ES2955957T3 - Polinucleótidos de ADN/ARN híbridos CRISPR y procedimientos de uso - Google Patents
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Abstract
La presente divulgación proporciona sistemas CRISPR guiados por ADN; polinucleótidos que comprenden ADN, ARN y mezclas de los mismos para uso con sistemas CRISPR; y métodos de uso que involucran dichos polinucleótidos y sistemas CRISPR guiados por ADN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Polinucleótidos de ADN/ARN híbridos CRISPR y procedimientos de uso
Antecedentes
Los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y asociados a CRISPR (Cas)son sistemas inmunes procarióticos descubiertos por primera vez por Ishino en E. coli. Ishino et al. 1987 (Journal of Bacteriology 169 (12): 5429-5433(1987)). Este sistema inmune proporciona inmunidad contra virus y plásmidos al dirigirse a los ácidos nucleicos de los virus y plásmidos de forma específica para cada secuencia.
Este sistema inmune consta de dos etapas principales: la primera es la adquisición y la segunda es la interferencia. La primera etapa consiste en cortar el genoma de los virus y plásmidos invasores e integrar segmentos del mismo en el locus CRISPR del organismo. Los segmentos que se integran en el genoma se conocen como protoespaciadores y ayudan a proteger al organismo de posteriores ataques del mismo virus o plásmido. La segunda fase consiste en atacar a un virus o plásmido invasor. Esta etapa se basa en la transcripción de los protoespaciadores a ARN, que, tras procesarse, se hibrida con una secuencia complementaria en el ADN de un virus o plásmido invasor, al tiempo que se asocia con una proteína o complejo proteico que corta eficazmente el ADN.
Existen varios sistemas CRISPR/Cas diferentes y la nomenclatura y clasificación de los mismos ha cambiado a medida que los sistemas se caracterizan más. En los sistemas de tipo II hay dos cadenas de ARN, un ARN CRISPR (ARNcr) y un ARN CRISPR transactivador (ARNtracr) que forman parte del sistema CRISPR/Cas. El ARNtracr se hibrida con una región complementaria del pre-ARNcr provocando la maduración del pre-ARNcr a ARNcr. El dúplex formado por el ARNtracr y el ARNcr es reconocido por una proteína, Cas9, y se asocia a ella, que es dirigida a un ácido nucleico objetivo por una secuencia del ARNcr que es complementaria a una secuencia del ácido nucleico objetivo e hibrida con ella. Se ha demostrado que estos componentes mínimos del sistema inmune basado en el ARN podrían reprogramarse para dirigirse al ADN de forma específica mediante el uso de una única proteína y dos secuencias guía de ARN o una única molécula de ARN. El sistema CRISPR/Cas es superior a otros procedimientos de edición del genoma que utilizan endonucleasas, meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc y nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), que pueden requerir la modificación de novo de proteínas para cada nuevo locus objetivo.
Los documentos WO2014/144761 y WO2015/026885 divulgan polinucleótidos Cas9 de guía única que comprenden monómeros de ADN en la región de orientación o activadora. Zetsche et al. describieron el descubrimiento de la nucleasa Cpf1, una endonucleasa CRISPR-Cas de clase 2 guiada por un único ARN (Cell, 163(3): 759-771 (2015)).
Al ser un sistema guiado por ARN, los sistemas CRISPR/Cas pueden ser propensos a problemas con las estructuras híbridas ARN-ADN, tal como la degradación por RNasa A de la cadena de ARN y la mayor posibilidad de desajustes ARN-ADN. Además, la síntesis de oligonucleótidos de ADN es más económica y robusta que la de oligonucleótidos de ARN. Los sistemas CRISPR guiados por ADN también pueden reclutar maquinaria adicional para un objetivo específico, en comparación con los sistemas CRISPR guiados por ARN naturales. Existe la necesidad de un sistema mejorado que supere los problemas asociados a los sistemas CRISPR/Cas basados en ARN, proporcione acceso al menor coste y mayor robustez de la síntesis de ADN, y mejore la especificidad del sistema CRISPR/Cas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un polinucleótido único para su uso con un sistema CRISPR de Clase 2 que comprende: una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN); y una región activadora adyacente a dicha región de orientación que comprende ADN, en donde dicha región activadora comprende una estructura de bucle de tallo, y es capaz de interactuar con Cpf1. En algunas realizaciones, la región de orientación comprende una mezcla de ADN y ARN; y la región activadora comprende una mezcla de ADN y ARN.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un sistema CRISPR de Clase 2 que comprende: un polinucleótido único como se ha descrito anteriormente y Cpf1. En algunas realizaciones, el sistema CRISPR de Clase 2 comprende además un polinucleótido donante.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento in vitro para modificar una molécula de ácido nucleico objetivo, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo que tiene una secuencia objetivo con: un polinucleótido único que comprende una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) y está configurado para hibridarse con una secuencia objetivo en un ácido nucleico; una región activadora adyacente a dicha región de orientación que comprende ADN y que comprende una estructura de bucle de tallo; y Cpfl, en donde la Cpf1 se une con la región activadora del polinucleótido único, en donde dicha molécula de ácido nucleico objetivo se escinde, en donde dicha molécula de ácido nucleico objetivo comprende ADN.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo es ADN. En algunas realizaciones, la región activadora se encuentra corriente abajo de la región de orientación. En algunas realizaciones, la región activadora se encuentra corriente arriba de la región de orientación. En algunas realizaciones, la región activadora comprende una mezcla de ADN y ARN. En algunas realizaciones, la región de orientación comprende una mezcla de ADN y ARN. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además proporcionar un polinucleótido donante.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento in vitro para introducir un polinucleótido donante en el genoma de una célula u organismo utilizando un sistema CRISPR de Clase 2 que comprende: poner en contacto una molécula de ácido nucleico objetivo que tiene una secuencia objetivo con: un polinucleótido único que comprende una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) y está configurado para hibridarse con una secuencia objetivo en un ácido nucleico; una región activadora adyacente a dicha región de orientación que comprende ADN y que comprende una estructura de bucle de tallo; y Cpfl, en donde la Cpf1 se une a la región activadora del polinucleótido único y en donde dicha molécula de ácido nucleico objetivo comprende ADN y se escinde en la secuencia objetivo, o cerca de ella, y proporciona un polinucleótido donante que se introduce en el genoma de la célula u organismo en el sitio de escisión.
En algunas realizaciones el ácido nucleico objetivo es ADN, en algunas realizaciones el ácido nucleico objetivo es una mezcla de ARN y ADN. En algunas realizaciones, la región activadora se encuentra corriente abajo de la región de orientación. En algunas realizaciones, la región activadora se encuentra corriente arriba de la región de orientación. En algunas realizaciones, la región activadora comprende una mezcla de ADN y ARN. En algunas realizaciones, la región de orientación comprende una mezcla de ADN y ARN. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante se introduce en el ácido nucleico por recombinación homóloga. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante se introduce en el ácido nucleico mediante unión de extremos no homólogos.
Breve Descripción de los dibujos
La FIGURA 1A muestra un crD(R)NA y un ARNtracr de un sistema CRISPR de tipo II (que no forma parte de la invención).
La FIGURA 1B muestra dos polinucleótidos (un crD(R)NA y un ARNtracr o un tracrD(R)NA) de la presente divulgación hibridados entre sí (también denominado sistema de "guía dual"; no forma parte de la invención).
La FIGURA 2 muestra un polinucleótido único de la presente divulgación que comprende una región de orientación unida a una región activadora (también denominado sistema de "guía única" o " D(R)NA de guía única" o "sg D(R)NA"; no forma parte de la invención).
La FIGURA 3 muestra la escisión de una secuencia de ADN objetivo con un sistema CRISPR/Cas de tipo II utilizando polinucleótidos objetivo de ácido nucleico de la presente divulgación (que no forman parte de la invención).
Las FIGURAS 4A y B muestran resultados de ensayos bioquímicos in vitro para determinar la cantidad de escisión de diversas secuencias objetivo por un sistema CRISPR/Cas de TIPO II utilizando polinucleótidos objetivo de ácido nucleico de la presente divulgación (no parte de la invención).
La FIGURA 5 muestra los resultados de ensayos in vivo para determinar la cantidad de escisión de una secuencia objetivo por un sistema CRISPR/Cas de TIPO II utilizando polinucleótidos objetivo de ácido nucleico de la presente divulgación (que no forman parte de la invención).
La FIGURA 6 muestra los resultados de ensayos bioquímicos in vitro para determinar la cantidad de escisión fuera de objetivo de una secuencia objetivo por un sistema CRISPR/Cas de TIPO II que utiliza polinucleótidos objetivo de ácido nucleico de la presente divulgación (que no forman parte de la invención).
La FIGURA 7 muestra los resultados de un ensayo in vivo para determinar la cantidad de escisión de una secuencia objetivo por un sistema CRISPR/Cas de TIPO II utilizando polinucleótidos objetivo de ácido nucleico de la presente divulgación (que no forman parte de la invención).
La FIGURA 8 muestra los resultados de la actividad de pinzamiento de una crD(R)NA o sgD(R)NA con una proteína Cas9-D10A contra un objetivo plasmídico in vitro (no forma parte de la invención).
La FIGURA 9 muestra una estructura típica de un ARNcr de un sistema CRISPR de tipo V.
Las FIGURAS 10A-C muestran posibles estructuras de una única guía D(R)NA de la presente divulgación para su uso con un sistema CRISPR de tipo V.
Las FIGURAS 11A-E muestran posibles estructuras de una única guía D(R)NA de la presente divulgación para su uso con un sistema CRISPR de tipo V.
Las FIGURAS 12A-I muestran posibles componentes de guías duales de la presente divulgación que comprenden ARNcr y/o crD(R)NA para su uso con un sistema CRISPR de tipo V (no forma parte de la invención).
Las FIGURAS 13A-H muestran posibles configuraciones de guías duales de la presente divulgación que comprenden ARNcr y/o crD(R)NA para su uso con un sistema CRISPR de tipo V (no forma parte de la invención).
Las FIGURAS 14A-B muestran resultados de secuenciación de un ensayo in planta para determinar la cantidad de escisión de una secuencia objetivo por un sistema CRISPR/Cas de tipo II utilizando polinucleótidos objetivo de ácido nucleico de la presente divulgación (no parte de la invención).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los sistemas CRISPR/Cas se han reclasificado recientemente en dos clases, que comprenden cinco tipos y dieciséis subtipos. Makarova et al. (Nature Reviews Microbiology 13:1-15 (2015)). Esta clasificación se basa en la identificación de todos los genes cas de un locus CRISPR/Cas y en la determinación de los genes característicos de cada locus CRISPR/Cas, determinando finalmente que los sistemas CRISPR/Cas pueden clasificarse en la Clase 1 o en la Clase 2 en función de los genes que codifican el módulo efector, es decir, las proteínas implicadas en la fase de interferencia.
Los sistemas de Clase 1 tienen un complejo ARNcr-efector de múltiples subunidades, mientras que los sistemas de Clase 2 tienen una sola proteína, tal como Cas 9, Cpfl, C2c1, C2c2, C2c3, o un complejo ARNcr-efector. Los sistemas de Clase 1 comprenden los de tipo I, III y IV. Los sistemas de Clase 2 comprenden los sistemas de tipo II y de tipo V.
Todos los sistemas de tipo I tienen una proteína Cas3 que tiene actividad helicasa y actividad de escisión. Los sistemas de tipo I se dividen a su vez en siete subtipos (I-A a I-F e I-U). Cada subtipo de tipo I tiene una combinación definida de genes característicos y características distintas de organización operónica. Por ejemplo, los subtipos I-A y I-B parecen tener los genes cas organizados en dos o más operones, mientras que los subtipos I-C a I-F parecen tener los genes cas codificados por un solo operón. Los sistemas de tipo I tienen un complejo multiproteico ARNcr-efector que participa en las etapas de procesamiento e interferencia del sistema inmune CRISPR/Cas. Este complejo multiproteico se conoce como complejo asociado a CRISPR para la defensa antivírica (Cascade). El subtipo I-A comprende csa5, que codifica una proteína de subunidad pequeña, y un gen cas8 dividido en dos, que codifica las subunidades grande y pequeña degradadas, y también tiene un gen cas3 dividido. Un ejemplo de organismo con un sistema CRISPR/Cas de subtipo I-A es Archaeoglobusfulgidus.
El subtipo I-B tiene una disposición de genes casl-cas2-cas3-cas4-cas5-cas6-cas7-cas8 y carece de un gen csa5. Un ejemplo de organismo con subtipo I-B es Clostridium kluyveri. El subtipo I-C no tiene un gen cas6. Un ejemplo de organismo con el subtipo I-C es Bacillus halodurans. El subtipo I-D tiene un Cas10d en lugar de un Cas8. Un ejemplo de organismo con subtipo I-D es Cyanothece sp. El subtipo I-E no tiene cas4. Un ejemplo de organismo con subtipo I-E es Escherichia coli. El subtipo I-F no tiene un cas4 y tiene un cas2 fusionado a un cas3. Un ejemplo de organismo con subtipo I-F es Yersinia pseudotuberculosis. Un ejemplo de organismo con subtipo I-U es Geobacter sulfurreducens.
Todos los sistemas de tipo III poseen un gen cas10, que codifica una proteína multidominio que contiene un dominio Palm (una variante del motivo de reconocimiento de ARN (RRM)) que es homólogo al dominio central de numerosas polimerasas y ciclasas de ácido nucleico y que es la subunidad más grande de los complejos ARNcr-efector de tipo III. Todos los loci de tipo III también codifican la proteína de subunidad pequeña, una proteína Cas5 y, normalmente, varias proteínas Cas7. El tipo III puede dividirse a su vez en cuatro subtipos, del III-A al III-D. El subtipo III-A tiene un gen csm2 que codifica una subunidad pequeña y también tiene genes cas1, cas2 y cas6. Un ejemplo de organismo con subtipo III-A es Staphylococcus epidermidis. El subtipo III-B tiene un gen cmr5 que codifica una subunidad pequeña y también suele carecer de los genes cas1, cas2 y cas6. Un ejemplo de organismo con subtipo III-B es Pyrococcus furiosus. El subtipo III-C tiene una proteína Cas10 con un dominio inactivo similar a la ciclasa y carece de los genes cas1 y cas2. Un ejemplo de organismo con el subtipo III-C es Methanothermobacter thermautotrophicus. El subtipo III-D tiene una proteína Cas10 que carece del dominio HD, carece de un gen cas1 y cas2 y tiene un gen similar a cas5conocido como csx10. Un ejemplo de organismo con el subtipo III-D es Roseiflexus sp.
Los sistemas de tipo IV codifican un complejo mínimo multi-subunidad ARNcr-efector que comprende una subunidad grande parcialmente degradada, Csf1, Cas5, Cas7, y en algunos casos, una subunidad pequeña putativa. Los sistemas de tipo IV carecen de los genes cas1 y cas2. Los sistemas de tipo IV no tienen subtipos, pero existen dos variantes distintas. Una variante de tipo IV tiene una helicasa de la familia DinG, mientras que una segunda variante de tipo IV carece de una helicasa de la familia DinG, pero tiene un gen que codifica una pequeña proteína a-hélica. Un ejemplo de organismo con un sistema de tipo IV es Acidithiobacillusferrooxidans.
Los sistemas de tipo II tienen los genes cas1, cas2 y cas9. cas9 codifica una proteína multidominio que combina las funciones del complejo ARNcr-efector con la escisión del ADN objetivo. Los sistemas de tipo II también codifican un ARNtracr. Los sistemas de tipo II se dividen a su vez en tres subtipos, los subtipos II-A, II-B y II-C. El subtipo II-A contiene un gen adicional, csn2. Un ejemplo de organismo con un sistema subtipo II-A es Streptococcus thermophilus. El subtipo II-B carece de csn2, pero tiene cas4. Un ejemplo de organismo con un sistema subtipo II-B es Legionella pneumophila. El subtipo II-C es el sistema de tipo II más común que se encuentra en las bacterias y sólo tiene tres proteínas, Cas1, Cas2 y Cas9. Un ejemplo de organismo con un sistema subtipo II-C es Neisseria lactamica.
Los sistemas de tipo V tienen un gen cpf1 y genes cas1 y cas2. El gen cpf1 codifica una proteína, Cpfl, que tiene un dominio de nucleasa similar a RuvC que es homólogo al dominio respectivo de Cas9, pero carece del dominio de nucleasa HNH que está presente en las proteínas Cas9. Se han identificado sistemas de tipo V en varias bacterias, incluyendo Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1), Lachnospiraceae bacterium MC2017 (Lb3Cpf1), Butyrivibrio proteoclasticus (BpCpf1), Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1), Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1), Porphyromonas macacae (PmCpf1), Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpfl), Porphyromonas crevioricanis (PeCpf1), Prevotella disiens (PdCpf1), Moraxella bovoculi 237(MbCpf1), Smithella sp. SC_K08D17 (SsCpf1), Leptospira inadai (LiCpf1), Lachnospiraceae
bacterium MA2020 (Lb2Cpf1), Franciscella novicida U112 (FnCpfl), Candidatus methanoplasma termitum (CMtCpfl), y Eubacterium eligens (EeCpfl).
En los sistemas de Clase 1, las etapas de expresión e interferencia involucran complejos de ARN CRISPR (ARNcr)-efector de subunidades múltiples. En los sistemas de Clase 2, las etapas de expresión e interferencia implican una única proteína de gran tamaño, por ejemplo, Cas9, Cpfl, C2C1, C2C2 o C2C3.
En los sistemas de Clase 1, el pre-ARNcr se une al complejo ARNcr-efector multi-subunidad y se procesa en un ARNcr maduro. En los sistemas de tipo I y III, esto implica una endonucleasa de ARN, por ejemplo, Cas6. En los sistemas de tipo II de Clase 2, el pre-ARNcr se une a Cas9 y se procesa en un ARNcr maduro en un paso que implica a la RNasa III y a un ARNtracr. Sin embargo, en al menos un sistema CRISPR-Cas de tipo II, el de Neisseria meningitidis, los ARNcr con extremos 5' maduros se transcriben directamente a partir de promotores internos, y no se produce procesamiento del ARNcr.
En los sistemas de Clase 1, el ARNcr se asocia con el complejo ARNcr-efector y logra la interferencia combinando la actividad nucleasa con dominios de unión a ARN y la formación de pares de bases entre el ARNcr y un ácido nucleico objetivo.
En los sistemas de tipo I, la unión del ARNcr y el objetivo del complejo ARNcr-efector implica a Cas7, Cas5 y Cas8 fusionados a una proteína de subunidad pequeña. La escisión del ácido nucleico objetivo de los sistemas de tipo I implica el dominio de nucleasa HD, que o bien está fusionado a la superfamilia 2 de la helicasa Cas3' o está codificado por un gen independiente, cas3".
En los sistemas de tipo III, la unión del ARNcr y el objetivo del complejo ARNcr-efector implica a Cas7, Cas5, Cas10 y una proteína de subunidad pequeña. La escisión del ácido nucleico objetivo de los sistemas de tipo III implica la acción combinada de las proteínas Cas7 y Cas10, con un dominio de nucleasa HD distinto fusionado a Cas10, que se cree que escinde el ADN monocatenario durante la interferencia.
En los sistemas de Clase 2, el ARNcr está asociado a una proteína única y logra la interferencia combinando la actividad nucleasa con dominios de unión a ARN y la formación de pares de bases entre el ARNcr y un ácido nucleico objetivo.
En los sistemas de tipo II, la unión del ARNcr y el objetivo involucra a Cas9 al igual que la escisión del ácido nucleico objetivo. En los sistemas de tipo II, el dominio de nucleasa similar a RuvC (plegamiento RNasa H) y el dominio de nucleasa HNH (similar a McrA) de Cas9 escinden cada uno una de las cadenas del ácido nucleico objetivo. La actividad de escisión de Cas9 de los sistemas de tipo II también requiere la hibridación del ARNcr con el ARNtracr para formar un dúplex que facilite la unión del ARNcr y el objetivo por parte de Cas9.
En los sistemas de tipo V, la unión del ARNcr y el objetivo involucra a Cpf1 al igual que la escisión del ácido nucleico objetivo. En los sistemas de tipo V, el dominio de nucleasa similar a RuvC de Cpf1 escinde ambas cadenas del ácido nucleico objetivo en una configuración escalonada, produciendo salientes de 5', lo que contrasta con los extremos romos generados por la escisión de Cas9. Estos salientes de 5' pueden facilitar la inserción de ADN mediante procedimientos de unión de extremos no homólogos.
La actividad de escisión de Cpf1 de los sistemas de tipo V tampoco requiere la hibridación del ARNcr con ARNtracr para formar un dúplex, más bien el ARNcr de los sistemas de tipo V utiliza un ARNcr único que tiene una estructura de bucle de tallo formando un dúplex interno. Cpf1 se une al ARNcr de una manera específica de secuencia y estructura, que reconoce el bucle del tallo y las secuencias adyacentes al bucle del tallo, más notablemente, el nucleótido 5' de las secuencias espaciadoras que se hibridan con el ácido nucleico objetivo. Esta estructura en bucle suele tener entre 15 y 19 nucleótidos de longitud. Las sustituciones que interrumpen este dúplex de bucle de tallo suprimen la actividad de escisión, mientras que otras sustituciones que no interrumpen el dúplex de bucle de tallo no suprimen la actividad de escisión. En los sistemas de tipo V, el ARNcr forma una estructura de bucle de tallo en el extremo 5' y la secuencia en el extremo 3' es complementaria a una secuencia en un ácido nucleico objetivo.
Otras proteínas asociadas con el ARNcr de tipo V y la unión y escisión de objetivos incluyen el candidato de Clase 2 1 (C2c1) y el candidato de Clase 23 (C2c3). Las proteínas C2c1 y C2c3 tienen una longitud similar a las proteínas Cas9 y Cpf1, que oscila entre aproximadamente 1.100 aminoácidos y aproximadamente 1.500 aminoácidos. Las proteínas C2c1 y C2c3 también contienen dominios de nucleasa similares a RuvC y tienen una arquitectura similar a Cpf1. Las proteínas C2c1 son similares a las proteínas Cas9 en cuanto a que requieren un ARNcr y un ARNtracr para la unión al objetivo y la escisión, pero tienen una temperatura óptima de escisión de 50 °C. Las proteínas C2c1 se dirigen a una PAM rica en AT, que, de forma similar a la Cpfl, se encuentra a 5' de la secuencia objetivo, véase, por ejemplo,Shmakov et al. (Molecular Cell; 60(3): 385-397 (2015)).
El candidato de Clase 2 (C2c2) no comparte similitud de secuencia con otras proteínas efectoras CRISPR, y por lo tanto puede estar en un sistema putativo de Tipo VI. Las proteínas C2c2 tienen dos dominios HEPN y se prevé que tengan actividad RNasa, por lo que pueden dirigirse y escindir ARNm. Las proteínas C2c2 parecen similares a las
proteínas Cpf1 al requerir ARNcr para la unión al objetivo y la escisión, mientras que no requieren ARNtracr. Al igual que el Cpfl, el ARNcr para las proteínas C2c2 forma una horquilla estable, o estructura de bucle de tallo, que puede ayudar en la asociación con la proteína C2c2.
Tal como se utiliza en el presente documento, "polipéptido dirigido al sitio" se refiere a una única proteína, o complejo de proteínas, utilizado en un sistema CRISPR con los polinucleótidos divulgados en el presente documento. Un polipéptido dirigido al sitio puede comprender uno o más dominios de nucleasa. Un polipéptido dirigido al sitio de la divulgación puede comprender un dominio de nucleasa HNH o similar a HNH, un dominio de nucleasa RuvC o similar a RuvC, y/o nucleasas similares a la superfamilia HEPN. Los dominios HNH o similares a HNH pueden incluir un plegamiento similar al de McrA. Los dominios HNH o similares a HNH pueden comprender dos cadenas p antiparalelas y una hélice a. Los dominios HNH o similares a HNH pueden comprender un sitio de unión a metales(por ejemplo, sitio de unión a cationes divalentes). Los dominios HNH o similares a HNH pueden escindir una cadena de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, la cadena complementaria de la cadena objetivo del ARNcr). Las proteínas que comprenden un dominio HNH o similar al HNH pueden incluir endonucleasas, colicinas, endonucleasas de restricción, transposasas y factores de empaquetamiento del ADN.
El polipéptido dirigido al sitio para su uso en la invención es una proteína Cpf1. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio con actividad nucleasa reducida puede ser una nicasa, es decir, puede modificarse para escindir una cadena de un dúplex de ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio puede modificarse para que no tenga actividad nucleasa, es decir, que no corte ninguna cadena de un dúplex de ácido nucleico objetivo, o ninguna cadena única de un ácido nucleico objetivo. Ejemplos de polipéptidos dirigidos al sitio con actividad nucleasa reducida, o nula, pueden incluir un Cpfl con una modificación en el dominio de nucleasa RuvC. Ejemplos no limitantes de tales modificaciones pueden incluir D917A, E1006A y D1225A al dominio de nucleasa RuvC de la Cpfl de F. novicida, y sus correspondientes residuos de aminoácidos en otras proteínas Cpfl.
En algunas realizaciones, puede modificarse un polipéptido dirigido al sitio. Dichas modificaciones pueden incluir la incorporación o fusión de un dominio de otro polipéptido a un polipéptido dirigido al sitio, o la sustitución de un dominio de un polipéptido dirigido al sitio por un dominio de otro polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido modificado dirigido al sitio puede contener un primer dominio de una proteína Cpfl y un segundo dominio de una proteína distinta de Cpfl. La modificación para incluir dichos dominios en los polipéptidos modificados dirigidos al sitio puede conferir actividad adicional a los polipéptidos modificados dirigidos al sitio. Tales actividades pueden incluir actividad de nucleasa, actividad de metiltransferasa, actividad de desmetilasa, actividad de reparación del ADN, actividad de daño del ADN, actividad de desaminación, actividad de dismutasa, actividad de alquilación, actividad de depurinación, actividad de oxidación, actividad de formación de dímeros de pirimidina, actividad de integrasa, actividad de transposasa, actividad de recombinasa, actividad de polimerasa, actividad de ligasa, actividad de helicasa, actividad de fotoliasa, actividad glicosilasa, actividad acetiltransferasa, actividad desacetilasa, actividad cinasa, actividad fosfatasa, actividad ubiquitina ligasa, actividad desubiquitinadora, actividad adeniladora, actividad deadeniladora, actividad SUMOiladora, actividad deSUMOiladora, actividad ribosiladora, actividad deribosiladora, actividad miristoiladora o actividad demiristoiladora) que modifica un polipéptido asociado con el ácido nucleico objetivo (por ejemplo, una histona).
En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio puede introducir roturas de doble cadena o roturas de cadena simple en secuencias de ácido nucleico,(por ejemplo, ADN genómico). En ciertas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico puede ser un ácido nucleico objetivo. Ciertos polipéptidos dirigidos al sitio de la presente divulgación pueden introducir sitios de escisión de extremo romo, mientras que ciertas realizaciones producen sitios de escisión que tienen extremos pegajosos, es decir, salientes 5' o 3'. Cpfl, por ejemplo, puede introducir una rotura escalonada de doble cadena de ADN con un saliente 5' de aproximadamente 4 o 5 nucleótidos (nt). Una rotura de doble cadena puede estimular las vías endógenas de reparación del ADN de una célula(por ejemplo, la recombinación homóloga y la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la unión de extremos no homólogos alternativa (A-NHEJ)). NHEJ puede reparar un ácido nucleico objetivo escindido sin necesidad de una plantilla homóloga. Esto puede dar lugar a deleciones del ácido nucleico objetivo. La recombinación homóloga (HR) puede producirse con una plantilla homóloga. La plantilla homóloga puede comprender secuencias homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. Después de que un ácido nucleico objetivo es escindido por un polipéptido dirigido al sitio, el sitio de escisión puede ser destruido (por ejemplo, el sitio puede no ser accesible para otra ronda de escisión con un polinucleótido objetivo de ácido nucleico y un polipéptido dirigido al sitio).
En algunos casos, la recombinación homóloga puede insertar una secuencia polinucleotídica exógena en el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. Una secuencia polinucleotídica exógena puede denominarse polinucleótido donante o secuencia donante. En algunas realizaciones, un polinucleótido donante, una porción de un polinucleótido donante, una copia de un polinucleótido donante, o una porción de una copia de un polinucleótido donante puede insertarse en un sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. Un polinucleótido donante puede ser una secuencia polinucleotídica exógena. Un polinucleótido donante puede ser ADN monocatenario. Un polinucleótido donante puede ser ADN bicatenario. Un polinucleótido donante puede ser ARN. Un polinucleótido donante puede ser un dúplex de ARN y ADN. Un polinucleótido donante puede ser una secuencia que no se encuentra de forma natural en el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, las modificaciones de un ácido nucleico objetivo debidas a NHEJ y/o HR pueden dar lugar, por ejemplo, a mutaciones, deleciones, alteraciones, integraciones, corrección de genes, sustitución de genes, marcado de genes, inserción de transgenes, deleción de nucleótidos, interrupción de
genes y/o mutación de genes. El proceso de integrar ácido(s) nucleico(s) no nativo(s) en el ADN genómico puede denominarse "modificación genómica"
Un sistema CRISPR de la presente divulgación puede denominarse "sistema CRISPR guiado por ADN"
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "crD(R)NA" se refiere a un polinucleótido que comprende una región de orientación y una región activadora, en donde la región de orientación comprende ADN, o ADN y ARN, y en donde la región activadora comprende ARN, o ADN, o una mezcla de ADN y ARN. Una región de orientación puede estar corriente arriba de una región activadora. Una región activadora puede estar corriente arriba de una región de orientación. Un ARNtracr puede comprender una secuencia complementaria a una secuencia de la región activadora de un crD(R)NA.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tracrD(R)NA" se refiere a un polinucleótido que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia en la región activadora de un crD(R)NA y en donde el polinucleótido comprende ADN o una mezcla de ADN y ARN.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región de orientación" se refiere a una región de un polinucleótido que comprende ADN, o una mezcla de ADN y ARN que es complementaria a una secuencia en un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una región de orientación también puede comprender otros ácidos nucleicos, o análogos de ácidos nucleicos, o combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, una región de orientación puede estar compuesta únicamente de ADN porque esta configuración puede tener menos probabilidades de descomponerse dentro de una célula huésped. En algunas realizaciones, esta configuración puede aumentar la especificidad del reconocimiento de la secuencia objetivo y/o reducir la aparición de unión/hibridación fuera del objetivo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región activadora" se refiere a una porción de un polinucleótido que comprende ADN, o una mezcla de ADN y ARN que interactúa, o es capaz de asociarse, o unirse con un polipéptido dirigido al sitio. En ciertas realizaciones, una región activadora también puede comprender otros ácidos nucleicos, o análogos de ácidos nucleicos, o combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, una región activadora es adyacente a una región de orientación. En ciertas realizaciones, la región activadora se encuentra corriente abajo de la región de orientación. En ciertas realizaciones, la región activadora se encuentra corriente arriba de la región de orientación.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sgD(R)NA" o "D(R)NA de guía única" se refiere a un polinucleótido que comprende una región de orientación y una región activadora, en donde la región de orientación comprende ADN, o una mezcla de ADN y ARN que es complementaria a una secuencia en un ácido nucleico objetivo, en donde la región activadora comprende ADN, o una mezcla de ADN y ARN, y en donde la región activadora tiene secuencias que son auto complementarias, que se hibridan para formar un dúplex, que puede contener estructuras secundarias.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "corriente abajo" se refiere a un punto distal de un punto de referencia en dirección 3' de una secuencia de nucleótidos. En el presente documento, el término "corriente arriba" se refiere a un punto distal de un punto de referencia en dirección 5' de una secuencia de nucleótidos.
Un polinucleótido de la presente divulgación, por ejemplo, D(R)NA de guía única, también puede comprender una mezcla de ADN y otros ácidos nucleicos, por ejemplo, ácido nucleico peptídico (PNA), u otros análogos de ácidos nucleicos.
La FIGURA 1A muestra polinucleótidos para su uso en un sistema CRISPR de tipo II (que no forma parte de la invención). En esta realización, 101 puede ser un crD(R)NA y 102 puede ser un tracrD(R)NA o un ARNtracr.
La FIGURA 1B muestra los polinucleótidos de la FIGURA 1A (que no forman parte de la invención) hibridados entre sí a lo largo de regiones de complementariedad. La hibridación puede generar estructuras secundarias como una protuberancia 105, una región l03 de orientación, un nexo 107 y horquillas 108 y 109. La FIGURA 1B también muestra una realización que comprende una región dúplex 106 superior y una región dúplex 104 inferior. Una región dúplex superior puede comprender un tallo superior. Una región dúplex inferior puede comprender un tallo inferior. Los polinucleótidos que se hibridan para formar la región 104 pueden comprender una mezcla de ADN y ARN en la misma cadena de polinucleótidos, por ejemplo, 102, en una región corriente abajo de una región 103 objetivo. La región 104, tal como se muestra en la FIGURA 1B, puede comprender una mezcla de ADN y ARN en la misma cadena polinucleotídica, por ejemplo, 102. Una secuencia de nucleótidos inmediatamente corriente abajo de una región de orientación puede comprender diversas proporciones de ADN y ARN. En determinadas realizaciones, este prorrateo puede ser 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de ARN e intervalos intermedios. Como se describe en el presente documento, una secuencia de nucleótidos corriente abajo (por ejemplo, una región entre una región 103 de orientación y una protuberancia 105 como se muestra en la FIGURA 1B) de una región 103 de orientación, puede comprender una mezcla de ADN y ARN como se muestra en las SEQ ID NOs. 19-26.
La FIGURA 2 muestra un ejemplo de una D(R)NA de guía única para su uso con un sistema CRISPR de Tipo II (no forma parte de la invención). En referencia a la FIGURA 2, la sgD(R)NA comprende una región 201 de orientación, una región 202 dúplex inferior, una región 203 dúplex superior, una región 204 de fusión, una estructura secundaria (por ejemplo, una protuberancia) 205, un nexo 206, y horquillas 207 y 208. Una región dúplex superior puede comprender un tallo superior. Una región dúplex inferior puede comprender un tallo inferior. Algunas sgD(R)NAs pueden comprender una región activadora que comprende una región dúplex superior y una región dúplex inferior. La región 202 puede comprender una mezcla de ADN y ARN, que se encuentra inmediatamente corriente abajo de una región 201 de orientación. Una secuencia de nucleótidos inmediatamente corriente abajo de una región de orientación puede comprender diversas proporciones de ADN y ARN. Este prorrateo puede ser 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100% de ARN e intervalos intermedios. Como se describe en el presente documento, una región de nucleótidos corriente abajo (por ejemplo, una región entre una región 201 de orientación y una protuberancia 205 como se muestra en la FIGURA 2) de una región 201 de orientación puede comprender una mezcla de ADN y ARN como se muestra en las SEQ ID NOs. 127-132. La región 203 puede comprender una mezcla de ADN y ARN, que se encuentra corriente abajo de una región 201 de orientación. Una secuencia de nucleótidos corriente abajo de una región de orientación puede comprender diversas proporciones de ADN y ARN. En determinadas realizaciones, este prorrateo puede ser 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de ARN e intervalos intermedios. Como se describe en el presente documento, una región de nucleótidos corriente abajo de una región 201 de orientación puede comprender una mezcla de ADN y ARN como se muestra en las SEQ ID NOs. 44-47 y 129.
Los sistemas CRISPR de tipo V de origen natural, a diferencia de los sistemas CRISPR de tipo II, no requieren un ARNtracr para la maduración del ARNcr y la escisión de un ácido nucleico objetivo. La FIGURA 9 muestra una estructura típica de un ARNcr de un sistema CRISPR de tipo V, en donde la secuencia de unión al objetivo de ADN se encuentra corriente abajo de una estructura de bucle de tallo que interactúa con la proteína Cpf1. Las alteraciones de los nucleótidos en la región del bucle no afectan a la actividad de escisión de Cpf1.
Las FIGURAS 10A-C muestran posibles estructuras de una D(R)NA de guía única de la presente divulgación para su uso con un sistema CRISPR de tipo V. En estas configuraciones, las regiones negras sólidas representan el ARN, mientras que las regiones a cuadros representan el ADN. La FIGURA 10A muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación comprende ARN, el tallo 3' comprende ADN, y el bucle y el tallo 5' comprenden ARN. La FIGURA 10B muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación comprende ARN, el tallo 5' comprende ADN, y el bucle y el tallo 3' comprenden ARN. La FIGURA 10C muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación y el bucle comprenden ARN, y los tallos 5' y 3' comprenden ADN. El tallo 3' y el tallo 5' de las FIGURAS 10A-C colectivamente, o individualmente, pueden denominarse en el presente documento como la "región activadora" de un polinucleótido para su uso con un sistema de tipo V.
Las FIGURAS 11A-E muestran posibles estructuras de una D(R)NA de guía única de la presente divulgación para su uso con un sistema CRISPR de tipo V. En estas configuraciones, las regiones negras sólidas representan el ADN, mientras que las regiones a cuadros representan el ARN. La FIGURA 11A muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación comprende ADN, el tallo 3' comprende ADN, y el bucle y el tallo 5' comprenden ARN. La FIGURA 11B muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación comprende ADN, el tallo 5' comprende ADN, y el bucle y el tallo 3' comprenden ARN. La FIGURA 11C muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación, el tallo 5' y el tallo 3' comprenden ADN y el bucle comprende ARN. La FIGURA 11D muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación comprende ADN y el tallo 5', el tallo 3' y el bucle comprenden ADN. La FIGURA 11E muestra una D(R)NA de guía única en donde la región de orientación comprende una mezcla de ADN y ARN y el tallo 5', el tallo 3' y el bucle comprenden ADN. El tallo 3' y el tallo 5' de las FIGURAS 11A-E colectivamente, o individualmente, pueden denominarse en el presente documento como la "región activadora" de un polinucleótido para su uso con un sistema de tipo V.
Las FIGURAS 12A-I muestran posibles configuraciones del ARNcr y del ARNcrD(R)NA de la presente divulgación para su uso con un sistema CRISPR de tipo V en donde el elemento 3' y el elemento 5' están en polinucleótidos separados y se asocian mediante interacciones de pares de bases de hidrógeno para formar una estructura dúplex o de tallo (no forma parte de la invención). La FIGURA 12A muestra un sistema de guía dual para su uso en un sistema CRISPR de tipo V, en donde la región de orientación está unida a un elemento 3'. En la FIGURA 12A también se muestra un segundo polinucleótido como elemento 5'. El elemento 5' está configurado para hibridarse con el elemento 3' que está unido a la región de orientación para formar un dúplex, o tallo. En la FIGURA 12A, la región de orientación, el elemento 3' y el elemento 5' comprenden ARN. La FIGURA 12B muestra un elemento 5' que comprende ARN. La FIGURA 12C muestra un elemento 5' que comprende ADN. La FIGURA 12D muestra una región de orientación que comprende ARN y un elemento 3' que comprende ARN. La FIGURA 12E muestra una región de orientación que comprende ARN y un elemento 3' que comprende ADN. La FIGURA 12F muestra una región de orientación que comprende ADN y un elemento 3' que comprende ARN. La FIGURA 12G muestra una región de orientación que comprende ADN y un elemento 3' que comprende ADN. La FIGURA 12H muestra una región de orientación que comprende ARN y ADN y un elemento 3' que comprende ADN. La FIGURA 121 muestra una región de orientación que comprende una mezcla alternativa de ARN y ADN y un elemento 3' que comprende ADN. El elemento 3' de las FIGURAS 12A-I puede denominarse en el presente documento "región activadora" de un polinucleótido para uso con un sistema de tipo V.
Las FIGURAS 13A-H muestran posibles configuraciones del ARNcr y del crD(R)NA de la presente divulgación para su uso con un sistema CRISPR de Tipo V en donde el elemento 3' y el elemento 5' están en polinucleótidos separados y se asocian a través de interacciones de interacción de pares de bases de hidrógeno para formar una estructura dúplex o de tallo (no forma parte de la invención). En algunos de los polinucleótidos mostrados en las FIGURAS 10A-13H, las regiones de ADN también pueden comprender ARN. Las regiones de ARN también pueden comprender ADN. Las regiones de ADN también pueden comprender ARN y las regiones de ARN también pueden comprender ADN. El elemento 3' de las FIGURAS 13A-H puede denominarse en el presente documento "región activadora" de un polinucleótido para uso con un sistema de tipo V. Las proporciones de ADN y ARN en las diversas regiones de los polinucleótidos mostrados en las FIGURAS 10A-13H pueden variar. Este prorrateo puede ser 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100% de ARN e intervalos intermedios. Los ejemplos de polinucleótidos que pueden utilizarse con un sistema CRISPR de tipo V se proporcionan en las SEQ ID NOs: 168-203.
Una región activadora de un polinucleótido dirigido a un ácido nucleico puede interactuar con una región de un polipéptido dirigido al sitio. Una región activadora puede interactuar con una pluralidad de regiones de un polipéptido dirigido al sitio. Una región activadora puede interactuar con una pluralidad de regiones de un polipéptido dirigido al sitio en donde al menos una de las regiones interactúa con un PAM de un ácido nucleico objetivo.
Los nucleótidos adyacentes a un nucleótido no apareado pueden ser un nucleótido que forma una interacción de apareamiento de bases wobble. Las interacciones de emparejamiento de bases Wobble pueden incluir guaninauracilo, hipoxantina-uracilo, hipoxantina-adenina e hipoxantina-citosina. Las interacciones de emparejamiento de bases Wobble pueden conducir a una menor especificidad de objetivo y/o de escisión. Al menos 1, 2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos adyacentes a un nucleótido no apareado pueden formar un apareamiento wobble. Como máximo, 1,2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos adyacentes a un nucleótido no apareado pueden formar un apareamiento wobble. En ciertas realizaciones, una región de orientación puede comprender un desoxirribonucleótido timina ("dT") como sustituto de un ribonucleótido uracilo. El uso de dT en lugar de U reduce el emparejamiento por bamboleo y reduce el emparejamiento de bases fuera del objetivo, lo que conduce a un aumento de la especificación del objetivo en ciertas realizaciones.
Un ácido nucleico objetivo puede estar compuesto de ADN, ARN o combinaciones de los mismos y puede ser un ácido nucleico bicatenario o un ácido nucleico monocatenario. Una secuencia de región de orientación puede hibridar con un ácido nucleico objetivo situado a 5' o 3' de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM), dependiendo del polipéptido dirigido al sitio concreto que se vaya a utilizar. Un PAM puede variar en función del polipéptido dirigido al sitio que se vaya a utilizar. Un polipéptido dirigido al sitio puede modificarse de tal manera que un PAM puede ser diferente en comparación con un PAM para un polipéptido dirigido al sitio no modificado. Otros polipéptidos dirigidos al sitio pueden reconocer otros PAM y un experto en la materia es capaz de determinar el PAM para cualquier polipéptido dirigido al sitio en particular. Por ejemplo, se identificó que Cpf1 de Francisella novicida tenía un PAM 5' -TTN -3' (Zetsche et al. (Cell; 163(3):759-71(2015)), pero esto no fue capaz de apoyar la escisión específica de un ácido nucleico objetivo in vivo. Dada la similitud en la secuencia guía entre Francisella nov icida y otras proteínas Cpf1, tal como la Cpf1 de Acidaminocccus sp BV3L6, que utilizan un PAM 5' - TTTN - 3', es más probable que la proteína Cpf1 de Francisella novicida reconozca y escinda un sitio en un ácido nucleico objetivo proximal a un PAM 5' - TTTN - 3' con mayor especificidad y actividad que un sitio en un ácido nucleico objetivo proximal al PAM 5' - TTN - 3' truncado identificado erróneamente por Zetsche et al. Los polinucleótidos y sistemas CRISPR descritos en la presente solicitud pueden utilizarse con una proteína Cpf1 (por ejemplo, de Francisella novicida) dirigida a un sitio en un ácido nucleico objetivo proximal a un PaM 5' - TTTN - 3'.
Una secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser de 20 nucleótidos. Un ácido nucleico objetivo puede tener menos de 20 nucleótidos. Un ácido nucleico objetivo puede tener al menos 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. Un nucleótido objetivo puede comprender intervalos de nucleótidos entre aproximadamente 5 30, e intervalos intermedios. La selección de una PAM específica está dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica con base en el polipéptido dirigido al sitio concreto que se vaya a utilizar en un caso determinado.
Los polinucleótidos de la presente divulgación que comprenden ADN y ARN en la misma cadena no pueden fabricarse in vivo utilizando vectores de expresión, pero pueden sintetizarse químicamente in vitro. La síntesis química de polinucleótidos es bien conocida por cualquier experto en la técnica. La síntesis química de los polinucleótidos de la presente divulgación puede realizarse en solución o sobre un soporte sólido. La síntesis en solución es preferible para grandes cantidades y para polinucleótidos de mayor pureza, ya que los intermediarios se purifican después de cada paso. Para cantidades menores, en las que la pureza de la secuencia no es tan crítica, la síntesis en fase sólida es el procedimiento preferido. Los polinucleótidos de la presente divulgación también pueden obtenerse de fuentes comerciales que proporcionan síntesis química automatizada de polinucleótidos.
La síntesis química del ADN puede ser más fácil, rápida y barata que la síntesis química del ARN. La generación y el ensayo de polinucleótidos que comprenden ADN pueden ser más rápidos y rentables en comparación con las secuencias que comprenden ARN. Las secuencias que contienen ADN pueden ofrecer la ventaja de una mayor especificidad para dirigirse a ácidos nucleicos objetivo tal como el ADN. Los polinucleótidos que comprenden ADN en regiones específicas, como se discute en el presente documento, pueden presentar además la ventaja de reducir la
unión fuera del objetivo debido a la reducción de la propensión al emparejamiento de bases bamboleantes asociado con las bases de ácido desoxirribonucleico en comparación con las bases de ácido ribonucleico (por ejemplo, las bases de timidina en el ADN en comparación con las bases de uracilo en el ARN).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente divulgación también pueden comprender modificaciones que, por ejemplo, aumentan la estabilidad del polinucleótido. Dichas modificaciones pueden incluir fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, tales como fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, fosforodiamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres, selenofosfatos y boranofosfatos con enlaces normales 3'-5', análogos con enlaces 2 -5' y aquellos con polaridad invertida en los que uno o más enlaces internucleotídicos son enlaces 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los polinucleótidos de orientación de ácido nucleico adecuados que tienen polaridad invertida pueden comprender un único enlace 3' a 3' en el enlace internucleotídico más 3' (es decir, un único residuo nucleósido invertido en donde falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También pueden incluirse diversas sales (por ejemplo, cloruro potásico o cloruro sódico), sales mixtas y formas ácidas libres.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente divulgación también pueden contener otros ácidos nucleicos, o análogos de ácidos nucleicos. Un ejemplo de análogo de ácido nucleico es el ácido nucleico peptídico (PNA).
La entrega de polinucleótidos de la presente divulgación a las células, in vitro o in vivo, puede lograrse mediante una serie de procedimientos conocidos por un experto en la técnica. Estos procedimientos incluyen lipofección, electroporación, nucleofección, microinyección, biolística, liposomas, inmunoliposomas, policationes o conjugados lípido: ácido nucleico. La lipofección es bien conocida y se describe en, por ejemplo, Patente de EE.UU Nos.
5,049,386, 4,946,787y 4,897,355y los reactivos de lipofección se venden comercialmente. Los lípidos catiónicos y neutros adecuados para la lipofección eficiente de polinucleótidos con reconocimiento de receptores se describen en la Publicación Internacional Nos. WO 91/17424 y W o 91/16024.
Los complejos lípido: ácido nucleico, incluyendo los liposomas dirigidos, tales como los complejos inmunolipídicos, y la preparación de dichos complejos es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995): Behr et al., Bioconjugate Chem.
5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Patente de EE. UU. Nos.
4.186.183; 4,217,344; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028y 4,946,787).
La electroporación puede utilizarse para administrar los polinucleótidos de la presente divulgación. La electroporación también puede utilizarse para administrar complejos del polipéptido dirigido al sitio y los polinucleótidos de la presente divulgación. En estos procedimientos, los polinucleótidos, o los complejos de polipéptidos dirigidos al sitio y polinucleótidos se mezclan en un tampón de electroporación con las células objetivo para formar una suspensión. A continuación, esta suspensión se somete a un impulso eléctrico a un voltaje optimizado, que crea poros temporales en la bicapa de fosfolípidos de la membrana celular, permitiendo que moléculas cargadas como el ADN y las proteínas atraviesen los poros y entren en la célula. Los reactivos y el equipo para realizar la electroporación se venden comercialmente.
La biolística, o entrega de microproyectiles, puede utilizarse para entregar los polinucleótidos de la presente divulgación. En estos procedimientos, los microproyectiles, tales como el oro o el tungsteno, se recubren con el polinucleótido por precipitación con cloruro cálcico, espermidina o polietilenglicol. Las partículas de microproyectiles se aceleran a alta velocidad en una célula utilizando un dispositivo tal como el BIOLISTIC® PDS-1000/Hc Particle Delivery System (Bio-Rad; Hercules, California).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos in vitro para modificar un gen objetivo en una célula. La célula puede ser de cualquier organismo (por ejemplo, una célula bacteriana, una célula arqueal, una célula de un organismo eucariota unicelular, una célula vegetal, una célula de alga, una célula fúngica (por ejemplo, una célula de levadura), una célula de un animal invertebrado, una célula de un animal vertebrado o una célula de un mamífero, incluyendo una célula humana.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos para modificar un gen objetivo en una planta. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "planta" se refiere a plantas enteras, órganos vegetales, tejidos vegetales, semillas, células vegetales, semillas y progenie de las mismas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. Las partes de las plantas incluyen tejidos diferenciados e indiferenciados, entre otros, raíces, tallos, brotes, hojas, pólenes, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivos (por ejemplo, células individuales, protoplastos, embriones y tejido calloso).
Ejemplo 1
Producción de componentes de ARN guía
Los ARN guía (por ejemplo, ARNsg y ARNtracr) se produjeron mediante transcripción in vitro (por ejemplo, T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit, New England Biolabs, Ipswich, MA) a partir de una plantilla de ADN de doble cadena que incorporaba un promotor T7 en el extremo 5' de las secuencias de ADN.
La plantilla de ADN de doble cadena para los componentes de ARN se ensambló mediante PCR utilizando cebadores solapados 3' que contenían las secuencias de ADN correspondientes a los componentes de ARN. Los oligonucleótidos utilizados en el ensamblaje se presentan en la Tabla 1.
T l 1:
Las secuencias de oligonucleótidos(por ejemplo, las secuencias de cebadores mostradas en SEQ ID NOs 63-122) se proporcionaron a fabricantes comerciales para su síntesis (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA; o Eurofins, Luxemburgo).
Los cebadores de ADN estaban presentes a una concentración de 2nM cada uno. Dos cebadores externos de ADN correspondientes al promotor T7 (cebador directo: SEQ ID NO: 63, Tabla 1), y el extremo 3' de la secuencia de ARN (cebadores inversos: SEQ ID NO 67 y 74, Tabla 1) se utilizaron a 640nM para dirigir la reacción de amplificación. Las reacciones de PCR se realizaron con Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de ensamblaje PCR se llevaron a cabo utilizando las siguientes condiciones de termociclado: 98°C durante 2 minutos, 35 ciclos de 15 segundos a 98°C, 15 segundos a 62°C, 15 segundos a 72°C y una extensión final a 72°C durante 2 min. La calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa (1,5%, SYBR® Safe, Life Technologies, Grand Island, NY).
Se transcribieron entre 0,25-0,5 μg de la plantilla de ADN para los componentes del ARN guía utilizando el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7 (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante ~16 horas a 37 °C. Las reacciones de transcripción se trataron con DNasa I (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se purificaron con el kit de limpieza y concentración de ARN GeneJet (Life Technologies, Grand Island, NY). El rendimiento de ARN se cuantificó utilizando el sistema Nanodrop™ 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). La calidad del ARN transcrito se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa (2%,SYBR® Safe, Life Technologies, Grand Island, NY). Las secuencias de los componentes del ARN guía se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2:
El procedimiento descrito anteriormente para la producción de componentes de ARN guía puede aplicarse a la producción de otros componentes de ARN como se describe en el presente documento.
Ejemplo 2
Producción de regiones objetivo de ADN bicatenario para su uso en ensayos de escisión de Cas9
El ADN bicatenario objetivo para su uso en un ensayo de escisión Cas in vitro se produjo mediante amplificación por PCR de la región de orientación a partir de ADN genómico.
Las regiones objetivo de ADN bicatenario (por ejemplo, AAVS-1) para ensayos bioquímicos se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico (ADNg) de la línea celular humana K562 (ATCC, Manassas, VA) preparada con fenolcloroformo. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 20ng/^l de ADNg en un volumen final de 25^l para amplificar la región de orientación seleccionada en las siguientes condiciones: 98°C durante 2 minutos, 35 ciclos de 20s a 98°C, 20s a 60°C, 20s a 72°C, y una extensión final a 72°C durante 2 min. Los productos de PCR se purificaron con tubos de purificación de PCR Spin Smart™ (Denville Scientific, South Plainfield, NJ) y se cuantificaron con el espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop™ 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
Los cebadores directo e inverso utilizados para la amplificación de las secuencias orientadas a partir del ADNg fueron los siguientes. Los cebadores, el tamaño del amplicón y los tamaños de los fragmentos generados a partir de la escisión mediada por Cas9 se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3:
Otras regiones objetivo de ADN bicatenario adecuadas se obtienen utilizando esencialmente el mismo procedimiento. Para las regiones objetivo no humanas, se utiliza ADN genómico del organismo seleccionadofpor ejemplo, plantas, bacterias, levaduras, algas) en lugar de ADN derivado de células humanas. Además, pueden utilizarse fuentes de polinucleótidos distintas del ADN genómicofpor ejemplo, vectores y fragmentos de ADN aislados en gel).
Ejemplo 3
Ensayos de escisión de Cas9
Este ejemplo ilustra el uso de una crD(R)NA de la presente divulgación en ensayos de escisión de Cas9 in vitro para evaluar y comparar el porcentaje de escisión de complejos de proteína crD(R)NA/ARNtracr/Cas9 seleccionados en relación con secuencias objetivo de ADN bicatenario seleccionadas.
La actividad de escisión se determinó para una colección de variantes de crD(R)NAs (SEQ ID NOs: 38-62) contra un objetivo de ADN bicatenario (AAVS-1; Ejemplo 2, Tabla 3).
Cada ARNsg, ADNcr o crD(R)NA se mezcló con ARNtracr (si procede) en cantidades equimolares en un tampón de fusión (1,25mM HEPES, 0,625mM MgCh, 9,375mM KCl a pH7,5), se incubó durante 2 minutos a 95°C, se retiró del termociclador y se dejó equilibrar a temperatura ambiente.
El ARNsg, el ADNcr/ARNtracr y el crD(R)NA/ARNtracr se añadieron a una mezcla de reacción Cas9. La mezcla de reacción Cas9 comprendía proteína Cas9 diluida a una concentración final de 200|j M en tampón de reacción (HEPES 20mM, KCl 100mM, MgCh 5mM, DTT 1mM y 5% de glicerol a pH 7,4). En la mezcla de reacción, la concentración final de cada crD(R)NA/ARNtracr fue de 500 nM en cada mezcla de reacción. Cada mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 10 minutos. La reacción de escisión se inició mediante la adición de ADN objetivo a una concentración final de 15nM. Las muestras se mezclaron y centrifugaron brevemente antes de incubarlas durante 15 minutos a 37°C. Las reacciones de escisión se terminaron añadiendo proteinasa K (Denville Scientific, South Plainfield, NJ) a una concentración final de 0,2 jg / j l y 0,44 m g/jl de solución de RNasa A (SigmaAldrich, St. Louis, MO).
Las muestras se incubaron durante 25 minutos a 37°C y 25 minutos a 55°C. Se evaluó la actividad de escisión de 12 j l de la reacción total mediante electroforesis en gel de agarosa (2%, SYBR® Gold, Life Technologies, Grand Island, NY). En el caso del objetivo de ADN bicatenario AAVS-1, la aparición de bandas de ADN a ~316 pb y ~179 pb indicaba que se había producido la escisión del ADN objetivo. Los porcentajes de escisión se calcularon utilizando los valores del área bajo la curva calculados por FIJI (ImageJ; un programa de procesamiento de imágenes Java de código abierto) para cada fragmento de escisión y el ADN objetivo, y dividiendo la suma de los fragmentos de escisión por la suma de los fragmentos de escisión y el ADN objetivo.
La FIGURA 3 presenta los resultados del ensayo de escisión de Cas9 utilizando el ADN de doble cadena objetivo AAVS-1 de sgRNA, ADNcr/ARNtracr, y el crD(R)NA/ARNtracr. En la parte superior de cada panel hay un número de carril correspondiente al componente de ARN guía utilizado, las SEQ ID NOs correspondientes a cada componente se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Los porcentajes de escisión se muestran en la parte inferior de cada carril. Para ADNcr o ADNcr(R)NAs donde no se observó actividad de escisión (por ejemplo, FIGURA 3, 3; FIGURA 3 , 5; FIGURA 3, 15; FIg UrA 3, 33; FIGURA 3, 34; FIGURA 3 , 35) la actividad de escisión se expresa como n/d (indicando que no se detectó actividad de escisión).
Los datos presentados en la FIGURA 3 demuestran que las crD(R)NAs de la presente divulgación facilitan la escisión sitio-específica mediada por Cas9 de un ADN bicatenario objetivo.
Ejemplo 4
Actividad de crD(R)NA contra múltiples objetivos
Este ejemplo demuestra la actividad bioquímica in vitro de crD(R)NAs que comprenden diferentes espacios programados para dirigirse a secuencias específicas.
Las secuencias del ADNcr, ARNcr y crD(R)NA (mostradas en la Tabla 5) se proporcionaron a un fabricante comercial para su síntesis.
T l :
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Los objetivos de ADN bicatenario se generaron como se describe en el Ejemplo 2 utilizando los oligonudeótidos mostrados en la Tabla 3 correspondientes a la secuencia objetivo apropiada.
Se hibridaron ADNcr/ARNtracr, ARNcr/ARNtracr, y crD(R)NA/ARNtracr y se realizó la escisión bioquímica como se describe en el Ejemplo 3.
Las FIGURAS 4A y 4B muestran los resultados de la escisión bioquímica de diversos espaciadores. La FIGURA 4A muestra los porcentajes de escisión bioquímica. La actividad para el objetivo 1 de EMX se muestra en el grupo 1: donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B ' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para el objetivo 1 de VEGFA se muestra en el grupo 2: donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para la objetivo 1 de CD34 se muestra en el grupo 3: donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para la objetivo 2 de CD34 se muestra en el grupo 4: donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para la objetivo 1 de STAT5a se muestra en el grupo 5: donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para la objetivo 2 de STAT5a se muestra en el grupo 6: donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para la objetivo 1 de JAK1 se muestra en el grupo 7; donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. La actividad para la objetivo 2 de JAK1 se muestra en el grupo 8; donde 'A' es un control Cas9 solo, 'B ' es el ADNcr/ARNtracr/Cas9, 'C' es el ARNcr/ARNtracr/Cas9, y 'D' es el crD(R)NA/ARNtracr/Cas9. En todas las muestras con Cas9 solamente(FIGURA4A, 'A') y en las muestras con ADNcr/ARNtracr/cas9(FIGURA 4B, 'B'), no se detectó actividad de escisión (FIGURA 4A , n/d').
En la FIGURA 4B, el porcentaje de escisión se muestra en el eje "y" del gráfico y el objetivo se muestra en el eje "x". La actividad para el objetivo 1 de EMX se muestra en las barras del grupo 1. La actividad para el objetivo 1 de VEGFA se muestra en las barras del grupo 2. La actividad para el objetivo 1 de CD34 se muestra en las barras del grupo 3. La actividad para el objetivo 2 de CD34 se muestra en las barras del grupo 4. La actividad para el objetivo 1 de STAT5a se muestra en las barras del grupo 5. La actividad para el objetivo 2 de STAT5a se muestra en las barras del grupo 6.
La actividad para el objetivo 1 de JAK1 se muestra en las barras del grupo 7. La actividad para el objetivo 2 de JAK1 se muestra en las barras del grupo 8. 'C' y 'D' se refieren a las mismas reacciones que en la FIGURA 4A.
La FIGURA 4 demuestra que la escisión bioquímica mediada por Cas9 de un objetivo de ADN bicatenario utilizando la crD(R)NA de la presente divulgación es transferible a través de diferentes secuencias objetivo.
Ejemplo 5
Ensayo T7E1 para la detección de modificaciones objetivo en células eucariotas
Este ejemplo ilustra el uso de ensayos T7E1 para evaluar el porcentaje de escisión in vivo de crD(R)NA en relación con secuencias objetivo de ADN bicatenario seleccionadas.
A. Transfecciones celulares con componentes polinucleotídicos Cas
Los ARNsg y crD(R)NA/ARNtracr que comprenden una secuencia de orientación AAVS-1 fueron transfectados en células HEK293 que expresan constitutivamente la fusión SpyCas9-GFP (HEK293-Cas9-GFP), utilizando el Nucleofector® 96-well Shuttle System (Lonza, Allendale, NJ) y el siguiente protocolo. Se prepararon cantidades molares iguales de componentes de ARN guía en un tampón de fusión (HEPES 1,25mM, MgCh 0,625mM, KCl 9,375mM a pH 7,5), se incubaron durante 2 minutos a 95 °C, se retiraron del termociclador, se dejaron equilibrar a temperatura ambiente y se dispensaron en un volumen final de 10μl por triplicado en una placa de 96 pocillos. Se aspiró el medio de cultivo de las células HEK293-Cas9-GFP, y las células se lavaron una vez con PBS libre de calcio y magnesio y luego se tripsinizaron mediante la adición de TryμLE (Life Technologies, Grand Island, NY) seguida de incubación a 37°C durante 3-5 minutos. Las células tripsinizadas se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo para formar una suspensión unicelular y se añadieron al medio de cultivo completo DMEM compuesto por medio de cultivo DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) que contenía 10% de FBS (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y suplementado con penicilina y estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY).
A continuación, las células se transformaron en pellas por centrifugación durante 3 minutos a 200 * g, se aspiró el medio de cultivo y las células se resuspendieron en p Bs . Las células se contaron utilizando el contador de células automatizado Countess® II (Life Technologies, Grand Island, NY). Se transfirieron 2, 2 * 107 células a un tubo de 50 ml y se transformaron en pellas. Se aspiró el PBS y las células se resuspendieron en solución Nucleofector™ SF (Lonza, Allendale, NJ) hasta una densidad de 1 * 107 células/mL. Luego se agregaron 20 μl de la suspensión celular a pocillos individuales que contenían 10 μl de componentes de polinucleótido Cas y el volumen completo se transfirió a los pocillos de una placa Nucleocuvette™ de 96 pocillos (Lonza, Allendale, Nueva Jersey). La placa se cargó en el Nucleofector™ 96-well Shuttle™ (Lonza, Allendale, Nueva Jersey) y las células se nucleofectaron utilizando el programa 96-CM-130 Nucleofector™ (Lonza, Allendale, Nueva Jersey). Tras la nucleofección, se añadieron 70 μl de medio de cultivo completo DMEM a cada pocillo y se transfirieron 50 μl de la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 96 pocillos recubierta de colágeno que contenía 150 μl de medio de cultivo completo DMEM precalentado. Luego, la placa se transfirió a una incubadora de cultivo de tejidos y se mantuvo a 37 °C en CO2 al 5 % durante 48 horas.
B. Generación de ADN bicatenario objetivo para el ensayo T7E1
El ADNg se aisló de células HEK-293-SpyCas948 horas después de la transfección del componente polinucleótido Cas utilizando 50μl de solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre, Madison, WI) por pocillo, seguida de incubación a 37°C durante 10 minutos, 65°C durante 6 minutos y 95°C durante 3 minutos para detener la reacción. A continuación, el ADNg se diluyó con 150μl de agua y las muestras se almacenaron a -80°C.
El ADN para T7E1 se generó mediante amplificación por PCR de una secuencia objetivo de ADN bicatenario (por ejemplo, AAVS-1) a partir de ADNg aislado. Las reacciones de PCR se prepararon utilizando 8μl de ADNg como molde con KAPA HiFi Hot Start polimerasa y conteniendo 0,5U de polimerasa, 1x tampón de reacción, 0,4mM de dNTPs y 300nM de cebadores directos e inversos dirigidos al ADN bicatenario objetivo(por ejemplo, AAVS-1, SEQ ID NOs: 75, 76 (Tabla 3)) en un volumen total de 25uL. El ADN objetivo se amplificó utilizando las siguientes condiciones: 95°C durante 5 minutos, 4 ciclos de 20 s a 98°C, 20 s a 70°C, menos 2°C/ciclo, 30 s a 72°C, seguidos de 30 ciclos de 15 s a 98°C, 20 s a 62°C, 20 s a 72°C, y una extensión final a 72°C durante 1 minuto.
C. Ensayo T7E1
El ADN bicatenario objetivo amplificado por PCR para los ensayos T7E1 se desnaturalizó a 95°C durante 10 minutos y luego se dejó templar de nuevo enfriándolo a 25°C a -0,5°C/s en un termociclador. El ADN fusionado se incubó con 0,5mL de endonucleasa I T7 en tampón 1x NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA) en un volumen total de 15mL durante 25 minutos a 37°C. Las reacciones de T7E1 se analizaron utilizando el sistema FragmentAnalyzer™ (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA) y el kit de reactivos de ADN de doble cadena DNF-910 (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA). El sistema Fragment Analyzer™ proporciona la concentración de cada fragmento de escisión y del ADN bicatenario objetivo que queda tras la escisión.
Los porcentajes de escisión del ADN bicatenario objetivo se calcularon a partir de la concentración de cada fragmento de escisión y del ADN bicatenario objetivo, que queda después de la escisión, mediante la siguiente fórmula:
En la Ecuación 1, las concentraciones de "frag1" y "frag2" corresponden a la concentración de los fragmentos de escisión Cas del ADN bicatenario objetivo y "padre" corresponde al ADN bicatenario objetivo que queda después de la escisión.
La FIGURA 5 muestra los resultados de un ensayo T7E1 de ADNg preparado a partir de células transfectadas con crD(R)NAs a diversas concentraciones. Encima de cada gráfico de barras se muestra el porcentaje promedio de indeles detectados (calculado mediante la ecuación 1). Los porcentajes son el promedio de tres muestras, excepto en la FIGURA 5, barra 4, en donde sólo se detectó actividad en dos muestras, y en la FIGURA 5, barra 5, en donde sólo se detectó actividad en una muestra. La concentración de crD(R)NA/ARNtracr o ARNsg nucleofectados en las células se muestra en la Tabla 6.
T l :
El ensayo T7E1 para la detección de modificaciones objetivo en células eucariotas proporciona datos que demuestran que los sistemas crD(R)NA/ARNtracr/Cas9 descritos en el presente documento facilitan la escisión in vivo sitioespecífica mediada por Cas del ADN bicatenario objetivo.
Siguiendo la guía descrita en el presente documento, el ensayo T7E1 descrito en este ejemplo puede ser practicado por un experto ordinario en la técnica para medir la actividad de células modificadas con otros sistemas CRISPR-Cas, incluyendo, pero no limitado a Cas9, Cas9-like, Cas1, Csn2, Cas4, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, proteínas codificadas por ortólogos de Cas9, proteínas sintéticas similares a Cas9, fusiones de Cas9, y variantes y modificaciones de las mismas, combinadas con sus componentes polinucleotídicos afines modificados como se describe en el presente documento para comprender un crD(R)NA.
Ejemplo 6
Actividad de escisión de crD(R)NA dentro/fuera del objetivo
Este ejemplo ilustra el uso de crD(R)NAs para evaluar la actividad de escisión de un objetivo en el sitio objetivo previsto ("en el objetivo") y los sitios vecinos más cercanos previstos ("fuera del objetivo"). Las secuencias objetivo de los sitios en/fuera del objetivo se muestran en la Tabla 7:
T l 7:
(continuación)
Las secuencias ARNcr y crD(R)NA se proporcionaron a un fabricante comercial para su síntesis. ARNtracr se construyó como se describe en el Ejemplo 1.
Los objetivos de ADN bicatenario se generaron como se describe en el Ejemplo 2 utilizando los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 8 correspondientes a la secuencia objetivo apropiada.
Tabla 8:
Se hibridaron ARNcr/ARNtracr y ARNcrD(R)NA/ARNtracr y se llevó a cabo la escisión bioquímica como se describe en el Ejemplo 3.
La FIGURA 6 muestra la comparación de la actividad bioquímica de un ARNcr/ARNTr y ARNcrD(R)NA/ARNTr en los sitios en el objetivo previstos y en cuatro sitios fuera del objetivo predichos computacionalmente. El porcentaje de escisión se muestra en el eje y las muestras en el eje x. La Tabla 9 recoge las muestras:
T l :
Los datos presentados en la FIGURA 7 muestran que los crD(R)NAs mantienen una alta actividad en el objetivo en comparación con el ARNcr. Los crD(R)NAs no soportan la actividad fuera del objetivo mientras que los ARNcr tienen una actividad fuera del objetivo indeseable.
Ejemplo 7
Análisis de secuenciación profunda para la detección de modificaciones objetivo en células eucariotas
Este ejemplo ilustra el uso del análisis de secuenciación profunda para evaluar y comparar el porcentaje de escisión in vivo de complejos proteicos sgD(R)NA/Cas9 seleccionados en relación con secuencias objetivo de Ad N bicatenario seleccionadas.
A. Síntesis de sgD(R)NA
Se proporcionaron a un fabricante comercial para su síntesis seis secuencias sgD(R)NA dirigidas al locus AAVS-1 humano y que comprendían diferentes composiciones de ADN/ARN y enlaces protegidos con fosforotioato. Estas secuencias se muestran en la Tabla 10.
T l 1 :
(continuación)
B. Formación de complejos RNP de la proteína sgD(R)NA/Cas9
La proteína Cas9 se expresó a partir de un vector de expresión bacteriana en E. coli (BL21 (DE3)) y se purificó utilizando cromatografía de intercambio iónico de afinidad y de exclusión por tamaño de acuerdo con los procedimientos descritos en Jinek et al. (Science; 337(6096):816-21(2012)). La secuencia codificadora de Streptococcus pyogenes Cas9 incluía dos secuencias de localización nuclear (NLS) en el extremo C-terminal. Se ensamblaron complejos de ribonucleoproteínas (RNP), por triplicado, a dos concentraciones, 20pmol Cas9:60pmoles sgD(R)NA y 200pmoles Cas9:600pmoles sgD(R)NA. Los componentes sgD(R)NA se mezclaron en cantidades equimolares en un tampón de fusión (HEPES 1,25mM, MgCl20,625mM, KCl 9,375mM a pH7,5) hasta la concentración deseada (60pmols o 600pmols) en un volumen final de 5^l, se incubaron durante 2 minutos a 95°C, se retiraron del termociclador y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente. La proteína Cas9 se diluyó a una concentración adecuada en tampón de unión (HEPES 20mM, KCl 100mM, MgCl25mM, DTT 1mM y 5% de glicerol a pH 7,4) hasta un volumen final de 5^l y se mezcló con los 5^l de crD(R)NAs desnaturalizados por calor, tras lo cual se incubó a 37°C durante 30 minutos.
C. Transfecciones celulares con RNPs de proteína sgD(R)NA/Cas9
Los complejos RNP fueron transfectados en células K562 (ATCC, Manassas, VA), utilizando el Nucleofector® de 96 pocilios Shuttle System (Lonza, Allendale, NJ) y el siguiente protocolo. Las Cas9-RNPs se dispensaron en un volumen final de 5 μl en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Las células K562 suspendidas en medio se transfirieron de un matraz de cultivo a un tubo cónico de 50 ml. Las células se transformaron en pellas por centrifugación durante 3 minutos a 200 * g, se aspiró el medio de cultivo y se lavaron una vez con PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, las células K562 se transformaron en pellas por centrifugación durante 3 minutos a 200 * g, se aspiró el PBS y se resuspendió la pella celular en 10mL de PBS libre de calcio y magnesio.
Las células se contaron utilizando el contador de células automatizado Countess® II (Life Technologies, Grand Island, NY). Se transfirieron 2, 2 * 107 células a un tubo de 50 ml y se transformaron en pellas. Se aspiró el PBS y las células se resuspendieron en solución Nucleofector™ SF (Lonza, Allendale, NJ) hasta una densidad de 1 * 107 células/mL. Se agregaron 20 μl de la suspensión celular a pocillos individuales que contenían 10 μl de complejos RNP y el volumen completo se transfirió a los pocillos de una placa Nucleocuvette™ de 96 pocillos (Lonza, Allendale, Nueva Jersey). La placa se cargó en el Nucleofector™ 96-well Shuttle™ (Lonza, Allendale, Nueva Jersey) y las células se nucleofectaron utilizando el programa 96-FF-120 Nucleofector™ (Lonza, Allendale, Nueva Jersey). Tras la nucleofección, se añadieron 70 μl de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Life Technologies, Grand Island, NY), suplementado con un 10% de FBS (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), penicilina y estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY) a cada pocillo y se transfirieron 50 μl de la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 96 pocillos que contenía 150 μl de medio de cultivo completo IMDM precalentado. Luego, la placa se transfirió a una incubadora de cultivo de tejidos y se mantuvo a 37 °C en CO2 al 5 % durante 48 horas.
D. Generación de ADN bicatenario objetivo para secuenciación profunda
El ADNg se aisló de las células K562 48 horas después de la transfección con RNP utilizando 50μl de solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre, Madison, WI) por pocillo, seguido de incubación a 37°C durante 10 minutos, 65°C durante 6 minutos y 95°C durante 3 minutos para detener la reacción. Los ADNg aislados se diluyeron en 50 μl de agua y las muestras se almacenaron a -80 °C.
Utilizando el ADNg aislado, se realizó una primera PCR utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) a concentración 1x, cebadores a 0,5μM cada uno (SEQ ID NOs: 93, 94), 3,75μl de ADNg en un volumen final de 10uL y se amplificó a 98°C durante 1 minuto, 35 ciclos de 10s a 98°C, 20s a 60°C, 30s a 72°C, y una extensión final a 72°C durante 2 min. La reacción PCR se diluyó 1:100 en agua.
Se estableció una PCR de "código de barras" utilizando cebadores únicos para cada muestra con el fin de facilitar la secuenciación multiplex. Las muestras y los pares de cebadores correspondientes se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11:
(continuación)
(continuación)
La PCR de código de barras se realizó utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) a concentración 1x, cebadores a 0,5|j M cada uno, 1 jl de primera PCR diluida 1:100, en un volumen final de 10 jl y amplificación a 98°C durante 1 minuto, 12 ciclos de l0s a 98°C, 20s a 60°C, 30s a 72°C, y una extensión final a 72°C durante 2 min.
E. Limpieza de SPRIselect
Las reacciones de PCR se agruparon en un único tubo de microcentrífuga para la limpieza de amplicones mediante perlas SPRIselect (Beckman Coulter, Pasadena, CA) para la secuenciación.
A los amplicones agrupados se añadieron volúmenes 0,9x de perlas SPRIselect, se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos. El tubo de microcentrífuga se colocó en un soporte magnético para tubos (Beckman Coulter, Pasadena, CA) hasta que se aclaró la solución. Se eliminó y desechó el sobrenadante, y las perlas residuales se lavaron con 1 volumen de etanol al 85% y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 segundos. Tras la incubación, se aspiró el etanol y las perlas se secaron al aire a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se retiró el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y se añadieron volúmenes 0,25x de tampón EB de Qiagen (Qiagen, Venlo, Limburgo) a las perlas, se mezclaron enérgicamente y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente. El tubo de microcentrífuga se volvió a colocar en el imán, se incubó hasta que la solución se aclaró y el sobrenadante que contenía los amplicones purificados se dispensó en un tubo de microcentrífuga limpio. La biblioteca de amplicones purificada se cuantificó con el sistema Nanodrop™ 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) y la calidad de la biblioteca se analizó con el sistema Fragment Analyzer™ (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA) y el kit de reactivos de ADN de doble cadena DNF-910 (Advanced Analytical Technologies, Inc. Ames, IA).
F. Configuración de secuenciación profunda
La biblioteca de amplicones se normalizó a una concentración de 4 nmolar calculada a partir de los valores de Nanodrop y el tamaño de los amplicones. Las bibliotecas se analizaron en el secuenciador MiSeq (Illumina, San Diego, CA) con el kit de reactivos MiSeq v2 (Illumina, San Diego, CA) durante 300 ciclos con dos corridas de 151 ciclos de extremo pareado más dos lecturas de índice de ocho ciclos.
G. Análisis de datos de secuenciación profunda
La identidad de los productos en los datos de secuenciación se determinó basándose en las secuencias de código de barras índice adaptadas en los amplicones en la ronda de código de barras de la PCR. Se utilizó una programación computacional para procesar los datos de MiSeq mediante la ejecución de las siguientes tareas:
• Las lecturas se alinearon con el genoma humano (construir GRCh38/38) utilizando el programa Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml).
• Las lecturas alineadas se compararon con la secuencia esperada del locus AAVS-1 de tipo silvestre; las lecturas que no se alineaban con ninguna parte del locus AAVS-1 se descartaban.
• Se contaron las lecturas que coincidían con la secuencia AAVS-1 de tipo silvestre.
• Las lecturas con indeles (inserción o eliminación de bases) se clasificaron por tipo de indel y se contabilizaron.
• El total de lecturas de indel se dividió por la suma de lecturas de tipo silvestre y lecturas de indel para obtener el porcentaje de indeles detectados.
La FIGURA 7 muestra los resultados de un análisis del locus objetivo AAVS-1 de células K562 humanas nucleofectadas con sgD(R)NA/Cas9 orientado a una región del locus AAVS-1. El eje x muestra la SEQ ID NO. Para el sgD(R)NA utilizado, el eje y muestra el porcentaje de indel detectado a partir de los datos de MiSeq. La serie A muestra el porcentaje medio de indeles detectados en tres réplicas independientes para una determinada sgD(R)NA a 20pmols Cas9:120pmols sgD(R)NA, y la serie B muestra el porcentaje medio de indeles detectados en tres réplicas independientes para una determinada sgD(R)NA a 100pmols Cas9:600pmols sgD(R)NA. La desviación estándar del porcentaje medio de las tres réplicas se representa mediante líneas negras verticales. Los números debajo de las barras corresponden al SEQ ID NO. de la sgD(R)NA utilizada en la transfección, las secuencias de la sgD(R)NA se proporcionan en la Tabla 10. Estos datos demuestran la capacidad de diversos tipos de sgD(R)NA para inducir modificaciones en una región de orientación en células humanas de forma específica para la secuencia y dependiente de la dosis.
Los procedimientos en el presente documento descritos fueron practicados por un experto en la técnica para demostrar la actividad in vivo de un sgD(R)NA/Cas9 mediante el análisis de secuenciación profunda.
Ejemplo 8
Cribado de múltiples crD(R)NA con secuencias de unión a objetivos de ADN
Este ejemplo ilustra el uso de crD(R)NAs de la presente divulgación para modificar objetivos presentes en ADN genómico humano y medir el nivel de actividad de escisión en esos sitios. En primer lugar, se pueden seleccionar los sitios objetivo a partir del ADN genómico y, a continuación, se pueden diseñar crD(R)NA para que se dirijan a esas secuencias seleccionadas. A continuación, se pueden realizar mediciones para determinar el nivel de escisión del objetivo que se ha producido. No todos los pasos siguientes son necesarios para cada cribado ni el orden de los pasos debe ser el presentado, y el cribado puede acoplarse a otros experimentos o formar parte de un experimento mayor.
A. Selección de una región de orientación de ADN a partir de ADN genómico
Identificar todas las secuencias PAM(por ejemplo, 'NGG') dentro de la región genómica seleccionada.
Identificar y seleccionar una o más secuencias largas de 20 nucleótidos (secuencia de ADN objetivo) que sean 5' adyacentes a secuencias PAM.
Los criterios de selección pueden incluir, entre otros: homología con otras regiones del genoma; porcentaje de contenido G-C; temperatura de fusión; presencia de homopolímero en el espaciador; y otros criterios conocidos por los expertos en la técnica.
Anexar una secuencia crD(R)NA apropiada al extremo 3' de la secuencia de ADN objetivo identificada. Un constructo crD(R)NA se sintetiza típicamente por un fabricante comercial y el ARNtracr cognado se produce como se describe en el Ejemplo 1 por transcripción in vitro.
Un crD(R)NA tal como el descrito en el presente documento puede usarse con ARNtracr cognado para completar un sistema crD(R)NA/ARNtracr para uso con una proteína Cas cognada.
B. Determinación de los porcentajes de escisión y de la especificidad
Los porcentajes de escisión in vitro y la especificidad asociada con un sistema crD(R)NA/ARNtracr se comparan, por ejemplo, utilizando los ensayos de escisión Cas del Ejemplo 3, como sigue:
(a) Si sólo se identifica o selecciona una única secuencia de ADN objetivo, se puede determinar el porcentaje de escisión y la especificidad para la región de objetivo de ADN. Si se desea, el porcentaje de escisión y/o la especificidad pueden alterarse en experimentos posteriores utilizando procedimientos de la presente divulgación, incluyendo, pero sin limitarse a la modificación de la crD(R)NA, la introducción de proteínas efectoras/secuencias de unión a proteínas efectoras o ligando/fracciones de unión a ligando.
(b) Los datos de porcentaje de escisión y los datos de especificidad de sitio obtenidos de los ensayos de escisión pueden compararse entre diferentes a Dn que comprenden la secuencia de unión al objetivo para identificar las secuencias de ADN objetivo que tienen el mejor porcentaje de escisión y la mayor especificidad. Los datos sobre el porcentaje de escisión y la especificidad proporcionan criterios en los que basar las elecciones para diversas aplicaciones. Por ejemplo, en algunas situaciones la actividad de crD(R)NA puede ser el factor más importante. En otras situaciones, la especificidad del sitio de escisión puede ser relativamente más importante que el porcentaje de escisión. Si así se desea, el porcentaje de escisión y/o la especificidad se alteran en experimentos posteriores utilizando procedimientos de la presente divulgación que incluyen, entre otros, la modificación de crD(R)NA, la introducción de proteínas efectoras/secuencias de unión a proteínas efectoras o ligando/fracciones de unión a ligando.
Opcionalmente, o en lugar del análisis in vitro, se comparan los porcentajes de escisión in vivo y la especificidad asociada a un sistema crD(R)NA, por ejemplo, utilizando el ensayo T7E1 descrito en el Ejemplo 5, como sigue:
(a) Si sólo se identifica una secuencia de ADN objetivo, se puede determinar el porcentaje de escisión y la especificidad para la región objetivo de ADN. Si así se desea, el porcentaje de escisión y/o la especificidad se alteran en experimentos posteriores utilizando procedimientos de la presente divulgación que incluyen, entre otros, la modificación de crD(R)NA, la introducción de proteínas efectoras/secuencias de unión a proteínas efectoras o ligando/fracciones de unión a ligando.
(b) Los datos de porcentaje de escisión y los datos de especificidad de sitio obtenidos de los ensayos de escisión pueden compararse entre diferentes ADN objetivo para identificar una secuencia crD(R)NA que produzca el mayor porcentaje de escisión del ADN objetivo y la mayor especificidad para el ADN objetivo. Los datos sobre el porcentaje de escisión y la especificidad proporcionan criterios en los que basar las elecciones para diversas aplicaciones. Por ejemplo, ciertas realizaciones pueden depender de la actividad de un crD(R)NA y puede ser el factor más importante.
En ciertas realizaciones, la especificidad del sitio de escisión puede ser relativamente más importante que el porcentaje de escisión. En ciertas realizaciones, el porcentaje de escisión y/o la especificidad pueden alterarse utilizando procedimientos de la presente divulgación, incluyendo, pero sin limitarse a la modificación del ARN, la introducción de proteínas efectoras/secuencias de unión a proteínas efectoras o fracciones de unión a ligando/ligando.
Siguiendo la guía de la presente memoria descriptiva y ejemplos, el cribado descrito en este ejemplo puede ser practicado por un experto ordinario en la técnica con otras proteínas CRISPR Cas de Clase II, incluyendo, pero no limitado a Cas9, Cas9-like, Cas, Cas3, Csn2, Cas4, proteínas codificadas por ortólogos de Cas9, proteínas sintéticas similares a Cas9, fusiones de Cas9, Cpfl, similar a Cpfl, C2c1, C2c2, C2c3, y variantes y modificaciones de las mismas, combinadas con sus componentes polinucleotídicos afines modificados como se describe en el presente documento para comprender un crD(R)NA.
Ejemplo 9
crD(R)NA: ARNtracr y sgD(R)NA mellado mediado
Este ejemplo ilustra el procedimiento a través del cual un complejo crD(R)NA: ARNtracr o sgD(R)NA de la presente divulgación podría utilizarse para inducir mellas en un objetivo plasmídico de ADN de doble cadena (ADNds) junto con S. pyogenes Cas9 que contiene una mutación D10A (Cas9-D10A) que deja inactivo el lóbulo de la nucleasa RuvC. No se requieren todos los pasos siguientes, ni el orden de los pasos debe ser el presentado.
La Cas9 de S. pyogenes tiene dos dominios de nucleasa activos, el RuvC y el HNH. Una mutación del ácido aspártico en la décima posición aminoacídica del Cas9 de S. pyogenes, convirtiéndolo en una alanina, reduce la capacidad nucleasa del dominio RuvC. El dominio HNH permanece activo, pero el polipéptido Cas9-D10A dirigido al sitio sólo puede causar mellas en la cadena principal fosfodiéster de la cadena objetivo de ADN complementaria a la secuencia espaciadora.
Se describen ejemplos de vectores, medios, condiciones de cultivo, etc. adecuados. Las modificaciones de estos componentes y condiciones serán comprendidas por un experto en la técnica a la vista de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.
Los reactivos guía se generaron de acuerdo con el Ejemplo 1 de la presente memoria descriptiva.
El objetivo de ADNds se generó como se describe en el Ejemplo 2 utilizando los SEQ ID NOs 133 y 134. A continuación, el fragmento amplificado se clonó en un vector adecuado compatible con LIC. Uno de estos vectores adecuados es el vector de clonación pET His6 LIC disponible en el mercado (Addgene, Cambridge, MA). El plásmido se transformó en una cepa bacteriana para la expresión del plásmido, utilizando células bacterianas XL1-Blu disponibles en el mercado (Agilent, Santa Clara, CA).
Las células bacterianas que contenían los vectores LIC se cultivaron en medio LB suplementado con 100ug/mL de ampicilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 18 horas a 37°C. Las células se centrifugaron a 5.000 rpm durante 15 minutos, tras lo cual se extrajo el plásmido utilizando Qiagen Plasmid Kit (Qiagen, Venlo, Países Bajos).
La escisión bioquímica del plásmido purificado se realizó como se detalla en el Ejemplo 3 de la presente memoria descriptiva, con la modificación de que el ADN objetivo se sustituyó por el plásmido purificado a una concentración final de 1nM en la reacción. Se hibrido crD(R)NA con ARNtracr (s Eq ID NO: 2) del modo descrito en el Ejemplo 3.
Las reacciones bioquímicas se analizaron en un gel de agarosa al 1% teñido con SYBR gold (Life Technologies, Grand Island, NY). La eficacia del mellado se calculó a partir de la desaparición de la forma superenrollada del plásmido y la aparición de la forma circular abierta mellada del plásmido (plásmido mellado), que se distinguía por el cambio en la velocidad de migración del plásmido en el gel.
Los porcentajes del plásmido mellado se calcularon a partir de las intensidades de las bandas teñidas en el gel que contenía el plásmido mellado y el plásmido superenrollado. Las intensidades se midieron utilizando los valores del área bajo la curva calculados por FIJI (ImageJ; un programa de procesamiento de imágenes Java de código abierto). Los porcentajes de mellado se calcularon dividiendo la intensidad de tinción del plásmido mellado por la suma de las intensidades de tinción de las especies de plásmido mellado y de plásmido superenrollado.
Las SEQ ID NOs para el crD(R)NA y sgD(R)NA usados en este experimento se muestran en la Tabla 12.
T l 12:
(continuación)
La FIGURA 8 muestra los resultados de la actividad de mellado bioquímico de un crD(R)NA o sgD(R)NA con una proteína Cas9-D10A contra un objetivo plasmídico. Las muestras crD(R)NA y sgD(R)NA se muestran en el eje de abscisas y corresponden a los identificadores de muestra que aparecen en la Tabla 12. Los datos muestran la capacidad de crD(R)NA y sgD(R)NA para apoyar la actividad de mellado de la proteína Cas9-D10A contra un plásmido objetivo. Los datos también muestran que el truncamiento de la secuencia espaciadora desde el extremo 5' del espaciador (SEQ ID NOs: 135, 136 y 137) es capaz de ejercer una actividad de mellado.
Siguiendo la guía de la presente memoria descriptiva y los ejemplos expuestos en el presente documento, el diseño y validación de la actividad de mellado de crD(R)NA: ARNtracr y sgD(R)NA puede ser practicado por un experto en la técnica.
Ejemplo 10
Identificación y cribado de ARN CRISPR y ARN CRISPR transactivador
Este ejemplo ilustra el procedimiento a través del cual se pueden identificar los ARN CRISPR (ARNcr) y los ARN CRISPR trans-activadores (ARNtracr) de un sistema CRISPR-Cas Tipo II. El procedimiento que aquí se presenta es una adaptación de Chylinski, et. al., (RNA Biol;10(5):726-37 (2013)). No todos los pasos siguientes son necesarios para la selección ni el orden de los pasos debe ser el presentado.
A. Identificar una especie bacteriana que contenga un sistema CRISPR-Cas9 de tipo II
Utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico (BLAST, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), se realiza una búsqueda en los genomas de diversas especies para identificar proteínas Cas9 o similares a Cas9. Los sistemas CRISPR-Cas9 de tipo II presentan una gran diversidad de secuencias entre especies bacterianas, aunque los ortólogos de Cas9 presentan una arquitectura de dominio conservada, con un dominio central de endonucleasa HNH y un dominio RuvC/RNasa H dividido. Los resultados primarios de BLAST se filtran en función de los dominios identificados; se descartan las secuencias incompletas o truncadas y se identifican los ortólogos de Cas9.
Cuando se identifica un ortólogo de Cas9 en una especie, las secuencias adyacentes a la secuencia codificante del ortólogo de Cas9 son sondeadas para otras proteínas Cas y una matriz de repetición-espaciador asociada con el fin de identificar todas las secuencias pertenecientes al locus CRISPR-Cas. Esto puede hacerse mediante la alineación con otros loci CRISPR-Cas de tipo II ya conocidos en el dominio público, con el conocimiento de que las especies estrechamente relacionadas exhiben una arquitectura de locus CRISPR-Cas9 similar^ es decir, composición de la proteína Cas, tamaño, orientación, ubicación de la matriz, ubicación del ARNtracr, etc.).
B. Identificación de ARNcr putativo y ARNtracr
Dentro del locus, los ARNcr son fácilmente identificables por la naturaleza de sus secuencias repetidas intercaladas por fragmentos de ADN extraño y conforman la matriz repetido-espaciador. Si la secuencia repetida procede de una especie conocida, se identifica y se recupera de la base de datos CRISPRdb (crispr.u-psud.fr/crispr/). Si no se conoce la secuencia de repetición asociada a una especie, las secuencias de repetición se predicen mediante el programa informático CRISPRfinder (crispr.u-psud.fr/Server/) utilizando la secuencia identificada como locus CRISPR-Cas de tipo II para la especie, tal como se ha descrito anteriormente.
Una vez que la secuencia de la secuencia repetida es identificada para la especie, el ARNtracr es identificado por su secuencia complementaria a la secuencia repetida en la matriz repetido-espaciador (secuencia tracr anti-repetición). El
cribado predictivo in silico se utiliza para extraer la secuencia antirrepetición con el fin de identificar el ARNtracr asociado. Los antirrepeticiones putativos se seleccionan, por ejemplo, de la siguiente manera.
La secuencia repetida identificada para una especie determinada se utiliza para sondear el locus CRISPR-Cas9 en busca de la secuencia antirrepetida (por ejemplo, utilizando el algoritmo BLASTp o similar). La búsqueda suele restringirse a las regiones intrónicas del locus CRISPR-Cas9.
Se valida la complementariedad de una región antirrepetición identificada con la secuencia repetida identificada. Se sondea una región anti-repetición putativa tanto 5' como 3' de la anti-repetición putativa para un terminador transcripcional independiente de Rho (TransTerm HP, transterm.cbcb.umd.edu/).
Así, se determina que la secuencia identificada que comprende el elemento antirrepetición y el terminador transcripcional independiente de Rho es el putativo ARNtracr de la especie dada.
C. Preparación de la biblioteca RNA-Seq
El ARNcr putativo y el ARNtracr que se identificaron in silico son validados adicionalmente usando secuenciación de ARN (ARNseq).
Las células de las especies de las que se identificaron el ARNcr putativo y el ARNtracr se obtienen de un depósito comercial (por ejemplo, ATCC, Manassas, VA; DSMZ, Braunschweig, Alemania).
Las células se cultivan hasta la mitad de la fase logarítmica y el ARN total se prepara utilizando el reactivo Trizol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se trata con DNasaI (Fermentas, Vilnius, Lituania).
10ug del ARN total se tratan con Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina, San Diego, CA) y el ARN restante se purifica utilizando RNA Clean y Concentrators (Zymo Research, Irvine, CA).
A continuación, se prepara una biblioteca utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño TruSeq (Illumina, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, lo que da lugar a la presencia de secuencias adaptadoras asociadas al ADNc.
La biblioteca de ADNc resultante se secuencia utilizando el secuenciador MiSeq (Illumina, San Diego, CA).
D. Tratamiento de los datos de secuenciación
Las lecturas de secuenciación de la biblioteca de ADNc pueden procesarse mediante el siguiente procedimiento. Las secuencias adaptadoras se eliminan utilizando cutadapt 1.1 (pypi.python.org/pypi/cutadapt/1.1) y se recortan 15 nt del extremo 3' de la lectura para mejorar la calidad de la misma.
Las lecturas se alinean de nuevo con el genoma de cada especie respectiva (a partir del cual se identificó el ARNtracr putativo) con un margen de desajuste de 2 nucleótidos.
La cobertura de lectura se calcula utilizando BedTools (bedtools.readthedocs.org/en/latest/).
Integrative Genomics Viewer (IGV, www.broadinstitute.org/igv/) se utiliza para mapear la posición inicial (5') y final (3') de las lecturas. Las lecturas totales recuperadas para el ARNtracr putativo se calculan a partir del archivo SAM de alineaciones.
Los datos de ARN-seq se utilizan para validar que un elemento putativo de ARNcr y ARNtracr se transcribe activamente in vivo. Las coincidencias confirmadas a partir de la combinación de los cribados in silico y RNA-seq se validan para la capacidad funcional de las secuencias identificadas de ARNcr y ARNtracr para apoyar la escisión mediada por Cas9 de un objetivo de ADN de doble cadena utilizando procedimientos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos 1,2 y 3).
Siguiendo la guía de la presente memoria descriptiva y los ejemplos expuestos en el presente documento, la identificación de nuevas secuencias de ARNcr y ARNtracr puede ser practicada por un experto en la técnica.
Ejemplo 11
Diseño de crD(R)NA y sgD(R)NA
Este ejemplo ilustra el procedimiento a través del cual crD(R)NA y sgD(R)NA son diseñados a partir de ARNcr y ARNtracr, respectivamente. No todos los pasos siguientes son necesarios para la selección ni el orden de los pasos
debe ser el presentado.
La identificación de las secuencias guía de ARNcr y ARNtracr para una especie dada se realiza como se describe en el Ejemplo 10.
Las secuencias identificadas de ARNcr y ARNtracr se transcriben inversamente in silico a ADN. Los elementos de tallo superior, tallo inferior y protuberancia se identifican a partir de las secuencias del ARNcr y del ARNtracr. Se introducen bases de ARN en la secuencia de ADN de las secuencias ADNcr y ADNtracr creando crD(R)NA y sgD(R)NA, respectivamente. La colocación, el número y la distribución de las bases de ARN dentro del ADNcr y el ARNtracr pueden elegirse utilizando procedimientos de cribado computacionales o experimentales. Se diseña una colección de crD(R)NAs con ribonucleótidos colocados en distintos lugares de la molécula. Preferiblemente, los desoxirriboucleótidos dentro del tallo inferior se sustituyen por ribonucleótidos en algunas secuencias crD(R)NA. Los ribonucleótidos se sustituyen en el extremo 3' de la secuencia espaciadora en algunas secuencias crD(R)NA. Las secuencias adicionales crD(R)NA y sgD(R)NA se diseñan, por ejemplo, como sigue.
Se realizan búsquedas en repositorios de estructuras tridimensionales de proteínas (por ejemplo, RCSB PDB; rcsb.org) de dominio público para identificar estructuras de endonucleasas Cas. En el repositorio se buscan archivos de coordenadas de alta resolución de endonucleasas Cas unidas a sus ARNcr y ARNtracr afines. Los vecinos estructurales, definidos por similitudes estructurales terciarias o de secuencia con la endonucleasa Cas de interés, se utilizan si no existe una estructura resuelta para la endonucleasa Cas de interés. Se descargan los archivos de coordenadas depositados. Utilizando software de visualización, tal como PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7.4 Schrodinger, LLC), se analizan las coordenadas para identificar las interacciones específicas de ribosa entre la proteína endonucleasa Cas y los nucleótidos del ARNcr y el ARNtracr. Las posiciones en las que la proteína entra en contacto directo o indirecto (es decir, a través de un intermediario de agua o metal) con los nucleótidos del ARNcr y el ARNtracr se utilizan para identificar las posiciones favorecidas dentro de las secuencias guía para sustituir los desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos u otras variantes de nucleótidos.
Las secuencias de ARNcr y ARNtracr se conservan cuando se comparan con proteínas Cas9 de especies relacionadas. El alineamiento de una secuencia guía con las demás secuencias guía conocidas de especies similares proporciona información adicional sobre las bases conservadas que conferirían una preferencia por los ribonucleótidos. Las alineaciones de secuencias múltiples de ARNcr o ARNtracr se realizan utilizando el programa informático MUSCLE (ebi.ac.uk/Tools/mas/muscle/). A continuación, se evalúan los alineamientos en busca de posiciones de secuencias de nucleótidos conservadas a lo largo de la columna vertebral.
El software de predicción de la estructura secundaria del ácido nucleico (por ejemplo, RNAfold; rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAfold.cgi) se utiliza para analizar el plegamiento de la columna vertebral guía. Las regiones en las que se favorecerían los ángulos de torsión específicos del ARN se utilizan para informar de la ubicación de los ribonucleótidos tanto en el ADNcr como en el ADNtracr.
Las combinaciones de estructura secundaria, interacción proteína-ácido nucleico y conservación de secuencia se utilizan para informar el posicionamiento de los ribonucleótidos dentro de la secuencia crD(R)NA, tracrD(R)NA y sgD(R)NA. Se prueban múltiples diseños de crD(R)NA y tracrD(R)NA con el entendimiento de que diferentes configuraciones pueden apoyar diferentes propiedades deseadas (es decir, actividad, especificidad, estabilidad, etc.). El crD(R)NA y el tracrD(R)NA pueden unirse en una sola molécula mediante un enlazador para formar un sgD(R)NA. La combinación de crD(R)NA y tracrD(R)NA puede ir acompañada de una reducción del número total de nucleótidos en el extremo 3' de crD(R)NA y en el extremo 5' de tracrD(R)NA que juntos formarían el tallo superior. Las SEQ ID NOs 138-142, 147-150, 154-157, y 161-164 muestran diseños para crD(R)NAs y tracrD(R)NAs. Las SEQ ID NOs 143 146, 151-153, 158-160, y 165-167 muestran diseños para sgD(R)NAs. La tabla 13 indica la identidad de las secuencias.
T l 1 :
(continuación)
Las secuencias se proporcionan a un fabricante comercial(por ejemplo, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) para su síntesis.
Se prueban experimentalmente crD(R)NA, tracrD(R)NA, y sgD(R)NA para determinar la actividad de diferentes secuencias para apoyar la escisión mediada por Cas9 de un objetivo de ADN de doble cadena utilizando procedimientos establecidos en el presente documento (véanse los Ejemplos 1,2 y 3).
Siguiendo la guía de la presente memoria descriptiva y los ejemplos expuestos en el presente documento, el diseño y validación de nuevas secuencias crD(R)NA, tracrD(R)NA, y sgD(R)NA puede ser practicado por un experto en la técnica.
Ejemplo 12
Diseño de elementos crD(R)NA y sgD(R)NA de Cpf1 de tipo V y uso con Cpf1 para modificar el ADN
Las Tablas 14 y 15 a continuación proporcionan guías duales crD(R)NAs y sgD(R)NAs ejemplares para su uso con sistemas CRISPR Tipo V. La referencia a figuras ejemplares y SEQ ID NOs no pretende ser limitativa en modo alguno y se entiende por un experto en la técnica que, sobre la base de la divulgación en las Tablas 14, 15, y las SEQ ID Nos asociados y figuras ejemplares, la guía dual crD(R)NAs y sgD(R)NAs para su uso con sistemas CRISPR de tipo V puede diseñarse para dirigirse a cualquier secuencia deseada dentro de un ácido nucleico objetivo.
Tabla 14:
(continuación)
T l 1:
(continuación)
A. Diseño de elementos Cpf1 crD(R)NA y sgD(R)NA de tipo V
Los ortólogos de Cpf1 se identifican utilizando programas de análisis de secuencias tales como PSI-BLAST, PHI-BLAST y HMMer. Una vez identificado un ortólogo de Cpf1, se buscan secuencias cercanas para identificar la matriz CRISPR asociada. Las secuencias ARNcr se identifican como secuencias repetidas localizadas dentro de la matriz CRISPR tal y como se describe en Zetsche et al. (Cell:163(3):759-71(2015)). Las secuencias de ARNcr de tipo V contienen un bucle de tallo dentro de la secuencia repetida, situado a 5' de la secuencia de la región de orientación. El bucle del tallo comprende un elemento 5' y un elemento 3'. Se identifican las secuencias del elemento 5', el elemento 3' y el bucle del ARNcr. La secuencia de estos elementos de ARNcr se transcribe inversamente in silico a ADN. Se diseñan elementos 5' que contienen mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Ejemplos de elementos 5' se muestran en la FIGURA 12, FIGURA 13 y Tabla 14. Se diseñan elementos 3' que contienen mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Ejemplos de elementos 3' se muestran en la FIGURA 12, FIGURA 13 y Tabla 14. Las secuencias de la región de orientación se seleccionan para que sean adyacentes a las secuencias PAM en el ADN de interés y se añaden al extremo 3' de los elementos ARNcr 3'. Se diseñan secuencias de regiones objetivo que contienen nucleótidos de ADN, ADN y ARN, o ARN. Al combinar elementos crD(R)NA 3' y elementos crD(R)NA 5' juntos (Tabla 14, FIGURA 12, FIGURA 13) para formar crD(R)NAs de tipo V de guía dual, Cpf1 se dirige a cortar secuencias de ácido nucleico objetivo en el ácido nucleico objetivo de interés. Se diseña una colección de crD(R)NAs para pruebas con ribonucleótidos colocados en una serie de ubicaciones diferentes dentro de las secuencias crD(R)NA. Preferiblemente, los desoxirriboucleótidos dentro del tallo 3'y el tallo 5'se sustituyen por ribonucleótidos en algunas secuencias crD(R)NA. Los ribonucleótidos se sustituyen en el extremo 5' de la secuencia de la región de orientación en algunas secuencias crD(R)NA.
Utilizando combinaciones de región de orientación, elementos 3' y elementos 5' conectados por una secuencia de bucle, se diseñan diferentes versiones de sgD(R)NA. La colocación, el número y la distribución de las bases de ARN dentro del sgD(R)NA pueden elegirse utilizando procedimientos de cribado computacionales o experimentales. Se diseña una colección de sgD(R)NAs con ribonucleótidos colocados en varios lugares diferentes dentro de las sgD(R)NAs. Preferiblemente, los desoxirriboucleótidos dentro del tallo 3'y el tallo 5'se sustituyen por ribonucleótidos en algunas secuencias sgD(R)NA. Los ribonucleótidos se sustituyen en el extremo 5' de la secuencia de la región de orientación en algunas secuencias sgD(R)NA. Ejemplos de NAs sgD(R) diseñados se enumeran en la Tabla 15, y se muestran en las FIGURAS 10A-C y FIGURAS 11A-E.
A continuación, se utilizan secuencias sgD(R)NA, pero se entiende que pueden utilizarse pares de elementos 3' y 5' crD(R)NA (ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 14) en lugar de la sgD(R)NA.
B. Digestión de secuencias de ácido nucleico con Cpf1 y sgD(R)NA
Cpf1 sgD(R)NA puede utilizarse junto con Cpf1 para apuntar y cortar secuencias de ácido nucleico. El ácido nucleico objetivo es ARN, ADN genómico, ADN plasmídico o ADN amplificado. El ADN objetivo amplificado puede prepararse como se describe en el Ejemplo 2. Se sintetizan secuencias sgD(R)NA que contienen secuencias espaciadoras orientadas a secuencias de interés en el ADN objetivo. Los ensayos de escisión se llevan a cabo como se describe en Zetsche et al. (2015) y analizado mediante los procedimientos descritos en el Ejemplo 3. En resumen, el ácido nucleico objetivo se incuba con Cpf1 y la secuencia o secuencias sgD(R)NA en un tampón adecuado elegido para favorecer la actividad de Cpf1. Se analiza el ácido nucleico para determinar si se ha producido la digestión descrita en el Ejemplo 3. Pueden utilizarse dos o más complejos Cpf1/sgD(R)NA para cortar secciones de ADN de un ADN objetivo. La sección de ADN tiene extremos sobresalientes y puede ligarse a adaptadores o vectores de secuencias complementarias una vez separada del ADN parental.
C. Edición del genoma con complejos de ribonucleoproteínas Cpf1 sgD(R)NA
Se construye un vector de expresión de E. coli sintetizando un marco de lectura abierta optimizado en codones que codifica Cpf1 y clonando el marco de lectura abierta en un plásmido de expresión (por ejemplo, pET27b). La secuencia de codificación puede incluir una etiqueta de afinidad para la purificación de la proteína y una secuencia NLS en el extremo C para impulsar la localización nuclear en células eucariotas. La proteína Cpf1 puede expresarse en E. coli a partir del vector de expresión y purificarse mediante una combinación de cromatografía de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. La proteína purificada se concentra a 10 mg/ml y se combina con sgD(R)NA para formar un complejo ribonucleoproteico. Se combinan 200pmol de CPF1 en tubos de reacción separados con 50pmol, 100pmol,
200pmol, 400pmol, 600pmol, 800pmol, 1000 pmol de sgD(R)NA y un tampón de reacción. Los complejos Cpf1-sgD(R)NA se electroporan por repetición en células HEK293 de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 7. Las células se cultivan a 37 °C y se recoge ADN genómico de cada reacción al cabo de 4, 8, 16, 24, 48 y 72 horas. El ADN genómico se analiza mediante PCR y secuenciación Illumina para determinar que el genoma se ha editado de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 7.
D. Edición del genoma utilizando vectores de expresión Cpf1 y sgD(R)NA en células eucariotas
Puede construirse un vector de expresión de mamíferos sintetizando un marco de lectura abierta optimizado para codones que codifique Cpf1 y clonando el marco de lectura abierta en un plásmido de expresión de mamíferos adecuado (por ejemplo, pcDNA3.1). La secuencia de codificación puede incluir una etiqueta de afinidad HA para la purificación o detección de la proteína, y una secuencia NLS en el extremo C para impulsar la localización nuclear en células eucariotas. La secuencia codificante puede estar unida de forma operable al promotor CMV del plásmido. Los plásmidos que expresan CPF1 se combinan en tubos de reacción separados con 50pmol, 100pmol, 200pmol, 400pmol, 600pmol, 800pmol, 1000 pmol de sgD(R)NA y un tampón de reacción. Las mezclas de reacción se electroporan por duplicado en células HEK293 de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 7. Las células se cultivan a 37 °C y se recoge ADN genómico de cada reacción al cabo de 4, 8, 16, 24, 48 y 72 horas. El ADN genómico se analiza mediante PCR y secuenciación Illumina para determinar que el genoma se ha editado de acuerdo con los procedimientos descritos en el
Ejemplo 7
Ejemplo 13
Modificación in planta de embriones de maíz
Este ejemplo ilustra el procedimiento por el cual el D(R)NA de guía única puede utilizarse para modificar embriones de maíz. El procedimiento que aquí se presenta es una adaptación de Svitashev, et. al. (Plant Physiol; 169(2):931-945 (2015)). No todos los pasos siguientes son necesarios para la selección ni el orden de los pasos debe ser el presentado.
Este ejemplo ilustra el uso de una sola guía D(R)NAs para guiar una endonucleasa Cas para escindir ADN cromosómico en embriones de maíz. Se diseñaron seis D(R)NAs de guía única (sgD(R)NAs) dirigidos a una región cercana al gen liguleless 1 y al gen de fertilidad Ms45 (Tabla 16), y se introdujeron en una línea de maíz que contenía un gen Cas9 preintegrado de S. pyogenes de expresión constitutiva. Los loci genómicos del maíz liguleless 1 y Ms45 se examinaron mediante secuenciación profunda para detectar la presencia de mutaciones inducidas por escisión mediada por sgD(R)NAs/Cas9.
T l 1 :
(continuación)
(continuación)
Se generó una línea de maíz preintegrada con expresión constitutiva de Cas9 de S. pyogenes como se describe en Svitashev et al. (2015).
Los diseños sgD(R)NAs se proporcionaron a un fabricante comercial para su síntesis (Eurofins Scientific, Huntsville, AL).
Se construyeron ARNsg (SEQ ID NOS: 207 y 227) como se describe en el Ejemplo 1.
La transformación mediada por biolística de embriones inmaduros de maíz (IMEs) derivados de la línea de S. pyogenes Cas9 de expresión constitutiva con los sgD(R)NAs se llevó a cabo como se describe en Svitashev et. al. (2015). Brevemente, se administraron 100 ng de cada sgD(R)NA a 60-90 IME en presencia de genes estimulantes de la división celular, ZmODP2 (US Publ. No. 20050257289) y ZmWUS2 (Pat. No. 7,256,322), como se describe en Ananiev et. al. (Chromosoma;118(2):157-77 (2009)). Dado que la transformación con pistola de partículas puede ser muy variable, también se administró un casete de expresión de ADN marcador seleccionable visual, MoPAT-DsRED, junto con los genes promotores de la división celular, tal y como se describe en Svitashev et. al. (2015). Embriones transformados con 100 ng de ARN guía único (ARNsg) transcrito en T7 dirigido a la misma región de escisión (SEQ ID NOS: 207 y 227) sirvieron como control positivo y los embriones transformados únicamente con los casetes de expresión ZmODP2, ZmWUS2 y Mo-PAT-DsRED sirvieron como control negativo. Al cabo de 3 días, se seleccionaron los 20-30 embriones más uniformemente transformados de cada tratamiento en función de la fluorescencia DsRED, se agruparon y se extrajo el ADN genómico total. La región que rodea el sitio objetivo previsto se amplificó por PCR con Phusion® HighFidelity PCR Master Mix (M0531L, New England Biolabs, Ipswich, MA) añadiendo las secuencias necesarias para los códigos de barras específicos del amplicón y la secuenciación Illumnia utilizando cebadores "de cola" mediante dos rondas de PCR. Los cebadores utilizados en la reacción PCR primaria se muestran en la Tabla 17 y los cebadores utilizados en la reacción PCR secundaria fueron SEQ ID NO: 214 y 215.
T l 17:
(continuación)
Las amplificaciones de PCR resultantes se purificaron con una columna de centrifugación de purificación de PCR de Qiagen, la concentración se midió con un ensayo fluorométrico basado en colorante Hoechst, se combinaron en una proporción equimolar y se realizó una secuenciación profunda de 100 nucleótidos de lectura única en el secuenciador personal MiSeq de Illumina con un pico del 25% (v/v) de control PhiX v3 (Illumina, FC-110-3001) para compensar el sesgo de secuencia. Sólo se clasificaron como mutantes aquellas lecturas con una indelación de >1 nucleótido que surgía dentro de la ventana de 10 nucleótidos centrada sobre el sitio esperado de escisión y que no se encontraba en un nivel similar en el control negativo. Se contaron las lecturas mutantes con la misma mutación, se agruparon en una sola lectura y se confirmó visualmente que la mutación se había producido en el lugar de escisión previsto. A continuación, se utilizó el número total de mutaciones confirmadas visualmente para calcular el porcentaje de lecturas mutantes basándose en el número total de lecturas de una longitud adecuada que contenían una coincidencia perfecta con el código de barras y el cebador directo.
Como se muestra en la Tabla 18, se recuperaron mutaciones en todos los tratamientos, lo que indica que sgD(R)NAs pueden utilizarse para guiar a las endonucleasas Cas a escindir el ADN cromosómico celular del maíz. Además, ciertos diseños sgD(R)NA (SEQ ID NOS. 205 y 226) mostraron frecuencias de mutación cercanas a las del sgRNA transcrito T7 (SEQ ID NOS. 207 y 227). En la FIGURA 14A se muestran ejemplos de las mutaciones recuperadas con los sgD(R)NAs (correspondientes a los SEQ ID NOs: 223, y en donde SEQ ID NO: 216 es la secuencia de referencia del maíz que comprende el locus objetivo liguleless 1 ) y la FIGURA 14B (correspondiente a SEQ ID NOS: 235-254, y en donde la SEQ ID NO: 234 es la secuencia de referencia del maíz que comprende el locus objetivo Ms45).
T l 1 :
Claims (12)
1. Un único polinucleótido CRISPR de clase 2 que comprende:
una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN); y
una región activadora adyacente a dicha región de orientación que comprende ADN;
en donde dicha región activadora comprende una estructura de bucle de tallo, y es capaz de interactuar con Cpf1.
2. El polinucleótido CRISPR único de clase 2 de la reivindicación 1, en donde la región de orientación comprende una mezcla de ADN y ARN y/o la región activadora comprende una mezcla de ADN y ARN.
3. Un sistema CRISPR de clase 2 que comprende:
(i) un polinucleótido único como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; y
(ii) Cpf1.
4. El sistema CRISPR de clase 2 de la reivindicación 3, que comprende además un polinucleótido donante.
5. Un procedimiento in vitro de modificación de una molécula objetivo de ácido nucleico, que comprende poner en contacto dicha molécula objetivo de ácido nucleico que tiene una secuencia objetivo con
(i) un polinucleótido único que comprenda
(a) una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) y está configurada para hibridarse con la secuencia objetivo; y
(b) una región activadora adyacente a la región de orientación que comprende ADN y en donde la región activadora comprende una estructura de bucle de tallo; y
(ii) una Cpf1, en donde la Cpf1 se une a la región activadora del polinucleótido único, en donde se escinde dicha molécula de ácido nucleico objetivo, en donde dicha molécula de ácido nucleico objetivo comprende ADN.
6. Un sistema CRISPR de clase 2 para su uso en un procedimiento de modificación de una molécula objetivo de ácido nucleico in vivo, en donde dicho sistema CRISPR comprende:
(i) un polinucleótido único que comprende (a) una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) y está configurada para hibridarse con la secuencia objetivo; y (b) una región activadora adyacente a la región de orientación que comprende ADN, en donde la región activadora comprende una estructura de bucle de tallo; y
(ii) un Cpf1;
y dicho procedimiento comprende poner en contacto dicha molécula de ácido nucleico objetivo que tiene una secuencia objetivo in vivo con el sistema CRISPR, en donde la Cpf1 se une con la región activadora del polinucleótido único y en donde dicha molécula de ácido nucleico objetivo se escinde,
en donde dicha molécula de ácido nucleico objetivo comprende ADN.
7. El procedimiento o sistema CRISPR para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, que comprende además proporcionar un polinucleótido donante.
8. Un procedimiento in vitro de modulación de la transcripción de al menos un gen dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto la molécula de ácido nucleico objetivo que tiene una secuencia objetivo con
(i) un polinucleótido único que comprenda
(a) una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) y está configurada para hibridarse con la secuencia objetivo; y
(b) una región activadora adyacente a la región de orientación que comprende ADN y en donde la región activadora comprende una estructura de bucle de tallo; y
(ii) una Cpf1,
en donde la Cpf1 no tiene actividad nucleasa, en donde la Cpf1 se une a la región activadora del polinucleótido único, en donde la región de orientación del polinucleótido único se hibrida con la secuencia objetivo, en donde se modula la transcripción de al menos un gen dentro de la molécula de ácido nucleico objetivo.
9. Un sistema CRISPR de clase 2 para su uso en un procedimiento de modulación de la transcripción de al menos un gen dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo in vivo, en donde dicho sistema CRISPR comprende:
(i) un polinucleótido único que comprenda
(a) una región de orientación que comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) y está configurada para hibridarse con la secuencia objetivo; y
(b) una región activadora adyacente a la región de orientación que comprende ADN y en donde la región activadora comprende una estructura de bucle de tallo; y
(ii) una Cpf1,
en donde la Cpf1 no tiene actividad nucleasa; y dicho procedimiento comprende poner en contacto la molécula de ácido nucleico objetivo que tiene una secuencia objetivo in vivo con el sistema CRISPR, en donde la Cpf1 se une con la región activadora del polinucleótido único, en donde la región de orientación del polinucleótido único se hibrida con la secuencia objetivo, y en donde se modula la transcripción de al menos un gen dentro de la molécula de ácido nucleico objetivo.
10. El procedimiento o sistema CRISPR para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde la región de orientación y/o la región activadora comprenden una mezcla de ADN y ARN.
11. El procedimiento o sistema CRISPR para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde la célula en donde se produce el procedimiento se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula arqueal, una célula vegetal, una célula algal, una célula fúngica, una célula invertebrada, una célula vertebrada, una célula de mamífero y una célula humana.
12. El polinucleótido CRISPR único de clase 2 de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el sistema CRISPR de clase 2 de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, o los procedimientos o sistemas CRISPR para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde la Cpf1 es de Francisella novicida U112 o Acidaminococcus sp. BV3L6.
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