩基から約１５塩基、約１塩基から約１０塩基、約１塩基から約５塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２０塩基から約２５塩基、約２５塩基から約３０塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０塩基の長さを有することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、それを複数の第２のインデキシングプライマーの各々に部分的にのみ相補的にするミスマッチをその配列に含むことができる。これを使用して、ブロッカーがＰＣＲステップ、例えばステップ（ｉｖ）～（ｉｖ）時に活性にならないように、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度を低下させることができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない配列を含むことができる。複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない配列は、約１塩基から約３０塩基の長さを有することができる。例として、限定することなく、複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない配列は、約１塩基から約３０塩基の長さを有することができる。さらなる例として、限定することなく、第２のさらなる部分は、約１塩基から約３０塩基、約１塩基から約２５塩基、約１塩基から約２０塩基、約１塩基から約１５塩基、約１塩基から約１０塩基、約１塩基から約５塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２０塩基から約２５塩基、約２５塩基から約３０塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０塩基の長さを有することができる。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ヘアピン部分を含まなければ、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含むことができる。例として、限定することなく、３’修飾は、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオチド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、またはポリＴ、ポリＡ、ポリＣおよびポリＧなどの、隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列であって、プルーフリーディングポリメラーゼ３’－５’エクソヌクレアーゼ活性が、隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列を除去することを防止するためにヌクレアーゼ抵抗性結合をさらに含むＤＮＡ配列であることができる。

上の実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度は、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度より低い。例として、限定するものではないが、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度は、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度より少なくとも５℃低くてもよい。さらなる例として、限定するものではないが、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度は、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間の融解温度より少なくとも５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃またはそれ以上低くてもよい。

上の実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドの５’部分は、配列番号１２７の配列を含むことができる。そのような場合には、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、配列番号１２６の配列を含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第１のさらなる部分の３’に位置するヘアピン部分をさらに含むことができ、ヘアピン部分は第１のヘアピン配列および第２のヘアピン配列を含み、第１のヘアピン配列は第２のヘアピン配列の５’に位置し、第１のヘアピン配列および第２のヘアピン配列は相補的であり、ヘアピン部分は第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より高い融解温度を有する。そのような実施形態では、ブロッカーオリゴヌクレオチドは３’ヒドロキシル基をさらに含む。

上の実施形態のいずれでも、ヘアピン部分は、第１のヘアピン配列と第２のヘアピン配列との間に第３のヘアピン配列をさらに含むことができる。そのような実施形態では、第３の配列は、ヘアピン部分および第１のさらなる部分による安定なステムループ構造の形成を可能にするのに十分なループを形成することができる。そのような実施形態では、第３のヘアピン配列は約４塩基から約２０塩基またはそれを超える長さを有することができる。第３のヘアピン配列は、第１および第２のヘアピン配列による安定なステムループ構造の形成を可能にするのに十分なループを形成することができることを理解すべきである。

上の実施形態のいずれでも、ヘアピン部分の融解温度は、５’部分および複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間、さらなる部分および複数の第２のインデキシングプライマーの各々の間、またはその両方の融解温度より高くてもよい。

上の実施形態のいずれでも、第２の条件集合は、ＤＮＡポリメラーゼがブロッカー（ヘアピン）オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長ヘアピンブロッカーを生成するのにさらに十分であってよい。そのような実施形態では、伸長ヘアピンブロッカーは、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より高い融解温度をそれに提供する、安定化された二次構造を有することができる。例として、限定するものではないが、伸長ヘアピンブロッカーの融解温度は、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃または３０℃高くてもよい。

上の実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドはｄＵ塩基をさらに含むことができ、ステップ（ｉｉ）はウラシルＤＮＡグリコシラーゼを第１の反応混合物に添加することをさらに含み、ステップ（ｉｉｉ）の第１の条件集合は、ＵＤＧがｄＵ塩基を切除し、ブロッカーオリゴヌクレオチドに脱塩基部位を作製するのにさらに十分であり、ステップ（ｉｖ）で、第２の条件集合はＵＤＧ酵素を不活性化するのにさらに十分である。

上の実施形態のいずれでも、本方法は、第５の鎖および第７の鎖または第６の鎖および第８の鎖をシークエンシングすることをさらに含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分は、ライゲーション温度より高い融解温度を有することができるが、融解温度は第１のアニーリング温度より低い。そのような実施形態では、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分の融解温度は、ライゲーション温度より少なくとも１℃高くてもよい。例として、限定するものではないが、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分の融解温度は、ライゲーション温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃または２０℃高くてもよい。さらなる例として、限定するものではないが、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分の融解温度は、第１のアニーリング温度、ならびに必要に応じて第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度より少なくとも１℃低くてもよい。さらなる例として、限定するものではないが、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の３’末端部分の融解温度は、第１のアニーリング温度、および必要に応じて第２のアニーリング温度または第３のアニーリング温度より、少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃または２０℃低くてもよい。

一部の実施形態では、第１の３’末端部分および第２の３’末端部分は、第１のアニーリング温度より低い融解温度を有することができる。そのような実施形態では、第２の部分および第４の部分は、第２の共通ヌクレオチド配列をさらに含むことができ、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、第２のインデキシングプライマーおよび第１の共通ヌクレオチド配列の間の融解温度を有する第２のヌクレオチド配列に相補的であってよく、第２の共通ヌクレオチド配列は第１のアニーリング温度より高い。

上の実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、複数の第２のインデキシングプライマーの各々および部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度より低い融解温度を有することができる。

ライゲーションカップルドＰＣＲのための方法－両方のインデキシングプライマーは共通３’末端配列を含まない；ヘアピンアダプターが使用される
一部の実施形態では、ライゲーションカップルドＰＣＲのための方法は、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分および第４の部分を含み、第１の鎖の第１の部分および第２の鎖の第３の部分が、相補的であり、二本鎖部分を形成し、第１の鎖の第２の部分が、第１の３’オーバーハングを形成し、第２の鎖の第４の部分が第２の３’オーバーハングを形成し、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分が、それぞれ第１の３’オーバーハングおよび第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列をそれぞれ含み、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分が、第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を各々含むこと；複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、複数の５’アダプター、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第１の３’末端部分を含み、複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第２の３’末端部分を含み、第２の３’末端配列が、第２の共通ヌクレオチド配列に相補的であり、複数の５’アダプターの各々が、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的である第３の３’末端配列、複数の第１のインデキシングプライマーの各々の第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、第３の３’末端配列の５’に位置する第１の５’部分、第１の５’部分に対して５’に位置し、第１の５’部分に相補的である第２の５’部分、および第１の５’部分の５’末端に位置するＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーを含み、５’アダプターが、第１の５’部分を第２の５’部分にアニーリングすることによって形成されるヘアピンを形成することができること；第１の反応混合物を、１）第３の３’末端部分が、第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、２）リガーゼが、複数の５’アダプターの１つを第１の鎖の第１の５’末端および第２の鎖の第２の５’末端にライゲーションして、５’から３’方向に複数の５’アダプターの１つ、第１の部分および第２の部分を含む第３の鎖、ならびに５’から３’方向に複数の５’アダプターの１つ、第３の部分および第４の部分を含む第４の鎖を含む第２の反応混合物を生成するのに十分なライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること；第２の反応混合物を、ａ）リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、ｂ）複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分が、第３の鎖の第２の部分の第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、第４の鎖の第４の部分の第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、ｃ）ＤＮＡポリメラーゼが第３の鎖の第２の部分の第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、第４の鎖の第４の部分の第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、第３の鎖、第４の鎖、第５の鎖は、５’から３’方向に複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、第３の部分、第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体、および複数の５’アダプターの１つの第１の５’部分のリバース相補体を含む第５の鎖、ならびに５’から３’方向に、複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、第１の部分、第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体、および複数の５’アダプターの１つの第１の５’部分のリバース相補体を含む第６の鎖を含む第３の反応混合物を生成するのに十分な、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度および第１の伸張持続時間にわたる第１の伸張温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることみ、ならびに第６の鎖は、；第３の反応混合物を、ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、ｂ）複数の第１のインデキシングプライマーの１つの第１の３’末端部分が第５の鎖の複数の５’アダプターの１つの第１の５’部分のリバース相補体にアニーリングし、複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、第６の鎖の複数の５’アダプターの１つの第１の５’部分のリバース相補体にアニーリングし、ｃ）ＤＮＡポリメラーゼが、第５の鎖の複数の５’アダプターの１つの第１の５’部分のリバース相補体にアニーリングされた複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、第６の鎖の複数の５’アダプターの１つの第１の５’部分のリバース相補体にアニーリングされた複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物を生成するのに十分な、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸張持続時間にわたる第２の伸張温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、第７の鎖が、５’から３’方向に複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、第１の共通ヌクレオチド配列、第１の部分、および複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、第８の鎖が、５’から３’方向に複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、第１の共通ヌクレオチド配列、第３の部分、および複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含むこと；第４の反応混合物を、ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、ｂ）複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、第７の鎖の複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体にアニーリングし、複数の第２のインデキシングプライマーの１つが第８の鎖の複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体にアニーリングし、ｃ）ＤＮＡポリメラーゼが第７の鎖および第８の鎖の各々にアニーリングされた複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を含む第５の反応混合物を生成するのに十分な、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度および第３の伸張持続時間にわたる第３の伸張温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、第９の鎖が、５’から３’方向に、複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、第３の部分、第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体、および複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、第１０の鎖が、５’から３’方向に複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、第１の部分、第１の共通配列のリバース相補体、および複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、第７の鎖および第９の鎖が相補的であり、第８の鎖および第１０の鎖が相補的であること；ならびに第５の反応混合物を、複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、およびＤＮＡポリメラーゼが、第７の鎖および第９の鎖および第８の鎖および第１０の鎖を増幅させるのに十分な、第４の変性持続時間にわたる第４の変性温度、第４のアニーリング持続時間にわたる第４のアニーリング温度、および第４の伸張持続時間にわたる第４の伸張温度を含む第５の条件集合下でインキュベートすることを含むことができる。

上の実施形態では、第２の共通ヌクレオチド配列は第１の共通のヌクレオチド配列と別であってよいか、または第１の共通ヌクレオチド配列と重なるかもしくはその３’部分であってもよいことを理解すべきである。したがって一部の実施形態では、複数の第２のインデキシングプライマーの１つは第１の鎖にも第２の鎖にもライゲーションすることができないが、なおプライマーとして作用することができるように、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、第１の共通ヌクレオチド配列の３’末端部分にアニーリングすることができる。あるいは一部の実施形態では、第２の共通ヌクレオチド配列は第１の共通ヌクレオチド配列と別であってよい。

上の実施形態のいずれでも、ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）は単一密閉管で実施することができる。上の実施形態のいずれでも、本方法は、ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）の間にいずれの精製ステップも含むことができない。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の５’部分および第２の５’部分は、約１２塩基から約２０塩基の長さを各々有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の５’アダプターの各々は、第１の５’部分と第２の５’部分の間に介在配列をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、介在配列は約４塩基から約２０塩基の長さを有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複製ブロックは、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３またはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基から選択することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の５’アダプターの各々は、約２５塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定するものではないが、複数の５’アダプターの各々は、約２５塩基から約１００塩基、約３０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約１００塩基、約９０塩基から約１００塩基、約２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有することができる。例として、限定するものではないが、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、約２４塩基から約６０００塩基、約２４塩基から約５５００塩基、約２４塩基から約５０００塩基、約２４塩基から約４５００塩基、約２４塩基から約４０００塩基、約２４塩基から約３５００塩基、約２４塩基から約３０００塩基、約２４塩基から約２５００塩基、約２４塩基から約２０００塩基、約２４塩基から約１５００塩基、約２４塩基から約１０００塩基、約２４塩基から約７５０塩基、約２４塩基から約５００塩基、約２４塩基から約２５０塩基、約２４塩基から約２００塩基、約２４塩基から約１００塩基、約２４塩基から約５０塩基、約１００塩基から約６０００塩基、約１００塩基から約５５００塩基、約１００塩基から約５０００塩基、約１００塩基から約４５００塩基、約１００塩基から約４０００塩基、約１００塩基から約３５００塩基、約１００塩基から約３０００塩基、約１００塩基から約２５００塩基、約１００塩基から約２０００塩基、約１００塩基から約１５００塩基、約１００塩基から約１０００塩基、約１００塩基から約７５０塩基、約１００塩基から約５００塩基、約１００塩基から約２５０塩基、約１００塩基から約２００塩基、約２００塩基から約６０００塩基、約２００塩基から約５５００塩基、約２００塩基から約５０００塩基、約２００塩基から約４５００塩基、約２００塩基から約４０００塩基、約２００塩基から約３５００塩基、約２００塩基から約３０００塩基、約２００塩基から約２５００塩基、約２００塩基から約２０００塩基、約２００塩基から約１５００塩基、約２００塩基から約１０００塩基、約２００塩基から約７５０塩基、約２００塩基から約５００塩基、約２００塩基から約２５０塩基、約２５０塩基から約６０００塩基、約２５０塩基から約５５００塩基、約２５０塩基から約５０００塩基、約２５０塩基から約４５００塩基、約２５０塩基から約４０００塩基、約２５０塩基から約３５００塩基、約２５０塩基から約３０００塩基、約２５０塩基から約２５００塩基、約２５０塩基から約２０００塩基、約２５０塩基から約１５００塩基、約２５０塩基から約１０００塩基、約２５０塩基から約７５０塩基、約２５０塩基から約５００塩基、約５００塩基から約６０００塩基、約５００塩基から約５５００塩基、約５００塩基から約５０００塩基、約５００塩基から約４５００塩基、約５００塩基から約４０００塩基、約５００塩基から約３５００塩基、約５００塩基から約３０００塩基、約５００塩基から約２５００塩基、約５００塩基から約２０００塩基、約５００塩基から約１５００塩基、約５００塩基から約１０００塩基、約５００塩基から約７５０塩基、約７５０塩基から約６０００塩基、約７５０塩基から約５５００塩基、約７５０塩基から約５０００塩基、約７５０塩基から約４５００塩基、約７５０塩基から約４０００塩基、約７５０塩基から約３５００塩基、約７５０塩基から約３０００塩基、約７５０塩基から約２５００塩基、約７５０塩基から約２０００塩基、約７５０塩基から約１５００塩基、約７５０塩基から約１０００塩基、約１０００塩基から約６０００塩基、約１０００塩基から約５５００塩基、約１０００塩基から約５０００塩基、約１０００塩基から約４５００塩基、約１０００塩基から約４０００塩基、約１０００塩基から約３５００塩基、約１０００塩基から約３０００塩基、約１０００塩基から約２５００塩基、約１０００塩基から約２０００塩基、約１０００塩基から約１５００塩基、約１５００塩基から約６０００塩基、約１５００塩基から約５５００塩基、約１５００塩基から約５０００塩基、約１５００塩基から約４５００塩基、約１５００塩基から約４０００塩基、約１５００塩基から約３５００塩基、約１５００塩基から約３０００塩基、約１５００塩基から約２５００塩基、約１５００塩基から約２０００塩基、約２０００塩基から約６０００塩基、約２０００塩基から約５５００塩基、約２０００塩基から約５０００塩基、約２０００塩基から約４５００塩基、約２０００塩基から約４０００塩基、約２０００塩基から約３５００塩基、約２０００塩基から約３０００塩基、約２０００塩基から約２５００塩基、約２５００塩基から約６０００塩基、約２５００塩基から約５５００塩基、約２５００塩基から約５０００塩基、約２５００塩基から約４５００塩基、約２５００塩基から約４０００塩基、約２５００塩基から約３５００塩基、約２５００塩基から約３０００塩基、約３０００塩基から約６０００塩基、約３０００塩基から約５５００塩基、約３０００塩基から約５０００塩基、約３０００塩基から約４５００塩基、約３０００塩基から約４０００塩基、約３０００塩基から約３５００塩基、約３５００塩基から約６０００塩基、約３５００塩基から約５５００塩基、約３５００塩基から約５０００塩基、約３５００から約４５００塩基、約３５００から約４０００塩基、約４０００塩基から約６０００塩基、約４０００塩基から約５５００塩基、約４０００塩基から約５０００塩基、約４０００塩基から約４５００塩基、約４５００塩基から約６０００塩基、約４５００塩基から約５５００塩基、約４５００塩基から約５０００塩基、約５０００塩基から約６０００塩基、約５０００塩基から約５５００塩基、約５５００から約６０００塩基、約２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００または６０００塩基の長さを有することができる。部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の長さは例示的であること、および他のサイズが本開示の範囲内であることを理解すべきである。部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の長さは、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第１の鎖または第２の鎖の長さ、すなわち第１の３’オーバーハングの第１の５’末端から３’末端まで、または第２の３’オーバーハングの第２の５’末端から３’末端までを指すことを理解すべきである。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、それぞれ第１の鎖および第２の鎖の第１の部分および第３の部分は、約２０塩基から約６０００塩基の長さを有することができる。例として、限定するものではないが、第１のオリゴヌクレオチドの第１の部分および第２のオリゴヌクレオチドの第３の部分は、約２０塩基から約６０００塩基、約２０塩基から約５５００塩基、約２０塩基から約５０００塩基、約２０塩基から約４５００塩基、約２０塩基から約４０００塩基、約２０塩基から約３５００塩基、約２０塩基から約３０００塩基、約２０塩基から約２５００塩基、約２０塩基から約２０００塩基、約２０塩基から約１５００塩基、約２０塩基から約１０００塩基、約２０塩基から約７５０塩基、約２０塩基から約５００塩基、約２０塩基から約２５０塩基、約２０塩基から約２００塩基、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約５０塩基、約１００塩基から約６０００塩基、約１００塩基から約５５００塩基、約１００塩基から約５０００塩基、約１００塩基から約４５００塩基、約１００塩基から約４０００塩基、約１００塩基から約３５００塩基、約１００塩基から約３０００塩基、約１００塩基から約２５００塩基、約１００塩基から約２０００塩基、約１００塩基から約１５００塩基、約１００塩基から約１０００塩基、約１００塩基から約７５０塩基、約１００塩基から約５００塩基、約１００塩基から約２５０塩基、約１００塩基から約２００塩基、約２００塩基から約６０００塩基、約２００塩基から約５５００塩基、約２００塩基から約５０００塩基、約２００塩基から約４５００塩基、約２００塩基から約４０００塩基、約２００塩基から約３５００塩基、約２００塩基から約３０００塩基、約２００塩基から約２５００塩基、約２００塩基から約２０００塩基、約２００塩基から約１５００塩基、約２００塩基から約１０００塩基、約２００塩基から約７５０塩基、約２００塩基から約５００塩基、約２００塩基から約２５０塩基、約２５０塩基から約６０００塩基、約２５０塩基から約５５００塩基、約２５０塩基から約５０００塩基、約２５０塩基から約４５００塩基、約２５０塩基から約４０００塩基、約２５０塩基から約３５００塩基、約２５０塩基から約３０００塩基、約２５０塩基から約２５００塩基、約２５０塩基から約２０００塩基、約２５０塩基から約１５００塩基、約２５０塩基から約１０００塩基、約２５０塩基から約７５０塩基、約２５０塩基から約５００塩基、約５００塩基から約６０００塩基、約５００塩基から約５５００塩基、約５００塩基から約５０００塩基、約５００塩基から約４５００塩基、約５００塩基から約４０００塩基、約５００塩基から約３５００塩基、約５００塩基から約３０００塩基、約５００塩基から約２５００塩基、約５００塩基から約２０００塩基、約５００塩基から約１５００塩基、約５００塩基から約１０００塩基、約５００塩基から約７５０塩基、約７５０塩基から約６０００塩基、約７５０塩基から約５５００塩基、約７５０塩基から約５０００塩基、約７５０塩基から約４５００塩基、約７５０塩基から約４０００塩基、約７５０塩基から約３５００塩基、約７５０塩基から約３０００塩基、約７５０塩基から約２５００塩基、約７５０塩基から約２０００塩基、約７５０塩基から約１５００塩基、約７５０塩基から約１０００塩基、約１０００塩基から約６０００塩基、約１０００塩基から約５５００塩基、約１０００塩基から約５０００塩基、約１０００塩基から約４５００塩基、約１０００塩基から約４０００塩基、約１０００塩基から約３５００塩基、約１０００塩基から約３０００塩基、約１０００塩基から約２５００塩基、約１０００塩基から約２０００塩基、約１０００塩基から約１５００塩基、約１５００塩基から約６０００塩基、約１５００塩基から約５５００塩基、約１５００塩基から約５０００塩基、約１５００塩基から約４５００塩基、約１５００塩基から約４０００塩基、約１５００塩基から約３５００塩基、約１５００塩基から約３０００塩基、約１５００塩基から約２５００塩基、約１５００塩基から約２０００塩基、約２０００塩基から約６０００塩基、約２０００塩基から約５５００塩基、約２０００塩基から約５０００塩基、約２０００塩基から約４５００塩基、約２０００塩基から約４０００塩基、約２０００塩基から約３５００塩基、約２０００塩基から約３０００塩基、約２０００塩基から約２５００塩基、約２５００塩基から約６０００塩基、約２５００塩基から約５５００塩基、約２５００塩基から約５０００塩基、約２５００塩基から約４５００塩基、約２５００塩基から約４０００塩基、約２５００塩基から約３５００塩基、約２５００塩基から約３０００塩基、約３０００塩基から約６０００塩基、約３０００塩基から約５５００塩基、約３０００塩基から約５０００塩基、約３０００塩基から約４５００塩基、約３０００塩基から約４０００塩基、約３０００塩基から約３５００塩基、約３５００塩基から約６０００塩基、約３５００塩基から約５５００塩基、約３５００塩基から約５０００塩基、約３５００塩基から約４５００塩基、約３５００から約４０００塩基、約４０００塩基から約６０００塩基、約４０００塩基から約５５００塩基、約４０００塩基から約５０００塩基、約４０００塩基から約４５００塩基、約４５００塩基から約６０００塩基、約４５００塩基から約５５００塩基、約４５００塩基から約５０００塩基、約５０００塩基から約６０００塩基、約５０００塩基から約５５００塩基、約５５００から約６０００塩基、約２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００または６０００塩基の長さを各々有することができる。第１の鎖の第１の部分および第２の鎖の第３の部分の長さは例示的であること、および他のサイズが本開示の範囲内であることを理解すべきである。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分、すなわちそれぞれ第１の３’オーバーハングおよび第２の３’オーバーハングは、約４塩基から約１００塩基を各々含むことができる。例として、限定するものではないが、第１の鎖の第２の部分および第２の鎖の第４の部分は、約４塩基から約１００塩基、約４塩基から約９０塩基、約４塩基から約８０塩基、約４塩基から約７５塩基、約４塩基から約７０塩基、約４塩基から約６０塩基、約４塩基から約５０塩基、約４塩基から約４０塩基、約４塩基から約３０塩基、約４塩基から約２５塩基、約４塩基から約２０塩基、約４塩基から約１５塩基、約４塩基から約１０塩基、約４塩基から約５塩基、約５塩基から約１００塩基、約５塩基から約９０塩基、約５塩基から約８０塩基、約５塩基から約７５塩基、約５塩基から約７０塩基、約５塩基から約６０塩基、約５塩基から約５５塩基、約５塩基から約５０塩基、約５塩基から約４０塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約１００塩基、約１０塩基から約９０塩基、約１０塩基から約８０塩基、約１０塩基から約７５塩基、約１０塩基から約７０塩基、約１０塩基から約６０塩基、約１０塩基から約５０塩基、約１０塩基から約４０塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約１００塩基、約１５塩基から約９０塩基、約１５塩基から約８０塩基、約１５塩基から約７５塩基、約１５塩基から約７０塩基、約１５塩基から約６０塩基、約１５塩基から約５０塩基、約１５塩基から約４０塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７５塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２０塩基から約２５塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７５塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７５塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７５塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７５塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７５塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約７０塩基から約７５塩基、約７５塩基から約１００塩基、約７５塩基から約９０塩基、約７５塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３３、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０または１００塩基を各々含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の共通配列は、約１塩基から約５０塩基を含むことができる。例として、限定するものではないが、第１の共通配列は、約１塩基から約５０塩基、約１塩基から約４５塩基、約１塩基から約４０塩基、約１塩基から約３５塩基、約１塩基から約３０塩基、約１塩基から約２５塩基、約１塩基から約２０塩基、約１塩基から約１５塩基、約１塩基から約１０塩基、約５塩基から約５０塩基、約５塩基から約４５塩基、約５塩基から約４０塩基、約５塩基から約３５塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約５０塩基、約１０塩基から約４５塩基、約１０塩基から約４０塩基、約１０塩基から約３５塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約５０塩基、約１５塩基から約４５塩基、約１５塩基から約４０塩基、約１５塩基から約３５塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４５塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３５塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４５塩基、約３０塩基から約４０塩基、約３０塩基から約３５塩基、約３５塩基から約５０塩基、約３５塩基から約４５塩基、約３５塩基から約４０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約４０塩基から約４５塩基、約４５塩基から約５０塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３３、３５、４０または５０塩基を含むことができる。好ましくは、第１の共通ヌクレオチド配列は、１３塩基を含む。一部の実施形態では、第１の共通ヌクレオチド配列は、配列番号１２７（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣ－３’）の配列を含む。第１の共通ヌクレオチド配列が配列番号１２７の配列を含む場合、複数の５’アダプターの各々の第３の３’末端部分は、配列番号１２６（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）の配列を各々含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定するものではないが、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定するものではないが、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の共通ヌクレオチド配列および第３の３’末端部分は、ライゲーション温度より高い融解温度を有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の第２のインデキシングプライマーの各々の第２の３’末端部分および第２の共通ヌクレオチド配列は、第１のアニーリング温度より高い融解温度を有することができる。例として、限定するものではないが、第２の共通ヌクレオチド配列および第２の３’末端部分の融解温度は、アニーリング温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃高くてもよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の共通ヌクレオチド配列および第３の３’末端部分の融解温度は、ライゲーション温度より少なくとも１℃高くてもよい。例として、限定するものではないが、第１の共通ヌクレオチド配列および第３の３’末端部分の融解温度は、ライゲーション温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃高くてもよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の共通ヌクレオチド配列および第３の３’末端部分の融解温度は、第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低くてもよい。例として、限定するものではないが、第１の共通ヌクレオチド配列および第３の３’末端部分の融解温度は、第１のアニーリング温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃低くてもよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第２の共通ヌクレオチド配列は、約３塩基から約１００塩基の長さを有することができる。例として、限定するものではないが、第２の共通ヌクレオチド配列は、約１塩基から約１００塩基、約１塩基から約９０塩基、約１塩基から約８０塩基、約１塩基から約７５塩基、約１塩基から約７０塩基、約１塩基から約６０塩基、約１塩基から約５０塩基、約１塩基から約４０塩基、約１塩基から約３０塩基、約１塩基から約２５塩基、約１塩基から約２０塩基、約１塩基から約１５塩基、約１塩基から約１０塩基、約１塩基から約５塩基、約５塩基から約１００塩基、約５塩基から約９０塩基、約５塩基から約８０塩基、約５塩基から約７５塩基、約５塩基から約７０塩基、約５塩基から約６０塩基、約５塩基から約５０塩基、約５塩基から約４０塩基、約５塩基から約３０塩基、約５塩基から約２５塩基、約５塩基から約２０塩基、約５塩基から約１５塩基、約５塩基から約１０塩基、約１０塩基から約１００塩基、約１０塩基から約９０塩基、約１０塩基から約８０塩基、約１０塩基から約７５塩基、約１０塩基から約７０塩基、約１０塩基から約６０塩基、約１０塩基から約５０塩基、約１０塩基から約４０塩基、約１０塩基から約３０塩基、約１０塩基から約２５塩基、約１０塩基から約２０塩基、約１０塩基から約１５塩基、約１５塩基から約１００塩基、約１５塩基から約９０塩基、約１５塩基から約８０塩基、約１５塩基から約７５塩基、約１５塩基から約７０塩基、約１５塩基から約６０塩基、約１５塩基から約５０塩基、約１５塩基から約４０塩基、約１５塩基から約３０塩基、約１５塩基から約２５塩基、約１５塩基から約２０塩基、約２０塩基から約１００塩基、約２０塩基から約９０塩基、約２０塩基から約８０塩基、約２０塩基から約７５塩基、約２０塩基から約７０塩基、約２０塩基から約６０塩基、約２０塩基から約５０塩基、約２０塩基から約４０塩基、約２０塩基から約３０塩基、約２０塩基から約２５塩基、約２５塩基から約１００塩基、約２５塩基から約９０塩基、約２５塩基から約８０塩基、約２５塩基から約７５塩基、約２５塩基から約７０塩基、約２５塩基から約６０塩基、約２５塩基から約５０塩基、約２５塩基から約４０塩基、約２５塩基から約３０塩基、約３０塩基から約１００塩基、約３０塩基から約９０塩基、約３０塩基から約８０塩基、約３０塩基から約７５塩基、約３０塩基から約７０塩基、約３０塩基から約６０塩基、約３０塩基から約５０塩基、約３０塩基から約４０塩基、約４０塩基から約１００塩基、約４０塩基から約９０塩基、約４０塩基から約８０塩基、約４０塩基から約７５塩基、約４０塩基から約７０塩基、約４０塩基から約６０塩基、約４０塩基から約５０塩基、約５０塩基から約１００塩基、約５０塩基から約９０塩基、約５０塩基から約８０塩基、約５０塩基から約７５塩基、約５０塩基から約７０塩基、約５０塩基から約６０塩基、約６０塩基から約１００塩基、約６０塩基から約９０塩基、約６０塩基から約８０塩基、約６０塩基から約７５塩基、約６０塩基から約７０塩基、約７０塩基から約１００塩基、約７０塩基から約９０塩基、約７０塩基から約８０塩基、約７０塩基から約７５塩基、約７５塩基から約１００塩基、約７５塩基から約９０塩基、約７５塩基から約８０塩基、約８０塩基から約１００塩基、約８０塩基から約９０塩基、約９０塩基から約１００塩基、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、８０、９０または１００塩基の長さを有することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、ライゲーション温度は、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度より低くてよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第３の鎖および第４の鎖の融解温度は、第１の変性温度より低くてよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、ライゲーション温度は、約２５℃から約４０℃であってよい。さらなる例として、限定するものではないが、ライゲーション温度は、約２５℃から約４０℃、約２５℃から約３７℃、約２５℃から約３５℃、約２５℃から約３０℃、約３０℃から約４０℃、約３０℃から約３５℃、約３５℃から約４０℃、約２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃であってよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、ライゲーション持続時間は、複数の第１のインデキシングプライマーの１つを第１の鎖の第１の５’末端または第２の鎖の第２の５’末端にライゲーションするのに十分である任意の時間であってよい。上の実施形態のいずれでも、ライゲーション持続時間は約５分から約６０分であってよい。例として、限定するものではないが、ライゲーション持続時間は、約５分から約６０分、約５分から約５０分、約５分から約４０分、約５分から約３０分、約５分から約２０分、約５分から約１０分、約１０分から約６０分、約１０分から約５０分、約１０分から約４０分、約１０分から約３０分、約１０分から約２０分、約２０分から約６０分、約２０分から約５０分、約２０分から約４０分、約２０分から約３０分、約３０分から約６０分、約３０分から約５０分、約３０分から約４０分、約４０分から約６０分、約４０分から約５０分、約５０分から約６０分、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分であってよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、任意の好適なリガーゼを使用することができる。リガーゼは低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能である熱不安定性リガーゼであるリガーゼであるべきであり、第１の変性持続時間の第１の変性温度で不活性化されるべきであることを理解すべきである。そのような低マグネシウム緩衝液条件は、ＰＣＲに好適な条件であることを理解すべきである。例として、限定するものではないが、リガーゼはＴ３ＤＮＡリガーゼであってよい。上の実施形態のいずれでも、例として、限定するものではないが、リガーゼは、第１の反応混合物の１μＬあたり約３０～約３００酵素単位で添加することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、任意の好適なポリメラーゼを使用することができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼはライゲーション温度で活性でない。例として、限定するものではないが、ポリメラーゼはホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができる。上の実施形態のいずれでも、ポリメラーゼは、活性化温度を有するホットスタートポリメラーゼであってよく、活性化温度は第１の変性温度より低い。例として、限定するものではないが、活性化温度は、第１の変性温度、第２の変性温度および第３の変性温度より低くてよい。例として、限定するものではないが、ポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択することができる。上の実施形態のいずれでも、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させるホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができる。そのような実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）であってよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の変性温度、第２の変性温度、第３の変性温度および第４の変性温度は、各々約９５℃から約９８℃であってよい。上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の変性持続時間、第２の変性持続時間、第３の変性持続時間および第４の変性持続時間は、各々約３０秒から約２分であってよい。例として、限定するものではないが、第１の変性持続時間、第２の変性持続時間、第３の変性持続時間および第４の変性持続時間は、各々約３０秒から約２分、約３０秒から１．５分、約３０秒から１分、約１分から約２分、約１分から約１．５分、約１．５分から約２分、約３０秒、４５秒、１分、１．５分または２分であってよい。各ＰＣＲサイクルでアニーリングされる二本鎖ＤＮＡを変性させるための任意の好適な温度を使用することができることを理解すべきである。第１の変性温度は、それが第１の鎖および第２の鎖の融解温度より高いように十分であるべきであることを理解すべきである。当業者は、通常の実験および／または知識を通してそのような温度および必要な時間を容易に決定することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度、第３のアニーリング温度および第４のアニーリング温度は、各々約５５℃から約６５℃であってよい。例として、限定するものではないが、第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度は、各々約５５℃から約６５℃、５５℃から約６０℃、約６０℃から約６５℃、約５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃であってよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１のアニーリング持続時間、第２のアニーリング持続時間、第３のアニーリング持続時間および第４のアニーリング持続時間は、各々約１０秒から約６０秒であってよい。第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度および第３のアニーリング温度、ならびに第１のアニーリング持続時間、第２のアニーリング持続時間および第３のアニーリング持続時間は、各それぞれのＰＣＲステップで必要とされるアニーリングが起こるのに十分であるべきであることを理解すべきである。当業者は、通常の実験および／または知識を通してそのような温度および必要な時間を容易に決定することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の伸張温度、第２の伸張温度、第３の伸張温度および第４の伸張温度は、各々約６０℃から約７２℃であってよい。例として、限定するものではないが、第１の伸張温度、第２の伸張温度および第３の伸張温度は、約６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃または７２℃であってよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、第１の伸長持続時間、第２の伸長持続時間、第３の伸長持続時間および第４の伸長持続時間は、各々約３０秒から約５分であってよい。第１の伸長温度、第２の伸長温度および第３の伸長温度、ならびに第１の伸長持続時間、第２の伸長持続時間および第３の伸長持続時間は、各それぞれのＰＣＲステップで必要とされる伸長が起こるのに十分であるべきであることを理解すべきである。当業者は、通常の実験および／または知識を通してそのような温度および必要な時間を容易に決定することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の第１のインデキシングプライマーおよび複数の第２のインデキシングプライマーを約１００ｎＭから約１μＭで第１の反応混合物に添加することができる。例として、限定するものではないが、複数の第１のインデキシングプライマーおよび複数の第２のインデキシングプライマーを約１００ｎＭから約２００ｎＭで第１の反応混合物に添加することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、配列番号８７の配列をさらに含むことができる。上の実施形態のいずれでも、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、配列番号７８の配列をさらに含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、本方法は、第７の鎖および第９の鎖または第８の鎖および第１０の鎖をシークエンシングすることをさらに含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、

上の実施形態のいずれでも、第３の３’末端部分および第１の共通ヌクレオチド配列は、ライゲーション温度より高いが、第１のアニーリング温度、第２のアニーリング温度、第３のアニーリング温度および第４のアニーリング温度より低いＴ_ｍを有することができることを理解すべきである。

ライゲーションカップルドＰＣＲのための上の実施形態のいずれでも、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、第２の共通ヌクレオチド配列に相補的でなくてもよいことを理解すべきである。

ライゲーションカップルドＰＣＲのための上の実施形態のいずれでも、鎖が、ある特定のエレメントを含むものとして挙げられる場合、その鎖はさらなる挙げられていないエレメントを含むことができることを理解すべきである。例として、限定するものではないが、５’ヘアピンアダプターを利用する実施形態では、第５の鎖は、第１の共通ヌクレオチド配列および第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体を含むことができる。したがって、これらのエレメントを挙げないことによって、それらが省略によって排除されるものでないことを理解すべきである。

部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するための方法
本開示の方法では、記載されるように部分的に二本鎖のＤＮＡ基質から開始する代わりに、本方法は、ライゲーションステップ、例えばステップ（ｉｉ）の間にプロセシングして部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成することができる開始ＤＮＡ基質分子から開始するように改変することができることを理解すべきである。例として、限定するものではないが、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、開始ＤＮＡ基質分子を、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を調製するための本明細書に開示される処理および酵素に加えて第１の反応混合物のための試薬と組み合わせて提供することができるように、組み合わせることができる。そのような実施形態では、第１の条件集合は、ライゲーションステップ（ｉｉ）の間にｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基をそれぞれ開裂するために、酵素、例えばＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＲＮアーゼＨまたはエンドヌクレアーゼＶのために十分であってもよい。ステップ（ｉｉｉ）で、第２の条件集合は、いかなるそのような酵素がさらなるＰＣＲ増幅に影響を及ぼさないようにそれらを不活性化するのにさらに十分であってよい。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、それらの５’末端にユニバーサルプライマー配列を各々含む第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、ユニバーサルプライマー配列はユニバーサルプライマー配列の内部またはその３’末端にｄＵ塩基を含むこと、ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、ならびにｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素および開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例として、限定するものではないが、ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素は、ＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せであってよい。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能な配列を含み、第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能な配列を含み、第１の５’開裂可能な配列および第２の５’開裂可能な配列の各々が、第１の５’開裂可能な配列および第２の５’開裂可能な配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含むこと、リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加すること、ならびにリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素および開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例として、限定するものではないが、リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素はＲＮアーゼＨである。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能な配列を含み、第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能な配列を含み、第１の５’開裂可能な配列および第２の５’開裂可能な配列の各々が、第１の５’開裂可能な配列および第２の５’開裂可能な配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含むこと、イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、ならびにイノシン塩基を開裂することが可能な酵素および開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例として、限定するものではないが、イノシン塩基を開裂することが可能な酵素はエンドヌクレアーゼＶである。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、末端修復を実施して、５’末端および３’末端を各々有する第１の開始鎖および第２の開始鎖を有する平滑末端の二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成すること、複数の３’アダプター鎖を平滑末端の二本鎖開始ＤＮＡ分子に添加することであって、各３’アダプター鎖が、ｄＵ塩基およびリガーゼを含む相補鎖にアニーリングされていること、ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた複数の３’アダプター鎖、リガーゼおよび平滑末端の二本鎖ＤＮＡ基質分子を、複数の３’アダプター鎖の１つを、平滑末端の開始ＤＮＡ基質分子の第１の開始鎖および第２の開始鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、必要に応じてライゲーションされた二本鎖分子を精製すること、ライゲーションされた二本鎖分子のｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、ならびにｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素およびライゲーションされた二本鎖基質分子を、相補鎖を開裂して、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例として、限定するものではないが、ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素は、ＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せであってよい。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、末端修復を実施して、５’末端および３’末端を各々有する第１の開始鎖および第２の開始鎖を有する平滑末端の二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成すること、複数の３’アダプター鎖を平滑末端の二本鎖開始ＤＮＡ分子に添加することであって、各３’アダプター鎖が、リボヌクレオチドおよびリガーゼを含む相補鎖にアニーリングされていること、ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた複数の３’アダプター鎖、リガーゼおよび平滑末端の二本鎖ＤＮＡ基質分子を、複数の３’アダプター鎖の１つを平滑末端の開始ＤＮＡ基質分子の第１の開始鎖および第２の開始鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、必要に応じてライゲーションされた二本鎖分子を精製すること、ライゲーションされた二本鎖基質分子にライゲーションされた二本鎖分子のリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加すること、ならびにリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素およびライゲーションされた二本鎖基質分子を、相補鎖を開裂して部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例として、限定するものではないが、リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素はＲＮアーゼＨである。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、末端修復を実施して５’末端および３’末端を各々有する第１の開始鎖および第２の開始鎖を有する平滑末端の二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成すること、複数の３’アダプター鎖を平滑末端の二本鎖開始ＤＮＡ分子に添加することであって、各３’アダプター鎖が、イノシン塩基およびリガーゼを含む相補鎖にアニーリングされていること、イノシン塩基を含む相補鎖にアニーリングされた複数の３’アダプター鎖、リガーゼおよび平滑末端の二本鎖ＤＮＡ基質分子を、複数の３’アダプター鎖の１つを平滑末端の開始ＤＮＡ基質分子の第１の開始鎖および第２の開始鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残してライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、必要に応じてライゲーションされた二本鎖分子を精製すること、ライゲーションされた二本鎖分子のイノシン塩基を開裂することが可能な酵素を、ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、ならびにイノシン塩基を開裂することが可能な酵素およびライゲーションされた二本鎖基質分子を、相補鎖を開裂して部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。例として、限定するものではないが、イノシン塩基を開裂することが可能な酵素はエンドヌクレアーゼＶである。

一部の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡ基質は、断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと；複数の３’アダプター鎖を単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加することであって、各３’アダプター鎖が、３’末端のｄＵ塩基およびリガーゼを含む相補鎖にアニーリングされていること；３’末端のｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた複数の３’アダプター鎖、リガーゼおよび単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、相補鎖の１つを単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること；必要に応じてライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること；ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること；ならびにｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素およびライゲーションされた二本鎖基質分子を、相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすることによって生成することができる。

代わりに、直前の実施形態では、相補鎖は３’末端ｄＵ塩基の代わりに３’末端Ｔ塩基を含むことができるが、ｄＵ塩基をさらに含むことができる。そのような場合には、ライゲーションはなお起こることができるが、相補鎖の一部分はエンドヌクレアーゼ開裂の後もそのままである。さらに、代わりに、３’末端Ｔ塩基を有するが、相補鎖はリボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含むことができ、添加される酵素はリボヌクレオチドまたはイノシン塩基をそれぞれ開裂することが可能であってよい。

断片化ＤＮＡ基質分子が提供される上の方法のいずれでも、方法は、標的ＤＮＡを断片化して、断片化ＤＮＡ基質分子を生成することをさらに含むことができる。

上の実施形態のいずれでも、例えば多重ＰＣＲのためにポリメラーゼが使用される場合、ＤＮＡポリメラーゼは任意の好適なポリメラーゼであってよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼはハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼのようなウラシル耐性のＤＮＡポリメラーゼであってよい。

部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するためのリガーゼ、および使用するならばポリメラーゼは、ライゲーションカップルドＰＣＲのために使用されるリガーゼおよびポリメラーゼと異なるかまたは同じであってもよいことを理解すべきである。

複数の３’アダプター鎖が使用される上の実施形態のいずれでも、複数の３’アダプター鎖の各々は５’ホスフェートをさらに含むことができ、相補鎖は３’ブロッキング基をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、３’ブロッキング基は、３’－デオキシチミジン、３’－デオキシアデニン、３’－デオキシグアニン、３’－デオキシシトシンおよび２’３’－ジデオキシヌクレオチドからなる群から選択することができる。

ライゲーションカップルドＰＣＲの後のライブラリー正規化
上の実施形態のいずれでも、ＰＣＲサイクルの後、ライブラリー正規化を実施することができる。

上の実施形態のいずれでも、複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の共通ヌクレオチド配列に相補的である第１の３’末端部分を有し、複数の第２のインデキシングプライマーの各々が第１の共通ヌクレオチド配列に相補的である第２の３’末端部分を有する場合、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は第１の５’末端部分を含み、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は第２の５’末端部分をさらに含み、第１の５’末端部分および第２の５’末端部分の各々は、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、第５の鎖および第６の鎖は、第５の鎖および第６の鎖の５’末端に第２の５’末端部分をさらに含み、第７の鎖および第８の鎖は、第７の鎖および第８の鎖の５’末端に第１の５’末端部分をさらに含み、第５の鎖および第７の鎖は、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖の生成物を形成することができ、第６の鎖および第８の鎖は、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖の生成物を形成することができ、本方法は、標的モル量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を生成するのに十分な量の、第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブであって、標的モル量より多い量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖が存在するプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加すること；第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖、第８の鎖、第２のリガーゼおよびプローブを、プローブが、標的モル量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること；エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を事前正規化反応混合物に添加すること；ならびに事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、プローブにライゲーションしない第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすることをさらに含む。例として、限定するものではないが、第２のリガーゼはＴ４ＤＮＡの第２のリガーゼであってよい。

上の実施形態のいずれでも、複数の５’アダプターが５’アダプターライゲーションのために使用される場合、本方法では、さらに、複数の第１のインデキシングプライマーの各々は、第１の５’末端部分を含み、複数の第２のインデキシングプライマーの各々は、第２の５’末端部分をさらに含み、第１の５’末端部分および第２の５’末端部分の各々は、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’のエクソヌクレアーゼ活性を有することにより、第７の鎖および第８の鎖は、第７の鎖および第８の鎖の５’末端に第１の５’末端部分をさらに含むことにより、第９の鎖および第１０の鎖は、第９の鎖および第１０の鎖の５’末端に第２の５’末端部分をさらに含むことにより、第７の鎖および第９の鎖は、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖の生成物を形成することができることにより、第８の鎖および第１０の鎖は、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖の生成物を形成することができ、本方法は、標的モル量の第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を生成するのに十分な量の第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖が、標的モル量より多い量で存在すること；第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖、第２のリガーゼおよびプローブを、プローブが、標的モル量の第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること；エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を事前正規化反応混合物に添加すること；ならびに事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、プローブにライゲーションしない第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすることをさらに含む。

正規化のための上の実施形態では、エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素はエクソヌクレアーゼＩＩＩであってよいことを理解すべきである。正規化のための上の実施形態では、プローブは、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素によるエクソヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を得るための修飾、例えば例として、限定するものではないが、ホスホロチオエート連結を含むことをさらに理解すべきである。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための方法
スプリント媒介プライマーアセンブリ（１つのプライマー）のための方法
一部の実施形態では、（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと；（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第１のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を二本鎖ＤＮＡ基質に添加して第１の反応混合物を生成することであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖の第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的である第３の３’末端部分および５’ホスフェートを含み、第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、第１のプライマーが、第２の鎖の第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分を含み、第１の３’ブロッキング基がポリメラーゼ連鎖伸張の能力がなく、第２のオリゴヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、第１のオリゴヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的である５’部分を有すること；（ｉｉｉ）第１の反応混合物を、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、第１のプライマー、二本鎖ＤＮＡ基質および第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること；ならびに（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸張持続時間にわたる伸張温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを第２の反応混合物に施して、第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、第１のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成することを含むことができるライゲーションカップルドＰＣＲのための方法が提供される。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ステップ（ｉｉ）は、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドを添加することであって、第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、第５のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸張の能力がない第２の３’ブロッキング基を含み、第５のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、および第４のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分をさらに含み、第１の条件集合は、第２のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドが第５のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、リガーゼが、第４のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、第４のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを生成するのにさらに十分であることをさらに含むことができる。そのような実施形態では、ライゲーション温度は、第２のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドの融解温度未満より低くてもよい。そのような実施形態では、第５のオリゴヌクレオチド、第４のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの融解温度は、アニーリング温度および伸張温度より低くてもよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドは、アニーリング温度および伸張温度より低い融解温度を有することができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリ（両プライマー）のための方法
一部の実施形態では、ライゲーションカップルドＰＣＲのための方法は、（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと；（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第４のオリゴヌクレオチド、第５のオリゴヌクレオチド、第６のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖の第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、第１のオリゴヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有し、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖の第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、第６のオリゴヌクレオチドが、第４のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、第５のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および第２の３’ブロッキング基を含み、第１の３’ブロッキング基および第２の３’ブロッキング基が、ポリメラーゼ連鎖伸張の能力がないこと；（ｉｉｉ）第１の反応混合物を、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが３’－５’方向で第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドが３’－５’方向で第６のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、第５のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた第４のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー、二本鎖ＤＮＡ基質、および第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分である、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること；（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸張持続時間にわたる伸張温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを第２の反応混合物に施して、第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、第１のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成することを含むことができる。

両プライマーのスプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの融解温度は、アニーリング温度および伸張温度より低くてもよく、第４、５および６のオリゴヌクレオチドの融解温度は、アニーリング温度および伸張温度より低くてもよい。そのような実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチド、これらの実施形態では第３のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドは、したがってアセンブルされたライゲーションされたプライマーから変性させることができることを理解すべきである。したがって、融解温度はスプリントからライゲーションされたオリゴヌクレオチドへの融解温度を指すことができる。

両プライマーのスプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ステップ（ｉｉ）は、第７のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドを添加することであって、ここで、第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、第８のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸張の能力がない第３の３’ブロッキング基を含み、第８のオリゴヌクレオチドが、第７のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分および第２のオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分をさらに含み、第１の条件集合が、第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが第８のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、リガーゼが第７のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、第７のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを生成するのにさらに十分であることをさらに含むことができる。そのような実施形態では、ライゲーション温度は第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドから第８のオリゴヌクレオチドへの融解温度より低くてよい。そのような実施形態では、アニーリング温度および伸張温度は、第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドから第８のオリゴヌクレオチドへの融解温度より高くてもよい。

一方または両方のプライマーのスプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーションされるオリゴヌクレオチドは、約５から約１００塩基の長さを各々有することができ、３’ブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドは約１０から約５０塩基の長さを有することができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、本方法は、（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを第３の反応混合物に施して、二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含むことができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーション温度は、二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度より低くてよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーション温度は、第１のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低くてよく、ライゲーション温度は、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低くてよい。さらなる例として、限定するものではないが、単一スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーション温度は、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低くてよい。さらなる例として、限定するものではないが、両方のプライマーのスプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーション温度は、第４のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチド、ならびに第５のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低くてもよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、任意の好適なリガーゼを使用することができる。リガーゼは低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能である熱不安定性リガーゼであるリガーゼであるべきであり、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度で不活性化されるべきであることを理解すべきである。そのような低マグネシウム緩衝液条件は、ＰＣＲに好適な条件であることを理解すべきである。例として、限定するものではないが、リガーゼはＴ３ＤＮＡリガーゼであってよい。上の実施形態のいずれでも、例として、限定するものではないが、リガーゼは、第１の反応混合物の１μＬあたり約３０～約３００酵素単位で添加することができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、３’ブロック基のいずれも、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３またはそれより多くのｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基からなる群から独立して選択することができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ステップ（ｉ）～（ｉｖ）は同じ管で実施することができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の間で精製を実施することができない。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、任意の好適なポリメラーゼを使用することができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼはライゲーション温度で活性でない。例として、限定するものではないが、ポリメラーゼはホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができる。上の実施形態のいずれでも、ポリメラーゼは、活性化温度を有するホットスタートポリメラーゼであってよく、活性化温度は第１の変性温度より低い。例として、限定するものではないが、活性化温度は、第１の変性温度、第２の変性温度および第３の変性温度より低くてよい。例として、限定するものではないが、ポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択することができる。上の実施形態のいずれでも、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を増加させるホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができる。そのような実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）であってよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーション温度は、約２５℃から約４０℃であってよい。さらなる例として、限定するものではないが、ライゲーション温度は、約２５℃から約４０℃、約２５℃から約３７℃、約２５℃から約３５℃、約２５℃から約３０℃、約３０℃から約４０℃、約３０℃から約３５℃、約３５℃から約４０℃、約２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃であってよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、ライゲーション持続時間は、複数の第１のインデキシングプライマーの１つを第１の鎖の第１の５’末端または第２の鎖の第２の５’末端にライゲーションするのに十分な任意の時間であってよい。上の実施形態のいずれでも、ライゲーション持続時間は約５分から約６０分であってよい。例として、限定するものではないが、ライゲーション持続時間は、約５分から約６０分、約５分から約５０分、約５分から約４０分、約５分から約３０分、約５分から約２０分、約５分から約１０分、約１０分から約６０分、約１０分から約５０分、約１０分から約４０分、約１０分から約３０分、約１０分から約２０分、約２０分から約６０分、約２０分から約５０分、約２０分から約４０分、約２０分から約３０分、約３０分から約６０分、約３０分から約５０分、約３０分から約４０分、約４０分から約６０分、約４０分から約５０分、約５０分から約６０分、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分であってよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、変性温度は、約９５℃から約９８℃であってよい。各ＰＣＲサイクルでアニーリングされる二本鎖ＤＮＡを変性させるための任意の好適な温度を使用することができることを理解すべきである。第１の変性温度は、それが二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より高いように十分であるべきであることを理解すべきである。当業者は、通常の実験および／または知識を通してそのような温度および必要な時間を容易に決定することができる。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、アニーリング温度は、約５５℃から約６５℃であってよい。例として、限定するものではないが、アニーリング温度は、各々約５５℃から約６５℃、５５℃から約６０℃、約６０℃から約６５℃、約５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃または６５℃であってよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、伸長温度は、各々約６０℃から約７２℃であってよい。例として、限定するものではないが、伸張温度は、約６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃または７２℃であってよい。

スプリント媒介プライマーアセンブリのための上の実施形態のいずれでも、変性持続時間は約３０秒から約２分であってよい。例として、限定するものではないが、変性持続時間は、各々約３０秒から約２分、約３０秒から１．５分、約３０秒から１分、約１分から約２分、約１分から約１．５分、約１．５分から約２分、約３０秒、４５秒、１分、１．５分または２分であってよい。
キット

本開示は、本開示の方法を実施するためのキットも提供する。キットは、各方法で使用する試薬のいずれかかまたは一部を含むことができ、試薬が含まれる場合、それは本開示で開示される特性のいずれかを有することができ、それに限定されないことを理解すべきである。

一部の実施形態では、３’末端部分を有する第１のインデキシングプライマーと、同じ３’末端部分を有する第２のインデキシングプライマーと、第１のリガーゼと、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含むキットが提供される。上のキット実施形態のいずれでも、キットは、３’末端部分に少なくとも部分的に相補的である５’部分を含むブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。ある特定の態様では、ブロッカーオリゴヌクレオチドは第２のインデキシングプライマーにプリアニーリングされる。上のキット実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第２のインデキシングプライマーに相補的であるが第１のインデキシングプライマーに相補的でない５’部分の３’側に第１のさらなる部分を含むことができる。上のキット実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基第１のさらなる部分に対して３’に位置するおよびヘアピン部分をさらに含むことができ、ヘアピン部分は、第２のヘアピン配列の５’に位置する第１のヘアピン配列を含み、第１のヘアピン配列および第２のヘアピン配列は相補的であり、ヘアピンを形成することができる。そのような実施形態では、本開示で開示される通り、第２のさらなる部分は約１から約３０塩基の長さを有することができる。そのような実施形態では、ヘアピン部分は、第１のヘアピン配列と第２のヘアピン配列の間に第３のヘアピン配列をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、第３のヘアピン配列は、約４塩基から約２０塩基の長さを有することができる。第３のヘアピン配列は、第１および第２のヘアピン配列と安定なステムループ構造を形成することを可能にするのに十分なループを形成することができることを理解すべきである。

上のキット実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、５’部分と第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含むことができ、第２のさらなる部分は、第１のインデキシングプライマーに相補的でなく、第２のさらなる部分は、第２のインデキシングプライマーに相補的でない。そのような実施形態では、本開示で開示される通り、第２のさらなる部分は約１塩基から約３０塩基の長さを有することができる。

上のキット実施形態のいずれでも、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、それがヘアピン部分を含まない場合、ポリメラーゼ伸張を阻害するための３’修飾をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、ポリメラーゼ伸張を阻害するための３’修飾は、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオチド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、または第２のインデキシングプライマーに相補的でないＤＮＡ配列であってよい。

一部の実施形態では、第１の３’末端部分を有する第１のインデキシングプライマーと、第２の３’末端部分を有する第２のインデキシングプライマーと、第３の３’末端部分を有する５’アダプターと、第１のリガーゼと、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含むことができるキットが提供される。そのような実施形態では、５’アダプターは、第１のインデキシングプライマーの第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含むことができる、第３の３’末端部分に対して５’に位置する第１の５’部分、第１の５’部分に対して５’に位置し、第１の５’部分に相補的な第２の５’部分、および第１の部分の５’末端に位置するＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーをさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、本開示に記載される通り、第１の５’部分および第２の５’部分は、約１２塩基から約２０塩基の長さを各々有することができる。そのような実施形態では、５’アダプターは、第１の５’部分と第２の５’部分の間に位置する介在配列をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、介在配列は約４塩基から約２０塩基の長さを有することができる。

上のキット実施形態のいずれでも、複製ブロックは、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択することができる。

上のキット実施形態のいずれでも、本開示に記載される通り、５’アダプターは約２５塩基から約１００塩基の長さを有することができる。

上のキット実施形態のいずれでも、第１の５’部分および第２の５’部分は、ヘアピンを形成することができる。

上のキット実施形態のいずれでも、第１のインデキシングプライマーおよび第２のインデキシングプライマーは、３つまたはそれより多いリボヌクレオチド塩基の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチド５’を含む５’テール配列をさらに含むことができ、ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する。上のキット実施形態のいずれでも、第１のインデキシングプライマーおよび第２のインデキシングプライマーは、配列番号１の配列を含む５’テール配列をさらにさらに含むことができ、ＤＮＡポリメラーゼは３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する。そのような実施形態では、キットは、５’テール配列に相補的なプローブオリゴヌクレオチドをさらに含むことができ、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾、および３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含むことができる。例として、限定するものではないが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素はエクソヌクレアーゼＩＩＩであってよい。例として、限定するものではないが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結であってよい。そのような実施形態では、キットは第２のリガーゼをさらに含むこともできる。例として、限定するものではないが、第２のリガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼであってよい。

上のキット実施形態のいずれでも、キットは、標的特異的プライマー対をさらに含むことができる。上のキット実施形態のいずれでも、キットは、複数の標的特異的プライマー対をさらに含むことができる。そのような実施形態では、キットは、ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含むユニバーサルプライマーをさらに含むことができる。そのような実施形態では、キットは、ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含むことができる。そのような酵素の例示的な非限定例には、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＲＮアーゼＨおよびエンドヌクレアーゼＶのそれぞれの組合せが含まれる。そのような実施形態では、キットは、標的特異的プライマー対およびユニバーサルプライマーを使用した多重ＰＣＲのための第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含むことができる。

上のキット実施形態のいずれでも、第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択することができる。さらなる例として、限定するものではないが、第２のＤＮＡポリメラーゼは、ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼなどのウラシル耐性ポリメラーゼであってよい。

上のキット実施形態のいずれでも、第１のＤＮＡポリメラーゼはホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含むことができ、ホットスタート抗体またはアプタマーは、ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる。そのような実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）またはＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）であってよい。

上のキット実施形態のいずれでも、本開示に記載される通り、第１のインデキシングプライマーおよび第２のインデキシングプライマーは、約２０塩基から約１００塩基の長さを有することができる。

上のキット実施形態のいずれでも、リガーゼは、Ｔ３ＤＮＡリガーゼなどの低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである。

本開示全体で、二本鎖ＤＮＡを変性させるまたは任意の二本鎖ＤＮＡを変性させるのに十分な条件への言及は、すべての二本鎖ＤＮＡが変性される、またはアニーリングされるものだけが変性される条件を含むことができることを理解すべきである。

本開示全体で、ライゲーションおよびＰＣＲサイクルの間の鎖の合成が言及されること、ならびに複数の鎖の生成のための用語「および」の使用は、１分子基準あたりでの最小値で「または」と解釈することもできることも理解すべきである。部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が提供される方法では、それが複数の部分的に二本鎖のＤＮＡ基質であってもよいこと、および特定の鎖へのライゲーションまたはそのＰＣＲ増幅が、単一分子または異なる基質の上で起こることができ、したがってなお本開示の範囲に入ることをさらに理解すべきである。例として、限定するものではないが、第１の鎖は部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の１つにライゲーションさせることができ、第２の鎖はもう１つにライゲーションさせることができ、そのような場合では、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドをなお形成することができる。

以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態を例示するものである。これらの実施例は、非限定的と解釈するべきであり、当業者は、本開示の精神から逸脱することなく本開示の範囲内で実施形態を改変することができることを理解するだろう。

（実施例１）
真菌ＩＴＳ１遺伝子を標的にするアンプリコンパネルによるライゲーションカップルドＰＣＲ
理論的根拠
この実施例は、ＩＴＳ１遺伝子のための非常に小さい標的化パネルの調製における最終のインデキシングおよび増幅ステップとしてのライゲーションカップルドＰＣＲの有用性を例示する。多重化ＰＣＲのためにＩＴＳ１遺伝子をカバーするように１５プライマーパネルを設計した。以降のライゲーションカップルドＰＣＲは、共通アダプター配列を含む完全長ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑインデキシングプライマーを使用して実施した。３’アダプター（ｉ７）を含むインデキシングプライマーのライゲーションを防止するために、ブロッカーオリゴヌクレオチド１９－０４を使用し、それは、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応へ添加する前にプライマーにプレアニーリングした。ＩＴＳ１のための標的特異的設計は、Bellemain et al. BMC Microbiol. 2010; 10: 189に由来した。
材料

ＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓＤＮＡ（ＡＴＣＣｃａｔ＃１０２３１）

Ｑ５ｄＵバイパスマスターミックス（２×）、（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０５９８）

１５標的特異的プライマー（表１、プライマーＦ１～Ｆ８およびＲ９～Ｒ１５）

トランケーションされた３’アダプター配列１４－８８２を含有するユニバーサルプライマー（表１）

完全長５’アダプター（ｉ５）および酵素正規化適合５’テール（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４配列（配列番号１）１８－４６０からなるインデキシングプライマー（表１）

完全長３’アダプター（ｉ７）と酵素正規化適合５’テール（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）１８－４５１からなるインデキシングプライマー、ブロッカー１９－０４にプリアニーリングされる（表１）

酵素正規化適合テール（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）１８－２２１を有する５’アダプターのためのＰ５末端プライマー（表１）

酵素正規化適合テール（Ｔ）_１２（ｒＵ）_４（配列番号１）１８－２２２を有する３’アダプターのためのＰ７末端プライマー（表１）

ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒｃａｔ＃Ｂ２３３１８）

２０％ＰＥＧ－８０００／２．５ＭＮａＣｌ溶液

ＤＮＡ懸濁緩衝液、１０ｍＭトリス、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｔ０２２７）

Ｔ３ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｌ６０１０）

ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ、ｃａｔ＃Ｍ５５０５Ｂ）

ＨｉＦｉＰＣＲマスターミックス（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｐ７６７０）

ＳｗｉｆｔＮｏｒｍａｌａｓｅキット（ｃａｔ＃６６０９６）
方法

ＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液に希釈した。標的選択および増幅のための第１の反応は、３０μｌで実施した。ＩＴＳ１アンプリコンパネルのために、フォワードおよびリバース標的特異的プライマーは、トランケーションされた３’アダプター配列であるユニバーサルアダプターを含む５’テールを含んだ。この反応は、Ｑ５ｄＵバイパスマスターミックス（２ｘ）、各々６０ｎＭの等濃度で存在する、１５標的特異的プライマーＦ１～Ｆ８およびＲ９～Ｒ１５（表１）のミックス、エンドヌクレアーゼ１４－８８２による以降の開裂のための改変塩基を有する１０μＭユニバーサルプライマー（表１）および１ｎｇゲノムＤＮＡからなった。この反応ミックスで以下のサイクリングプログラムを実行した：９８℃で３０秒、その後９８℃で１０秒、６３℃で５分および６５℃で１分を４サイクル、続いて９８℃で１０秒、および６４℃で１分を１４サイクル、最後に６５℃で１分のインキュベーション。未使用の標的特異的プライマーを除去し、緩衝液交換を促進するために、精製を実施した。精製は、３０μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（１．０×比）を使用して実施し、反応は１７．４μｌのＴＥに溶出させたが、ビーズから除去されなかった。アダプターライゲーションおよびＰＣＲ増幅を合わせた第２の反応は５０μｌで実施し、ビーズを有する１７．４μｌの溶出反応ミックス、１ｘＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲマスターミックス、１μＬのＴ３ＤＮＡリガーゼ、１μＬのＵＳＥＲ、各々２００ｎＭ濃度のインデキシングプライマー１８－４６０および１８－４５１、ならびに各々４００ｎＭ濃度の末端プライマー１８－２２１および１８－２２２を含んだ（表１）。この反応ミックスで以下のサイクリングプログラムを実行した：ＵＳＥＲおよびＴ３リガーゼ活性を可能にするために３７℃で２０分、その後エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを不活性化し、ＤＮＡ基質を変性させ、ホットスタートポリメラーゼを活性化するために９８℃で３０秒、これに続いて標的特異的アンプリコンのインデキシングＰＣＲのために９８℃で１０秒、６０℃で３０秒および６６℃で１分を７サイクル。反応は次に４２．５μＬの２０％ＰＥＧ－８０００／２．５ＭＮａＣｌ溶液（０．８５×比）で精製し、ＤＮＡは２０μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液に溶出させ、新規の管へ移した。ライブラリーは、ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＫａｐａｑＰＣＲアッセイキットを使用して定量化し、その後、製造業者のワークフロー推奨によるＳｗｉｆｔＮｏｒｍａｌａｓｅキットを通して正規化を完了して、２ｎＭプールを達成した。プールをＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｎｉＳｅｑにローディングし、１５１塩基の対末端リードでシークエンシングをした。
結果

ライブラリー収量は、正規化の前で５３ｎＭであった。リードの９８％より多くが意図する標的領域に整列したように、シークエンシングデータは高品質であった。図７は、ＩＧＶで観察されたＩＴＳ１のカバレージを表す。３５塩基未満の挿入断片サイズを有する短いリードが全リードの０．１％未満を占めるように、プライマー二量体も最終ライブラリーで最小である。
結論

この標的化アンプリコンライブラリーワークフローは、１５個のプライマーを使用して単一遺伝子座の極めて小さい標的領域から十分なライブラリー収量を首尾よくもたらした。第１のアダプターを含む標的特異的アンプリコンは、ＮＧＳライブラリーに変換され、第２のアダプターライゲーションおよびライブラリーインデキシング戦略としてライゲーションカップルドＰＣＲを使用してインデックス化された。アダプター二量体およびプライマー二量体は、最終ライブラリーに有意には寄与しなかった。ライブラリー調製は、アンプリコンベースのライブラリーのための統合されたライブラリー調製および正規化手順を実証した。

（実施例２）
長いプライマーアセンブリおよび酵素ライブラリー正規化の理論的根拠のためのライゲーションカップルドＰＣＲ
理論的根拠
単一密閉管での酵素正規化のために、ライブラリーをインデックス化、増幅および調整するためにライゲーションカップルドＰＣＲを使用した。詳細には、ユニバーサルスプリントを使用して酵素正規化のための末端修飾オリゴをインデキシングプライマーにライゲーションし、続いてＰＣＲサイクリングによってトランケーションされたアダプターを有するライブラリーをインデックス化および増幅する。ＰＣＲのために最適化された条件でのオリゴサブユニットからのプライマーのライゲーションベースのアセンブリのために、Ｔ３ＤＮＡリガーゼを使用した。ライゲーションカップルドＰＣＲ方法は、酵素正規化のためのＲＮＡおよびＤＮＡ塩基を含有する完全長９２および８６塩基オリゴの合成を置き換え、より低い合成費用のために短いユニバーサル正規化５’テール配列が既存のインデキシングプライマーにライゲーションすることを可能にする。
材料

酵素的断片化、Ｓｗｉｆｔ２ＳＴｕｒｂｏＦｌｅｘｉｂｌｅＤＮＡライブラリーキット（ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃４５０２４）

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒａｐｉｄ）（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｌ６０３０－ＨＣ－Ｌ）

５ＸＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、ｃａｔ＃６０５８）

トランケーションされたアダプター；第１のオリゴヌクレオチド１３－６９１（表１）

トランケーションされたアダプター；第２のオリゴヌクレオチド１６－３４９（表１）

ｉ５およびｉ７のためのトランケーションされたインデキシングオリゴ１８－２０６、１８－２０７、１８－２１０、１８－２１１、１８－２１２、１８－２１３（表１）

修飾末端正規化テールオリゴ１８－２０４、１８－２０５（表１）

トランケーションされたインデキシングオリゴの正規化オリゴ１８－２１４、１８－２１５へのライゲーションのためのユニバーサルスプリント（表１）

Ｔ３ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｌ６０１０Ｌ）

ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＳＰＨｉＦｉＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液（Ｔａｋａｒａ、ｃａｔ＃ＲＦ２２０Ｑ）

ＳｗｉｆｔＮｏｒｍａｌａｓｅキット（ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃６６０９６）

ＭｉＳｅｑ試薬キットＶ２、５０サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ｃａｔ＃ＭＳ１０２－２００１）

ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ、ｃａｔ＃Ｂ２３４１９）

ヒトゲノムＤＮＡ（ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＡ１２８７８）
方法

ヒトゲノムＤＮＡをＤＮＡ懸濁緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁させた。１０ｎｇのＤＮＡを断片化し、末端修復し、酵素断片化ミックスを３０μｌ反応で使用してアデニル化した。ＤＮＡは、３２℃で２２分の断片化時間で２００ｂｐの平均サイズを有するように断片化し、続いて６５℃で３０分の不活性化およびアデニル化を実施した。酵素断片化の後、トランケーションされたアダプターは、最終濃度の１ＸＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液、１２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２５μＭのトランケーションされたアダプターを６０μｌ反応で使用してライゲーションした。反応は、２０℃で２０分間インキュベートした。トランケーションされたアダプターでライゲーションしたＤＮＡは、４８μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８０×）を使用して精製し、２０μｌのＤＮＡ再懸濁緩衝液で溶出した。２０μＭのユニバーサルスプリントオリゴの保存溶液は、５０ｍＭのＮａＣｌと８０℃で１５分間インキュベートし、２０℃で３０分間冷却することによって、２７．５μＭの修飾末端Ｎｏｒｍａｌａｓｅプロトコールオリゴにプレアニーリングした。プレアニーリングされたスプリントおよび修飾末端Ｎｏｒｍａｌａｓｅプロトコールオリゴの修飾インデックスプライマーオリゴへのライゲーション、ならびにライゲーションされたインデキシングオリゴによる調整されたＤＮＡの増幅のための成分は、すべて単一密閉管反応に存在し；この反応は、ＰＣＲのために最適化された１×ＨｉＦｉＰＣＲＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液条件、各々０．６μＭのｉ５およびｉ７修飾インデキシングオリゴ、各々１μＭのユニバーサルスプリントオリゴ、ならびに各々１．３７μＭの末端修飾Ｎｏｒｍａｌａｓｅプロトコールオリゴ、３７００単位のＴ３ＤＮＡリガーゼ、およびトランケーションされたアダプターとライゲーションした２０μｌの精製されたＤＮＡを含有する５０μｌの最終量でアセンブルした。反応は、以下のプログラムによるサーモサイクラーに置いた：２５℃で１５分；９８℃で３０秒；９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を７サイクル；６８℃で５分、および４℃で保持。最終ライブラリーは５０μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：１．０×）を使用して精製し、２０μｌのＴＥで溶出し、蛍光定量的方法（Ｑｕｂｉｔおよび高感度ＤＮＡＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーキット）およびｑＰＣＲによって調査し、所望のライブラリーサイズを確実にし、量を確認した。Ｓｗｉｆｔ酵素正規化キットを使用してライブラリーを４ｎＭに正規化し、インデックスバランスを測定するために１２ｐＭを５０サイクルのＭｉＳｅｑカートリッジにローディングした。
結果

ライゲーションカップルドＰＣＲのために修飾したインデキシングプライマーの複数の組合せで調製した７反復のライブラリーの平均収量は、１８ｎＭであった。ライブラリーのインデックスバランスは、ＭｉＳｅｑの上のフィルターを通過したリードによって測定される１０．６％変動係数および７５２Ｋ／ｍｍ^２のクラスター密度を有した。
結論

ＮＧＳライブラリーは、単一密閉管でのライゲーションカップルドＰＣＲを使用した酵素正規化方法のために首尾よくインデックス化、増幅および調整された。

（実施例３）
ライゲーションカップルドＰＣＲのためのＰＣＲマスターミックスでＴ３ＤＮＡリガーゼを使用したプライマーアセンブリの効率
理論的根拠
この実施例は、ＰＣＲのために最適化された条件でのスプリントライゲーションによるインデキシングプライマーアセンブリを実証し、これは単一密閉管での複合的プライマーアセンブリおよび基質分子のＰＣＲ増幅を可能にする。
材料

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｃａｔ＃Ｌ６０３０－ＬＣ－Ｌ）

ｉ５のための改変されたトランケーションされたインデキシングオリゴ１８－２０６（表１）

修飾末端正規化テールオリゴ１８－２０４（表１）

改変されたトランケーションされたインデキシングオリゴの正規化オリゴ１８－２１４へのライゲーションのためのユニバーサルスプリントオリゴ（表１）

Ｔ３ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｃａｔ＃Ｌ６０１０Ｌ）

ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＳＰＨｉＦｉＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液（Ｔａｋａｒａｃａｔ＃ＲＦ２２０Ｑ）

Ｎｏｖｅｘ（商標）ＴＢＥ－尿素ゲル、１５％、１２ウェル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃａｔ＃ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）

ＴＢＥランニングバッファー５×（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃａｔ＃ＬＣ６６７５）

Ｎｏｖｅｘ（商標）ＴＢＥ－尿素サンプル緩衝液２×（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃａｔ＃ＬＣ６８７６）

ＳＹＢＲＧｏｌｄ核酸ゲル染色１０，０００×（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃａｔ＃Ｓ１１４９４）

ＴｒａｃｋＩｔ（商標）２５ｂｐＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃａｔ＃１０４８８－０２２）
方法

２０μＭのユニバーサルスプリントオリゴ（１８－２１４）の保存溶液は、５０ｍＭのＮａＣｌと８０℃で１５分間インキュベートし、２０℃で３０分間冷却することによって、２７．５μＭの修飾末端Ｎｏｒｍａｌａｓｅプロトコールオリゴ（１８－２０４）にプレアニーリングした。プレアニーリングされたスプリントおよび修飾末端Ｎｏｒｍａｌａｓｅプロトコールオリゴの修飾インデックスプライマーオリゴへのライゲーションのための成分は、単一密閉管反応に存在し；ライゲーションカップルドＰＣＲは、ＰＣＲのために最適化された１×緩衝液条件、０．６μＭのｉ５改変インデキシングオリゴ、１μＭのユニバーサルスプリントオリゴ、および１．３７μＭの末端改変Ｎｏｒｍａｌａｓｅプロトコールオリゴ、３７００単位のＴ３ＤＮＡリガーゼまたは３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する５０μｌの最終量でアセンブルした。２５℃に設定したサーモサイクラーに反応を１５分間置いた。反応の一部は、１５分間のインキュベーションの前またはその後に添加した１×ＨｉＦｉＰＣＲＤＮＡポリメラーゼで実行した。インキュベーションの後、各反応の１０μｌを、１０μｌのＴＢＥ－尿素サンプル緩衝液と混合し、９５℃で２分間変性させ、ＴＢＥ尿素ゲルの各レーンに変性混合物の１８μｌをローディングした。ゲルの最外部のレーンには、２５塩基ラダーの１．５μｌをローディングした。ゲルは、６５℃のオーブンの中の１×ＴＢＥランニングバッファーに１４０Ｖで１時間流した。ゲルは２×ＳＹＢＲＧｏｌｄを使用して室温で１０分間染色し、蒸留水で１分間水洗し、紫外光源で画像を獲得した。
結果

ゲルに示されるように（図８）、バンド４はライゲーションした生成物（７３塩基）を示し、バンド１は末端Ｎｏｒｍａｌａｓｅオリゴ（バンド２、１８－２０４、２８塩基）を修飾インデキシングプライマー（バンド３、１８－２０６、４５塩基）にライゲーションするために使用したユニバーサルスプリントオリゴ（１８－２１４、２４塩基）である。レーン（Ａ）から（Ｅ）は、修飾インデキシングオリゴ単独の１００％、６０％、４０％、２０％および１０％をそれぞれ示し、それはライゲーション反応における限界オリゴである。レーン（Ｆ）および（Ｇ）は、ＨｉＦｉＤＮＡポリメラーゼ無しおよび有りのＰＣＲのために最適化された条件でＴ４ＤＮＡリガーゼを使用した、修飾インデキシングオリゴの部分的なライゲーションだけを実証する。レーン（Ｈ）、（Ｉ）および（Ｊ）は、それぞれ２５℃で１５分間のインキュベーションの後および前に加えたＨｉＦｉＤＮＡポリメラーゼ無しおよび有りのＰＣＲのために最適化された反応条件でインキュベートしたＴ３ＤＮＡリガーゼを使用した、修飾インデキシングオリゴの９０％を超えるライゲーションを実証する。
結論

結果は、ＰＣＲのために最適化された条件でＴ３ＤＮＡリガーゼを使用して９０％を超えるライゲーションを実証するが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用すると部分的なライゲーションだけが観察される。

（実施例４）
連続アダプター結合化学および平滑末端を有する３’アダプターを利用したＤＮＡＮＧＳライブラリー方法のためのトランケーションされたインデキシングプライマーおよびヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルＰＣＲ。
理論的根拠
この実施例は、３’末端の１３塩基を欠くトランケーションされたインデキシングプライマーｉ５およびｉ７ならびにトランケーションされたヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲ反応の実行可能性を実証する。それは、線状５’アダプターに対するヘアピン５’アダプターの利点も実証する（図３Ａおよび３Ｂに示す）。１３塩基の３’末端トランケーションのために、トランケーションされたインデキシングプライマーｉ５（図３Ａ、Ｂのドメイン３）は５’アダプターとして使用することができないので、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応にさらなる５’アダプターを添加する必要がある。この実施例で利用される３’アダプターは、平滑末端のトランケーションされたアダプター（ドメイン２）であり；一方、５’アダプターは比較的短い一本鎖の３’部分を有するトランケーションされたヘアピン（図３Ｂのドメイン５）であるか、または実質的により高いＴ_ｍを有するトランケーションされた線状アダプター（図３Ａのドメイン５）である。この実施例で使用されるヘアピン５’アダプターのステム領域の融解温度は非常に高い（Ｔ_ｍ約８０℃）ので、プライマーアニーリングおよび伸張の間、ヘアピン５’アダプターはその一本鎖の３’部分の低Ｔ_ｍ（Ｔ_ｍ約５０℃）のために折りたたまれ、ＰＣＲに参加しない。線状のトランケーションされた５’アダプターの融解温度は実質的により高く（Ｔ_ｍ約７３℃）、ライブラリー分子のＰＣＲ増幅および生成におけるこのアダプターの可能性の高い関与が、シークエンシングの間のフローセルの上でのクラスター形成を支えることを不可能にしている。さらに、ヘアピンアダプター領域は、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応の間のヘアピン複製および望ましくない生成物の形成を防止するための複製不能なスペーサーを含有する。

この実施例では、オリゴヌクレオチド１によって表されるデオキシウリジン含有鎖は、ＵＤＧ酵素によって完全に分解され、その後、５’トランケーションされたヘアピンアダプターの３’アダプター（オリゴヌクレオチド１）の残りの一本鎖へのアニーリング、およびＴ３ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ基質の５’末端へのライゲーションが続いた。さらに、９５～９８℃でのＵＤＧおよびＴ３ＤＮＡリガーゼの不活性化、およびホットスタート耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性化が同時発生し、その後、トランケーションされたインデキシングプライマーの存在下でＮＧＳＤＮＡライブラリーの以降のＰＣＲが続き、すべては単一管でのインキュベーションで生じた。
材料

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒａｐｉｄ）（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｃａｔ＃Ｌ６０３０－ＨＣ－Ｌ）

オリゴヌクレオチド配列（表１）

５×ＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、ｃａｔ＃６０５８）

ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｃａｔ＃Ｇ５０１０Ｌ）

２×ＨｉＦｉＰＣＲマスターミックス（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｐ７６７０）

１００ｍＭ２’－デオキシヌクレオシド５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）セット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１０２９７０１８）

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｐ７０８０Ｌ）

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｙ９０４Ｌ）

ヒトゲノムＤＮＡ（ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＡ１２８７８）

ＤＮＡ懸濁緩衝液、１０ｍＭトリス、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｔ０２２７）
方法

ヒトゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ懸濁緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に１００ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。ＤＮＡは、ＣｏｖａｒｉｓＭ２２０Ｆｏｃｕｓｅｄ－Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒで２００塩基対の平均サイズに断片化した。約１５０ｂｐから約２５０ｂｐの断片化ＤＮＡのタイトな分布が得られた。

断片化ＤＮＡは、ＮＧＳライブラリーを調製するために使用した。ポリシング反応は、各ｄＮＴＰの１００μＭ、０．１５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０μｌでアセンブルした。反応は、２０℃で２０分間インキュベートし、その後、６５℃で１０分間の熱不活化が続いた。３’アダプターライゲーション反応は、１×ＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液、２２０ピコモルの３’アダプターオリゴヌクレオチド１３－７１２、１１０ピコモルの３’アダプターオリゴヌクレオチド１３－６９０、３０μｌのポリッシュされたＤＮＡおよび１２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む６０μｌでアセンブルした。ライゲーション反応は、２０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡは、４８μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８×）を使用して精製した。ＤＮＡは１８．５μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液に溶出させた。ライゲーションカップルドインデキシングＰＣＲ反応は、１×ＨｉＦｉＰＣＲマスターミックス、１ピコモルのトランケーションされたヘアピン５’アダプターオリゴヌクレオチド１９－３５１または線状５’アダプター１９－３１、６０ピコモルのインデキシングプライマーｉ５オリゴヌクレオチド１７－２７７、６０ピコモルのインデキシングプライマーオリゴヌクレオチド１４－１６１、１５００単位のＴ３ＤＮＡリガーゼ、２単位のウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよび３’アダプターライゲーション反応の後に精製された１８μｌのＤＮＡを含有する５０μｌ量でアセンブルした。反応は、以下の設定プログラムによるサーモサイクラーに置いた：３７℃で２０分間、続いて９８℃で２分間、続いて（９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間）を７サイクル、続いて７２℃で１分間、および４℃で保持。最終ライブラリーは、４２．５μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８×）を使用して精製した。ＤＮＡは２０μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液に溶出させ、蛍光定量的方法（Ｑｕｂｉｔおよび高感度ＤＮＡＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーキット）およびｑＰＣＲによって調査し、所望のライブラリーサイズを確実にし、定量を確認した。

トランケーションされた平滑末端の３’アダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって調製した（参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許第１０，２０８，３３８号に記載される通り）：５’末端のホスフェート基および３’末端のブロック基（Ｃ３スペーサーなど）を有するオリゴヌクレオチド１３－６９０、ならびに３’末端に分解可能なデオキシウリジン塩基およびライゲーション不能の３’－ｄＴ塩基を含むオリゴヌクレオチド１３－７１２（３’リボース位置のヒドロキシル基を欠くチミン塩基修飾）。
結果

表２は、ＱｕｂｉｔおよびＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用したライブラリー収量の定量調査によって得られた実験結果を概説する。５’トランケーションされたヘアピンアダプターは、フルサイズのインデキシングプライマーが使用され、アダプターｉ５のライゲーションが完了した後にｉ７アダプターが添加された条件と比較して同等のライブラリー収量によって実証される通り、ライゲーションカップルドインデキシングＰＣＲ反応の効率を維持した。さらに、５’トランケーションされたヘアピンアダプターを線状アダプターで置き換えることは、ライブラリー収量の低減をもたらした。
結論

ＮＧＳライブラリーは、２つのＮＧＳアダプターの連続ライゲーションによる３ステッププロトコールを使用して首尾よく作製され、ここで、図１Ｇおよび図３Ｂに示すように、第１のステップはＤＮＡ末端を修復し、第２のステップは３’平滑末端アダプターを加え、最終ステップは、トランケーションされたインデキシングプライマーを使用した単一密閉管反応において５’ヘアピンアダプターをライゲーションし、インデックスを加え、ＰＣＲによってＮＧＳライブラリーを増幅した。ループ領域の中の複製不可能スペーサーからなるトランケーションされたヘアピン５’アダプターの使用はライブラリー収量を向上させ、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応中の望ましくない生成物の形成を防止する。

（実施例５）
連続アダプター結合化学および平滑末端を有する３’アダプターを利用したＤＮＡＮＧＳライブラリー方法のためのフルサイズインデキシングプライマーおよびプライマーブロッカーによるライゲーションカップルＰＣＲ
理論的根拠
この実施例は、フルサイズインデキシングプライマーによるライゲーションカップルドＰＣＲ反応の実行可能性を実証し、ここで、インデキシングプライマーの１つ（ｉ５）は５’アダプターとして使用してＤＮＡにライゲーションし、図１Ｅおよび図２Ｂに示すように第２のインデキシングプライマー（ｉ７）のライゲーションは、第２のインデキシングプライマーにプレアニーリングされたブロッカーオリゴヌクレオチドによって防止される。この実施例は、ブロッカーオリゴヌクレオチドがない場合の実質的により低いライブラリー収量を実証することによって（図２Ａ）、開裂可能なｄＵ塩基およびミスマッチを含有するブロッカーオリゴヌクレオチドの有用性を示す（図２Ｆおよび図２Ｇ）。ブロッカーオリゴヌクレオチドの中のミスマッチおよび開裂可能な塩基の数および位置の両方がその性能にとって重要であることも示す。ＰＣＲ反応の間のブロッカーオリゴヌクレオチドの不活性化は、図２Ｆおよび図２Ｇに示すように、Ｔ３ＤＮＡリガーゼによる５’アダプターライゲーションおよび３７℃でのウラシルデオキシグリコシラーゼとのインキュベーションを合わせた間に生成される脱塩基部位における高温でのオリゴヌクレオチド断片化によって達成される。最後の反応は、ｄＵ塩基を有する３’アダプターオリゴヌクレオチドをＤＮＡに結合したオリゴヌクレオチドから解離させるのを助けるが、ブロッカーオリゴヌクレオチドとインデキシングプライマーｉ７の間の相互作用を実質的に破壊しない。この実施例で利用される３’アダプターは、平滑末端のトランケーションされたアダプターである。フルサイズインデキシングプライマーの存在下でのＵＤＧ処理、Ｔ３ＤＮＡリガーゼによる５’アダプターライゲーションおよびライブラリー増幅を含むすべての３つの反応は、単一密閉管反応で起こる。
材料

オリゴヌクレオチド配列（表１）

断片化ＤＮＡは、ＮＧＳライブラリーを調製するために使用した。ポリシング反応は、各ｄＮＴＰの１００μＭ、０．１５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０μｌでアセンブルした。反応は、２０℃で２０分間インキュベートし、その後、６５℃で１０分間のインキュベーションが続いた。３’アダプターライゲーション反応は、１×ＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液、２２０ピコモルの３’アダプターオリゴヌクレオチド１３－７１２、１１０ピコモルの３’アダプターオリゴヌクレオチド１３－６９０、３０μｌのポリッシュされたＤＮＡおよび１２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む６０μｌでアセンブルした。反応は、２０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡは、４８μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８×）を使用して精製した。ＤＮＡは１８．５μｌのＤＮＡ再懸濁緩衝液に溶出させた。ライゲーションカップルドインデキシングＰＣＲは、１×ＨｉＦｉＰＣＲマスターミックス、６０ピコモルのフルサイズインデキシングプライマーｉ５オリゴヌクレオチド１９－３４、６０ピコモルのフルサイズインデキシングプライマーｉ７オリゴヌクレオチド１９－３７、７２ピコモルのインデキシングプライマーｉ７ブロッカー、１５００単位のＴ３ＤＮＡリガーゼ、２単位のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および３’アダプターライゲーション反応の後に精製したＤＮＡの１８μｌを含有する５０μｌの反応量でアセンブルした。反応は、以下の設定プログラムによるサーモサイクラーに置いた：３７℃で２０分、続いて９８℃で２分、続いて９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒を７サイクル、続いて７２℃で１分、および４℃で保持。最終ライブラリーは、４２．５μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８５×）を使用して精製した。ＤＮＡは２０μｌに溶出させ、蛍光定量的方法（Ｑｕｂｉｔおよび高感度ＤＮＡＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーキット）およびｑＰＣＲによって調査し、所望のライブラリーサイズを確実にし、定量を確認した。

トランケーションされた平滑末端の３’アダプターは、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって調製した（参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許第１０，２０８，３３８号に記載される）：５’末端のホスフェート基および３’末端のブロッキング基（Ｃ３スペーサーなど）を有するオリゴヌクレオチド１３－６９０、および３’末端に分解可能なデオキシウリジン塩基およびライゲーション不能の３’－ｄＴ塩基を含むオリゴヌクレオチド１３－７１２（３’リボース位置のヒドロキシル基を欠くチミン塩基修飾）。
結果

表１にオリゴヌクレオチド１９－３５６、１９－３５７、１９－３５２、１９－３５３および１９－３５４として掲載したすべての試験したプライマーブロッカーの配列は、それらの標的、インデキシングプライマーＰ７オリゴヌクレオチド１９－３７と合わせて図９に示す。表２は、ＱｕｂｉｔおよびＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用したライブラリー収量の定量調査によって得られた実験結果を概説する。ライゲーションカップルドインデキシングＰＣＲ反応の効率は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの追加およびその組成に高度に依存していた。図９に示すすべてのブロッキングオリゴヌクレオチドは、プライマーｉ７を効率的に阻害し、３つのｄＵ塩基および１つのＴ＊Ｇミスマッチを含有するブロッカーオリゴヌクレオチド１９－３５６は、ライブラリー収量の最大の増加をもたらし、ｉ５プライマー－アダプターのライゲーションが完了した後にインデキシングプライマーが加えられた条件と同等であった。ブロッカーがライゲーションカップルＰＣＲに添加されなかったときにはライブラリー収量の４分の１の低減があったが、他のブロッカーが使用されたときはより少ない低減であった。
結論

２つのＮＧＳアダプターの連続ライゲーションによる３ステッププロトコールを使用して、ＮＧＳライブラリーは首尾よく作製され、ここで、図１Ｅおよび図２Ｂに示すように、第１のステップはＤＮＡ末端を修復し、第２のステップは３’平滑末端アダプターを加え、最終ステップは、フルサイズインデキシングプライマーを使用した単一密閉管反応において５’プライマー－アダプターｉ５をライゲーションし、インデックスを加え、ＰＣＲによってＮＧＳライブラリーを増幅した。ｄＵ塩基およびミスマッチを含有するプライマーブロッカーの使用はライブラリー収量を４倍向上させ、５’アダプターの１００％組込みを特徴とする対照例と同じ性能を達成することを可能にする。

（実施例６）
連続アダプター結合化学および単一塩基オーバーハングを有する３’アダプターを利用したＤＮＡＮＧＳライブラリー方法のためのトランケーションされたインデキシングプライマーおよびヘアピン５’アダプターによるライゲーションカップルドＰＣＲ
理論的根拠
この実施例は、３’末端の１３塩基を欠くトランケーションされたインデキシングプライマーｉ５およびｉ７ならびにトランケーションされたヘアピン５’アダプターを利用したライゲーションカップルドＰＣＲ反応の実行可能性を実証する。この実施例で使用する３’アダプターは、ＴまたはＵの単一塩基３’オーバーハングを有するトランケーションされたアダプターであり（それぞれ、図３Ｋおよび３Ｉ）、一方、５’アダプターは、１１ｂまたは１３ｂの一本鎖３’部分をそれぞれ有するトランケーションされたヘアピンアダプター（図３Ｋおよび３Ｉのドメイン５）である。この実施例で使用されるヘアピン５’アダプターのステム領域の融解温度は８０℃であり、プライマーアニーリングおよび伸張ＰＣＲ相の間にヘアピンアダプターはその残りの一本鎖３’部分の低Ｔ_ｍ（Ｔｍ約５０℃）のために折りたたまれ、ＰＣＲに参加しないことを示唆する。さらに、ヘアピンループ領域は、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応の間のその複製および他の望ましくない生成物の形成を防止するための複製不能なスペーサーを有する。図１０Ａは、この実施例で使用される３’および５’アダプターを示す。

この実施例では、オリゴヌクレオチド１によって表されるデオキシウリジン含有３’アダプター鎖は、ＵＳＥＲ酵素によって完全に分解され、その後、５’トランケーションされたヘアピンアダプターの３’アダプターの残りの一本鎖（オリゴヌクレオチド２）へのアニーリング、およびＴ３ＤＮＡリガーゼによるライゲーションが続いた。単一塩基Ｕオーバーハングを有する３’アダプターの場合、ライゲーションはヘアピンアダプターの１３ｂ一本鎖部分とＤＮＡ断片の５’末端の間で起こったが（図３Ｉ）、単一塩基Ｔオーバーハングを有する３’アダプターの場合、ライゲーションはヘアピンアダプターの１１ｂ一本鎖部分とＤＮＡ断片に共有結合しているオリゴヌクレオチド１のＣＴジヌクレオチド部分の間で起こった（図３Ｋ）。ライゲーション不能なｄｄＴまたはこの場合３’－ｄＴ塩基アナログを有する３’アダプターの使用は、単一塩基オーバーハングを有するアダプターの１本のＤＮＡ鎖だけへのライゲーションの低効率のために、平滑末端３’アダプターの場合ほど有益ではない（実施例４および５）（データは示さず）。さらに、９５～９８℃でのＵＳＥＲおよびＴ３ＤＮＡリガーゼの不活性化、ならびにホットスタート耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性化が同時発生し、その後、トランケーションされたインデキシングプライマーの存在下でＮＧＳＤＮＡライブラリーの以降のＰＣＲが続き、すべては単一管でのインキュベーションで生じた。

この実施例は、非常に広範囲のＤＮＡ投入量の中での汎用濃度の３’および５’アダプター、ならびにフェムトグラムレベルまで下げたＤＮＡ投入量でのアダプター二量体形成の欠如を使用してＮＧＳライブラリーを作成する、記載されたアプローチの能力を実証する。
材料

オリゴヌクレオチド配列（表１）

ＵＳＥＲ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓｃａｔ＃Ｍ５５０５Ｌ）

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、ｃａｔ＃Ｍ０２０２Ｌ）

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｐ７２２５０Ｌ）

断片化ＤＮＡは、ＮＧＳライブラリーを調製するために使用した。ライブラリー調製のために使用したＤＮＡの量は、２５０ｎｇから０．３ｆｇまで変化した。非常に低いＤＮＡ投入量による一部の実験では、ライブラリー調製の間のＤＮＡの損失を防止する担体として３．３ｐｇの一本鎖ＤＮＡを添加した。ポリシング反応は、各ｄＮＴＰの１００μＭ、０．１５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および１．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む３０μｌでアセンブルした。反応は、２０℃で２０分間インキュベートし、その後、６５℃で１０分間インキュベートした。３’アダプターライゲーション反応は、１×ＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液、２２０ピコモルの３’アダプターオリゴヌクレオチド２０－１４１または２０－１４６、１１０ピコモルの３’アダプターオリゴヌクレオチド２０－１４８、３０μｌのポリッシュされたＤＮＡおよび１２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む６０μｌでアセンブルした。反応は、２０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡは、４８μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８×）を使用して精製した。ＤＮＡは１８．５μｌのＤＮＡ再懸濁緩衝液に溶出させた。３’アダプターのｄＵ含有鎖の分解、トランケーションされたヘアピン５’アダプターオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびに調整したＤＮＡの増幅は、すべて単一密閉管反応の中で起こり、それは、１×ＨｉＦｉＰＣＲマスターミックス、１ピコモルのトランケーションされたヘアピン５’アダプターオリゴヌクレオチド２０－１４７または１９－３５１、６０ピコモルのトランケーションされたインデキシングプライマーｉ５オリゴヌクレオチド１７－２７７、６０ピコモルのトランケーションされたインデキシングプライマーｉ７オリゴヌクレオチド１４－１６１、１５００単位のＴ３ＤＮＡリガーゼ、１単位のＵＳＥＲおよび３’アダプターライゲーション反応の後に精製されたＤＮＡの１９μｌを含有した５０μｌの最終量でアセンブルされた。反応は、以下の設定プログラムによるサーモサイクラーに置いた：３７℃で２０分、続いて９８℃で２分、続いて（９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒）を７サイクル、続いて７２℃で１分、および４℃で保持。最終ライブラリーは、４２．５μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（比：０．８５×）を使用して精製した。ＤＮＡは２０μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液に溶出させ、蛍光定量的方法（高感度ＤＮＡＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーキット）およびｑＰＣＲによって調査し、所望のライブラリーサイズを確実にし、定量を確認した。定量化したライブラリーをプールし、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｎｉＳｅｑに加え、１５１塩基の対末端リードでシークエンシングをした。
結果

表４は、ＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーおよびｑＰＣＲを使用したライブラリー収量の定量調査によって得られた実験結果を概説する。表５および図１０Ａ～１０Ｅは、理論的根拠で概説される２つの別々のライブラリー調製条件で得られた配列測定基準を概説する。

単一塩基オーバーハングを含有する３’アダプターによる連続アダプターライゲーション化学およびライゲーションカップルドインデキシングＰＣＲを使用して合成されたＮＧＳライブラリーは、３’アダプターでＴかＵのどのタイプの末端３’塩基が利用されたかに関係なしに等しく優れた結果をもたらした。Ｔオーバーハングを有する３’アダプターおよび１１ｂオーバーハングを有するヘアピン５’アダプターを利用したライブラリープロトコール（図１０ＡのＮＧＳライブラリーＡ）は、より低い投入量試料（５０および１００ｎｇ）に対してわずかにより効率的であったが、Ｕオーバーハングを有する３’アダプターおよび１３ｂオーバーハングを有するヘアピン５’アダプターを利用したプロトコール（図１０ＡのＮＧＳライブラリーＢ）は、より高い投入量試料（２５０ｎｇ）に対してより効率的であった（表４）。両方法のシークエンシング測定基準はかなり優れており、非常に類似していた（表５）。図１０Ｂ～１０Ｃに示すピカードプロット（ＮＧＳライブラリーＡ）は、ＹアダプターによるＴ／Ａライゲーション化学によって調製されるＮＧＳライブラリーに一般的なＡＴ／ＧＣバイアスを実証する（データ示さず）。ＮＧＳライブラリーＢは、特に最も高いＤＮＡ投入量（２５０ｎｇ）に対してより強力なＡＴ／ＧＣバイアスを実証する（図１０Ｄ～１０Ｅ）。そのようなバイアスは、おそらくライゲーションカップルドＰＣＲ反応の間のＵＳＥＲ酵素による、ＧＣに富むＤＮＡ配列を有する接合部におけるｄＵ塩基の開裂効率の低減の結果である。３’アダプターが３’末端にＴ塩基を有するＮＧＳライブラリーＡの場合のように、ｄＵ塩基が３’アダプター配列の中に位置するとき、開裂は向上し、バイアスはより低くなる。

ＮＧＳライブラリー方法Ａを非常に低いＤＮＡ投入量に適用したとき、それは、サブフェムトグラム量までアダプター二量体の欠如を実証した。表６および図１１Ａ～１１Ｂは、方法ＡによってＤＮＡについて３ｐｇ～１００ｐｇのＤＮＡ投入量範囲で調製されたＮＧＳライブラリーのＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザートレースを示、一方、表７および図１１Ｃは、０．３ｆｇ～３ｐｇ範囲の極めて低いＤＮＡ試料で調製されたライブラリーを例示する。ＤＮＡのそのような低い量および多数のＰＣＲサイクル（３０）にもかかわらず、アダプター二量体は観察されなかった。図１１Ａ～１１Ｃに示すすべてのライブラリートレースは、同じアダプター濃度で調製されたＮＧＳライブラリーによって生成されたことを強調することが重要である。
結論

５’アダプターの結合およびライブラリー増幅が単一密閉管でのライゲーションカップルドＰＣＲ反応で起こり、３’アダプターがＴまたはＵ塩基の３’オーバーハングを有する、３’および５’アダプターの連続添加を含むアダプターライゲーション化学によるＮＧＳライブラリーは、いかなるアダプター濃度調整もなしで１つのユニバーサルプロトコールを使用して、高ＤＮＡおよび低ＤＮＡ試料のために効率的に使用することができる。ＮＧＳライブラリーは、ＤＮＡのトレース量を含有する試料から調製することができ、法医学適用、古代ＤＮＡ試料および細菌性ＤＮＡの単細胞シークエンシングのために潜在的に有益である。

（実施例７）
１６ＳＤＮＡアンプリコンパネルのためのフルサイズインデキシングプライマーおよびプライマーブロッカーによるライゲーションカップルＰＣＲ
理論的根拠
この実施例は、ライゲーションカップルドＰＣＲステップによるアンプリコンワークフローにおけるＰ７インデキシングプライマーにアニーリングされたプライマーブロッカーの有用性を実証する。様々なｉ７プライマーブロッカーを試験するために、２３個の１６Ｓプライマーを含有するアンプリコンパネルを使用した。標的特異的プライマーは、多重ＰＣＲの間ユニバーサルプライマー配列として、およびライゲーションカップルドＰＣＲの間Ｐ５アダプター配列の組込みのための分解可能なアダプター領域として使用される、トランケーションされたアダプターＰ７配列を含んだ。
材料

Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ（ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＥＤＬ９３３）

Ｑ５（登録商標）ｄＵバイパスハイフィデリティ２×マスターミックス（ＮＥＢ、ｃａｔ＃Ｍ０４９４）

２３個の標的特異的プライマーＰ１～Ｐ２３（表１）

トランケーションされたＰ７アダプター配列１４－８８２を含有するユニバーサルプライマー（表１）

完全長Ｐ７アダプター配列１８－４５３からなるインデキシングプライマー（表１）

完全長Ｐ５アダプター配列１８－４５２からなるインデキシングプライマー（表１）

Ｐ７アダプター１９－０４の３’末端に一部対応するブロッキングオリゴ（表１）

アダプター配列の末端領域に対応するプライマー（表１）

ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｂ２３３１８）

２０％ＰＥＧ－８０００／２．５ＭＮａＣｌ溶液

Ｔ３リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ｃａｔ＃Ｌ６０１０）

ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ、ｃａｔ＃Ｍ５５０５Ｂ）

Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡＨＳアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｑ３２８５１）
方法

Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡはＤＮＡ懸濁緩衝液に希釈した。標的選択のための第１の反応は、３０μｌで実行した。標的アンプリコンのために、フォワード標的特異的プライマーおよびリバース標的特異的プライマーは、５’末端にトランケーションされたＰ７アダプター配列を含有した。この反応は、１×Ｑ５ｄＵＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスターミックス、３０～９０ｎＭの様々な濃度で存在する２３個の標的特異的プライマーＰ１～Ｐ２３のミックス（表１）、１０μＭのオリゴ１４－８８２および１ｎｇのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡからなった。この反応ミックスで以下のサイクリングプログラムを実行した：９８℃で３０秒、その後９８℃で１０秒、６３℃で５分および６５℃で１分を４サイクル、続いて９８℃で１０秒、および６４℃で１分を１４サイクル。６５℃で１分の最後の仕上げステップは、標的特異的アンプリコンを生成する。標的特異的プライマーの除去を最大化し、緩衝液交換を促進するために、精製を実行した。精製は３０μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（１．０×比）で実行し、反応は１７．４μｌのＴＥに溶出させたが、ビーズから除去されなかった。標的特異的アンプリコンのアダプターライゲーションおよびＰＣＲ増幅を合わせた第２の反応。この反応は、ビーズを有する１７．４μｌの溶出された反応ミックス、１×ＨｉＦｉＰＣＲマスターミックス、アダプター（配列１８－２０４および１８－２０５）の末端配列に対応する４００ｎＭのプライマー、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、ＵＳＥＲおよびインデキシングプライマー（配列１８－４５２および１８－４５３）を含有した。ライブラリーは、第２のＰＣＲ反応で１μＭのＰ７ブロッキングオリゴ（配列１９－０４）有りおよび無しで調製した。標的特異的アンプリコンの増幅のために、この反応ミックスで以下のサイクリングプログラムを実行した：３７℃で２０分、続いて９８℃で３０秒、続いて９８℃で１０秒、６０℃で３０秒および６６℃で１分を８サイクル。反応は次に４２．５μＬの２０％ＰＥＧ－８０００／２．５ＭＮａＣｌ溶液（０．８５×比）で精製し、ＤＮＡは２０μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液に溶出させた。ライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡＨＳキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。
結果

ライブラリーは一貫した予想収量をもたらし、ブロッカーオリゴなしのライブラリーでは１７．６ｎｇ／μＬの平均収量（ｎ＝２）で、ブロッカーオリゴを含有するライブラリーでは２５．５ｎｇ／μＬの平均収量（ｎ＝２）であった。平均収量の差は、概ね４４．９％であった。
結論

標的特異的プライマーを通して導入されたトランケーションされたＰ７配列を使用して、標的化１６Ｓアンプリコンライブラリーが首尾よく作製された。標的特異的アンプリコンは、１ステップの密閉管ライゲーション増幅戦略を使用してインデックス化した。ブロッキングオリゴ有りおよび無しのアンプリコンライブラリーの間の収量の１．５倍の差は、その差が４倍であるＮＧＳＤＮＡライブラリー（実施例４）の場合より実質的に低い。この実施例は、ライゲーションカップルドＰＣＲ反応においてブロッキングオリゴヌクレオチド無しでアンプリコンライブラリーを効率的に作製し、増幅することができることを実証する。

オリゴヌクレオチド修飾のために使用した略記号:
/5Phos/5'ホスフェート基
/3SpC3/C3スペーサー、3'末端の、DNAポリメラーゼによる伸張またはDNAリガーゼによるライゲーションを防止する
/5SpC3/C3スペーサー、5'末端のライゲーションおよび分解を防止する
/iSpC3/内部C3スペーサー、DNAポリメラーゼによる連続複製を防止する
*3'末端の分解を防止するヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート結合

Claims

（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ、前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分、および前記第２の３’末端部分に対して５’に位置し、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の５’部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分および前記第１の５’部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの第２の３’末端部分および第１の５’部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の少なくとも前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列および第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
ステップ（ｉ）～（ｖｉ）が単一密閉管において実施される、請求項１に記載の方法。
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列が１３塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列が配列番号１２７（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣ－３’）の配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記第１の３’末端部分および前記第２の３’末端部分が、それぞれ配列番号１２６（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）の配列を含む、請求項８に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、ライゲーション温度より高い融解温度（Ｔ_ｍ）を有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、第１のアニーリング温度より低いＴ_ｍを有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分のＴ_ｍが、前記ライゲーション温度より少なくとも１℃高く、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分のＴ_ｍが、前記第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低い、請求項１１に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第１の３’末端部分が、前記第１のアニーリング温度より低い融解温度（Ｔ_ｍ）を有し、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第２の３’末端部分が、前記第１のアニーリング温度より低いＴ_ｍを有する、請求項１に記載の方法。
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記第２の共通ヌクレオチド配列が２０塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ_ｍ）より少なくとも１℃低い、請求項１に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度（Ｔ_ｍ）より低い、請求項１に記載の方法。
前記第３の鎖および第４の鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）が、前記第１の変性温度より低い、請求項１に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、請求項１に記載の方法。
前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、請求項１に記載の方法。
前記ライゲーション持続時間が約２０分である、請求項１に記載の方法。
前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、請求項１に記載の方法。
前記リガーゼがＴ３ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、請求項２４に記載の方法。
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、３’～５’エクソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、請求項２８に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）（ａ）における前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分の融解温度（Ｔ_ｍ）が、それぞれ、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々、ならびに第１の鎖および第２の鎖の前記第２の部分または前記第４の部分のＴ_ｍより高い、請求項１に記載の方法。
前記第１の変性温度、前記第２の変性温度および前記第３の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃である、請求項１に記載の方法。
前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間および前記第３の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、請求項１に記載の方法。
前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃である、請求項１に記載の方法。
前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間および前記第３のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、請求項１に記載の方法。
前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度および前記第３の伸長温度が、それぞれ独立して約６２℃から約７２℃である、請求項１に記載の方法。
前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間および前記第３の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、請求項１に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約２００ｎＭで前記第１の反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｉｉ）が、ブロッカーオリゴヌクレオチドを前記第１の反応混合物に添加することをさらに含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な５’部分を含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の融解温度（Ｔ_ｍ）が、前記ライゲーション温度より高く、前記第１のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より低い、請求項１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記Ｔ_ｍが、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々のＴ_ｍより高い、請求項４１に記載の方法。
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第１の鎖の前記第１の５’末端へのライゲーションおよび前記第２の鎖の前記第２の５’末端へのライゲーションを抑制するのに十分な量の前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが添加される、請求項４１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの量の１倍、１．５倍、２倍、４倍または６倍の量添加される、請求項４１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々にプレアニーリングされる、請求項４１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的であり、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、５’部分に対して３’に位置する第１のさらなる部分を含む、請求項４１に記載の方法。
前記第１のさらなる部分と５’部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度（Ｔ_ｍ）が、前記５’部分と前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度とほぼ同じ、またはそれより高い、請求項４６に記載の方法。
前記第１のさらなる部分と前記５’部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の前記Ｔ_ｍが、前記５’部分と前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度より少なくとも１℃高い、請求項４７に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記５’部分と前記第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含み、前記第２のさらなる部分が、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々に相補的でなく、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない、請求項４６～４８のいずれかに記載の方法。
前記第２のさらなる部分が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、請求項４９に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない配列を含む、請求項４１に記載の方法。
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々に相補的でない前記配列が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、請求項５１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
ポリメラーゼ伸長を阻害するための前記３’修飾が、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオチド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、またはポリＴ、ポリＡ、ポリＣおよびポリＧなどの、前記隣接するプライマー配列に相補的でないＤＮＡ配列であって、プルーフリーディングポリメラーゼ３’～５’エクソヌクレアーゼ活性が、前記隣接するプライマー配列に相補的でない前記ＤＮＡ配列を除去することを防止するためにヌクレアーゼ抵抗性結合をさらに含むＤＮＡ配列からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々との間の融解温度（Ｔ_ｍ）が、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間のＴ_ｍより低い、請求項４１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々との間の前記Ｔ_ｍが、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドと前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々との間のＴ_ｍより少なくとも５℃低い、請求項５５に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの前記５’部分が、配列番号１２７の配列を含む、請求項４１に記載の方法。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基、および前記第１のさらなる部分に対して３’に位置するヘアピン部分をさらに含み、前記ヘアピン部分が、第１のヘアピン配列および第２のヘアピン配列を含み、前記第１のヘアピン配列が、前記第２のヘアピン配列に対して５’に位置し、前記第１のヘアピン配列および前記第２のヘアピン配列が相補的であり、前記ヘアピン部分が、前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より高い融解温度を有する、請求項４６～５０のいずれかに記載の方法。
前記ヘアピン部分が、前記第１のヘアピン配列と前記第２のヘアピン配列との間に位置する第３のヘアピン配列をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
前記第３のヘアピン配列が、前記ヘアピン部分および前記第１のさらなる部分による安定なステムループ構造の形成を可能にするのに十分なループを形成する、請求項５９に記載の方法。
前記第３のヘアピン配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項６０に記載の方法。
前記ヘアピン部分の融解温度が、前記５’部分と前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々、前記さらなる部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々またはその両方との間の融解温度より高い、請求項５８に記載の方法。
前記第２の条件集合は、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ブロッカーオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、伸長ヘアピンブロッカーを生成するのにさらに十分である、請求項５８～６０のいずれかに記載の方法。
前記伸長ヘアピンブロッカーが、前記第２のアニーリング温度および前記第３のアニーリング温度より高い融解温度（Ｔ_ｍ）を有する、請求項６３に記載の方法。
前記伸長ヘアピンブロッカーが、安定した第２の構造を有する、請求項６３に記載の方法。
前記伸長ヘアピンブロッカーの融解温度（Ｔ_ｍ）が、前記５’部分および前記第１のさらなる部分から前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々までのＴ_ｍより高い、請求項６３に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、配列番号８７の配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、配列番号７８の配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記第５の鎖および第７の鎖または前記第６の鎖および前記第８の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第５の鎖および第６の鎖が、前記第５の鎖および第６の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第５の鎖および第７の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第６の鎖および第８の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖、第８の鎖、第２のリガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第５の鎖、第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記正規化ＮＧＳライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分および第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が、相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が、前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が、前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列をそれぞれ含み、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ前記第１の共通ヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、複数の５’アダプター、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的でない第２の３’末端部分を含み、前記第２の３’末端配列が、前記第２の共通ヌクレオチド配列に相補的であり、前記複数の５’アダプターの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第３の３’末端配列、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、前記第３の３’末端配列に対して５’に位置する第１の５’部分、前記第１の５’部分に対して５’に位置し、前記第１の５’部分に相補的である第２の５’部分、および前記第１の５’部分の５’末端に位置する前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーを含み、前記５’アダプターが、前記第１の５’部分を前記第２の５’部分にアニーリングすることによって形成されるヘアピンを形成することができること、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、１）前記第３の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、２）前記リガーゼが、前記複数の５’アダプターの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端および前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の５’アダプターの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の５’アダプターの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、
ａ）前記リガーゼを不活性化し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させ、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第２の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖、第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列のリバース相補体、および前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分のリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体を含む、第３の反応混合物を生成するのに十分な、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、
ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記第１の３’末端部分が、前記第５の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、前記第６の鎖の前記複数の５’アダプターの１つの前記第１の５’部分の前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の共通ヌクレオチド配列、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第４の反応混合物を生成するのに十分な、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすること、
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、
ａ）任意の二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第７の鎖の前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つが、前記第８の鎖の前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第７の鎖および第８の鎖の各々にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第７の鎖、前記第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を含む第５の反応混合物であって、前記第９の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第１０の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、前記第１の共通ヌクレオチド配列の前記リバース相補体、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖および第９の鎖が相補的であり、前記第８の鎖および第１０の鎖が相補的である第５の反応混合物を生成するのに十分な、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすること、および
（ｖｉｉ）前記第５の反応混合物を、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分、および前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第７の鎖、第９の鎖および第８の鎖および第１０の鎖を増幅させるのに十分な、第４の変性持続時間にわたる第４の変性温度、第４のアニーリング持続時間にわたる第４のアニーリング温度、および第４の伸長持続時間にわたる第４の伸長温度を含む第５の条件集合下でインキュベートすること
を含む、ライゲーションカップルドＰＣＲの方法。
ステップ（ｉ）～（ｖｉｉ）が単一密閉管において実施される、請求項７２に記載の方法。
前記第１の５’部分および前記第２の５’部分が、それぞれ約１２塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記複数の５’アダプターの各々が、前記第１の５’部分と前記第２の５’部分の間に介在配列をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
前記介在配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項７５に記載の方法。
前記複製ブロッカーが、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
前記複数の５’アダプターの各々が、約２５塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、約２４塩基から約６０００塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
それぞれ前記第１の鎖および前記第２の鎖の前記第１の部分および前記第３の部分が、それぞれ約２０塩基から約６０００塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ約４塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約５０塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、１３塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列が、配列番号１２７の配列を含む、請求項７２に記載の方法。
前記複数の５’アダプターの各々の前記第３の３’末端部分が、配列番号１２６の配列を含む、請求項８４に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有し、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分が、前記ライゲーション温度より高い融解温度を有する、請求項７２に記載の方法。
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々の前記第２の３’末端部分および前記第２の共通ヌクレオチド配列が、前記第１のアニーリング温度より高い融解温度を有する、請求項７２に記載の方法。
前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分の融解温度が、前記ライゲーション温度より少なくとも１℃高く、前記第１の共通ヌクレオチド配列および前記第３の３’末端部分の前記融解温度が、前記第１のアニーリング温度より少なくとも１℃低い、請求項７２に記載の方法。
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、約１塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項７２に記載の方法。
前記第２の共通ヌクレオチド配列が、配列番号９５の配列を含む、請求項７２に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の融解温度より低い、請求項７２に記載の方法。
前記第３および第４の鎖の融解温度が、前記第１の変性温度より低い、請求項７２に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、請求項７２に記載の方法。
前記ライゲーション持続時間が、約５分から約６０分である、請求項７２に記載の方法。
前記ライゲーション持続時間が約２０分である、請求項７２に記載の方法。
前記リガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、請求項７２に記載の方法。
前記リガーゼがＴ３ＤＮＡリガーゼである、請求項７２に記載の方法。
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、請求項９９に記載の方法。
前記リガーゼが温度感受性であり、前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、請求項７２に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、請求項７２に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、請求項１０３に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＨｏｔＳｔａｒｔＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、前記第１の変性持続時間にわたる前記第１の変性温度が、前記ホットスタートポリメラーゼを活性化させるのに十分である、請求項７２に記載の方法。
前記第１の変性温度、前記第２の変性温度、前記第３の変性温度および前記第４の変性温度が、それぞれ独立して約９５℃から約９８℃である、請求項７２に記載の方法。
前記第１の変性持続時間、前記第２の変性持続時間、前記第３の変性持続時間および前記第４の変性持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約２分である、請求項７２に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約１μＭで前記第１の反応混合物に添加される、請求項７２に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーおよび前記複数の第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立して約１００ｎＭから約２００ｎＭで前記第１の反応混合物に添加される、請求項７２に記載の方法。
前記第１のアニーリング温度、前記第２のアニーリング温度、前記第３のアニーリング温度および前記第４のアニーリング温度が、それぞれ独立して約５５℃から約６５℃である、請求項７２に記載の方法。
前記第１のアニーリング持続時間、前記第２のアニーリング持続時間、前記第３のアニーリング持続時間および前記第４のアニーリング持続時間が、それぞれ独立して約１０秒から約６０秒である、請求項７２に記載の方法。
前記第１の伸長温度、前記第２の伸長温度、前記第３の伸長温度および前記第４の伸長温度が、それぞれ独立して約６０℃から約７２℃である、請求項７２に記載の方法。
前記第１の伸長持続時間、前記第２の伸長持続時間、前記第３の伸長持続時間および前記第４の伸長持続時間が、それぞれ独立して約３０秒から約５分である、請求項７２に記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、配列番号８７の配列をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、配列番号７８の配列をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
前記第７の鎖および第９の鎖または前記第８の鎖および前記第１０の鎖をシークエンシングすることをさらに含む、請求項７２～１１６のいずれかに記載の方法。
前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、第１の５’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、第２の５’末端部分をさらに含み、前記第１の５’末端部分および前記第２の５’末端部分の各々が、５’から３’方向に、２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む第１の配列および３つまたはそれより多いリボヌクレオチドを含む第２の配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有し、前記第７の鎖および第８の鎖が、前記第７の鎖および第８の鎖の５’末端に前記第１の５’末端部分をさらに含み、前記第９の鎖および第１０の鎖が、前記第９の鎖および第１０の鎖の５’末端に前記第２の５’末端部分をさらに含み、前記第７の鎖および第９の鎖が、第１の５’オーバーハングおよび第２の５’オーバーハングを有する第１の二本鎖生成物を形成することができ、前記第８の鎖および第１０の鎖が、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングを有する第２の二本鎖生成物を形成することができ、前記方法が、
標的モル量の前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を生成するのに十分な量の、前記第１の５’オーバーハング、第２の５’オーバーハング、第３の５’オーバーハングおよび第４の５’オーバーハングの各々に相補的なプローブ、ならびに第２のリガーゼを添加することであって、前記標的モル量より多い量の前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖が存在し、前記プローブが、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むこと、
前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖、第１０の鎖、リガーゼおよびプローブを、前記プローブが、前記標的モル量の第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖にライゲーションして、事前正規化反応混合物を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記事前正規化反応混合物に添加すること、および
前記事前正規化反応混合物およびエクソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、前記プローブにライゲーションしていない前記第７の鎖、第８の鎖、第９の鎖および第１０の鎖を消化して、正規化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項７２～１１７のいずれかに記載の方法。
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、前記第１の開始鎖の５’末端にユニバーサルプライマー配列を含み、前記ユニバーサルプライマー配列が、前記ユニバーサルプライマー配列の内部またはその３’末端にｄＵ塩基を含み、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、前記第２の開始鎖の５’末端に前記ユニバーサルプライマー配列を含むこと、
前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記ｄＵ塩基および開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を開裂することが可能な前記酵素を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、請求項１１９に記載の方法。
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能配列を含み、前記第１の５’開裂可能配列が、前記第１の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含み、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能配列を含み、前記第２の５’開裂可能配列が、前記第２の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にリボヌクレオチドを含むこと、
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列のリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素ならびに前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、請求項１２１に記載の方法。
第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することであって、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第１の開始鎖が、第１の５’開裂可能配列を含み、前記第１の５’開裂可能配列が、前記第１の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含み、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記第２の開始鎖が、第２の５’開裂可能配列を含み、前記第２の５’開裂可能配列が、前記第２の５’開裂可能配列の内部またはその３’末端にイノシン塩基を含むこと、
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加すること、および
前記第１の５’開裂可能配列および前記第２の５’開裂可能配列の前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素ならびに前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をステップ（ｉ）の前にさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、請求項１２３に記載の方法。
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、ｄＵ塩基および３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の鎖および第２の鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、請求項１２５に記載の方法。
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、リボヌクレオチドおよび３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
リボヌクレオチドを含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の開始鎖および第２の開始鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１の開始鎖および第２の開始鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、請求項１２７に記載の方法。
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復を実施して、第１の鎖および第２の鎖を含む平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の鎖および前記第２の鎖の各々が５’末端および３’末端を含むこと、
各３’アダプター鎖が、イノシン塩基および３’ブロッキング基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
イノシン塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記平滑末端化二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを前記平滑末端化開始ＤＮＡ基質分子の第１の鎖および第２の鎖の各３’末端にライゲーションし、各相補鎖と前記第１および第２の鎖の各５’末端との間に切れ目を残して、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
前記ライゲーションされた二本鎖基質分子の前記イノシン塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションＰＣＲ反応混合物に添加すること、および
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、請求項１２９に記載の方法。
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が、５’末端および３’末端を含み、前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと、
各３’アダプター鎖が、３’末端ｄＵ塩基および３’ヒドロキシル基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
３’末端ｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、前記相補鎖の１つを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、請求項１３１に記載の方法。
前記相補鎖が、相補鎖の内部にさらなるｄＵ塩基を含む、請求項１３１に記載の方法。
断片化ＤＮＡ基質分子を提供すること、
末端修復および断片化ＤＮＡ基質分子のＡテーリングを実施して、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を生成することであって、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の各々が、５’末端および３’末端を含み、前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子が、各３’末端に単一Ａ塩基オーバーハングを含むこと、
各３’アダプター鎖が、３’末端Ｔ塩基、３’ヒドロキシル基およびｄＵ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた、５’ホスフェートを含む複数の３’アダプター鎖、ならびにリガーゼを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子に添加すること、
３’末端Ｔ塩基を含む相補鎖にアニーリングされた前記複数の３’アダプター鎖、前記リガーゼおよび前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子を、前記複数の３’アダプター鎖の１つを各単一Ａ塩基オーバーハングにライゲーションし、前記相補鎖の１つを前記単一Ａテールド二本鎖開始ＤＮＡ基質分子の各５’末端にライゲーションして、ライゲーションされた二本鎖基質分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること、
必要に応じて前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を精製すること、
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を、前記ライゲーションされた二本鎖基質分子に添加すること、および
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素および前記ライゲーションされた二本鎖基質分子を、前記相補鎖を開裂して、ステップ（ｉ）の前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を生成するのに十分な条件下でインキュベートすること
をさらに含む、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシレートとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、請求項１３４に記載の方法。
標的ＤＮＡを断片化して、前記断片化ＤＮＡ基質分子を生成することをさらに含む、請求項１２５～１３５のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉ）～（ｖｉ）または（ｉ）～（ｖｉｉ）の間に精製が実施されない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、前記第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、前記第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと、
（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第１のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、前記第１のプライマーが、前記第２の鎖の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分を含み、前記第１の３’ブロッキング基がポリメラーゼ連鎖伸長の能力がなく、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有すること、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、前記第１のプライマー、前記二本鎖ＤＮＡ基質、および前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、および
（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸長持続時間にわたる伸長温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを前記第２の反応混合物に施して、前記第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、前記第１のプライマーを前記二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む前記二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成すること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを前記第３の反応混合物に施して、前記二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より低い、請求項１３８に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、請求項１３８に記載の方法。
前記リガーゼが低マグネシウムＰＣＲ緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、請求項１３８に記載の方法。
前記リガーゼがＴ３ＤＮＡリガーゼである、請求項１３８に記載の方法。
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、請求項１４３に記載の方法。
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、請求項１３８に記載の方法。
ステップ（ｉｉ）が、第４のオリゴヌクレオチドおよび第５のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、前記第５のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がない第２の３’ブロッキング基を含み、前記第５のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、および前記第４のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分をさらに含み、前記第１の条件集合は、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドが前記第５のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記リガーゼが、前記第４のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、前記第４のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のオリゴヌクレオチドを含む前記第２のプライマーを生成するのにさらに十分である、請求項１３８に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、請求項１４６に記載の方法。
前記第２の３’ブロッキング基が、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、請求項１４６に記載の方法。
前記第４のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、請求項１４６に記載の方法。
前記第５のオリゴヌクレオチドが、約１０から約５０塩基の長さを有する、請求項１４６に記載の方法。
前記第５のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低い、請求項１４６に記載の方法。
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が同じ管で実施される、請求項１３８～１５１のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に精製が実施されない、請求項１３８～１５１のいずれかに記載の方法。
前記第１のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、請求項１３８～１５３のいずれかに記載の方法。
前記第２のオリゴヌクレオチドが、約５から約１００塩基の長さを有する、請求項１３８～１５４のいずれかに記載の方法。
前記第３のオリゴヌクレオチドが、約１０から約５０塩基の長さを有する、請求項１３８～１５５のいずれかに記載の方法。
前記第１の３’ブロッキング基が、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、請求項１３８～１５６のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、請求項１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性温度を上昇させる、請求項１５９に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項１６０に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるのに十分である、請求項１３８～１５７のいずれかに記載の方法。
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、請求項１３８～１６２のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性温度が、独立して、約９５℃から約９８℃である、請求項１３８～１６３のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記アニーリング温度が、独立して、約５５℃から約６５℃である、請求項１３８～１６４のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記伸長温度が、独立して、約６２℃から約７２℃である、請求項１３８～１６５のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性持続時間が、独立して、約３０秒から約２分である、請求項１３８～１６６のいずれかに記載の方法。
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ基質を提供することであって、前記第１の鎖が、第１の３’末端部分および第１の５’末端部分を含み、前記第２の鎖が、第２の３’末端部分および第２の５’末端部分を含むこと、
（ｉｉ）リガーゼ、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、第３のオリゴヌクレオチド、第４のオリゴヌクレオチド、第５のオリゴヌクレオチド、第６のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記二本鎖ＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖の前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第３の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１の３’ブロッキング基を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分を有し、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分を有し、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖の前記第２の３’末端部分の少なくとも一部分に相補的な第４の３’末端部分、および５’ホスフェートを含み、前記第６のオリゴヌクレオチドが、前記第４のオリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な５’部分、前記第５のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および第２の３’ブロッキング基を含み、前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がないこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第３のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドが、３’－５’方向に前記第６のオリゴヌクレオチドにアニーリングして、前記第５のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第４のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー、前記二本鎖ＤＮＡ基質、および前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた前記第１のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む第２の反応混合物を生成するのに十分な、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすること、
（ｉｖ）各サイクルが、独立して、変性持続時間にわたる変性温度、アニーリング持続時間にわたるアニーリング温度、および伸長持続時間にわたる伸長温度を含む少なくとも３回のＰＣＲサイクルを前記第２の反応混合物に施して、前記第２のプライマーを二本鎖ライブラリー分子の第１の５’末端に含み、前記第１のプライマーを前記二本鎖ライブラリー分子の第２の５’末端に含む前記二本鎖ライブラリー分子を含む第３の反応混合物を生成すること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
（ｖ）さらなるＰＣＲサイクルを前記第３の反応混合物に施して、前記二本鎖ライブラリー分子を増幅させることをさらに含む、請求項１６８に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より低い、請求項１６８に記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低く、前記ライゲーション温度が、前記第５のオリゴヌクレオチドおよび第６のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、請求項１６８に記載の方法。
前記リガーゼが、低マグネシウムＰＣＲ緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、請求項１６８に記載の方法。
前記リガーゼがＴ３ＤＮＡリガーゼである、請求項１６８に記載の方法。
前記リガーゼが、前記第１の反応混合物５０μＬ当たり約３０から約３００の酵素単位で添加される、請求項１７３に記載の方法。
前記リガーゼが温度感受性であり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記リガーゼを不活性化させるのに十分である、請求項１６８に記載の方法。
前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、それぞれ独立して、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基から選択される、請求項１６８～１７５のいずれかに記載の方法。
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第３のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低く、前記第４のオリゴヌクレオチドおよび前記第５のオリゴヌクレオチドおよび前記第６のオリゴヌクレオチドの融解温度が、前記アニーリング温度および前記伸長温度より低い、請求項１６８～１７６のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が同じ管で実施される、請求項１６８～１７７のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に精製が実施されない、請求項１６８～１７７のいずれかに記載の方法。
前記第１のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１３８～１７９のいずれかに記載の方法。
前記第２のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１３８～１８０のいずれかに記載の方法。
前記第３のオリゴヌクレオチドが、約１０塩基から約５０塩基の長さを有する、請求項１３８～１８１のいずれかに記載の方法。
前記第４のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１３８～１８２のいずれかに記載の方法。
前記第５のオリゴヌクレオチドが、約５塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項１３８～１８３のいずれかに記載の方法。
前記第６のオリゴヌクレオチドが、約１０塩基から約５０塩基の長さを有する、請求項１３８～１４１のいずれかに記載の方法。
前記第１の３’ブロッキング基および前記第２の３’ブロッキング基が、それぞれ独立して、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチル塩基からなる群から選択される、請求項１３８～１８５のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ライゲーション温度で活性でない、請求項１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、請求項１８８に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項１８９に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼがホットスタートポリメラーゼであり、ステップ（ｉｖ）における前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの最初のサイクル時の変性温度が、前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させるのに十分である、請求項１３８～１８６のいずれかに記載の方法。
前記ライゲーション温度が、約２５℃から約４０℃である、請求項１３８～１９１のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記変性温度が、独立して、約９５℃から約９８℃である、請求項１３８～１９２のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の前記アニーリング温度が、独立して、約５５℃から約６５℃である、請求項１３８～１９３のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の伸長温度が、独立して、約６２℃から約７２℃である、請求項１３８～１９４のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクル時の変性持続時間が、独立して、約３０秒から約２分である、請求項１３８～１９５のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの前記最初のサイクル時の変性温度が、前記二本鎖ＤＮＡ基質の融解温度より高い、請求項１３８～１９６のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｉｉ）が、第７のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’ホスフェートをさらに含み、前記第８のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖伸長の能力がない第３の３’ブロッキング基を含み、前記第８のオリゴヌクレオチドが、前記第７のオリゴヌクレオチドの３’部分に相補的な３’部分、および前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分をさらに含み、前記第１の条件集合は、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第８のオリゴヌクレオチドにアニーリングし、前記リガーゼが、前記第７のオリゴヌクレオチドを前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることにより、５’から３’方向に、前記第７のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のオリゴヌクレオチドを含む前記第２のプライマーを生成するのにさらに十分である、請求項１３８～１９７のいずれかに記載の方法。
前記ライゲーション温度が、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドの融解温度より低い、請求項１９８に記載の方法。
前記少なくとも３回のＰＣＲサイクルの少なくとも前記最初のサイクル時の前記アニーリング温度および前記伸長温度が、前記第７のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドおよび第８のオリゴヌクレオチドの前記融解温度より高い、請求項１９８～１９９のいずれかに記載の方法。
３’末端部分を含む第１のインデキシングプライマーと、
前記３’末端部分を含む第２のインデキシングプライマーと、
第１のリガーゼと、
第１のＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
前記３’末端部分に少なくとも部分的に相補的である５’部分を含むブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２０１に記載のキット。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーにプレアニーリングされている、請求項２０２に記載のキット。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデキシングプライマーに相補的であり、前記第１のインデキシングプライマーに相補的でない前記５’部分の第１のさらなる部分３’を含む、請求項２０２～２０３のいずれかに記載のキット。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、３’ヒドロキシル基、および前記第１のさらなる部分に対して３’に位置するヘアピン部分をさらに含み、前記ヘアピン部分が、第２のヘアピン配列の５’に位置する第１のヘアピン配列を含み、前記第１のヘアピン配列および前記第２のヘアピン配列が相補的であり、ヘアピンを形成することができる、請求項２０４に記載のキット。
前記ヘアピン部分が、前記第１のヘアピン配列と前記第２のヘアピン配列の間に第３のヘアピン配列をさらに含む、請求項２０５に記載のキット。
前記第３のヘアピン配列が、前記第１および第２のヘアピン配列と安定なステムループ構造を形成することを可能にするのに十分なループを形成する、請求項２０６に記載のキット。
前記第３のヘアピン配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項２０６に記載のキット。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記５’部分と前記第１のさらなる部分との間に位置する第２のさらなる部分をさらに含み、前記第２のさらなる部分が、前記第１のインデキシングプライマーに相補的でなく、前記第２のさらなる部分が、前記第２のインデキシングプライマーに相補的でない、請求項２０２～２０４のいずれかに記載のキット。
前記第２のさらなる部分が、約１塩基から約３０塩基の長さを有する、請求項２０８に記載のキット。
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾をさらに含む、請求項２０２～２０４および２０９～２１１のいずれかに記載のキット。
ポリメラーゼ伸長を阻害するための３’修飾が、Ｃ３炭素スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、ホスフェート、２’，３’－ジデオキシヌクレオシドｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ、３’－デオキシヌクレオシド３’－Ａ、３’－Ｔ、３’－Ｃおよび３’－Ｇ、ｒＵなどのＲＮＡヌクレオシド、３－Ｏ－メチルヌクレオチド、ならびに前記第２のインデキシングプライマーに相補的でないＤＮＡ配列からなる群から選択される、請求項２１１に記載のキット。
前記第１のインデキシングプライマーおよび前記第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立に、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項２０１～２１２のいずれかに記載のキット。
第１の３’末端部分を含む第１のインデキシングプライマーと、
前記第２の３’末端部分を含む第２のインデキシングプライマーと、
第３の３’末端部分を含む５’アダプターと、
第１のリガーゼと、
第１のＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
前記５’アダプターが、前記第１のインデキシングプライマーの前記第１の３’末端部分の少なくとも一部分を含む、前記第３の３’末端部分に対して５’に位置する第１の５’部分、前記第１の５’部分に対して５’に位置し、前記第１の５’部分に相補的な第２の５’部分、および前記第１の５’部分の５’末端に位置する前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害することが可能な複製ブロッカーをさらに含む、請求項２１４に記載のキット。
前記第１の５’部分および前記第２の５’部分が、それぞれ約１２塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項２１５に記載のキット。
前記５’アダプターが、前記第１の５’部分と前記第２の５’部分の間に介在配列をさらに含む、請求項２１４～２１６のいずれかに記載のキット。
前記介在配列が、約４塩基から約２０塩基の長さを有する、請求項２１７に記載のキット。
前記複製ブロッカーが、安定な脱塩基部位、Ｃ３スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、３つまたはそれより多いｒＵ塩基、および２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基からなる群から選択される、請求項２１４～２１８のいずれかに記載のキット。
前記５’アダプターが、約２５塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項２１４～２１９のいずれかに記載のキット。
前記第１の５’部分および第２の５’部分が、ヘアピンを形成することができる、請求項２１４～２２０のいずれかに記載のキット。
前記第１のリガーゼが、低マグネシウム緩衝液中でのライゲーションが可能な熱不安定性リガーゼである、請求項２０１～２２１のいずれかに記載のキット。
前記第１のリガーゼがＴ３ＤＮＡリガーゼである、請求項２２２に記載のキット。
前記第１のインデキシングプライマーが、配列番号１の配列を含む５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２０１～２２３のいずれかに記載のキット。
前記第２のインデキシングプライマーが、前記５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２０１～２２４のいずれかに記載のキット。
前記第１のインデキシングプライマーが、３つまたはそれより多いリボヌクレオチド塩基の５’側の２つまたはそれより多いデオキシヌクレオチドを含む５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２０１～２２５のいずれかに記載のキット。
前記第２のインデキシングプライマーが、前記５’テール配列をさらに含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２２６に記載のキット。
前記５’テール配列に相補的であり、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する抵抗性を得るための修飾を含むプローブオリゴヌクレオチド、３’エクソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素、および第２のリガーゼをさらに含む、請求項２２４～２２７のいずれかに記載のキット。
エクソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素がエクソヌクレアーゼＩＩＩである、請求項２２８に記載のキット。
標的特異的プライマー対をさらに含む、請求項２０１～２２９のいずれかに記載のキット。
複数の標的特異的プライマー対をさらに含む、請求項２０１～２２９のいずれかに記載のキット。
ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含むユニバーサルプライマーをさらに含む、請求項２０１～２３１のいずれかに記載のキット。
第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２３０～２３２のいずれかに記載のキット。
ｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含む、請求項２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
ｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、請求項２３４に記載のキット。
リボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素をさらに含む、請求項２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
リボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、請求項２３６に記載のキット。
イノシン塩基を開裂することが可能な酵素をさらに含む、請求項２０１～２３３のいずれかに記載のキット。
イノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶある、請求項２３８に記載のキット。
前記第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼが、それぞれ独立して、ＫａｐａＨｉＦｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項２０１～２３９のいずれかに記載のキット。
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタート抗体またはアプタマーをさらに含み、前記ホットスタート抗体またはアプタマーが、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性化温度を上昇させる、請求項２０１～２４０のいずれかに記載のキット。
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＥＢＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）およびＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）からなる群から選択される、請求項２４１に記載のキット。
前記第１のインデキシングプライマーおよび前記第２のインデキシングプライマーが、それぞれ独立に、約２０塩基から約１００塩基の長さを有する、請求項２１５～２４２のいずれかに記載のキット。
（ｉ）第１の鎖および第２の鎖を含む部分的に二本鎖のＤＮＡ基質を提供することであって、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質が、第１の３’オーバーハング、二本鎖部分および第２の３’オーバーハングを含み、
前記第１の鎖が、５’から３’方向に、第１の５’末端、第１の部分および第２の部分を含み、
前記第２の鎖が、５’から３’方向に、第２の５’末端、第３の部分、および前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質の第４の部分を含み、
前記第１の鎖の前記第１の部分および前記第２の鎖の前記第３の部分が相補的であり、前記二本鎖部分を形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分が、前記第１の３’オーバーハングを形成し、
前記第２の鎖の前記第４の部分が、前記第２の３’オーバーハングを形成し、
前記第１の鎖の前記第２の部分および前記第２の鎖の前記第４の部分が、それぞれ前記第１の３’オーバーハングおよび前記第２の３’オーバーハングの５’末端に位置する第１の共通ヌクレオチド配列を含むこと、
（ｉｉ）複数の第１のインデキシングプライマー、複数の第２のインデキシングプライマー、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を前記部分的に二本鎖のＤＮＡ基質に添加して、第１の反応混合物を生成することであって、前記複数の第１のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第１の３’末端部分を含み、前記複数の第２のインデキシングプライマーの各々が、前記第１の共通ヌクレオチド配列に相補的な第２の３’末端部分を含むこと、
（ｉｉｉ）前記第１の反応混合物を、ライゲーション持続時間にわたるライゲーション温度を含む第１の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第１の条件集合は、
ａ）前記第１の３’末端部分が、前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｂ）前記リガーゼが、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第１の鎖の前記第１の５’末端に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つを前記第２の鎖の前記第２の５’末端にライゲーションして、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分および前記第２の部分を含む第３の鎖と、
５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分および前記第４の部分を含む第４の鎖と
を含む第２の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｉｖ）前記第２の反応混合物を、第１の変性持続時間にわたる第１の変性温度、第１のアニーリング持続時間にわたる第１のアニーリング温度、および第１の伸長持続時間にわたる第１の伸長温度を含む第２の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第２の条件集合は、
ａ）前記リガーゼを不活性化させ、二本鎖ＤＮＡを変性させ、必要に応じて前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化させ、
ｂ）前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記第２の３’末端部分が、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第３の鎖の前記第２の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させ、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第４の鎖の前記第４の部分の前記第１の共通ヌクレオチド配列にアニーリングされた前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つを伸長させて、前記第３の鎖、前記第４の鎖、第５の鎖および第６の鎖を含む第３の反応混合物であって、前記第５の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第６の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含む第３の反応混合物を生成するのに十分であること、
（ｖ）前記第３の反応混合物を、第２の変性持続時間にわたる第２の変性温度、第２のアニーリング持続時間にわたる第２のアニーリング温度、および第２の伸長持続時間にわたる第２の伸長温度を含む第３の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第３の条件集合は、
ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させ、
ｂ）前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つが、前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングし、
ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記第５の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つ、および前記第６の鎖の前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つの前記リバース相補体にアニーリングされた前記複数の第１のインデキシングプライマーの前記１つを伸長させて、前記第５の鎖、前記第６の鎖、第７の鎖および第８の鎖を含む第４の反応混合物であって、前記第７の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第１の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つのリバース相補体を含み、前記第８の鎖が、５’から３’方向に、前記複数の第１のインデキシングプライマーの１つ、前記第３の部分、および前記複数の第２のインデキシングプライマーの１つの前記リバース相補体を含み、前記第７の鎖が前記第５の鎖に相補的であり、前記第８の鎖が前記第６の鎖に相補的である第４の反応混合物を生成するのに十分であること、および
（ｖｉ）前記第４の反応混合物を、第３の変性持続時間にわたる第３の変性温度、第３のアニーリング持続時間にわたる第３のアニーリング温度、および第３の伸長持続時間にわたる第３の伸長温度を含む第４の条件集合下でインキュベートすることであって、前記第４の条件集合は、前記複数の第１のインデキシングプライマーの少なくとも一部分および前記複数の第２のインデキシングプライマーの少なくとも一部分が、前記第５の鎖および第７の鎖ならびに前記第６の鎖および第８の鎖を増幅させるのに十分であること
を含む、ライゲーションカップルドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのｄＵ塩基を含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１つのｄＵ塩基を開裂することが可能な前記酵素が、ＵＤＧとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組合せである、請求項２４５に記載の方法。
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのリボヌクレオチドをそれぞれ含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１つのリボヌクレオチドを開裂することが可能な前記酵素がＲＮアーゼＨである、請求項２４７に記載の方法。
ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉｉ）時に実施され、第１の開始鎖および第２の開始鎖を含む開始二本鎖ＤＮＡ基質分子を提供することをステップ（ｉｉ）の前にさらに含み、前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖が、それぞれ前記第１の開始鎖および前記第２の開始鎖の５’末端の内部に少なくとも１つのイノシン塩基をそれぞれ含み、ステップ（ｉｉ）が、前記二本鎖ＤＮＡ基質分子の前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な酵素を添加することをさらに含み、ステップ（ｉｖ）における前記第２の条件集合は、前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素を不活性化させるのにさらに十分であり、ステップ（ｉｉｉ）の中間体が、後にステップ（ｉｉｉ）に従ってライゲーションすることができる部分的に二本鎖のＤＮＡ基質である、請求項１～１１８のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１つのイノシン塩基を開裂することが可能な前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、請求項２４９に記載の方法。
前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子が、前記開始二本鎖ＤＮＡ基質分子の３’オーバーハングにアニーリングされた相補鎖を含む、請求項２４５～２５０のいずれかに記載の方法。
前記相補鎖が、ｄＵ塩基、リボヌクレオチドまたはイノシン塩基を含む、請求項２５２に記載の方法。