JP2018503386A - Ｃｒｉｓｐｒハイブリッドｄｎａ／ｒｎａポリヌクレオチドおよび使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、ＤＮＡに誘導されるＣＲＩＳＰＲ系；ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの混合物を含むポリヌクレオチド；ならびにかかるポリヌクレオチドおよびＤＮＡに誘導されるＣＲＩＳＰＲ系を含む使用方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全てが参照によって本明細書に組み入れられている、２０１５年１月２８日に出願した米国仮特許出願第６２／１０８，９３１号および２０１５年１１月５日に出願した米国仮特許出願第６２／２５１５４８号の利益を主張する。

配列表
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出した配列表を含有する。２０１６年１月２６日に作成した上記ＡＳＣＩＩコピーは、０１９８４７０１０１ＰＴＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが８３，５２２バイトである。

Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、Ｉｓｈｉｎｏによって大腸菌において最初に発見された原核生物免疫系である。非特許文献１。この免疫系は、配列特異的な様式でウイルスおよびプラスミドの核酸を標的とすることによって、ウイルスおよびプラスミドに対する免疫性を提供する。

この免疫系に関与する２つの主要な段階が存在し、第１の段階は獲得であり、第２の段階は干渉である。第１のステージは、侵入しているウイルスおよびプラスミドのゲノムを切断することと、このセグメントを生物のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むこととを含む。ゲノムに組み込まれるセグメントは、プロトスペーサーとして公知であり、同じウイルスまたはプラスミドによる続く攻撃から生物を保護するのを助長する。第２の段階は、侵入しているウイルスまたはプラスミドを攻撃することを含む。この段階は、プロトスペーサーがＲＮＡに転写されること、このＲＮＡが、幾つかのプロセシング後に、続いて進入しているウイルスまたはプラスミドのＤＮＡにおいて相補的な配列とハイブリダイズすると同時にＤＮＡを効果的に切断するタンパク質、またはタンパク質複合体とも結合することに依存する。

幾つかの異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および命名法が存在し、これらの分類は、系がさらに特徴付けられると変化した。タイプＩＩ系では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の一部であるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）のＲＮＡの２つの鎖が存在する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの成熟を引き起こすｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの相補領域にハイブリダイズする。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡによって形成される二本鎖は、標的核酸における配列に相補的であるか、またはハイブリダイズするｃｒＲＮＡの配列によって標的核酸に誘導されるタンパク質Ｃａｓ９によって認識されて、それと結合する。ＲＮＡベースの免疫系のこれらの最小の構成成分が、単一タンパク質および２つのＲＮＡガイド配列または単一ＲＮＡ分子を使用することによって、部位特異的な様式でＤＮＡを標的とするよう再プログラムすることができることが立証された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、あらゆる新たな標的遺伝子座には新生タンパク質工学を必要とする可能性がある、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、および転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含むゲノム編集の他の方法よりも優れている。

ＲＮＡに誘導される系である場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡ鎖のＲＮａｓｅ Ａ分解およびＲＮＡ−ＤＮＡミスマッチの高い蓋然性のようなＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド構造に関する問題を起こしやすい傾向があり得る。さらに、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成よりも経済的で、かつ頑強である。ＤＮＡに誘導されるＣＲＩＳＰＲ系はまた、天然に存在するＲＮＡに誘導されるＲＩＳＰＲ系と比較して、特異的な標的にさらなる機構を補充することもできる。ＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と関連した課題を克服して、ＤＮＡ合成のコストの減少および頑強性の増加を得る機会を提供して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の特異性を改善する、系の改善に対する要求が存在する。

Ｉｓｈｉｎｏら、１９８７（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９（１２）：５４２９〜５４３３頁（１９８７年））

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための単一ポリヌクレオチドであって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲティング領域と；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む活性化領域とを含む単一ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための単一ポリヌクレオチドであって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲティング領域と；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接したポリヌクレオチド領域を含む活性化領域とを含む単一ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ステムループ構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、Ｃｐｆ１タンパク質と相互作用する。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系であって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域を含む単一ポリヌクレオチドと；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；部位特異的ポリペプチドとを含むクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を提供する。幾つかの実施形態では、核酸はＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、核酸はＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ステムループ構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、部位特異的ポリペプチドと相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系は、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系であって、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと；前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドと；部位特異的ポリペプチドとを含むクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を提供する。幾つかの実施形態では、活性化領域および第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、活性化領域と相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための２つのポリヌクレオチドであって、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと；前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む２つのポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施形態では、活性化領域および第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、標的核酸分子を修飾する方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域と；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；部位特異的ポリペプチドとを含む単一ポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、単一ポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が切断されるか、または標的核酸分子によりコードされる少なくとも１つの遺伝子の転写が調節される方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、部位特異的ペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ステムループ構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、部位特異的ポリペプチドと相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、標的核酸分子を修飾する方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと接触させることと、前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドおよび部位特異的ポリペプチドを供給することとを含み、ここで、第１および第２のポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が切断されるか、または標的核酸分子によりコードされる少なくとも１つの遺伝子の転写が調節される方法を提供する。幾つかの実施形態では、活性化領域および第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用してオフターゲットの修飾を低減させる方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域と；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；部位特異的ポリペプチドとを含む単一ポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、単一ポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が、該標的核酸における他の配列よりも優先的に該標的配列で切断されるかまたは編集されて、それによりオフターゲットの修飾を低減させる方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ステムループ構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、部位特異的ポリペプチドと相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、前記ターゲティング領域は、ウラシルを含まない。幾つかの実施形態では、上記方法は、ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用してオフターゲットの修飾を低減させる方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと接触させることと、前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドおよび部位特異的ポリペプチドを供給することとを含み、ここで、第１および第２のポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が、該標的核酸における他の配列よりも優先的に該標的配列で切断されるかまたは編集されて、それによりオフターゲットの修飾を低減させる方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域および第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、部位特異的ペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、前記ターゲティング領域は、ウラシルを含まない。幾つかの実施形態では、上記方法は、ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して標的特異的な修飾を増加させる方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域と；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；部位特異的ポリペプチドとを含む単一ポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、単一ポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が、該標的核酸における他の配列よりも優先的に該標的配列で切断されるかまたは編集されて、それにより標的特異的な修飾を増加させる方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ステムループ構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、部位特異的ポリペプチドと相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して標的特異的な修飾を増加させる方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと接触させることと、前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドおよび部位特異的ポリペプチドを供給することとを含み、ここで、第１および第２のポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が、該標的核酸における他の配列よりも優先的に該標的配列で切断されるかまたは編集されて、それにより標的特異的な修飾を増加させる方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域および第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、前記ターゲティング領域は、ウラシルを含まない。幾つかの実施形態では、上記方法は、ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、ドナーポリヌクレオチドを細胞または生物のゲノムへ導入する方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域と；リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；部位特異的ポリペプチドとを含む単一ポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、単一ポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が、該標的配列で、またはその付近で切断されて、また該切断部位で該細胞または生物の該ゲノムへ導入されるドナーポリヌクレオチドを供給することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流にある。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ステムループ構造を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、部位特異的ポリペプチドと相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによって核酸へ導入される。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、非相同末端結合によって核酸へ導入される。

幾つかの実施形態では、本開示は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、ドナーポリヌクレオチドを細胞または生物のゲノムへ導入する方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと接触させることと；前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドおよび部位特異的ポリペプチドを供給することとを含み、ここで、第１および第２のポリヌクレオチドは、部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、前記標的核酸分子が、該標的配列で、またはその付近で切断されて、また該切断部位で該細胞または生物の該ゲノムへ導入されるドナーポリヌクレオチドを供給することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡであり、幾つかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物である。幾つかの実施形態では、活性化領域および第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、活性化領域は、部位特異的ポリペプチドと相互作用する。幾つかの実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９タンパク質である。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣｐｆ１タンパク質である。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによって核酸へ導入される。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、非相同末端結合によって導入される。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、マイクロホモロジー媒介末端結合によって核酸へ導入される。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖アニーリングによって導入される。

図１Ａは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを示す図である。図１Ｂは、互いにハイブリダイズした本開示の２つのポリヌクレオチド（ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ）（「二重ガイド」系とも称される）を示す図である。 活性化領域に連結されたターゲティング領域を含む本開示の単一ポリヌクレオチド（「単一ガイド」系または「単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡ」または「ｓｇ Ｄ（Ｒ）ＮＡ」とも称される）を示す図である。 本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いた標的ＤＮＡ配列の切断を示す図である。 図４ＡおよびＢは、本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による様々な標的配列の切断の量を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学アッセイの結果を示す図である。 本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的配列の切断の量を決定するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果を示す図である。 本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的配列のオフターゲットの切断の量を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学アッセイの結果を示す図である。 本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的配列の切断の量を決定するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果を示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミド標的に対するＣａｓ９−Ｄ１０Ａタンパク質によるｃｒＤ（Ｒ）ＮＡまたはｓｇＤ（Ｒ）ＮＡのニッキング活性の結果を示す図である。 タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系由来のｃｒＲＮＡの典型的な構造を示す図である。 図１０Ａ〜Ｃは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための本開示の単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの考え得る構造を示す図である。 図１１Ａ〜Ｅは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための本開示の単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの考え得る構造を示す図である。 図１１−１の続き。 図１２Ａ〜Ｉは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのｃｒＲＮＡおよび／またはｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを含む本開示の二重ガイドの考え得る構成成分を示す図である。 図１３Ａ〜Ｈは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのｃｒＲＮＡおよび／またはｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを含む本開示の二重ガイドの考え得る形を示す図である。 本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的配列の切断の量を決定するためのｉｎ ｐｌａｎｔａアッセイのシーケンシングの結果を示す図である。 本開示の核酸ターゲティングポリヌクレオチドを使用したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的配列の切断の量を決定するためのｉｎ ｐｌａｎｔａアッセイのシーケンシングの結果を示す図である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、５個のタイプおよび１６個のサブタイプを含む２つのクラスに最近再分類された。Ｍａｋａｒｏｖａら（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：１〜１５頁（２０１５年））。この分類は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座における全てのｃａｓ遺伝子を同定すること、続いて各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座におけるシグネチャー遺伝子を決定すること、最終的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、エフェクターモジュール、即ち、干渉段階に関与するタンパク質をコードする遺伝子に基づいてクラス１またはクラス２のいずれかに配置させることができることを決定することに基づく。

クラス１系は、多サブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を有するのに対して、クラス２系は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３またはｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体のような単一タンパク質を有する。クラス１系は、タイプＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ系を含む。クラス２系は、タイプＩＩおよびタイプＶ系を含む。

タイプＩ系は全て、ヘリカーゼ活性および切断活性を有するＣａｓ３タンパク質を有する。タイプＩ系は、７個のサブタイプ（Ｉ−Ａ〜Ｉ−ＦおよびＩ−Ｕ）に、さらに分けられる。タイプＩサブタイプはそれぞれ、シグネチャー遺伝子の規定の組合せおよびオペロン機構の異なった特徴を有する。例えば、サブタイプＩ−ＡおよびＩ−Ｂは２つまたはそれ以上のオペロンにおいて組織化されるｃａｓ遺伝子を有するように見えるのに対して、サブタイプＩ−Ｃ〜Ｉ−Ｆは、単一オペロンによってコードされるｃａｓ遺伝子を有するように見える。タイプＩ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ免疫系のプロセシングおよび干渉段階に関与している多タンパク質ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を有する。この多タンパク質複合体は、抗ウイルス性防御（カスケード）に関するＣＲＩＳＰＲ関連複合体として公知である。サブタイプＩ−Ａは、小さなサブユニットタンパク質をコードするｃｓａ５ならびに分解される大きなサブユニットおよび小さなサブユニットをコードする２つに分割され、また分断ｃａｓ３遺伝子も有するｃａｓ８遺伝子を含む。サブタイプＩ−Ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する微生物の例は、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）である。

サブタイプＩ−Ｂは、ｃａｓ１−ｃａｓ２−ｃａｓ３−ｃａｓ４−ｃａｓ５−ｃａｓ６−ｃａｓ７−ｃａｓ８遺伝子配置を有し、ｃｓａ５遺伝子を欠如している。サブタイプＩ−Ｂを有する微生物の例は、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）である。サブタイプＩ−Ｃは、ｃａｓ６遺伝子を有さない。サブタイプＩ−Ｃを有する微生物の例は、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）である。サブタイプＩ−Ｄは、Ｃａｓ８の代わりにＣａｓ１０ｄを有する。サブタイプＩ−Ｄを有する微生物の例は、シアノセイス属種（Cyanothece sp.）である。サブタイプＩ−Ｅは、ｃａｓ４を有さない。サブタイプＩ−Ｅを有する微生物の例は、大腸菌（Escherichia coli）である。サブタイプＩ−Ｆは、ｃａｓ４を有さず、ｃａｓ３に融合されたｃａｓ２を有する。サブタイプＩ−Ｆを有する微生物の例は、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）である。サブタイプＩ−Ｕを有する微生物の例は、ジオバクター・サルフレドゥセンス（Geobacter sulfurreducens）である。

タイプＩＩＩ系は全て、ｃａｓ１０遺伝子を保有して、それは、多数の核酸ポリメラーゼおよびシクラスのコアドメインに相同性であり、タイプＩＩＩ ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体の最も大きなサブユニットであるＰａｌｍドメインを含有する多ドメインタンパク質（ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）の変異体）をコードする。また、タイプＩＩＩ遺伝子座は全て、小さなサブユニットタンパク質、１個のＣａｓ５タンパク質および通常幾つかのＣａｓ７タンパク質をコードする。タイプＩＩＩは、４つのサブタイプ、ＩＩＩ−Ａ〜ＩＩＩ−Ｄにさらに分けられる。サブタイプＩＩＩ−Ａは、小さなサブユニットをコードいるｃｓｍ２遺伝子を有し、またｃａｓ１、ｃａｓ２およびｃａｓ６遺伝子を有する。サブタイプＩＩＩ−Ａを有する微生物の例は、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）である。サブタイプＩＩＩ−Ｂは、小さなサブユニットをコードするｃｍｒ５遺伝子を有し、また典型的にｃａｓ１、ｃａｓ２およびｃａｓ６遺伝子を欠如している。サブタイプＩＩＩ−Ｂを有する微生物の例は、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）である。サブタイプＩＩＩ−Ｃは、不活性シクラーゼ様ドメインを有するＣａｓ１０タンパク質を有し、ｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を欠如している。サブタイプＩＩＩ−Ｃを有する微生物の例は、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）である。サブタイプＩＩＩ−Ｄは、ＨＤドメインを欠如しているＣａｓ１０タンパク質を有し、それはｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を欠如していて、ｃｓｘ１０として公知のｃａｓ５様遺伝子を有する。サブタイプＩＩＩ−Ｄを有する微生物の例は、ロセイフレキサス属種（Roseiflexus sp.）である。

タイプＩＶ系は、部分的に分解される大きなサブユニット、Ｃｓｆ１、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、および場合によっては、推定小さなサブユニットを含む最小多サブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体をコードする。タイプＩＶ系は、ｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を欠如している。タイプＩＶ系は、サブタイプを有さないが、２つの別個の変異体が存在する。１つのタイプＩＶ変異体は、ＤｉｎＧファミリーヘリカーゼを有するのに対して、第２のタイプＩＶ変異体は、ＤｉｎＧファミリーヘリカーゼを欠如するが、小さなα−ヘリックスタンパク質をコードする遺伝子を有する。タイＩＶ系を有する微生物の例は、アシディチオバチルス・フェロオキシダン（Acidithiobacillus ferrooxidans）である。

タイプＩＩ系は、ｃａｓ１、ｃａｓ２およびｃａｓ９遺伝子を有する。ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体の機能を標的ＤＮＡ切断と組み合わせる多ドメインタンパク質をコードする。タイプＩＩ系はまた、ｔｒａｃｒＲＮＡもコードする。タイプＩＩ系は、３つのサブタイプ、サブタイプＩＩ−Ａ、ＩＩ−ＢおよびＩＩ−Ｃにさらに分けられる。サブタイプＩＩ−Ａは、さらなる遺伝子、ｃｓｎ２を含有する。サブタイプＩＩ−Ａ系を有する微生物の例は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）である。サブタイプＩＩ−Ｂは、ｃｓｎ２を欠如しているが、ｃａｓ４を有する。サブタイプＩＩ−Ｂ系を有する微生物の例は、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）である。サブタイプＩＩ−Ｃは、細菌で見出される最も一般的なタイプＩＩ系であり、３つのタンパク質、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２およびＣａｓ９のみを有する。サブタイプＩＩ−Ｃ系を有する微生物の例は、ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）である。

タイプＶ系は、ｃｐｆ１遺伝子ならびにｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を有する。ｃｐｆ１遺伝子は、Ｃａｓ９の各々のドメインに相同的であるＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有するが、Ｃａｓ９タンパク質中に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠如しているタンパク質、Ｃｐｆ１をコードする。タイプＶ系は、パルクバクテリア・バクテリウム（Parcubacteria bacterium）ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス（Butyrivibrio proteoclasticus）（ＢｐＣｐｆ１）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Peregrinibacteria bacterium）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）（ＰｍＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）（ＰｃＣｐｆ１）、プレボテーラ・ディシエンス（Prevotella disiens）（ＰｄＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Moraxella bovoculi）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、スミセラ属種（Smithella sp.）ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）（ＬｉＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Candidatus methanoplasma termitum）（ＣＭｔＣｐｆ１）、およびユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）（ＥｅＣｐｆ１）を含む幾つかの細菌において同定された。

クラス１系では、発現および干渉段階は、多サブユニットＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）−エフェクター複合体を含む。クラス２系では、発現および干渉段階は、単一大きなタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ２またはＣ２Ｃ３を含む。

クラス１系では、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、多サブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体に結合して、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされる。タイプＩおよびＩＩＩ系では、これは、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６を含む。クラス２ タイプＩＩ系では、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む工程において、Ｃａｓ９に結合して、成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。しかしながら、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のものである少なくとも１つのタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、成熟５’末端を伴うｃｒＲＮＡは、内部プロモーターから直接転写され、ｃｒＲＮＡプロセシングは、起こらない。

クラス１系では、ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体と関連付けられ、ヌクレアーゼ活性を、ＲＮＡ結合ドメインおよびｃｒＲＮＡと標的核酸との間の塩基対形成と組み合わせることによって干渉を達成する。

タイプＩ系では、ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体のｃｒＲＮＡおよび標的結合は、小さなサブユニットタンパク質に融合されたＣａｓ７、Ｃａｓ５およびＣａｓ８を含む。タイプＩ系の標的核酸切断は、ＨＤヌクレアーゼドメインを含み、それはスーパーファミリー２ヘリカーゼＣａｓ３’に融合されるか、または別々の遺伝子、ｃａｓ３”によってコードされる。

タイプＩＩＩ系では、ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体のｃｒＲＮＡおよびターゲット結合は、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ１０および小さなサブユニットタンパク質を含む。タイプＩＩＩ系の標的核酸切断は、Ｃａｓ１０に融合された別個のＨＤヌクレアーゼドメインとの、Ｃａｓ７およびＣａｓ１０タンパク質の複合作用を含み、それは、干渉中に一本鎖ＤＮＡを切断すると考えられる。

クラス２系では、ｃｒＲＮＡは、単一タンパク質と関連付けられ、ヌクレアーゼ活性を、ＲＮＡ結合ドメインおよびｃｒＲＮＡと標的核酸との間の塩基対形成と組み合わせることによって、干渉を達成する。

タイプＩＩ系では、ｃｒＲＮＡおよび標的結合は、標的核酸切断と同様にＣａｓ９を含む。タイプＩＩ系では、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ Ｈフォールド）ドメインおよびＨＮＨ（ＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインはそれぞれ、標的核酸の鎖の１つを切断する。タイプＩＩ系のＣａｓ９切断活性はまた、Ｃａｓ９によるｃｒＲＮＡおよび標的結合を容易とする二本鎖を形成するのに、ｃｒＲＮＡの、ｔｒａｃｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションを必要とする。

タイプＶ系では、ｃｒＲＮＡおよび標的結合は、標的核酸切断と同様にＣｐｆ１を含む。タイプＶ系では、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインは、ねじれ型立体配置で標的核酸の両方の鎖を切断して、Ｃａｓ９切断によって生成される平滑末端とは対照的である５’オーバーハングを生じる。これらの５’オーバーハングは、非相同的な末端結合方法によりＤＮＡの挿入を容易にし得る。

タイプＶ系のＣｐｆ１切断活性はまた、二本鎖を形成するのに、ｃｒＲＮＡの、ｔｒａｃｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションを必要とせず、むしろタイプＶ系のｃｒＲＮＡは、内部二本鎖を形成するステムループ構造を有する単一ｃｒＲＮＡを使用する。Ｃｐｆ１は、配列および構造特異的な様式でｃｒＲＮＡを結合して、ステムループおよびステムループに隣接する配列、最も注目すべきは、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列のヌクレオチド５’を認識する。このステムループ構造は通常、１５〜１９ヌクレオチド長の範囲である。このステムループ二本鎖を破壊する置換は、切断活性を無効にするのに対して、ステムループ二本鎖を破壊しない他の置換は、切断活性を無効にしない。タイプＶ系では、ｃｒＲＮＡは、５’末端でステムループ構造を形成して、３’末端にある配列は、標的核酸における配列に相補的である。

タイプＶ ｃｒＲＮＡおよび標的結合ならびに切断と関連付けられる他のタンパク質として、クラス２候補１（Ｃ２ｃ１）およびクラス２候補３（Ｃ２ｃ３）が挙げられる。Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３タンパク質は、長さの点でＣａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質に類似しており、およそ１，１００個のアミノ酸〜およそ１，５００個のアミノ酸の範囲である。Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３タンパク質はまた、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有し、Ｃｐｆ１に類似した構築物を有する。Ｃ２ｃ１タンパク質は、標的結合および切断に関してｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする際に、Ｃａｓ９タンパク質に類似しているが、最適切断温度５０℃を有する。Ｃ２ｃ１タンパク質は、ＡＴリッチＰＡＭを標的とし、それは、Ｃｐｆ１に類似して、標的配列の５’である。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ；６０（３）：３８５〜３９７頁（２０１５年））を参照されたい。

クラス２候補２（Ｃ２ｃ２）は、他のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に対して配列類似性を共有せず、したがって、推定タイプＶＩ系中に存在してもよい。Ｃ２ｃ２タンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを有して、ＲＮａｓｅ活性を有すると予測され、したがって、ｍＲＮＡを標的として、切断し得る。Ｃ２ｃ２タンパク質は、標的結合および切断に関してｃｒＲＮＡを必要とする際にＣｐｆ１タンパク質に類似して見える一方で、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。また、Ｃｐｆ１のように、Ｃ２ｃ２タンパク質に関するｃｒＲＮＡは、Ｃ２ｃ２タンパク質との結合に役立ち得る安定なヘアピン、またはステムループ構造を形成する。

本明細書で使用する場合、「部位特異的ポリペプチド」は、本明細書で開示するポリヌクレオチドとともにＣＲＩＳＰＲ系で使用される単一タンパク質またはタンパク質複合体を指す。部位特異的ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のヌクレアーゼドメインを含むことができる。本開示の部位特異的ポリペプチドは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＨＥＰＮ−スーパーファミリー様ヌクレアーゼを含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行β鎖およびα−ヘリックスを含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価陽イオン結合部位）を含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）を切断することができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインを含むタンパク質として、エンドヌクレアーゼ、コリシン、制限エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼおよびＤＮＡパッケージング因子を挙げることができる。

部位特異的ポリペプチドは、使用されている特定のＣＲＩＳＰＲ系に依存して、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、またはこれらの複合体であり得る。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質であり得る。幾つかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性が低減された部位特異的ポリペプチドは、ニッカーゼであり得る。即ち、それを、標的核酸二本鎖の１つの鎖を切断するように修飾することができる。幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドを、ヌクレアーゼ活性を有さないように修飾することができる。即ち、それは、標的核酸二本鎖のいかなる鎖も、標的核酸のいかなる単一鎖も切断しない。ヌクレアーゼ活性が低減されたか、またはヌクレアーゼ活性を有さない部位特異的ポリペプチドの例として、ＨＮＨおよび／またはＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに対して修飾を伴うＣａｓ９、およびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに対して修飾を伴うＣｐｆ１を挙げることができる。かかる修飾の非限定的な例として、Ｆ．ノビシダ（F.novicida）Ｃｐｆ１のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに対するＤ９１７Ａ、Ｅ１００６ＡおよびＤ１２２５Ａ、ならびにＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９の残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６および／またはＡ９８７の変更、ならびに他のＣｐｆ１およびＣａｓ９タンパク質におけるそれらの相当するアミノ酸残基を挙げることができる。

幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドを修飾することができる。かかる修飾は、部位特異的ポリペプチドへの、別のポリペプチド由来のドメインの取り込みもしくは融合、または別のポリペプチドのドメインによる、部位特異的ポリペプチドのドメインの置き換えを含むことができる。例えば、修飾された部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質由来の第１のドメインおよびＣａｓ９またはＣｐｆ１以外のタンパク質由来の第２のドメインを含有することができる。修飾された部位特異的ポリペプチドにおいてかかるドメインを含むための修飾は、修飾された部位特異的ポリペプチドに、さらなる活性を付与することができる。かかる活性として、標的核酸（例えば、ヒストン）と結合するポリペプチドを修飾するヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を挙げることができる。

幾つかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）において二本鎖切断または一本鎖切断導入することができる。ある特定の実施形態では、核酸配列は、標的核酸であり得る。本開示のある特定部位特異的ポリペプチドは、平滑末端切断部位を導入することができる一方で、ある特定の実施形態は、付着末端、即ち、５’または３’オーバーハングを有する切断部位を生じる。例えば、Ｃｐｆ１は、約４つまたは５つのヌクレオチド（ｎｔ）５’オーバーハングを有するスタガー型ＤＮＡ二本鎖切断を導入し得る。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同組換えおよび非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同的な鋳型を必要とすることなく切断された標的核酸を修復することができる。これは、標的核酸の欠失をもたらし得る。相同組換え（ＨＲ）は、相同的な鋳型を用いて行うことができる。相同的な鋳型は、標的核酸切断部位に隣接している配列相同的である配列を含むことができる。標的核酸が、部位特異的ポリペプチドによって切断された後、切断の部位を破壊することができる（例えば、部位は、核酸ターゲティングポリヌクレオチドおよび部位特異的ポリペプチドによる別のラウンドの切断に利用可能でない場合がある）。

場合によっては、相同組換えは、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入することができる。外因性ポリヌクレオチド配列を、ドナーポリヌクレオチドまたはドナー配列と呼ぶことができる。幾つかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡの二本鎖であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、標的核酸切断部位で天然に存在しない配列であり得る。幾つかの実施形態では、ＮＨＥＪおよび／またはＨＲに起因する標的核酸の修飾は、例えば、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、および／または遺伝子突然変異を引き起こすことができる。非自然核酸（複数可）をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、「ゲノム工学」と称することができる。

本開示のＣＲＩＳＰＲ系は、「ＤＮＡに誘導されるＣＲＩＳＰＲ系」と称してもよい。本開示のＣＲＩＳＰＲ系は、２つの核酸ターゲティングポリヌクレオチド（「二重ガイド」）を使用して標的核酸を切断するようにプログラムすることができる。幾つかの実施形態では、二重ガイドＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｄ（Ｒ）ＮＡ（ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む１つのポリヌクレオチドならびにＲＮＡを含む第２のポリヌクレオチドを含むことができる。幾つかの実施形態では、二重ガイド系は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む１つのポリヌクレオチドならびにＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む第２のポリヌクレオチドを含むことができる。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ要素は、図２に示すよう融合領域（例えば、リンカー）により接続されて、単一要素（例えば、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ）として合成することができる（「単一ガイド」）。

本明細書で使用する場合、「ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ」という用語は、ターゲティング領域および活性化領域を含むポリヌクレオチドを指し、ここで、ターゲティング領域は、ＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡを含み、活性化領域は、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。ある特定の実施形態では、ターゲティング領域は、活性化領域の上流にある。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流にある。幾つかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの活性化領域における配列に相補的な配列を含む。

本明細書中で使用する場合、「ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ」という用語は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの活性化領域における配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを指し、ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。

本明細書中で使用する場合、「ターゲティング領域」という用語は、標的核酸における配列に相補的なＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含むポリヌクレオチドの領域を指す。ある特定の実施形態では、ターゲティング領域はまた、他の核酸、もしくは核酸の類似体、またはそれらの組合せを含んでもよい。ある特定の実施形態では、この形状が宿主細胞内部で分解する可能性が低い場合があるので、ターゲティング領域は、単にＤＮＡだけから成ってもよい。幾つかの実施形態では、この形状は、標的配列認識の特異性を増加させてもよく、および／またはオフターゲットの結合／ハイブリダイゼーションの発生を低減させてもよい。

本明細書中で使用する場合、「活性化領域」という用語は、部位特異的ポリペプチドと相互作用するか、または会合もしくは結合することが可能であるＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含むポリヌクレオチドの一部を指す。ある特定の実施形態では、活性化領域はまた、他の核酸、もしくは核酸の類似体、またはそれらの組合せを含んでもよい。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域に隣接している。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域から下流にある。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域から上流にある。

本明細書で使用する場合、「ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ」または「単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡ」という用語は、ターゲティング領域および活性化領域を含むポリヌクレオチドを指し、ここで、ターゲティング領域は、標的核酸における配列に相補的なＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡまたはＲＮＡの混合物を含み、ここで、活性化領域は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、ターゲティング領域もしくは活性化領域または両方は、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチドを含み、活性化領域は、自己相補的な配列を有し、ハイブリダイズして、二本鎖を形成し、二次構造を含有し得る。単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの例は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡから構築することができ、ここで、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、またはｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ヌクレオチドの配列により接続され、このようなヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物であり得る。

本明細書中で使用する場合、「下流」という用語は、ヌクレオチド配列の３’方向での基準点から遠位である点を指す。本明細書中で使用する場合、「上流」という用語は、ヌクレオチド配列の５’方向での基準点から遠位である点を指す。

本開示のポリヌクレオチド、例えば、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、または単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡは、ＤＮＡおよび他の核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または他の核酸の類似体の混合物を含んでもよい。

本開示は、部位特異的ポリペプチドによって標的核酸のプログラム可能な切断および／または修飾を支持する、本明細書中に開示するような任意長の単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡ、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡならびにポリヌクレオチドの組合せの使用を提供する。

図１Ａは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドを示す。この実施形態では、１０１は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡであってもよく、１０２は、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡであってもよい。

図１Ｂは、相補性の領域に沿って互いにハイブリダイズされる図１Ａのポリヌクレオチドを示す。ハイブリダイゼーションは、バルジ１０５、ターゲティング領域１０３、ネクサス１０７、ならびにヘアピン１０８および１０９などの二次構造を生成し得る。図１Ｂはまた、上方二本鎖領域１０６および下方二本鎖領域１０４を含む実施形態も示す。上部二本鎖領域は、上方ステムを含み得る。下方二本鎖領域は、下方ステムを含み得る。ある特定の実施形態では、ハイブリダイズして、領域１０４を形成するポリヌクレオチドは、ターゲティング領域１０３の下流の領域において、同じポリヌクレオチド鎖上のＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、例えば、１０２を含んでもよい。ある特定の実施形態では、図１Ｂに示すような領域１０４は、同じポリヌクレオチド鎖上のＤＮＡおよびＲＮＡの混合物、例えば、１０２を含んでもよい。ターゲティング領域のすぐ下流のヌクレオチド配列は、様々な比率のＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、この割当ては、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＲＮＡおよびその間の範囲であってもよい。本明細書中に記載するように、ターゲティング領域１０３の下流のヌクレオチド配列（例えば、図１Ｂに示すようなターゲティング領域１０３とバルジ１０５との間の領域）は、配列番号１９〜２６に示すようなＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み得る。

図２は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系とともに使用するための単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの例を示す。図２を参照すると、実施形態は、ターゲティング領域２０１、下方二本鎖領域２０２、上方二本鎖領域２０３、融合領域２０４、二次構造（例えば、バルジ）２０５、ネクサス２０６、ならびにヘアピン２０７および２０８を含む。上方二本鎖領域は、上方ステムを含み得る。下方二本鎖領域は、下方ステムを含み得る。幾つかの実施形態は、上方二本鎖領域および下方二本鎖領域を含む活性化領域を含み得る。幾つかの実施形態では、領域２０２は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含んでもよく、それは、ターゲティング領域２０１のすぐ下流にある。ターゲティング領域のすぐ下流のヌクレオチド配列は、様々な比率のＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、この割当ては、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＲＮＡおよびその間の範囲であってもよい。本明細書中に記載するように、ターゲティング領域２０１の下流のヌクレオチド配列（例えば、図２に示すようなターゲティング領域２０１とバルジ２０５との間の領域）は、配列番号１２７〜１３２に示すようなＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み得る。幾つかの実施形態では、領域２０３は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含んでもよく、それは、ターゲティング領域２０１の下流にある。ターゲティング領域の下流のヌクレオチド配列は、様々な比率のＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、この割当ては、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＲＮＡおよびその間の範囲であってもよい。本明細書中に記載するように、ターゲティング領域２０１の下流のヌクレオチドの領域は、配列番号４４〜４７および１２９に示すようなＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み得る。

ある特定の実施形態では、活性化領域は、少なくとも１つの二次構造を含み得る。二次構造は、下方ステム、上方ステム、バルジ、ネクサス、ヘアピン、これらの１つまたはそれ以上、およびそれらの組合せであり得る。ある特定の実施形態では、活性化領域は、バルジを含む。図１Ｂは、下方ステム１０４、バルジ１０５、上方ステム１０６、ネクサス１０７、およびヘアピン、例えば、１０８を含む、二重ガイド系、即ち、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡにハイブリダイズしているｃｒＤ（Ｒ）ＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズしているｃｒＤ（Ｒ）ＮＡによって創出される二次構造を示す。二次構造はまた、さらなるタイプの構造を含んでもよい。二次構造の位置決めおよび数は、特に限定されず、どの部位特異的ポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ系で使用されるかに依存して変更させてもよい。

ある特定の実施形態では、活性化領域は、下方ステム、上方ステム、およびバルジを含むヌクレオチド領域を含み得る。ある特定の実施形態では、バルジのみが存在し得る。ある特定の実施形態では、バルジは、下方ステムと上方ステムとの間に存在し得る。特定の実施形態は、上方ステムを省略し得る。「上方ステム」および「下方ステム」という用語は、活性化領域の示した位置について言及するためにだけ、本明細書中で使用してもよく、これらの領域をいかなる特定の構造、二次構造、または位置決めに限定すると必ずしも意図されない。例えば、図１Ｂは、バルジとスペーサーの間に配置される下方ステム、１０４を示す。ある特定の実施形態では、ターゲティング領域は、スペーサーを含んでもよい。

幾つかの実施形態では、下方ステムにおけるターゲティング領域から下流のヌクレオチド配列は、５’ＧＹＹＹＵＲ（式中、ＹはＣまたはＵ／Ｔであり、ＲはＡまたはＧである）配列を有することができる。幾つかの実施形態では、下方ステムにおけるターゲティング領域から下流のヌクレオチド配列は、５’ＧＵＵＵＵＵＧＵである配列を有することができる。幾つかの実施形態では、下方ステムにおけるターゲティング領域から下流のヌクレオチド配列は、５’ＧＵＵＵＵＡである配列を有することができる。幾つかの実施形態では、下方ステムにおけるヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物であり得る。

ある種の実施形態では、二次構造は、バルジを含むことができる。バルジは、二本鎖内のヌクレオチドの不対領域を指すことができる。ある特定の実施形態では、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡは、バルジを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドのある特定の実施形態は、二次構造を含んでもよく、上記二次構造は、テトラループである。バルジを含む単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡは、二本鎖の５’側および３’側を含んでもよい。図２を参照すると、例えば、二本鎖の５’側は、２０４の上流にある（即ち、５’方向の）領域を指すことができ、二本鎖の３’側は、２０４の下流にある（即ち、３’方向の）領域を指すことができる。ある特定の実施形態では、活性化領域は、バルジを含む。幾つかの実施形態では、バルジは、部位特異的ポリペプチドに結合すること、またはそれと相互作用することに関与し得る。バルジは、二本鎖の片側に、不対５’−ＲＲＲＺ−３’（式中、Ｒは、任意のプリンであり、Ｚは、反対鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成することができるヌクレオチドであり得る）を、また二本鎖の他方の側に、不対ヌクレオチド領域を含むことができる。バルジは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物を含み得る。バルジは、バルジ二本鎖の５’側に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその混合物を含んでもよく、バルジ３’側に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその混合物を含んでもよい。ある特定の実施例では、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドは、ターゲティング領域および活性化領域を含むことができ、バルジ二本鎖のターゲティング領域側は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物を含んでもよく、バルジ二本鎖の活性化領域側は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物を含有してもよい。例えば、一実施形態では、ポリヌクレオチドの５’末端により近いバルジの側は、ＲＮＡを含んでもよく、ポリヌクレオチドの３’末端により近いバルジの側は、ＲＮＡを含んでもよい。ある特定の実施形態では、バルジの側は、バルジの別の側よりも少ないヌクレオチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのポリヌクレオチドは、５’方向および３’方向を有するポリヌクレオチドを含み、５’側を有するバルジを含み、３’側および５’側は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでもよく、３’側は、ＲＮＡを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのポリヌクレオチドは、５’方向および３’方向を有するポリヌクレオチドを含み、５’側および３’側を有するバルジを含み、５’側は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでもよく、３’側は、ＲＮＡを含んでもよく、３’側は、上記バルジの５’側よりも多くのヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドは、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを含んでもよく、バルジ二本鎖のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側は、２つのヌクレオチドを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物を含んでもよく、バルジ二本鎖のｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物を含有し得る。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドは、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよく、バルジ二本鎖のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側は、２つのヌクレオチドを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物を含んでもよく、バルジ二本鎖のｔｒａｃｒＲＮＡ側は、２つよりも多いヌクレオチドを含有し得る。

例えば、バルジは、バルジの側に、不対プリン（例えば、アデニン）を含むことができる。幾つかの実施形態では、バルジは、バルジの側に、不対５’−ＡＡＧＺ−３’（式中、Ｚは、バルジの別の側上のヌクレオチドとゆらぎ対形成を形成することができるヌクレオチドであり得る）を含むことができる。

二本鎖の第１の側（例えば、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドの５’末端に向かう側）上のバルジは、少なくとも１個、２個、３個、４個、もしくは５個またはそれよりも多い不対ヌクレオチドを含むことができる。二本鎖の第１の側（例えば、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドの５’末端に向かう側）上のバルジは、多くても１個、２個、３個、４個、もしくは５個またはそれよりも多い不対ヌクレオチドを含むことができる。二本鎖の第１の側（例えば、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のためのポリヌクレオチドの５’末端に向かう側）上のバルジは、１個の不対ヌクレオチドを含むことができる。

二本鎖の第２の側（例えば、二本鎖のｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側）上のバルジは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個またはそれよりも多い不対ヌクレオチドを含むことができる。二本鎖の第２の側（例えば、二本鎖のｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側）上のバルジは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個またはそれよりも多い不対ヌクレオチドを含むことができる。二本鎖の第２の側（例えば、二本鎖のｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側）上のバルジは、４個の不対ヌクレオチドを含むことができる。

二本鎖の各鎖上の異なる数の不対ヌクレオチドの領域は、一緒に対形成することができる。ある特定の実施形態は、バルジを含む二次構造を含んでもよく、ここで、上記バルジは、二本鎖を形成していない。バルジは、第１の鎖からの５個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの１個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの４個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの１個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの３個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの１個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの２個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの１個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの１個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの１個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの１個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの２個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの１個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの３個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの１個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの４個の不対ヌクレオチドを含むことができる。バルジは、第１の鎖からの１個の不対ヌクレオチドおよび第２の鎖からの５個の不対ヌクレオチドを含むことができる。

ある特定の実施形態では、不対二次構造は、ポリヌクレオチドのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側上に形成される。ある特定の実施形態では、不対二次構造は、ポリヌクレオチドのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側の上に形成され、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ側上に不対二次構造をさらに含んでもよい。かかる実施形態では、これらの二次構造は、バルジであってもよい。ある特定の実施形態では、「不対」という用語は、二次構造について言及する場合、二次構造が二本鎖の形態で存在しないことを意味することができる。

場合によっては、バルジは、少なくとも１つのゆらぎ対形成を含むことができる。場合によっては、バルジは、多くても１つのゆらぎ対形成を含むことができる。バルジ配列は、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、ウラシルを含むことができる。二次構造は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの組合せを含んでもよい。ある特定の実施形態では、二次構造は、二本鎖構造を形成してもよく、上記二本鎖構造は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むバルジを含んでもよい。

ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、約６個のヌクレオチド〜約１５０個のヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、約６個のヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔまたは約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１３０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。幾つかの実施形態では、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、およそ１４個のヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、単にＤＮＡで構成される。ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、一連の少なくとも６個、７個、または８個の近接するヌクレオチドにわたって参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、一連の少なくとも６個、７個、または８個の近接するヌクレオチドにわたって参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。

ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、１つよりも多い二重領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズされた領域）を含むことができる。ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、２つの二重領域を含むことができる。ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、二次構造を含んでもよい。ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、１つよりも多い二次構造を含有し得る。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、第１の二次構造および第２の二次構造を含んでもよく、第１の二次構造は、第２の二次構造よりも多いヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、第１の二次構造、第２の二次構造、および第３の二次構造を含んでもよく、上記第１の二次構造は、上記第２の二次構造よりも少ないヌクレオチドを含み、上記第２の二次構造は、上記第３の二次構造よりも多いヌクレオチドを含む。二次構造の数および相当するヌクレオチド長は、特に限定されない。

ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６個のヌクレオチド〜約１５０個のヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔまたは約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１３０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。幾つかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４個のヌクレオチドの長さを有する。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一連の少なくとも６個、７個、または８個の近接するヌクレオチドにわたって参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一連の少なくとも６個、７個、または８個の近接するヌクレオチドにわたって参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。

ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つよりも多い二重領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズされた領域）を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重領域を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、二次構造を含んでもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つよりも多い二次構造を含有してもよい。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、第１の二次構造および第２の二次構造を含んでもよく、第１の二次構造は、第２の二次構造よりも多いヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第１の二次構造、第２の二次構造、および第３の二次構造を含んでもよく、上記第１の二次構造は、上記第２の二次構造よりも少ないヌクレオチドを含み、上記第２の二次構造は上記第３の二次構造よりも多いヌクレオチドを含む。二次構造の数および相当するヌクレオチド長は、特に限定されない。

天然に存在するタイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系と異なり、標的核酸のｃｒＲＮＡ成熟および切断にｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。図９は、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系からｃｒＲＮＡの典型的な構造を示し、ここで、ＤＮＡ標的結合配列は、Ｃｐｆ１タンパク質と相互作用するステムループ構造の下流にある。ループ領域におけるヌクレオチドの変更は、Ｃｐｆ１切断活性に影響を及ぼさない。

図１０Ａ〜Ｃは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための本開示の単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの考え得る構造を示す。これらの形状では、黒の実線の領域はＲＮＡを表すのに対して、チェックの領域はＤＮＡを表す。図１０Ａは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを表し、ここで、ターゲティング領域はＲＮＡを含み、３’ステムはＤＮＡを含み、ループおよび５’ステムは、ＲＮＡを含む。図１０Ｂは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを示し、ここで、ターゲティング領域ＲＮＡを含み、５’ステムはＤＮＡを含み、ループおよび３’ステムは、ＲＮＡを含む。図１０Ｃは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを示し、ここで、ターゲティング領域およびループは、ＲＮＡを含み、５’および３’ステムは、ＤＮＡを含む。図１０Ａ〜Ｃにおける３’および５’ステムは、集合的または個々に、本明細書中で、タイプＶ系で使用するためのポリヌクレオチドの「活性化領域」と称してもよい。

図１１Ａ〜Ｅは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための本開示の単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの考え得る構造を示す。これらの形状では、黒の実線の領域は、ＤＮＡを表すのに対して、チェックの領域はＲＮＡを表す。図１１Ａは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを示し、ここで、ターゲティング領域はＤＮＡを含み、３’ステムはＤＮＡを含み、ループおよび５’ステムは、ＲＮＡを含む。図１１Ｂは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを示し、ここで、ターゲティング領域はＤＮＡを含み、５’ステムはＤＮＡを含み、ループおよび３’ステムは、ＲＮＡを含む。図１１Ｃは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを示し、ここで、ターゲティング領域、５’ステムおよび３’ステムは、ＤＮＡを含み、ループはＲＮＡを含む。図１１Ｄは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを示し、ここで、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよび５’ステムを含み、３’ステムおよびループは、ＤＮＡを含む。図１１Ｅは、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを含み、ここで、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物ならびに５’ステムを示し、３’ステムおよびループは、ＤＮＡを含む。図１１Ａ〜Ｅにおける３’および５’ステムは、集合的または個々に、本明細書中で、タイプＶ系で使用するためのポリヌクレオチドの「活性化領域」と称してもよい。

図１２Ａ〜Ｉは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための本開示のｃｒＲＮＡおよびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの考え得る形状を示し、ここで、３’要素および５’要素は、別々のポリヌクレオチド上に存在し、水素塩基対相互作用を通じて結合して、二本鎖またはステム構造を形成する。図１２Ａは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系における使用のための二重ガイド系を示し、ここで、ターゲティング領域は、３’要素に連結されている。第２のポリヌクレオチドもまた、５’要素として図１２Ａに示される。５’要素は、ターゲティング領域に連結されている３’要素にハイブリダイズして、二本鎖またはステムを形成するように構成される。図１２Ａでは、ターゲティング領域、３’要素、および５’要素は、ＲＮＡを含む。図１２Ｂは、ＲＮＡを含む５’要素を示す。図１２Ｃは、ＤＮＡを含む５’要素を示す。図１２Ｄは、ＲＮＡを含むターゲティング領域およびＲＮＡを含む３’要素を示す。図１２Ｅは、ＲＮＡを含むターゲティング領域およびＤＮＡを含む３’要素を示す。図１２Ｆは、ＤＮＡを含むターゲティング領域およびＲＮＡを含む３’要素を示す。図１２Ｇは、ＤＮＡを含むターゲティング領域およびＤＮＡを含む３’要素を示す。図１２Ｈは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むターゲティング領域ならびにＤＮＡを含む３’要素を示す。図１２Ｉは、ＲＮＡおよびＤＮＡの代替的混合物を含むターゲティング領域ならびにＤＮＡを含む３’要素を示す。図１２Ａ〜Ｉにおける３’要素は、本明細書中で、タイプＶ系で使用するためのポリヌクレオチドの「活性化領域」と称してもよい。

図１３Ａ〜Ｈは、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための本開示のｃｒＲＮＡおよびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの考え得る形状を示し、ここで、３’要素および５’要素は、別々のポリヌクレオチド上に存在し、水素塩基対相互作用を通じて結合して、二本鎖またはステム構造を形成する。図１０Ａ〜図１３Ｈに示すポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、ＤＮＡの領域はまた、ＲＮＡを含んでもよい。幾つかの実施形態では、ＲＮＡの領域はまた、ＤＮＡを含んでもよい。幾つかの実施形態では、ＤＮＡの領域はまた、ＲＮＡを含んでもよく、ＲＮＡの領域はまた、ＤＮＡを含んでもよい。図１３Ａ〜Ｈにおける３’要素は、本明細書中で、タイプＶ系で使用するためのポリヌクレオチドの「活性化領域」と称してもよい。図１０Ａ〜図１３Ｈに示すポリヌクレオチドの様々な領域におけるＤＮＡおよびＲＮＡの比率は多様であり得る。ある特定の実施形態では、この割当ては、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＲＮＡおよびその間の範囲であってもよい。タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用することができるポリヌクレオチドの例を、配列番号１６８〜２０３で提供する。

核酸−ターゲティングポリヌクレオチドの活性化領域は、部位特異的ポリペプチドの領域と相互作用することができる。活性化領域は、部位特異的ポリペプチドの複数の領域と相互作用することができる。活性化領域は、領域の少なくとも１つが標的核酸のＰＡＭと相互作用する部位特異的ポリペプチドの複数の領域と相互作用することができる。これらの領域の例として、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）におけるＣａｓ９のアミノ酸１０９６〜１２２５および１１０５〜１１３８を挙げることができる。

不対ヌクレオチドに隣接したヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対形成相互作用を形成するヌクレオチドであり得る。ゆらぎ塩基対形成相互作用は、グアニン−ウラシル、ヒポキサンチン−ウラシル、ヒポキサンチン−アデニンおよびヒポキサンチン−シトシンを含むことができる。ゆらぎ塩基対形成相互作用は、低減された標的および／または切断特異性を引き起こし得る。非対ヌクレオチドに隣接した少なくとも１個、２個、３個、４個、もしくは５個またはそれよりも多いヌクレオチドは、ゆらぎ対形成を形成することができる。不対ヌクレオチドに隣接した多くても１個、２個、３個、４個、もしくは５個またはそれよりも多いヌクレオチドは、ゆらぎ対形成を形成することができる。ある特定の実施形態では、ターゲティング領域は、リボヌクレオチドウラシルに対する代用として、デオキシリボヌクレオチドチミン（「ｄＴ」）を含んでもよい。Ｕの代わりにｄＴを使用することにより、ゆらぎ対形成を低減して、オフターゲットの塩基対合を低減させて、したがって、ある特定の実施形態において標的特異性の増加を引き起こす。

標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せで構成することができ、二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。ターゲティング領域配列は、使用されるべき特定の部位特異的ポリペプチドに応じて、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置する標的核酸にハイブリダイズすることができる。ＰＡＭは、使用されるべき部位特異的ポリペプチドに応じて多様であり得る。例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来のＣａｓ９を使用する場合、ＰＡＭは、配列５’−ＮＲＲ−３’（式中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかであってもよく、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、ターゲティング領域配列によって標的とされる標的核酸配列のすぐ３’である）を含む標的核酸における配列であり得る。部位特異的ポリペプチドを、ＰＡＭが未修飾部位特異的ポリペプチドに関するＰＡＭと比較して異なり得るように修飾してもよい。例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）由来のＣａｓ９を使用する場合、ＰＡＭがもはや、配列５’−ＮＲＲ−３’を含まないが、代わりに、配列５’−ＮＮＲ−３’（式中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかであってもよく、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、ターゲティング領域配列によって標的とされる標的核酸配列のすぐ３’である）を含むように、Ｃａｓ９を修飾してもよい。他の部位特異的ポリペプチドは、他のＰＡＭを認識してもよく、当業者は、任意の特定の部位特異的ポリペプチドに関するＰＡＭを決定することが可能である。例えば、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１は、５’−ＴＴＮ−３’ＰＡＭを有すると同定された（Ｚｅｔｓｃｈｅら（Ｃｅｌｌ；１６３（３）：７５９〜７１頁（２０１５年）））が、これは、ｉｎ ｖｉｖｏで標的核酸の部位特異的切断を支持することはできなかった。フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）と、５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭを利用するアシダミノコッカス属種（Acidaminococcus sp）ＢＶ３Ｌ６由来のＣｐｆ１などの他のＣｐｆ１タンパク質との間でのガイド配列における類似性を考慮すると、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｚｅｔｓｃｈｅらにより誤認された切断型５’−ＴＴＮ−３’ＰＡＭに近位の標的核酸上の部位よりも高い特異性および活性で、５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭに近位の標的核酸上の部位を認識および切断する可能性がより高い。本出願に記載するポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ系を、５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭに近位の標的核酸上の部位に誘導されるＣｐｆ１タンパク質（例えば、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）由来）とともに使用してもよい。

標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、少なくとも５個、１０個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個またはよりも多いヌクレオチドであり得る。標的ヌクレオチドは、約５〜３０の範囲のヌクレオチドを含むことができる。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＲＲ−３’を含む配列において、標的核酸は、Ｎに相当する配列であってもよく、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｘは、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）によって認識されるＰＡＭの第１のヌクレオチドである。特異的なＰＡＭの選択は、所定の場合で使用されるべき特定の部位特異的ポリペプチドに基づいて、当業者の知識の範囲内である。

同じ鎖上にＤＮＡおよびＲＮＡを含む本開示のポリヌクレオチドは、発現ベクターを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで作製することができないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成は、当業者に十分理解されている。本開示のポリヌクレオチドの化学合成は、溶液中で、または、固体支持体上で実行することがきる。溶液中の合成は、中間体が各工程後に精製されるため、大量およびより高い純度のポリヌクレオチドに好ましい。より少ない量に関して、配列純度がそれほど重要でない場合、固相合成は好ましい方法である。本開示のポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドの自動化学合成を提供する商業的供給源から得ることができる。

ＤＮＡの化学合成は、ＲＮＡの化学合成よりも容易で、速く、安価であり得る。ＤＮＡを含むポリヌクレオチドの生成および試験は、ＲＮＡを含む配列と比較して、より迅速で、費用効率が良い可能性がある。ＤＮＡを含有する配列は、ＤＮＡのような標的核酸を標的とする特異性の増加の利点を提供し得る。本明細書中で論述されるような特異的な領域においてＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、リボ核酸塩基と比較して、デオキシリボ核酸塩基（例えば、ＲＮＡにおけるウラシル塩基と比較して、ＤＮＡにおけるチミジン塩基）と関連したゆらぎ塩基対形成の傾向の低減のため、オフターゲットの結合を低減させる利点をさらに提供し得る。

幾つかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはまた、例えば、ポリヌクレオチドの安定性を増加させる修飾を含んでもよい。かかる修飾は、正常な３’−５’結合、２−５’連結類縁体、および１つまたはそれ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’への、５’から５’へのまたは２’から２’への結合である反転極性を有するものを有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸メチルならびにホスホン酸３’−アルキレン、ホスホン酸５’−アルキレンのような他のホスホン酸アルキル、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホフェートおよびボラノホスフェートを含み得る。反転極性を有する適切な核酸−ターゲティングポリヌクレオチドは、３’−最も多いヌクレオチド間結合で単一３’から３’への結合（即ち、核酸塩基が欠損しているか、またはその代わりに水酸基を有する単一反転ヌクレオシド残基）を含むことができる。各種塩（例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）、混合塩および遊離酸形態もまた、含むことができる。

幾つかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはまた、他の核酸、または核酸類似体を含有してもよい。核酸の類似体の例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの本開示のポリヌクレオチドの細胞への送達は、当業者に公知の多数の方法によって達成してもよい。これらの方法としては、リポフェクション、エレクトロポーレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲートが挙げられる。リポフェクションは周知であり、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている。ポリヌクレオチドの効率的な受容体−認識リポフェクションに適している陽イオン性および中性の脂質は、国際公開第９１／１７４２４号および同第９１／１６０２４号に記載されている。

免疫脂質複合体のような目的とされるリポソームを含む脂質：核酸複合体、およびかかる複合体の製造は、当業者にとって周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１〜２９７頁（１９９５年）：Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；同第４，９４６，７８７号を参照）。

エレクトロポーレーションは、本開示のポリヌクレオチドを送達するのに使用することができる。エレクトロポーレーションはまた、部位特異的ポリペプチドおよび本開示のポリヌクレオチドの複合体を送達することに使用してもよい。これらの方法では、ポリヌクレオチド、または部位特異的ポリペプチドおよびポリペプチドの複合体は、エレクトロポーレーション緩衝液中で標的細胞と混合されて、懸濁液を形成する。続いて、この懸濁液を、最適化された電圧で電気的パルスに付して、それは、細胞膜のリン脂質二重層中に一時的な孔を創出して、ＤＮＡおよびタンパク質のような荷電分子が、孔を通って細胞へと駆動されるのを可能にする。エレクトロポーレーションを実行する試薬および機器は、商業的に販売される。

バイオリスティック、またはマイクロプロジェクタイル送達は、本開示のポリヌクレオチドを送達するのに使用することができる。これらの方法では、金またはタングステンのようなマイクロプロジェクタイルは、塩化カルシウム、スペルミジンまたはポリエチレングリコールによる沈殿によって、ポリヌクレオチドでコーティングされている。マイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ（登録商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；ハーキュリーズ、カリフォルニア）などの装置を使用して、高速で細胞へ加速される。

幾つかの実施形態では、本開示は、細胞における標的遺伝子を修飾する方法を提供する。細胞は、任意の生物由来であってもよい（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、無脊椎動物由来の細胞、脊椎動物由来の細胞またはヒト由来の細胞を含む哺乳類由来の細胞）。

幾つかの実施形態では、本開示は、植物における標的遺伝子を修飾する方法を提供する。本明細書中では、「植物」という用語は、植物全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子およびその子孫を指す。植物細胞として、種子、懸濁培養液、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉および花粒粉から細胞が挙げられるが、限定的でない。植物部位は、根、茎、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織ならびに細胞および培養液の様々な形態（例えば、単細胞、原形質体、胚およびカルス組織）を含むがこれらに限定されない分化および未分化組織を含む。

下記実施例は、発明者が本発明の様々な態様と考えるものの範囲を限定すると意図されない。

ガイドＲＮＡ構成成分の産生
ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＤＮＡ配列の５’末端でＴ７プロモーターを組み込んでいる二本鎖ＤＮＡ鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（例えば、Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）によって産生した。

ＲＮＡ構成成分に関する二本鎖ＤＮＡ鋳型は、相当するＤＮＡ配列を含有する３’重複プライマーを使用してＰＣＲによって、ＲＮＡ構成成分へと構築した。構築において使用するオリゴヌクレオチドを表１に示す。

オリゴヌクレオチド配列（例えば、配列番号６３〜１２２に示すプライマー配列）を、合成のために商業的な製造業者に供給した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル、ＩＡ；またはＥｕｒｏｆｉｎｓ、ルクセンブルク）。

ＤＮＡプライマーは、それぞれ２ｎＭの濃度で存在した。Ｔ７プロモーター（フォワードプライマー：配列番号６３、表１）、およびＲＮＡ配列の３’末端（リバースプライマー：配列番号６７および７４、表１）に相当する２つの外側ＤＮＡプライマーを６４０ｎＭで使用して、増幅反応を駆動した。ＰＣＲ反応は、製造業者の指示書に倣って、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）を使用して実行した。ＰＣＲ構築反応は、下記熱循環条件を使用して行った：９８℃で２分間、９８℃で１５秒、６２℃で１５秒、７２℃で１５秒を３５サイクル、および７２℃での最終伸長を２分間。ＤＮＡの品質は、アガロースゲル電気泳動（１．５％、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）によって評価した。

ガイドＲＮＡ構成成分に関するＤＮＡ鋳型０．２５〜０．５μｇを、Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）を使用して３７℃でおよそ１６時間転写した。転写反応を、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）で処理して、ＧｅｎｅＪｅｔ ＲＮＡ精製および濃縮キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を使用して精製した。ＲＮＡ収率は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ）を使用して定量化した。転写されたＲＮＡの品質は、アガロースゲル電気泳動（２％、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）によって調べた。

ガイドＲＮＡ構成成分配列を表２に示す。

ガイドＲＮＡ構成成分に関する上述の方法は、本明細書中に記載するような他のＲＮＡ構成成分の産生に当てはめることができる。

Ｃａｓ９切断アッセイでの使用のための二本鎖ＤＮＡ標的領域の産生
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓ切断アッセイにおける使用のための標的二本鎖ＤＮＡを、ゲノムＤＮＡからの標的領域のＰＣＲ増幅を使用して産生した。

生化学アッセイのための二本鎖ＤＮＡ標的領域（例えば、ＡＡＶＳ−１）は、フェノール−クロロホルム製造ヒト細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応は、製造業者の指示書に倣って、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）を使用して実行した。最終２５μｌ中の２０ｎｇ／μＬ ｇＤＮＡを使用して、下記条件下で、選択した標的領域を増幅させた：９８℃で２分間、９８℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒を３５サイクル、および７２℃での最終伸長を２分間。ＰＣＲ産物は、Ｓｐｉｎ Ｓｍａｒｔ（商標）ＰＣＲ精製チューブ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サウスプレインフィールド、ＮＪ）を使用して精製して、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ）を使用して定量化した。

ｇＤＮＡ由来の選択した標的配列の増幅に使用するフォワードおよびリバースプライマーは、下記の通りだった。プライマー、アンプリコンサイズ、およびＣａｓ媒介性切断から生成される断片のサイズを表３に示す。

他の適切な二本鎖ＤＮＡ標的領域は、本質的に同じ方法を使用して得られる。非ヒト標的領域に関しては、ヒト細胞に由来するＤＮＡに代わって、選択した生物（例えば、植物、細菌、酵母、藻類）由来のゲノムＤＮＡを使用する。さらに、ゲノムＤＮＡ以外のポリヌクレオチド供給源を使用することができる（例えば、ベクターおよびゲル分離ＤＮＡ断片）。

Ｃａｓ９切断アッセイ
この実施例は、選択したｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の切断パーセントを評価して、選択した二本鎖ＤＮＡ標的配列に対して比較するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓ９切断アッセイにおける本開示のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの使用を示す。

二本鎖ＤＮＡ標的（ＡＡＶＳ−１；実施例２、表３）に対して、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ変異体（配列番号：３８〜６２）の一群に関して、切断活性を決定した。

ｓｇＲＮＡ、ｃｒＤＮＡまたはｃｒＤ（Ｒ）ＮＡはそれぞれ、アニーリング緩衝液（１．２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．６２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、９．３７５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５にて）中で等モル量で、ｔｒａｃｒＲＮＡ（適切である場合）と混合して、９５℃で２分間インキュベートして、サーモサイクラーから取り出して、室温に平衡化させた。

ｓｇＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｃａｓ９反応ミックスに添加した。Ｃａｓ９反応ミックスは、反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴおよび５％グリセリン、ｐＨ ７．４にて）中に、最終濃度２００μＭに希釈したＣａｓ９タンパク質を含んでいた。反応ミックスにおいて、各ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの最終濃度は、各反応ミックス中で５００ｎＭであった。反応ミックスはそれぞれ、３７℃で１０分間インキュベートした。切断反応は、最終濃度１５ｎＭへの標的ＤＮＡの添加によって開始した。サンプルを混合して、手短に遠心分離した後、３７℃で１５分間インキュベートした。切断反応は、最終濃度０．２μｇ／μＬでのプロテイナーゼＫ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サウスプレインフィールド、ＮＪ）および０．４４ｍｇ／μｌのＲＮａｓｅ Ａ溶液（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）の添加によって終結させた。

サンプルを３７℃で２５分間および５５℃で２５分間インキュベートした。反応全体１２μｌを、アガロースゲル電気泳動（２％、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）によって切断活性に関して評価した。ＡＡＶＳ−１二本鎖ＤＮＡ標的に関して、およそ３１６ｂｐおよびおよそ１７９ｂｐでのＤＮＡバンドの出現は、標的ＤＮＡの切断が起きたことを示した。切断の百分率は、各切断断片および標的ＤＮＡに関してＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ；オープンソースＪａｖａ（登録商標）画像処理プログラム）によって算出される曲線下面積値を使用して、切断断片の合計を、切断断片および標的ＤＮＡの両方の合計で除算して算出した。

図３は、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡのＡＡＶＳ−１標的二本鎖ＤＮＡを使用したＣａｓ９切断アッセイの結果を示す。各パネルの上部に、使用するガイドＲＮＡ構成成分に相当するレーン番号が見られ、各構成成分に相当する配列番号を表４に示す。

切断の百分率は、各レーンの底部に示す。切断活性が観察されなかったｃｒＤＮＡまたはｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ（例えば、図３の３；図３の５；図３の１５；図３の３３；図３の３４；図３の３５）に関しては、切断活性は、ｎ／ｄ（切断活性が検出されなかったことを
示す）と表す。

図３に提示するデータは、本開示のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡが、標的二本鎖ＤＮＡのＣａｓ９媒介性部位特異的切断を促進することを実証している。

多重標的に対するｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ活性
この実施例は、特異的な配列を標的とするようにプログラムされた種々の空間を含むｃｒＤ（Ｒ）ＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生化学活性を実証する。

ｃｒＤＮＡ、ｃｒＲＮＡ、およびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの配列（表５に示す）は、合成のために商業的な製造業者に供給した。

ｔｒａｃｒＲＮＡは、実施例１に記載するように構築した。

二本鎖ＤＮＡ標的は、適切な標的配列に相当する表３に示すオリゴヌクレオチドを使用して、実施例２に記載するように生成した。

ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡをハイブリダイズして、生化学的切断は、実施例３に記載するように実行する。

図４Ａおよび図４Ｂは、各種スペーサーの生化学的切断に関する結果を示す。図４Ａは、生化学的切断の百分率を示す。ＥＭＸ標的１に関する活性を、群１に示す：ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＶＥＧＦＡ標的１に関する活性を、群２に示す：ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＣＤ３４標的１に関する活性を、群３に示す：ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＣＤ３４標的２に関する活性を、群４に示す：ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＳＴＡＴ５ａ標的１に関する活性を、群５に示す：ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＳＴＡＴ５ａ標的２に関する活性を、群６に示す：ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＪＡＫ１標的１に関する活性を、群７に示す；ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。ＪＡＫ１標的２に関する活性を、群８に示す；ここで、「Ａ」は、Ｃａｓ９のみの対照であり、「Ｂ」は、ｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｃ」は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９であり、「Ｄ」は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９である。全てのＣａｓ９のみのサンプル（図４Ａ、「Ａ」）およびｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃａｓ９サンプル（図４Ｂ、「Ｂ」）については、切断活性が検出されなかった（図４Ａ、「ｎ／ｄ」）。

図４Ｂでは、切断パーセントは、グラフのｙ軸上に示され、標的は、ｘ軸上に示される。ＥＭＸ標的１に関する活性は、群１の棒で示される。ＶＥＧＦＡ標的１に関する活性は、群２の棒で示される。ＣＤ３４標的１に関する活性は、群３の棒で示される。ＣＤ３４標的２に関する活性は、群４の棒で示される。ＳＴＡＴ５ａ標的１に関する活性は、群５の棒で示される。ＳＴＡＴ５ａ標的２に関する活性は、群６の棒で示される。ＪＡＫ１標的１に関する活性は、群７の棒で示される。ＪＡＫ１標的２に関する活性は、群８の棒で示される。「Ｃ」および「Ｄ」は、図４Ａと同じ反応を指す。

図４は、本開示のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを使用した二本鎖ＤＮＡ標的のＣａｓ９媒介性の生化学的切断が、種々の標的配列を移行可能であることを実証する。

真核細胞における標的修飾の検出に関するＴ７Ｅ１アッセイ
この実施例は、選択した二本鎖ＤＮＡ標的配列に対して、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの切断パーセントを評価するためのＴ７Ｅ１アッセイの使用を示す。

Ａ．Ｃａｓポリヌクレオチド構成成分を使用した細胞トランスフェクション
ＡＡＶＳ−１ターゲティング配列を含むｓｇＲＮＡおよびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）および下記プロトコールを使用して、ＳｐｙＣａｓ９−ＧＦＰ融合（ＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９−ＧＦＰ）を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトした。等モル量のガイドＲＮＡ構成成分は、アニーリング緩衝液（１．２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．６２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、９．３７５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５にて）中で製造して、９５℃で２分間インキュベートして、サーモサイクラーから取り出して、室温に平衡化させて、９６ウェルプレートにおいて三連で、最終容量１０μＬで分配した。培養培地を、ＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９−ＧＦＰ細胞から吸引し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳで一度、細胞を洗浄して、続いて、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）の添加によってトリプシン処理した後、３７℃で３〜５分間インキュベートした。トリプシン処理した細胞を、穏やかに上下にピペットで採取して、単一細胞懸濁液を形成し、１０％のＦＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ＰＡ）を含有し、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を補充したＤＭＥＭ培養培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）で構成されるＤＭＥＭ完全培養培地に添加した。

続いて、２００×ｇで３分間の遠心分離によって、細胞をペレット化して、吸引した培養培地および細胞を、ＰＢＳ中に再懸濁させた。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を使用して、細胞を計数した。２．２×１０^７個の細胞を、５０ｍｌチューブへ移して、ペレット化した。ＰＢＳを吸引して、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＳＦ（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）溶液中に、１×１０^７個の細胞／ｍＬの密度になるように細胞を再懸濁した。次に、細胞懸濁液２０μＬを、Ｃａｓポリヌクレオチド構成成分１０μＬを含有する個々のウェルに添加して、容量全体を、９６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）プレート（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）のウェルに移した。プレートを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ（商標）（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）上に載せて、９６−ＣＭ−１３０ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）を使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、ＤＭＥＭ完全培養培地７０μＬを各ウェルに添加して、細胞懸濁液５０μＬを、予熱したＤＭＥＭ完全培養培地１５０μＬを含有するコラーゲンでコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートに移した。続いて、プレートは、組織培養インキュベーターへ移して、３７℃にて５％ＣＯ_２中で４８時間、プレートを維持した。

Ｂ．Ｔ７Ｅ１アッセイのための標的二本鎖ＤＮＡ生成
ウェル１つ当たりＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ＷＩ）５０μＬを使用して、Ｃａｓポリヌクレオチド構成成分トランスフェクションの４８時間後に、ｇＤＮＡを、ＨＥＫ−２９３−ＳｐｙＣａｓ９細胞から単離して、続いて３７℃で１０分間、６５℃で６分間および９５℃で３分間インキュベートして、反応を停止させた。次に、ｇＤＮＡは、水１５０μＬ水で希釈して、サンプルを−８０℃で保管した。

Ｔ７Ｅ１に関するＤＮＡは、単離したｇＤＮＡからの標的二本鎖ＤＮＡ配列（例えば、ＡＡＶＳ−１）のＰＣＲ増幅によって生成させた。ＰＣＲ反応は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼともに鋳型としてｇＤＮＡ ８μＬを使用して、また総容量２５μＬ中に０．５Ｕのポリメラーゼ、１×反応緩衝液、０．４ｍＭ ｄＮＴＰおよび標的二本鎖ＤＮＡ（例えば、ＡＡＶＳ−１、配列番号：７５、７６（表３））に対する３００ｎＭフォワードおよびリバースプライマーを含有して、ＰＣＲ反応を設定した。標的ＤＮＡは、下記条件を使用して増幅した：９５℃で５分間、９８℃で２０秒、７０℃の２０秒、−２℃／サイクル、７２℃で３０秒を４サイクル、続いて９８℃で１５秒、６２℃で２０秒、７２℃で２０秒を３０サイクル、および７２℃での最終伸長を１分間。

Ｃ．Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイのためのＰＣＲ増幅した標的二本鎖ＤＮＡを、９５℃で１０分間変性させた後、サーマルサイクラーで−０．５℃／秒で２５℃まで冷却することによって再アニーリングさせた。再アニーリングしたＤＮＡを、総容量１５ｍＬ中で１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２緩衝液中のＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）０．５ｍＬとともに、３７℃で２５分間インキュベートした。Ｔ７Ｅ１反応は、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、エームズ、ＩＡ）およびＤＮＦ−９１０二本鎖ＤＮＡ試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、エームズ、ＩＡ）を使用して分析した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システムは、各切断断片の、および切断後に残存する標的二本鎖ＤＮＡの濃度を提供する。

標的二本鎖ＤＮＡの切断の百分率は、下記方程式を使用して、各切断断片および切断が行われた後に残存する標的二本鎖ＤＮＡの濃度から算出した：

方程式１において、「ｆｒａｇ１」および「ｆｒａｇ２」の濃度は、二本鎖ＤＮＡ標的のＣａｓ切断断片の濃度に相当し、「親」は、切断が行われた後に残存する標的二本鎖ＤＮＡに相当する。

図５は、様々な濃度でｃｒＤ（Ｒ）ＮＡでトランスフェクトした細胞から準備したｇＤＮＡのＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す。検出されるインデル頻度の平均パーセントを、各棒グラフ上に示した（方程式１を使用して算出）。パーセントは、図５の棒４（ここでは、活性が２つのサンプルで検出されたに過ぎなかった）および図５の棒５（ここでは、活性が１つのサンプルで検出されたに過ぎなかった）を除いて、３つのサンプルの平均値である。細胞へヌクレオフェクトしたｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮのいずれかの濃度を、表６に示す。

真核細胞における標的修飾の検出に関するＴ７Ｅ１アッセイは、本明細書中に記載するようなｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９系が標的二本鎖ＤＮＡのＣａｓ媒介性の部位特異的なｉｎ ｖｉｖｏ切断を促進することを実証するデータを提供する。

本明細書中に記載するガイダンスを受けて、この実施例で記載するＴ７Ｅ１アッセイは、当業者によって実行されて、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを含むように本明細書中に記載するように修飾されたそれらの同族ポリヌクレオチド構成成分と組み合わせて、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９オルソログによってコードされるタンパク質、Ｃａｓ９様合成タンパク質、Ｃａｓ９融合、ならびにそれらの変異体および修飾を含むがこれらに限定されない他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で修飾された細胞由来の活性を測定することができる。

オン／オフターゲットのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ切断活性
この実施例は、意図する標的部位（「オンターゲット」）および予測される最も近隣接（オフターゲットの）部位の標的の切断活性を評価するためのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの使用を示す。オン／オフターゲットの部位の標的配列を、表７に示す：

ｃｒＲＮＡおよびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列を、合成のために商業的な製造業者に供給した。ｔｒａｃｒＲＮＡは、実施例１に記載するように構築した。

二本鎖ＤＮＡ標的は、適切な標的配列に相当する表８に示すオリゴヌクレオチドを使用して、実施例２に記載するように生成した。

ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡをハイブリダイズして、生化学的切断は、実施例３に記載するように実行した。

図６は、意図するオンターゲット部位および４つの計算的に予測されるオフターゲットの部位でのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの生化学活性の比較を示す。切断パーセントは、グラフのｙ軸上に示され、サンプルは、ｘ軸上に示される。表９にサンプルを列挙する：

図７に提示するデータは、ｃｒＲＮＡと比較した場合に、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡが高いオンターゲット活性を維持することを示す。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、オフターゲットの活性を支持しないのに対して、ｃｒＲＮＡは、望ましくないオフターゲットの活性を有する。

真核細胞における標的修飾の検出に関するディープシーケンシング分析
この実施例は、選択した二本鎖ＤＮＡ標的配列に対して、選択したｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの切断パーセントを評価および比較するためのディープシーケンシング分析の使用を示す。

Ａ．ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの合成
ヒトＡＡＶＳ−１遺伝子座を標的とし、種々のＤＮＡ／ＲＮＡ組成およびホスホロチオエート保護結合を含む６つのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列を、合成のために商業的な製造業者に供給した。これらの配列を、表１０に示す。

Ｂ．ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＰ複合体の形成
Ｃａｓ９タンパク質は、Ｊｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ；３３７（６０９６）：８１６〜２１頁（２０１２年））に記載されている方法に従って、大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１（ＤＥ３））における細菌発現ベクターから発現させて、アフィニティーイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９に関するコード配列は、Ｃ末端に２つの核局在配列（ＮＬＳ）を含んでいた。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、２つの濃度２０ｐｍｏｌのＣａｓ９：６０ｐｍｏｌのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡおよび２００ｐｍｏｌのＣａｓ９：６００ｐｍｏｌのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡで、三連で構築した。ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ構成成分は、最終容量５μＬ中で望ましい濃度（６０ｐｍｏｌまたは６００ｐｍｏｌ）になるように、アニーリング緩衝液（１．２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．６２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、９．３７５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５にて）中で等モル量で混合して、９５℃で２分間インキュベートして、サーモサイクラーから取り出して、室温に平衡化させた。Ｃａｓ９タンパク質は、最終容量５μＬになるように、結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴおよび５％グリセリン、ｐＨ ７．４にて）中で適切な濃度へ希釈して、熱変性させたｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ ５μＬと混合して、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。

Ｃ．ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質ＲＮＰを使用した細胞トランスフェクション
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）および下記プロトコールを使用して、ＲＮＰ複合体を、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）にトランスフェクトした。ＲＮＰ複合体を、最終容量１０μＬで９６ウェルプレートの個々のウェルに分配した。培地中に懸濁したＫ５６２細胞を、培養フラスコから５０ｍＬコニカルチューブへ移した。２００×ｇで３分間の遠心分離によって、細胞をペレット化して、培養培地を吸引して、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳで一度、細胞を洗浄した。続いて、２００×ｇで３分間の遠心分離によって、Ｋ５６２細胞をペレット化して、ＰＢＳを吸引して、細胞ペレットを、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ １０ｍＬ中に再懸濁させた。

Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を使用して、細胞を計数した。２．２×１０^７個の細胞を、５０ｍｌのチューブへ移して、ペレット化した。ＰＢＳを吸引して、１×１０^７個の細胞／ｍＬの密度になるように、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＳＦ（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）溶液中に細胞を再懸濁させた。細胞懸濁液２０μＬを、ＲＮＰ複合体１０μＬを含有する個々のウェルに添加して、容量全体を、９６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）プレート（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）のウェルへ移した。プレートを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ（商標）（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）上に載せて、９６−ＦＦ−１２０ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ｌｏｎｚａ、アレンデール、ＮＪ）を使用して、細胞をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後に、１０％ＦＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ＰＡ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）７０μＬを各ウェルに添加して、細胞懸濁液５０μＬを、予熱したＩＭＤＭ完全培養培地１５０μＬを含有する９６ウェル細胞培養プレートへ移した。次に、プレートを、組織培養インキュベーターへ移して、３７℃にて５％ＣＯ_２中で４８時間維持した。

Ｄ．ディープシーケンシングのための標的二本鎖ＤＮＡ生成
ウェル１つ当たりＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ＷＩ）５０μＬを使用して、ＲＮＰトランスフェクションの４８時間後に、ｇＤＮＡを、Ｋ５６２細胞から単離して、続いて３７℃で１０分間、６５℃で６分間および９５℃で３分間インキュベートして、反応を停止させた。単離したｇＤＮＡは、水５０μＬ水で希釈して、サンプルを−８０℃で保管した。

単離したｇＤＮＡを使用して、第１のＰＣＲは、最終容量１０μＬ中で、１×濃度でのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）、それぞれ０．５μＭでのプライマー（配列番号９３、９４）、ｇＤＮＡ ３．７５μＬを使用して実行し、９８℃で１分間、９８℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル、および７２℃での最終伸長を２分間増幅させた。ＰＣＲ反応は、水中に１：１００希釈した。

「バーコーディング」ＰＣＲは、マルチプレックスシーケンシングを容易とするために各サンプルにつき特有のプライマーを使用して設定した。サンプルおよび相当するプライマー対を、表１１に示す。

バーコーディングＰＣＲは、最終容量１０μＬ中で、１×濃度でのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）、それぞれ０．５μＭでのプライマー、１：１００希釈した第１のＰＣＲ １μＬを使用して実行し、９８℃で１分間、９８℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒を１２サイクル、および７２℃での最終伸長を２分間増幅させた。

Ｅ．ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔによる浄化
ＰＣＲ反応を、シーケンシング用のアンプリコンのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、パサデナ、ＣＡ）ビーズベースの浄化用の単一マイクロチューブにプールした。

プールしたアンプリコンに、０．９倍容量のＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを添加して、混合して、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。溶液が透明になるまで、マイクロチューブを、磁気チューブスタンド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、パサデナ、ＣＡ）に配置した。上清を除去して、廃棄して、残留ビーズは、１容量の８５％エタノールで洗浄して、ＲＴで３０秒間インキュベートした。インキュベーション後、エタノールを吸引して、ビーズをＲＴで１０分間風乾させる。続いて、マイクロチューブを磁気スタンドから取り外して、０．２５倍容量のＱｉａｇｅｎ ＥＢ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、フェンロ、リンブルフ）をビーズに添加して、激しく混合して、室温で２分間インキュベートした。マイクロチューブを磁石に戻して、溶液が透明になるまでインキュベートして、精製アンプリコンを含有する上清を、きれいなマイクロチューブに分配した。精製アンプリコンライブラリーは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ）を使用して定量化して、ライブラリーの品質は、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、エームズ、ＩＡ）およびＤＮＦ−９１０二本鎖ＤＮＡ試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、エームズ、ＩＡ）を使用して分析した。

Ｆ．ディープシーケンシング設定
アンプリコンライブラリーは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ値およびアンプリコンのサイズから算出される場合に４ｎｍｏｌａｒ濃度に標準化させた。ライブラリーは、ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）で、ＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて、２つの１５１サイクルペアードエンドラン＋２つの８サイクルインデックス読取りで３００サイクルに関して分析した。

Ｇ．ディープシーケンシングデータ分析
シーケンシングデータにおける産物の独自性は、ＰＣＲのバーコーディングラウンドにおいてアンプリコン上に適応させたインデックスバーコード配列に基づいて決定した。コンピュータースクリプトを使用して、下記タスクを実行することによってＭｉＳｅｑデータを処理した：

・Ｂｏｗｔｉｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｗｔｉｅ−ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）ソフトウェアを使用して、読取りを、ヒトゲノム（ビルドＧＲＣｈ３８／３８）に整列させた。

・整列させた読取りを、予測される野生型ＡＡＶＳ−１遺伝子座配列と比較して、ＡＡＶＳ−１遺伝子座のいかなる部分にも整列しない読取りは廃棄した。

・野生型ＡＡＶＳ−１配列に適合する読取りを集計した。

・インデル（塩基の挿入または欠失）を伴う読取りは、ｉｎｄｅｌ型で分類して、集計した。

・総計ｉｎｄｅｌ読取りを、野生型読取りの合計で除算して、インデル読取りは、検出されるインデルパーセントを付与する。

図７は、ＡＡＶＳ−１遺伝子座における領域を標的とするｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ／Ｃａｓ９でヌクレオフェクトしたヒトＫ５６２細胞由来のＡＡＶＳ−１標的遺伝子座の分析の結果を示す。ｘ軸は、配列番号を示す。使用するｓｇＤ（Ｒ）ＮＡに関して、ｙ軸は、ＭｉＳｅｑデータから検出されるインデルパーセントを示す。シリーズＡは、２０ｐｍｏｌのＣａｓ９：１２０ｐｍｏｌのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡで所定のｓｇＤ（Ｒ）ＮＡに関して、３つの独立複製について検出されるインデル平均パーセントを示し、シリーズＢは、１００ｐｍｏｌのＣａｓ９：６００ｐｍｏｌのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡで所定のｓｇＤ（Ｒ）ＮＡに関して、３つの独立した複製について検出されるインデル平均パーセントを示す。３つの複製の平均パーセントの標準偏差は、垂直黒線で表される。棒の下の数字は、トランスフェクションで使用するｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの配列番号に相当し、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの配列を、表１０に示す。このデータは、様々なタイプのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの、配列特異的および用量依存性様式でヒト細胞における標的領域にて修飾を誘導する能力を示す。

本明細書中に記載する方法は、ディープシーケンシングの分析によってｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ／Ｃａｓ９のｉｎ ｖｉｖｏ活性を実証するために、当業者によって実行された。

ＤＮＡ標的結合配列を含む多重ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡのスクリーニング
この実施例は、ヒトゲノムＤＮＡ中に存在する標的を修飾して、それらの部位での切断活性のレベルを測定するための、本開示のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの使用を示す。標的部位はまず、ゲノムＤＮＡから選択することができ、次に、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを、それらの選択した配列を標的とするように設計することができる。続いて、測定を実行して、起こった標的切断のレベルを決定することができる。下記工程が全て、あらゆるスクリーニングに必要とされるわけでなく、また工程の順序が提示するようでなくてはならないわけでもなく、スクリーニングは、他の実験と連結させることができるか、またはより大規模な実験の一部を成すことができる。

Ａ．ＤＮＡ標的領域をゲノムＤＮＡから選択する
選択したゲノム領域内の全てのＰＡＭ配列（例えば、「ＮＧＧ」）を同定する。

ＰＡＭ配列に５’で隣接している１つまたはそれ以上の２０ヌクレオチド配列長の配列（標的ＤＮＡ配列）を同定および選択する。

選択基準として、ゲノム中の他の領域に対する相同性；Ｇ−Ｃ含有量パーセント；融解温度；スペーサー内のホモポリマーの存在；および当業者に公知の他の基準が挙げることができるが、これらに限定されない。

同定した標的ＤＮＡ配列の３’末端に、適切なｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列を付加する。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ構築物は通常、商業的な製造業者によって合成されて、同族のｔｒａｃｒＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって実施例１に記載するように産生される。

本明細書に記載するｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、同族ｔｒａｃｒＲＮＡとともに使用して、同族Ｃａｓタンパク質で使用するためのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ系を完成することができる。

Ｂ．切断の百分率および特異性の決定
ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ系と関連付けられるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断の百分率および特異性を、例えば、下記の通りに、実施例３のＣａｓ切断アッセイを使用して比較する：

（ａ）単一標的ＤＮＡ配列のみが同定または選択される場合、ＤＮＡ標的領域に関する切断の百分率および特異性を決定することができる。そのように望まれる場合、切断の百分率および／または特異性は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを修飾すること、エフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列またはリガンド／リガンド結合部分を導入することを含むがこれらに限定されない本開示の方法を使用して、さらなる実験において変更させることができる。

（ｂ）切断アッセイから得られる切断の百分率データおよび部位特異性データを、標的結合配列を含む種々のＤＮＡ間で比較して、最良の切断の百分率および最高の特異性を有する標的ＤＮＡ配列を同定することができる。切断の百分率データおよび特異性データは、様々な用途に関する選択の基礎となる基準を提供する。例えば、幾つかの状況では、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの活性は、最も重要な因子であり得る。他の状況では、切断部位の特異性は、切断の百分率よりも比較的重要であり得る。そのように望まれる場合、切断の百分率および／または特異性は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを修飾すること、エフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列またはリガンド／リガンド結合部分を導入することを含むがこれらに限定されない本開示の方法を使用して、さらなる実験において変更させる。

場合により、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析に代わって、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ系と関連付けられるｉｎ ｖｉｖｏでの切断の百分率および特異性は、例えば、下記の通りに、実施例５に記載するＴ７Ｅ１アッセイを使用して比較する：

（ａ）標的ＤＮＡ配列のみが同定される場合、ＤＮＡ標的領域に関する切断の百分率および特異性を決定することができる。そのように望まれる場合、切断の百分率および／または特異性は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを修飾すること、エフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列またはリガンド／リガンド結合部分を導入することを含むがこれらに限定されない本開示の方法を使用して、さらなる実験において変更させる。

（ｂ）切断アッセイから得られる切断の百分率データおよび部位特異性データを、種々の標的ＤＮＡ間で比較して、標的ＤＮＡの最高の切断の百分率および標的ＤＮＡに関する最高の特異性をもたらすｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列を同定することができる。切断の百分率データおよび特異性データは、様々な用途に関する選択の基礎となる基準を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの活性に依存する場合があり、最も重要な要因であり得る。ある特定の実施形態では、切断部位の特異性は、切断の百分率よりも比較的重要であり得る。ある特定の実施形態では、切断の百分率および／または特異性は、ＲＮＡを修飾すること、エフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列またはリガンド／リガンド結合部分を導入することを含むがこれらに限定されない本開示の方法を使用して、変更させることができる。

本明細書および実施例のガイダンスを受けて、この実施例に記載するスクリーニングは、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを含むように本明細書中に記載するように修飾されたそれらの同族ポリヌクレオチド構成成分と組み合わせて、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ、Ｃａｓ３、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ９オルソログによってコードされるタンパク質、Ｃａｓ９様合成タンパク質、Ｃａｓ９融合、Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ１様、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ならびにそれらの変異体および修飾を含むがこれらに限定されない他のＣｌａｓｓ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質を用いて、当業者によって実行することができる。

ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ媒介性ニッキング
この実施例は、本開示のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体またはｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを使用して、ＲｕｖＣヌクレアーゼの突出部を不活性にするＤ１０Ａ突然変異（Ｃａｓ９〜Ｄ１０Ａ）を含有するＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９と併せて、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プラスミド標的のニックを誘導してもよい方法を示す。下記工程が全て、必要とされるわけでなく、また工程の順序が提示するようでなくてはならないわけでもない。

Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９は、２つの活性なヌクレアーゼドメインＲｕｖＣおよびＨＮＨドメイン域を有する。アスパラギン酸をアラニンに変換する、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９の１０番目のアミノ酸位置にあるアスパラギン酸の突然変異は、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ能力を低減する。ＨＮＨドメインは、依然として活性のままであるが、Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ部位特異的ポリペプチドは、スペーサー配列に相補的なＤＮＡ標的鎖のホスホジエステル骨格におけるニックを引き起こすことができるに過ぎない。

適切なベクター、培地、培養条件などの例が記載される。これらの構成成分および条件の改変は、本明細書の教示を考慮して当業者により理解される。

ガイド試薬は、本明細書の実施例１に従って生成した。

ｄｓＤＮＡ標的は、配列番号１３３および１３４を使用して、実施例２に記載するように生成した。続いて、増幅させた断片を、適切なＬＩＣ適合性ベクターにクローニングした。かかる適切なベクターの１つは、市販のｐＥＴ Ｈｉｓ６ ＬＩＣクローニングベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、ケンブリッジ、ＭＡ）である。プラスミドを、市販のＸＬ１−Ｂｌｕ細菌細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、ＣＡ）を使用して、プラスミド発現用の細菌株に形質転換した。

ＬＩＣベクターを含有する細菌細胞を、３７℃で１８時間、１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）を補充したＬＢ培地中で成長させた。細胞を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、その後、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ、フェンロ、オランダ）を使用して抽出した。

精製したプラスミドの生化学的切断は、ＤＮＡ標的が反応において１ｎＭの最終濃度で精製されたプラスミドと置き換える修飾を用いて、本明細書の実施例３で詳述するように実行した。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、実施例３に記載する様式で、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）とハイブリダイズさせた。

生化学的反応は、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）で染色した１％のアガロースゲルに流すことによって分析した。ニッキング効率は、スーパーコイル状プラスミド形態の消失およびプラスミドの切れ目の入った開環状形態（切れ目の入ったプラスミド）の出現に基づいて算出して、それは、ゲル上のプラスミドの遊走率におけるシフトによって識別可能であった。

切れ目の入ったプラスミドの百分率は、切れ目の入ったプラスミドおよび超らせん状プラスミドを含有するゲル上の染色バンドの強度から算出した。強度は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ；オープンソースＪａｖａ（登録商標）画像処理プログラム）によって算出されるような曲線下面積値を使用して測定した。ニッキングの百分率は、切れ目の入ったプラスミドの染色強度を、切れ目の入ったプラスミド種および超らせん状プラスミド種の両方の染色強度の合計で除算することによって算出した。

この実験で使用するｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡに関する配列番号を表１２に示す。

図８は、プラスミド標的に対するＣａｓ９−Ｄ１０Ａタンパク質を有するｃｒＤ（Ｒ）ＮＡまたはｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの生化学的ニッキング活性の結果を示す。ニッキングの百分率をｙ軸に示す。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡサンプルは、ｘ軸に示し、表１２に示すサンプルＩＤに相当する。データは、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの、プラスミド標的に対するＣａｓ９−Ｄ１０Ａタンパク質のニッキング活性を支持する能力を示す。データはまた、スペーサーの５’末端からのスペーサー配列（配列番号１３５、１３６および１３７）のトランケーションがニッキング活性の能力があることを示す。

本明細書および本明細書中の実施例のガイダンスを受けて、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡのニッキング活性の設計ならびに検証は、当業者によって実行することができる。

ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの同定ならびにスクリーニング
この実施例は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ タイプＩＩ系のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を同定し得る方法を示す。本明細書で提示する方法は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉらの方法（ＲＮＡ Ｂｉｏｌ；１０（５）：７２６〜３７頁（２０１３年））を適合させたものである。下記工程の全てが必ずしもスクリーニングに必要でなはく、また示された工程の順序通りでなくてもよい。

Ａ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ タイプＩＩ系を含有する細菌種を同定する
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、様々な種のゲノムの検索を行って、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様のタンパク質を同定した。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、細菌種の至るところで配列における高い多様性を示すが、Ｃａｓ９オルソログは、中心的なＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび分断ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ Ｈドメインの保存ドメイン構造を示した。主要なＢＬＡＳＴ結果は、同定された領域に関してフィルタリングされて、不完全な、または切断型配列を廃棄して、Ｃａｓ９オルソログを同定した。

Ｃａｓ９オルソログが種において同定される場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座に属する全ての配列を同定するために、Ｃａｓ９オルソログのコード配列に隣接している配列を、他のＣａｓタンパク質および関連繰り返し−スペーサーアレイに関してプロービングした。これは、密接に関連した種が類似のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座構造（即ち、Ｃａｓタンパク質組成、サイズ、配向、アレイの位置、ｔｒａｃｒＲＮＡの位置など）を示すという見解で、公的ドメインですでに公知である他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ タイプＩＩ遺伝子座に対するアラインメントによって実行された。

Ｂ．推定ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの同定
遺伝子座内で、ｃｒＲＮＡは、外来ＤＮＡの断片によって間が空いているそれらの繰り返し配列の性質によって容易に同定可能であり、繰り返し−スペーサーアレイを作り上げる。繰り返し配列が、公知の種由来である場合、それは、ＣＲＩＳＰＲｄｂデータベース（ｃｒｉｓｐｒ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒ／）において同定されて、それから検索された。繰り返し配列が、種と関連付けられることが公知でない場合、繰り返し配列は、上述するように種に関するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ タイプＩＩ遺伝子座と同定された配列を使用して、ＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒソフトウェア（ｃｒｉｓｐｒ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／Ｓｅｒｖｅｒ／）を使用して予測された。

繰り返し配列の配列が、いったん種に関して同定されると、ｔｒａｃｒＲＮＡは、繰り返し−スペーサーアレイにおける繰り返し配列（ｔｒａｃｒ抗繰り返し配列）に対するその配列相補性によって同定された。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの予測的スクリーニングを使用して、関連ｔｒａｃｒＲＮＡを同定するために抗繰り返し配列を抽出した。推定抗繰り返しは、例えば、下記の通りにスクリーニングされた。

所定の種に関して同定した繰り返し配列を使用して、抗繰り返し配列に関するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座をプロービングした（例えば、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムなどを使用して）。検索はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座のイントロン領域に、典型的に制限された。

同定した抗繰り返し領域は、同定した繰り返し配列に対する相補性に関して検証した。

推定抗繰り返し領域は、Ｒｈｏ独立転写ターミネーターに関して推定抗繰り返しの５’および３’の両方でプロービングした（ＴｒａｎｓＴｅｒｍ ＨＰ、ｔｒａｎｓｔｅｒｍ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／）。

したがって、抗繰り返し要素およびＲｈｏ独立転写ターミネーターを含む同定した配列は、所定の種の推定ｔｒａｃｒＲＮＡであると決定された。

Ｃ．ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの製造
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定された推定ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）を使用してさらに検証された。

推定ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが同定された種由来の細胞は、商業的な貯蔵所（例えば、ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ；ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から調達した。

細胞は、対数期の中間にまで成長させて、総ＲＮＡは、トリゾール試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）を使用して準備して、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ヴィリニュス、リトアニア）で処理した。

総ＲＮＡ １０μｇは、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）で処理して、残存するＲＮＡを、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、アーバイン、ＣＡ）を使用して精製した。

続いて、製造業者の指示書に倣って、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用して、ライブラリーを製造して、それが、ｃＤＮＡと関連付けられるアダプター配列の存在をもたらした。

得られたｃＤＮＡライブラリーは、ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用してシーケンシングした。

Ｄ．シーケンシングデータの処理
ｃＤＮＡライブラリーのシーケンシングの読取りは、下記方法を使用して処理することができる。

アダプター配列は、ｃｕｔａｄａｐｔ １．１（ｐｙｐｉ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／ｐｙｐｉ／ｃｕｔａｄａｐｔ／１．１）を使用して除去され、１５ｎｔは、読取りの３’末端から切り取られて、読取りの品質を改善させた。

読取りは、２個のヌクレオチドのミスマッチ許容度で、各々の種のゲノム（推定ｔｒａｃｒＲＮＡが同定されたもの）に戻して整列させた。

読取り範囲は、ＢｅｄＴｏｏｌｓ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）を使用して算出した。

Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ、ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／）を使用して、読取りの開始（５’）および終了（３’）位置をマッピングした。推定ｔｒａｃｒＲＮＡに関して検索される読取り全体は、アラインメントのＳＡＭファイルから算出した。

ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して、推定ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ要素がｉｎ ｖｉｖｏで能動的に転写されることを検証した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの、およびＲＮＡ−ｓｅｑスクリーンの複合材料からの確認したヒットは、本明細書中に概要する方法（実施例１、２および３を参照）を使用して、同定したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の、二本鎖ＤＮＡ標的のＣａｓ９媒介性切断を支持する機能的な能力に関して検証した。

本明細書および本明細書中の実施例のガイダンスを受けて、新規ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の同定は、当業者によって実行することができる。

ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの設計
この実施例は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡが、それぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡから設計される方法を示す。下記工程が全て、スクリーニングに必要とされるわけでなく、また工程の順序が提示するようでなくてはならないわけでもない。

所定の種に関するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡガイド配列の同定は、実施例１０に記載するように実行した。

同定したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＤＮＡに逆転写した。上方ステム、下方ステムおよびバルジ要素は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの配列から同定された。ＲＮＡ塩基を、ｃｒＤＮＡのＤＮＡ配列、ならびにそれぞれｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを創出するｔｒａｃｒＤＮＡ配列に導入した。ｃｒＤＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ内のＲＮＡ塩基の配置、数および分布は、計算的または実験的スクリーニング方法のいずれかを使用して選択することができる。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの一群は、分子内の多数の異なる位置に置かれるリボヌクレオチドを用いて設計された。好ましくは、下方ステム内のデオキシリボヌクレオチドは、幾つかのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列におけるリボヌクレオチドと置換された。リボヌクレオチドは、幾つかのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列のスペーサー配列の３’末端で置換された。さらなるｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列は、例えば、下記の通りに設計された。

パブリックドメインで、三次元タンパク質構造の保存場所（例えば、ＲＣＳＢ ＰＤＢ；ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）を検索して、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ構造を同定した。保存場所を、それらの同族ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに結合されたＣａｓエンドヌクレアーゼの高解像度座標ファイルに関して検索した。所定のＣａｓエンドヌクレアーゼに対する配列または三次構造類似性によって規定される構造隣接物は、所定のＣａｓエンドヌクレアーゼに関して解析された構造が存在しない場合に使用された。蓄積された座標ファイルは、ダウンロードされた。ＰｙＭＯＬ（ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．７．４ Ｓｃｈｒｏｇｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）などの可視化ソフトウェアを使用して、座標を分析して、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドとの間のリボース特異的相互作用を同定した。タンパク質が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドと直接的または間接的に（即ち、水または金属中間体による）接触する位置を使用して、デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドまたは他のヌクレオチド変異体で置き換えるためのガイド配列内の望ましい位置を同定した。

ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、関連種由来のＣａｓ９タンパク質と比較した場合に保存された。類似した種由来の他の公知のガイド配列を有するガイド配列のアラインメントは、リボヌクレオチドに関する優先度を付与する保存塩基に関するさらなる情報を提供した。ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの多重配列アラインメントは、ウェブベースのソフトウェアＭＵＳＣＬＥ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍａｓ／ｍｕｓｃｌｅ／）を使用して実行された。次に、アラインメントは、主鎖に沿って保存ヌクレオチド配列位置に関して評価された。

核酸二次構造予測ソフトウェア（例えば、ＲＮＡｆｏｌｄ；ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用して、ガイド主鎖のフォールディングを分析した。ＲＮＡ特異的ねじれ角が望ましい領域を使用して、ｃｒＤＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＤＮＡの両方におけるリボヌクレオチド位置の配置の情報を与えた。

二次構造、タンパク質−核酸相互作用、および配列保存の組合せを使用して、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列内のリボヌクレオチドの位置決めの情報を与えた。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの多重設計は、異なる立体配置が異なる所望の特性（即ち、活性、特異性、安定性など）を支持し得るという理解の下で試験された。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡは、リンカーによって単一分子に接続されて、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを形成することができる。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの結合は、上方ステムを一緒に形成するｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの３’末端およびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの５’末端にあるヌクレオチドの総数の低減を伴う可能性がある。配列番号１３８〜１４２、１４７〜１５０、１５４〜１５７および１６１〜１６４は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡに関する設計を示す。配列番号１４３〜１４６、１５１〜１５３、１５８〜１６０および１６５〜１６７は、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡに関する設計を示す。表１３は、配列の独自性を付与する。

配列を、合成のための商業的な製造業者（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル、ＩＡ）に供給した。

ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを実験的に試験して、本明細書中に記載する方法（実施例１、２および３を参照）を使用して、種々の配列の、二本鎖ＤＮＡ標的のＣａｓ９媒介性切断を支持する活性を決定した。

本明細書および本明細書中の実施例のガイダンスを受けて、新規ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ、ｔｒａｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列の設計ならびに検証は、当業者によって実行することができる。

タイプＶ Ｃｐｆ１ ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ要素の設計ならびにＤＮＡを修飾するためのＣｐｆ１での使用
以下の表１４および１５は、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための例示的な二重ガイドｃｒＤ（Ｒ）ＮＡｓおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡｓを提供する。例示的な図および配列番号への言及は、いかなる場合であっても限定的であるとは意図されず、表１４、表１５ならびに関連する配列番号および例示的な図における開示に基づいて、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するための二重ガイドｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを、標的核酸内の任意の所望の配列を標的とするように設計することができることは、当業者によって理解されよう。

Ａ．タイプＶ Ｃｐｆ１ ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ要素の設計
Ｃｐｆ１オルソログは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴおよびＨＭＭｅｒなどの配列分析プログラムを使用して同定された。Ｃｐｆ１オルソログがいったん同定されると、近くの配列が検索されて、関連ＣＲＩＳＰＲアレイを同定する。ｃｒＲＮＡ配列は、Ｚｅｔｓｃｈｅら（Ｃｅｌｌ；１６３（３）：７５９〜７１頁（２０１５年））に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲアレイ内に位置する繰り返し配列として同定された。タイプＶ ｃｒＲＮＡ配列は、ターゲティング領域配列に対して５’に位置する繰り返し配列内のステムループを含有した。ステムループは、５’要素および３’要素を含んでいた。ｃｒＲＮＡの５’要素、３’要素の両方ならびにループの配列が同定された。これらのｃｒＲＮＡ要素の配列は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＤＮＡに逆転写された。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含有する５’要素が設計された。５’要素の例を、図１２、図１３および表１４に示す。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含有する３’要素が設計された。３’要素の例を、図１２、図１３および表１４に示す。ターゲティング領域配列は、所定のＤＮＡ中のＰＡＭ配列に隣接するように選択されて、３’ｃｒＲＮＡ要素の３’末端に付加された。ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ、またはＲＮＡヌクレオチドを含有するターゲティング領域配列が設計された。ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ ３’要素およびｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ ５’要素を一緒に組み合わせて（表１４、図１２、図１３）、二重ガイドタイプＶ ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡを形成することによって、Ｃｐｆ１は、所定の標的核酸中の標的核酸配列を切断するよう誘導された。実験用のｃｒＤ（Ｒ）ＮＡの一群は、ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列内の多数の異なる位置に置かれるリボヌクレオチドを用いて設計された。好ましくは、３’ステムおよび５’ステム内のデオキシリボヌクレオチドは、幾つかのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列におけるリボヌクレオチドと置換された。リボヌクレオチドは、幾つかのｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ配列中のターゲティング領域配列の５’末端で置換された。

ターゲティング領域、ループ配列より接続される３’要素、および５’要素の組合せを使用して、種々のバージョンのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡが設計された。ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ内のＲＮＡ塩基の配置、数および分布は、計算的または実験的スクリーニング方法のいずれかを使用して選択することができる。ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの一群は、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ内の多数の異なる位置に置かれるリボヌクレオチドを用いて設計された。好ましくは、３’ステムおよび５’ステム内のデオキシリボヌクレオチドは、幾つかのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列におけるリボヌクレオチドと置換された。リボヌクレオチドは、幾つかのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列中のターゲティング領域配列の５’末端で置換された。設計したｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの例を、表１５に列挙して、図１０Ａ〜Ｃおよび図１１Ａ〜Ｅに示す。

下記において、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列を使用するが、３’および５’ｃｒＤ（Ｒ）ＮＡ要素（その例は、表１４に示す）の対を、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡの代わりに使用することができることが理解されよう。

Ｂ．Ｃｐｆ１およびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを有する核酸配列の消化
Ｃｐｆ１ ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡをＣｐｆ１と一緒に使用して、核酸配列を標的として、切断することができる。標的核酸は、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または増幅ＤＮＡのいずれかであった。増幅標的ＤＮＡは、実施例２に記載するように製造することができる。標的ＤＮＡ中に所定の配列を標的とするスペーサー配列を含有するｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列が合成された。切断アッセイは、Ｚｅｔｓｃｈｅら（２０１５年）に記載されるように実行して、実施例３に記載する方法を使用して分析した。要約すると、標的核酸を、Ｃｐｆ１活性を支持するように選択される適切な緩衝液中でＣｐｆ１およびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ配列（単数または複数）とともにインキュベートした。核酸を分析して、実施例３に記載するように消化が起きたかどうか決定した。２つまたはそれ以上のＣｐｆ１／ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ複合体を使用して、標的ＤＮＡ由来のＤＮＡの切片を切断することができる。ＤＮＡの切片は、オーバーハング末端を有し、それが親ＤＮＡから分離された後に、相補的な配列アダプターまたはベクターにライゲーションすることができる。

Ｃ．Ｃｐｆ１ ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡリボ核タンパク質複合体を用いたゲノム編集
大腸菌（E. coli）発現ベクターは、Ｃｐｆ１をコードするコドン最適化オープンリーディングフレームを合成すること、およびオープンリーディングフレームを発現プラスミド（例えば、ｐＥＴ２７ｂ）へクローニングすることによって構築された。コード配列は、タンパク質の精製用のアフィニティータグ、および真核細胞において核局在化を駆動させるためのＣ末端にあるＮＬＳ配列を含むことができる。Ｃｐｆ１タンパク質を、大腸菌（E. coli）において発現ベクターから発現させることができ、アフィニティー、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーの組合せを使用して精製することができる。精製タンパク質を、１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮して、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡと組み合わせて、リボ核タンパク複合体を作製した。２００ｐｍｏｌのＣｐｆ１を、別々の反応チューブ中で、５０ｐｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌ、４００ｐｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、８００ｐｍｏｌ、１０００ｐｍｏｌのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡおよび反応緩衝液と組み合わせた。Ｃｐｆ１−ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ複合体は、実施例７に記載する方法に従って、反復でＨＥＫ２９３細胞に電気穿孔した。細胞を３７℃で成長させて、ゲノムＤＮＡを、４、８、１６、２４、４８、および７２時間後に各反応から収集した。ゲノムＤＮＡをＰＣＲおよびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを使用して分析して、実施例７に記載する方法に従って、ゲノムが編集されたことを決定した。

Ｄ．真核細胞におけるＣｐｆ１発現ベクターおよびｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを使用したゲノム編集
哺乳動物発現ベクターは、Ｃｐｆ１をコードするコドン最適化オープンリーディングフレームを合成すること、およびオープンリーディングフレームを適切な哺乳動物発現プラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）へクローニングすることによって構築することができる。コード配列は、タンパク質の精製または検出用のアフィニティータグ、および真核細胞において核局在化を駆動させるためのＣ末端にあるＮＬＳ配列を含むことができる。コード配列は、プラスミド中のＣＭＶプロモーターに操作可能に連結させることができる。Ｃｐｆ１発現プラスミドを、別々の反応チューブ中で、５０ｐｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌ、４００ｐｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、８００ｐｍｏｌ、１０００ｐｍｏｌのｓｇＤ（Ｒ）ＮＡおよび反応緩衝液と組み合わせた。反応混合物は、実施例７に記載する方法に従って、反復でＨＥＫ２９３細胞に電気穿孔した。細胞を３７℃で成長させて、ゲノムＤＮＡを、４、８、１６、２４、４８、および７２時間後に各反応から収集した。ゲノムＤＮＡをＰＣＲおよびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを使用して分析して、実施例７に記載する方法に従って、ゲノムが編集されたことを決定した。

トウモロコシ胚のｉｎ ｐｌａｎｔａでの修飾
この実施例は、単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡを使用して、トウモロコシ胚を修飾することができる方法を示す。本明細書に提示する方法は、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ；１６９（２）：９３１〜９４５頁（２０１５年））から脚色される。下記工程が全て、スクリーニングに必要とされるわけでなく、また工程の順序が提示するようでなくてはならないわけでもない。

この実施例は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを導いて、トウモロコシ胚中の染色体ＤＮＡを切断するための単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡの使用を示す。ｌｉｇｕｌｅｌｅｓｓ １遺伝子および稔性遺伝子Ｍｓ４５（表１６）付近の領域を標的とする６つの単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡ（ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ）を設計して、予め組み込まれた構成的に発現するＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９遺伝子を含有するトウモロコシ系統に送達させた。トウモロコシｌｉｇｕｌｅｌｅｓｓ １およびＭｓ４５ゲノム遺伝子座は、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ／Ｃａｓ９媒介性切断により誘導される突然変異の存在に関して、ディープシーケンシングによって検査した。

予め組み込まれた構成的に発現するＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９トウモロコシ系統は、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖら（２０１５年）に記載されるように生成させた。

ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ設計を、合成のための商業的な製造業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ハンツビル、ＡＬ）に供給した。

ｓｇＲＮＡ（配列番号２０７および２２７）は、実施例１に記載するように構築した。

構成的に発現するＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９系統に由来する未熟トウモロコシ胚（ＩＭＥ）の、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡによるバイオリスティック媒介性形質転換は、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖら（２０１５年）に記載されるように実行した。簡潔に述べると、Ａｎａｎｉｅｖら（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ；１１８（２）：１５７〜７７頁（２００９年））に記載されるように、各ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ １００ｎｇを、細胞分裂刺激遺伝子であるＺｍＯＤＰ２（米国特許公開番号第２００５０２５７２８９号）およびＺｍＷＵＳ２（米国特許第７，２５６，３２２号）の存在下で、６０〜９０個のＩＭＥに送達した。粒子銃形質転換は、非常に可変的であり得るため、視覚的な選択可能なマーカーＤＮＡ表現カセットであるＭｏＰＡＴ−ＤｓＲＥＤもまた、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖら（２０１５年）に記載されるように、細胞分裂促進遺伝子とともに同時送達させた。切断に関して同じ領域を標的とするＴ７転写された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）１００ｎｇで形質転換させた胚（配列番号２０７および２２７）は、陽性対照として機能を果たし、ＺｍＯＤＰ２、ＺｍＷＵＳ２およびＭｏ−ＰＡＴ−ＤｓＲＥＤ発現カセットのみで形質変換させた胚は、陰性対照として機能を果たした。３日後、各処理由来の２０〜３０個のほとんど一様に形質転換された胚を、ＤｓＲＥＤ蛍光に基づいて選択して、プールして、総ゲノムＤＮＡを抽出した。意図した標的部位を取り囲む領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲマスターミックス（Ｍ０５３１Ｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）を道いてＰＣＲ増幅させて、アンプリコン特異的バーコードに必要な配列を付け加えて、Ｉｌｌｕｍｎｉａシーケンシングは、２ラウンドのＰＣＲによって「テイルド」プライマーを使用した。一次ＰＣＲ反応で使用するプライマーを表１７に示し、二次ＰＣＲ反応で使用するプライマーは、配列番号２１４および２１５であった。

得られたＰＣＲ増幅を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製スピンカラムで精製して、等モル比で組み合わせてＨｏｅｃｈｓｔ色素ベースの蛍光定量的なアッセイで濃度を測定して、単一読取り１００ヌクレオチド長ディープシーケンシングを、配列の偏りを相殺するためにＰｈｉＸ制御ｖ３の２５％（ｖ／ｖ）のスパイクを有するＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＦＣ−１１０−３００１）で実行した。切断の予測部位上に中心があり、陰性対照において類似したレベルで見出されない１０ヌクレオチドウィンドウ内に生じる１個以上のヌクレオチドインデルを有する読取りのみを、突然変異体と分類した。同じ突然変異を有する突然変異体の読取りを計数して、単一読取りへとし、切断の予測部位内に生じる突然変異を有するとして視覚的に確認した。次に、視覚的に確認した突然変異の総数を使用して、バーコードおよびフォワードプライマーへの完全な適合を含有する適当な長さの読取りの総数に基づいて、突然変異体パーセント読取り算出した。

表１８に示すように、ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡを使用して、トウモロコシ細胞染色体ＤＮＡを切断するようにＣａｓエンドヌクレアーゼを誘導し得ることを示す全ての処理において、突然変異が回収された。さらに、ある特定のｓｇＤ（Ｒ）ＮＡ設計（配列番号２０５および２２６）は、Ｔ７転写されたｓｇＲＮＡ（配列番号２０７および２２７）の突然変異頻度付近で突然変異頻度を示した。ｓｇＤ（Ｒ）ＮＡによって回収される突然変異の例を、図１４Ａ（配列番号２１７〜２２３に相当する、ここで、配列２１６は、ｌｉｇｕｌｅｌｅｓｓ１標的遺伝子座を含む参照トウモロコシ配列である）および図１４Ｂ（配列番号２３５〜２５４に相当する、ここで、配列番号２３４は、Ｍｓ４５標的遺伝子座を含む参照トウモロコシ配列である）に示す。

上述の開示は、本発明の特定の実施形態の説明および実施例を提供するが、それは、いかなる場合であっても限定的であるとは意図されず、本発明の範囲内で所望の結果を達成するように特定の方法、組成物または工程を適応させるために、開示する実施例を変更させることは、当業者の知識の範囲内である。かかる変更は全て、本発明の範囲内であると意図される。

Claims (52)

1. 単一ポリヌクレオチドであって、
   デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むターゲティング領域と；
   リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；
   を含み、
   ここで、前記単一ポリヌクレオチドは、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのものである、前記単一ポリヌクレオチド。
2. 活性化領域はＤＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記活性化領域は、前記ターゲティング領域の下流にある、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記活性化領域は、前記ターゲティング領域の上流にある、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記活性化領域は、ステムループ構造を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 前記活性化領域は、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記活性化領域は、Ｃｐｆ１タンパク質と相互作用する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
11. クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系であって、
    デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域を含む単一ポリヌクレオチドと；
    リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域と；
    部位特異的ポリペプチドと
    を含む、前記クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
12. 前記活性化領域は、前記ターゲティング領域の下流にあり、前記部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９を含む、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
13. 前記活性化領域は、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、およびヘアピンからなる群から選択される構造を含む、請求項１２に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
14. 前記活性化領域は、前記ターゲティング領域の上流にあり、前記部位特異的ポリペプチドは、Ｃｐｆ１を含む、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
15. 前記活性化領域は、ステムループ構造を含む、請求項１４に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
16. 前記部位特異的ポリペプチドは、前記活性化領域と相互作用する、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
17. 前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
18. 前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
19. 前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
20. ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
21. クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系であって、
    （ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと；
    前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドと；
    部位特異的ポリペプチドと
    を含む、前記クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
22. 前記活性化領域および前記第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする、請求項２１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
23. 前記部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１からなる群から選択される、請求項２１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
24. 前記部位特異的ポリペプチドは、前記活性化領域と相互作用する、請求項２１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
25. 前記活性化領域は、ＤＮＡをさらに含む、請求項２１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
26. 前記第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む、請求項２１に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
27. 前記第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡをさらに含む、請求項２６に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系。
28. ２つのポリヌクレオチドであって、
    （ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、核酸における標的配列とハイブリダイズするように構成されるターゲティング領域および（ｉｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む前記ターゲティング領域に隣接した活性化領域を含む第１のポリヌクレオチドと；
    前記第１のポリヌクレオチドの前記活性化領域における配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチドと
    を含み、ここで、前記２つのポリヌクレオチドは、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのものである、前記２つのポリヌクレオチド。
29. 前記活性化領域および前記第２のポリヌクレオチドは、下方ステム、バルジ、上方ステム、ネクサス、および二本鎖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の構造を形成するようにハイブリダイズする、請求項２８に記載の２つのポリヌクレオチド。
30. 前記ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、前記活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み、前記第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項２８に記載の２つのポリヌクレオチド。
31. 標的核酸分子を修飾する方法であって、標的配列を有する前記標的核酸分子を、請求項１１〜１９または請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系と接触させることを含み、ここで、前記標的核酸分子が切断されるか、または前記標的核酸分子によりコードされる少なくとも１つの遺伝子の転写が調節される、前記方法。
32. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
33. 前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
34. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３１に記載の方法。
35. ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
36. クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用してオフターゲットの修飾を低減させる方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、請求項１１〜１９または請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系と接触させることを含み、ここで、前記標的核酸分子が、該標的核酸における他の配列よりも優先的に該標的配列で切断されるかまたは編集されて、それによりオフターゲットの修飾を低減させる、前記方法。
37. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
39. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項３６に記載の方法。
40. クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのポリヌクレオチドのターゲティング領域は、ウラシルを含まない、請求項３６に記載の方法。
41. ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
42. クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して標的特異的な修飾を増加させる方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、請求項１１〜１９または請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系と接触させることを含み、ここで、前記標的核酸分子が、該標的核酸における他の配列よりも優先的に該標的配列で切断されるかまたは編集されて、それにより標的特異的な修飾を増加させる、前記方法。
43. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項４２に記載の方法。
45. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項４２に記載の方法。
46. ドナーポリヌクレオチドを供給することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
47. クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、ドナーポリヌクレオチドを細胞または生物のゲノムへ導入する方法であって、標的配列を有する標的核酸分子を、請求項１１〜１９または請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系と接触させることを含み、ここで、前記標的核酸分子が、該標的配列で、またはその付近で切断されて、また該切断部位で該細胞または生物の該ゲノムへ導入されるドナーポリヌクレオチドを供給することを含む前記方法。
48. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡを含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記標的核酸分子は、ＲＮＡを含む、請求項４７に記載の方法。
50. 前記標的核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む、請求項４７に記載の方法。
51. ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによって核酸へ導入される、請求項４７に記載の方法。
52. ドナーポリヌクレオチドは、非相同末端結合によって核酸へ導入される、請求項４７に記載の方法。

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