JP2019535287A - Ｃｒｉｓｐｒ／ｃｐｆ１システム及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムに使用するための組換えＡｓＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１核酸及びポリペプチド並びに組換えＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１ポリペプチドをコードする哺乳動物細胞株に関する。本発明は、組換えリボ核タンパク質複合体を含み、適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有するＣＲＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムは、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学的に修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。これらのシステム及び試薬を使用して遺伝子編集を実施する方法もまた、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９条の下、２０１６年１１月２２日に出願され、「ＣＰＦ１ ＣＲＩＳＰＲ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ」と題する米国仮特許出願第６２／４２５，３０７号、及び２０１７年４月７日に出願され、「ＨＥＫ２９３ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥ ＷＩＴＨ ＳＴＡＢＬＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＡＣＩＤＡＭＩＮＯＣＯＣＣＵＳ ＳＰ．ＢＶ３Ｌ６ ＣＰＦ１」と題する米国仮特許出願第６２／４８２，８９６号の優先権の利益を主張し、これらの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。＿＿＿に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＩＤＴ０１−０１０−ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、＿＿＿バイトサイズである。

発明の分野
本発明は、Ｃｐｆ１ベースのＣＲＩＳＰＲ遺伝子、これによってコードされるポリペプチド、Ｃｐｆ１を安定に発現する哺乳動物細胞株、ｃｒＲＮＡ並びにＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１システム及び方法の組成物におけるこれらの物質の使用に関する。

部位特異的ＤＮＡ切断のための、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）及び関連Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）の使用は、多くの生物学的用途に対する優れた可能性を示してきた。ＣＲＩＳＰＲは、ゲノム編集、内在性遺伝子に対する転写抑制因子（ＣＲＩＳＰＲｉ）及び活性化因子（ＣＲＩＳＰＲａ）のゲノムスケール特異的ターゲティング並びにＣａｓ酵素によるＲＮＡ指向型ＤＮＡターゲティングの他の用途に使用されている。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌及び古細菌にもとより備わっているものであり、ウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を提供する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの３つのクラスが、研究及び治療試薬に潜在的に適応され得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ（具体的に、Ｃａｓ９）を、適切なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との複合体中で利用する際に、望ましい特徴を有する。細菌又は古細菌において、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ種を含む。標的特異的ＣＲＩＳＰＲ活性化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特異的ＤＮＡ配列に結合し、これを標的とするようにＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を指向する。ｃｒＲＮＡは、２つの機能ドメインである、標的特異的である５’−ドメイン及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とのｃｒＲＮＡの結合を指向する３’−ドメインを有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに結合し、ｇＲＮＡ複合体のＣａｓ９との結合を媒介する、より長いユニバーサルＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡの結合は、Ｃａｓ９構造の変化を誘導し、不活性な立体配座から活性な立体配座にシフトする。ｇＲＮＡ機能はまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが単一種に融合されている、人工単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）としても提供され得る（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６〜２１頁、２０１２年を参照のこと）。ｓｇＲＮＡフォーマットは、転写プロモーター及びｓｇＲＮＡ配列を含有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）カセットによって提供され得る単一の転写単位からの機能的ｇＲＮＡの転写を可能にする。哺乳動物系において、これらのＲＮＡは、ＲＮＡ転写を駆動するＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６又はＨ１のような）、ウイルスベクター及びインビトロ転写後の一本鎖ＲＮＡを含有するＤＮＡカセットのトランスフェクションによって導入されてきた（Ｘｕ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０１４年．８０（５）：１５４４〜５２頁を参照のこと）。細菌系において、これらのＲＮＡは、原始免疫系の一部として発現される又は形質転換によって導入されているプラスミドから人工的に発現され得る（Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１６年、５３２（７６００）：５１７〜２１頁を参照のこと）。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、一例として、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ｐｙ．又はＳｐｙ）に存在するシステムを使用すると、天然ｃｒＲＮＡは、約４２塩基長であり、標的配列に相補的である約２０塩基長の５’領域（ｃｒＲＮＡのプロトスペーサー配列又はプロトスペーサードメインとも称されている）及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の領域に相補的であり、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡとの結合を媒介する、典型的に約２２塩基長の３’領域を、含有する。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、相補的標的ＤＮＡのＣａｓ９切断を指向することができる機能的ｇＲＮＡを含む。天然ｔｒａｃｒＲＮＡは、約８５〜９０塩基長であり、ｃｒＲＮＡに相補的な領域を含有する５’領域を有する。ｔｒａｃｒＲＮＡの残りの３’領域は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体のＣａｓ９との結合を媒介する二次構造モチーフ（本明細書において「ｔｒａｃｒＲＮＡ ３’テール」と称されている）を含む。

Ｊｉｎｅｋらは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの適切な機能化に必要とされるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの物理的ドメインを広範囲に調査した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年．３３７（６０９６）：８１６〜２１頁）。彼らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓにおいて依然として機能することができる切断されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ断片を考案し、ｃｒＲＮＡは、野生型の４２個のヌクレオチドであり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、７５個のヌクレオチドに切断されていた。彼らはまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、リンカーループと連結され、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する実施形態を開発し、これは、異なる実施形態では、９９〜１２３個のヌクレオチドの間で異なる。

少なくとも３つのグループが、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）の結晶構造を解明した。Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．らにおいて、この構造は、ガイドＲＮＡ又は標的ＤＮＡのいずれかとの複合体においてヌクレアーゼを示さなかった。彼らは、分子モデリング実験を実施して、ＲＮＡ及びＤＮＡとの複合体におけるタンパク質間の予測的相互作用を明らかにした（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年．３４３、１２１５頁、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ／１２４７９９７）。

Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．らにおいて、Ｓｐｙ Ｃａｓ９の結晶構造は、ｓｇＲＮＡ及びこの標的ＤＮＡとの複合体において２．５オングストローム解像度にて示されている（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｅｌｌ、２０１４年．１５６（５）：９３５〜４９頁）。この結晶構造は、Ｃａｓ９酵素に対する２つのローブ：認識ローブ（ＲＥＣ）及びヌクレアーゼローブ（ＮＵＣ）を同定した。ｓｇＲＮＡ：標的ＤＮＡヘテロ二重鎖（負の電荷を持つ）は、２つのローブ間の正の電荷を持つ溝にある。既知のタンパク質との構造的類似性を示さず、したがってＣａｓ９特異的機能ドメインのようなＲＥＣローブは、互いに相補的であるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分と相互作用する。

別のグループである、Ｂｒｉｎｅｒら（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、２０１４年．５６（２）：３３３〜９頁）は、天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖及びｓｇＲＮＡ内の６つの保存モジュールを同定し、特徴付けた。Ａｎｄｅｒｓら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、５１３（７５１９）、５６９〜７３頁）は、ｓｇＲＮＡガイドと関連するＣａｓ９によるプロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）配列のＤＮＡ配列認識についての構造的基盤を解明した。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、以下のようにゲノム工学において利用されている：ｇＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体又はｓｇＲＮＡのいずれか）はＣａｓ９と結合し、Ｃａｓ９を活性化し、ＤＮＡ結合の裂け目を開く立体配座変化を誘導し、ｃｒＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）のプロトスペーサードメインは相補的標的ＤＮＡと整列し、Ｃａｓ９はＰＡＭ配列に結合し、標的ＤＮＡの巻き戻しを開始し、続いて標的に対するプロトスペーサードメインのアニーリングが起こり、この後、標的ＤＮＡの切断が生じる。Ｃａｓ９は、エンドヌクレアーゼＨＮＨ及びＲｕｖＣのそれぞれに相同的な２つのドメインを含有し、ＨＮＨドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインは、非相補鎖を切断する。これは、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断をもたらす。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復された場合、切断は、典型的に不正確な様式において修復され、１つ以上の塩基だけシフトされているＤＮＡ配列をもたらし、天然ＤＮＡ配列の崩壊につながり、多くの場合、この事象がタンパク質をコードする遺伝子のコード化エキソン内で起こる場合、フレームシフト変異につながる。切断はまた、相同性指向的組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）によって修復され得、これにより、Ｃａｓ９切断によって作り出された切断部位に導入される、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を有する細胞に導入された外因性ＤＮＡに基づく新たな遺伝物質の挿入が可能となる。

ＳｐｙＣａｓ９は最も広範に使用されているタンパク質であるが、この有効性に対していくつかの障壁がある。ＳｐｙＣａｓ９は、ＧＧジヌクレオチド配列が直後に続くゲノム内の標的化配列を認識し、したがって、このシステムはゲノムのＧＣリッチ領域に限定される。したがって、ＡＴリッチな種又はゲノム領域は、ＳｐｙＣａｓ９システムにより標的化できないことが多い。さらに、Ｃａｓ９システムが、１００より多い塩基を含むｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分の両方を有するｇＲＮＡを含むという事実は、より多くのＲＮＡが配列特異的ターゲティングのために最適化され、合成されなければならないことを意味する。したがって、より短く、より単純なｇＲＮＡが望ましい。

Ｖ型に割り当てられた第２のクラス２ＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。このＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連システムは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９よりわずかに小さい、約１３００アミノ酸タンパク質である、Ｃｐｆ１を含有する。アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６又はラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１のＰＡＭ認識配列は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のＮＧＧ ＰＡＭ認識ドメインとは対照的にＴＴＴＮである（図１）。ゲノムのＡＴリッチ領域を標的とする能力を有することは、ＧＧジヌクレオチドモチーフを欠いている領域における遺伝子標的を操作し、研究するために非常に有益である。Ｃｐｆ１システムはまた、別個のｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、標的ＤＮＡ配列の特定及びＣｐｆ１ヌクレアーゼへのＲＮＡの結合の指向の両方を行う４０〜４５塩基長の単一の短いｃｒＲＮＡのみを必要とするという点で非常に単純である。

平滑末端切断産物を産生するＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１は、４〜５個のヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖切断を促進する。この利点は、適切な指向を確実にすることができ、さらに非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の間にマイクロホモロジーを提供することもできることである。これはまた、相同性指向修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）に耐性がある傾向がある非分裂細胞型においても有利であり得る。さらに、Ｃｐｆ１が切断する場合、Ｃａｓ９が切断する場合よりも、ＰＡＭからずっと遠く離れかつまた標的部位からも遠く離れた位置で、行う。結果として、プロトスペーサー、特にプロトスペーサーのシード配列は、編集される可能性が低く、それによって、所望の修復事象が最初に起こらない場合、切断の第２ラウンドの可能性を開いたままにする。

Ｃｐｆ１タンパク質は、標的化ＤＮＡ切断を媒介するために、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドと複合体を形成する。一本鎖ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２０ｎｔの定常領域及び２１〜２４ｎｔの標的領域からなり、全長は４１〜４４ｎｔである。活性及び標的選択に関して異なっておりかつゲノム編集適用における使用のための候補となり得る、種々の異なる細菌及び古細菌起源由来のＣｐｆ１の多くの既知のオルソログが存在する。本発明の目的のために、本発明者らは、代表的な例として、Ａ．ｓ．（アシダミノコッカス属種ＢＶ３Ｌ６）Ｃｐｆ１及びＬ．ｂ．（ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６）由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼを主に研究し、これらの両方はゲノム編集のための手段として哺乳動物細胞において活性であることが既に示されている。注目すべきは、ＰＡＭ認識配列がＴＴＴＮであることである。Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの構造及びゲノムＤＮＡにおけるＰＡＭ部位へのＲＮＡ結合の関係は、図１に示されている。

哺乳動物細胞におけるゲノム編集のための、潜在的有用性を有する別のＣＲＩＳＰＲ経路としての、Ｃｐｆ１の発見以来、いくつかの刊行物によって、このシステムが哺乳動物において機能し、胚工学に使用され得ることが確認されており、結晶構造及びＰＡＭ部位認識の機構が記載されている。このシステムはまた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような遺伝的に扱いやすい細菌種におけるスクリーニング目的のための有用性も示した。したがって、このシステムは有用であることが証明されており、Ｃｐｆ１を使用してゲノム編集を実施するための最適化した試薬を開発することが有益である。

ＳｐｙＣａｓ９ ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡについて行われた以前の研究によって、天然に存在するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ種の意味のある短縮が化学合成によって作製されたＲＮＡについて行われ得ること、並びにこのような短縮ＲＮＡが、１）より高い品質であり、２）製造するのにより少ない費用であり、３）野生型（ＷＴ）ＲＮＡと比較して哺乳動物ゲノム編集において改善された性能を示したことが実証された。２０１６年６月２３日に米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０１７７３０４Ａ１号として公開され、２０１７年１２月１２日に米国特許第９８４０７０２号として発行された、２０１５年１２月１８日に出願された米国特許出願第１４／９７５，７０９号である、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ，Ｍ．Ａ．、Ｊａｃｏｂｉ，Ａ．Ｍ．、Ｒｅｔｔｉｇ，Ｇ．Ｒ．、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．、及びＢｅｈｌｋｅ，Ｍ．Ａ．、「ＣＲＩＳＰＲ−ＢＡＳＥＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＵＳＥ」を参照のこと。

以前の研究は、３’末端からの欠失により２２塩基長から１８塩基長へＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの長さを低減させることが標的ＤＮＡの切断を支持するが、１７又はそれより短い長さが、低減した活性を示すことを実証した。ユニバーサルループドメインにおける塩基対合を破壊した欠失又は変異は活性を破壊した。Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．、Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．、Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ，Ｐ．、Ｖｏｌｚ，Ｓ．Ｅ．、Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ，Ｊ．、Ｒｅｇｅｖ，Ａ．、Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．、及びＺｈａｎｇ，Ｆ．（２０１５年）Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｅｌｌ １６３：１〜１３頁を参照のこと。しかしながら、ＦｎＣｐｆ１ヌクレアーゼは、哺乳動物細胞において、ゲノム編集を実施するように機能しない。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡについて観察されたものと同じ長さ規則がＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡに適用されるかどうかは不明である。本発明者らは、哺乳動物ゲノム編集適用において完全な活性を有するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの最短型を本明細書において確立する。本発明者らはまた、哺乳動物又は原核細胞において使用される場合、合成Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの機能を維持する又は改善する化学修飾パターンを確立する。

米国特許出願公開第２０１６／０１７７３０４号明細書 米国特許第９８４０７０２号明細書 米国特許出願第１４／９７５，７０９号明細書

Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７、８１６〜２１頁、２０１２年 Ｘｕ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０１４年．８０（５）：１５４４〜５２頁 Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１６年、５３２（７６００）：５１７〜２１頁 Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年．３３７（６０９６）：８１６〜２１頁 Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年．３４３、１２１５頁、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ／１２４７９９７ Ｃｅｌｌ、２０１４年．１５６（５）：９３５〜４９頁 Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、２０１４年．５６（２）：３３３〜９頁 Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、５１３（７５１９）、５６９〜７３頁 Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．、Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．、Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ，Ｐ．、Ｖｏｌｚ，Ｓ．Ｅ．、Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ，Ｊ．、Ｒｅｇｅｖ，Ａ．、Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．、及びＺｈａｎｇ，Ｆ．（２０１５年）Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｅｌｌ １６３：１〜１３頁

（発明の要旨）
本発明は、Ｃｐｆ１ベースのＣＲＩＳＰＲ遺伝子、これによってコードされるポリペプチド、Ｃｐｆ１を安定に発現する哺乳動物細胞株、及び化学的に合成されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、並びにＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１システム及び方法の組成物におけるこれらの使用に関する。例は、アシダミノコッカス属種ＢＶ３Ｌ６及びラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１システムを利用することを示すが、これは他の種から単離されたＣｐｆ１ホモログ又はオルソログに及ぶ範囲を制限することを意図しない。

第１の態様では、単離された核酸が提供される。単離された核酸は、核局在化シグナル及びエピトープタグの使用を含む、配列番号８、配列番号１５及び配列番号２２に見られる、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）における発現のためにコドン最適化されたＡｓ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードする。単離された核酸はまた、配列番号５を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化されたＡｓ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードし、核局在化シグナル、複数の核局在化シグナル又は抗体若しくは他の方法による検出を可能にするエピトープタグをコードする配列並びに／又は配列番号１２及び配列番号１９に見られるＨｉｓ−Ｔａｇのような核酸から発現される組換えタンパク質の簡単な精製を可能にする親和性タグと融合することができる又は連結することができる。

第２の態様では、野生型Ａｓ Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離されたポリペプチドが提供される。第１の点では、単離されたポリペプチドは配列番号２を含む。タンパク質は、核局在化シグナル、複数の核局在化シグナル又は抗体若しくは他の方法による検出を可能にするエピトープタグをコードする配列並びに／又は配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１９に見られるＨｉｓ−Ｔａｇのような核酸から発現される組換えタンパク質の簡単な精製を可能にする親和性タグと、融合することができる又は連結することができる。

第３の態様では、単離された核酸が提供される。単離された核酸は、核局在化シグナル及びエピトープタグの使用を含む、配列番号９及び配列番号１７に見られる、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されたＬｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードする。単離された核酸はまた、配列番号６を含むＥ．コリにおける発現のためにコドン最適化されたＬｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードし、核局在化シグナル、複数の核局在化シグナル又は抗体若しくは他の方法による検出を可能にするエピトープタグをコードする配列並びに／又は配列番号１３に見られるＨｉｓ−Ｔａｇのような核酸から発現される組換えタンパク質の簡単な精製を可能にする親和性タグと融合することができる又は連結することができる。

第４の態様では、野生型Ｌｂ Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離されたポリペプチドが提供される。第１の点では、単離されたポリペプチドは配列番号７及び配列番号１０を含む。タンパク質は、核局在化シグナル、複数の核局在化シグナル又は抗体若しくは他の方法による検出を可能にするエピトープタグをコードする配列並びに／又は配列番号１４に見られるＨｉｓ−Ｔａｇのような核酸から発現される組換えタンパク質の簡単な精製を可能にする親和性タグと、融合することができる又は連結することができる。

第５の態様では、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５及び配列番号１７をコードする単離された発現ベクターが提供される。単離された発現ベクターは、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするように配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７と作動可能に連結しているプロモーター及びエンハンサーのような転写開始エレメントを含む。

第６の態様では、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５及び配列番号１７をコードする単離された発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７をコードする単離された発現ベクターは、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６を含むポリペプチドの発現を可能にするように適切なプロモーター及び他の遺伝エレメント（必要に応じて）と作動可能に連結している。

第７の態様では、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムが提供される。このシステムはＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含む。

第８の態様では、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムが提供される。このシステムは、ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを発現するヒト細胞株を含む。

第９の態様では、単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが提供される。単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼシステムにおいて活性である。哺乳動物細胞における実施のために最適化された種及び細菌における実施のために最適化された種を含むｃｒＲＮＡの異なるバリアントが提供される。

第１０の態様では、遺伝子編集を実施する方法が提供される。この方法は、候補編集標的部位遺伝子座を、野生型ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む。

Ｃｐｆ１ ＰＡＭ認識部位及び標的ＤＮＡに対するガイドｃｒＲＮＡのアラインメントの図的表示である。ヒトＨＰＲＴ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、部位「３８５９５」に示されている。Ａｓ Ｃｐｆ１部位を特定している「ＴＴＴＮ」ＰＡＭ部位は強調され、ガイド結合部位の配列には下線が引かれている。ＤＮＡは大文字で示され、ＲＮＡは小文字で示される。Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡにおいて、プロトスペーサー標的特異的ドメインには下線が引かれ、３’−ドメインを含む。Ｃｐｆ１タンパク質との結合を媒介するユニバーサルヘアピンＲＮＡ配列は５’−ドメインを含む。 組換え、合成、コドン最適化ＡｓＣｐｆ１を発現するように設計されたプラスミドベクターのマップを示す図である。 ＡｓＣｐｆ１安定細胞株を生成するために使用される最終プラスミド構築物を示す概略図を示す。 Ｖ５タグ化タンパク質の発現を示す例示的なウェスタンブロットを示す図である。Ｖ５タグを有するＣａｓ９を安定に発現するモノクローナルＨＥＫ細胞株からの細胞抽出物をレーン２に流した。Ｖ５タグ化ＡｓＣｐｆ１を発現する新たなポリクローナルＨＥＫ細胞培養物からの細胞抽出物をレーン３に流した。ベータ−アクチンを示し、質量負荷対照を表す。レーン１には、質量標準マーカーを流した。 １０個のクローントランスジェニック細胞株における内部対照ＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡに対して正規化されたＡｓＣｐｆ１ ｍＲＮＡの例示的な発現プロファイルを示す図である。ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの位置は、ＡｓＣｐｆ１ ｍＲＮＡに従って位置が変わる。陰性対照の非トランスジェニックＨＥＫ１細胞を右端に示す。 Ｖ５エピトープの検出に基づく１０個のモノクローナルトランスジェニック細胞株におけるＡｓＣｐｆ１タンパク質の相対的発現レベルを示す例示的なウェスタンブロットを示す図である。ベータ−アクチン負荷対照はＡｓＣｐｆ１バンドの下に見られる。 ２つの配列標的部位である、ＨＰＲＴ１−３８３５１（パネル（ｉ））及びＨＰＲＴ１−３８５９５（パネル（ｉｉ））におけるＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの修飾寛容マップを示す図であり、ユニバーサル５’−ループドメインの配列が、２４−ｎｔプロトスペーサードメイン（パネル（ｉ．ａ）及び（ｉｉ．ａ））及び２１−ｎｔプロトスペーサードメイン（パネル（ｉ．ｂ）及び（ｉｉ．ｂ））の両方について（５’−３’方向で）示される。可変３’標的特異的プロトスペーサードメインの配列は、この配列が標的ごとに変化するので、「Ｎ」塩基として示される。単一塩基ウォーク（ｗａｌｋ）における２’ＯＭｅ ＲＮＡ残基として修飾された場合に活性の喪失を受けなかった位置は大文字で示され、一方、修飾により活性の喪失を示した位置は小文字で示される。小文字の残基の上には、活性の喪失の相対的な大きさを示す矢印が示され、それぞれのＲＮＡ残基が２’ＯＭｅ ＲＮＡに変化した場合、大きな矢印は活性の大きな喪失を表し、中サイズの矢印は活性の中程度の喪失を表し、小さな矢印は活性のわずかな喪失を表す。 複数の標的部位にて哺乳動物細胞におけるゲノム編集適用において活性であり、したがって部位特異的ではない、例示的な改変されたバリアントＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを示す図である。ユニバーサル５’−ループドメインの配列を（５’−３’方向で）示し、下線を引いて示す。可変３’標的特異的プロトスペーサードメインの配列は、この配列が標的ごとに変化するので、「Ｎ」塩基として示される。２’ＯＭｅ ＲＮＡ修飾は大文字で示され、ＲＮＡ残基は小文字で示される。「Ｘ」は、Ｃ３スペーサー（プロパンジオール）又はＺＥＮ（ナフチル−アゾ）基のような、末端非塩基修飾因子を示す。「^＊」は、ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を示す。 Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイによって、低いＧＣ含量を有するＨＰＲＴ遺伝子の１２の領域について、ＬｂＣｐｆ１の標的編集活性を、ＡｓＣｐｆ１及びＳｐｙＣａｓ９の標的編集活性と比較した例示的な結果を示す図である。この研究において、全ての酵素及びｃｒＲＮＡは、Ｌｏｎｚａ製のＡｍａｘａシステムを使用したヌクレオフェクションによって、ＲＮＰ複合体（５μＭ）として、ＨＥＫ２９３細胞に送達され、ＤＮＡは４８時間後に抽出された。編集パーセントは、Ｔ７Ｅ１ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイによって決定された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。注目すべきことに、ＬｂＣｐｆ１についてのｃｒＲＮＡは、天然の２３ｍｅｒヌクレオチド長及び以前に最適化されたＡｓＣｐｆ１の２１塩基長にて試験された。

本明細書に記載されている本発明の方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムにおける使用のための野生型ＡｓＣｐｆ１核酸及びポリペプチドを提供する。本発明は、ＨＥＫ２９３におけるＡｓＣｐｆ１の安定した低レベルの発現を有し、システムの核酸成分の調査及び最適化のためのプラットフォームとして使用され得るＨＥＫ２９３細胞株を記載する。ＡｓＣｐｆ１は、ＧＣリッチ領域（Ｃａｓ９）からゲノムのＡＴリッチ領域（Ｃｐｆ１）まで標的化され得るＰＡＭ配列の範囲を拡大し、それによってＣＲＩＳＰＲゲノム工学法を使用して修飾され得る配列の範囲を拡大することによって、ＳｐｙＣａｓ９に対する有用な補体を提供する。ＴリッチＰＡＭ部位を有することに加えて、Ｃａｓ９と比較したＡｓＣｐｆ１システムの別の利点は、単一の短いＲＮＡ分子の使用である。しかしながら、ヒトゲノムのほとんどの部位において活性を示すＣａｓ９とは異なり、ＡｓＣｐｆ１はＴＴＴＮ ＰＡＭ部位の半分において活性をほとんど示さないか、全く示さない。したがって、ＡｓＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲシステムの可能性を十分に引き出すことは、配列状況に基づいて高活性部位を豊富にする適切な予測ソフトウェアの利用可能性によって高められる。安定な構成的Ｃｐｆ１発現細胞株の使用は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のエレクトロポレーションのような代替の方法を使用することと比較して、アルゴリズムの開発を労力及びコストを低減させて行うことを容易にする。ＨＥＫ２９３細胞は、容易に培養され、継代され、低温で保存される不死化細胞株である。本発明者らは、アルゴリズム開発又はガイドＲＮＡの化学構造の迅速な試験／最適化のための適切な試験ビヒクルとして、ＳｐｙＣａｓ９及びＡｓＣｐｆ１を構成的に発現するクローン細胞株を確立した。本発明は、ゲノム編集における機能を改善するＡｓＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの長さが最適化されたバリアントの長さ及び化学修飾を記載する。

ＡｓＣｐｆ１がコードされた遺伝子、ポリペプチド、発現ベクター及び宿主細胞
「野生型ＡｓＣｐｆ１タンパク質」（「ＷＴ−ＡｓＣｐｆ１」又は「ＷＴ−ＡｓＣｐｆ１タンパク質」）という用語は、天然に存在するアシダミノコッカス属種ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（例えば、配列番号２）の同一のアミノ酸配列を有し、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムを形成するために適切なｃｒＲＮＡと組み合わせた場合に生化学的及び生物学的活性を有するタンパク質を包含する。

「野生型ＬｂＣｐｆ１タンパク質」（「ＷＴ−ＬｂＣｐｆ１」又は「ＷＴ−ＬｂＣｐｆ１タンパク質」）という用語は、天然に存在するラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（例えば、配列番号４）の同一のアミノ酸配列を有し、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムを形成するために適切なｃｒＲＮＡと組み合わせた場合に生化学的及び生物学的活性を有するタンパク質を包含する。

「野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム」という用語は、野生型ＡｓＣｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡとして適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムを指す。

「ポリペプチド」という用語は、１つより多いアミノ酸を含む任意の直鎖又は分枝ペプチドを指す。ポリペプチドはタンパク質、断片又は融合物が有用な生化学的又は生物学的活性を保持するならば、このようなタンパク質又はその断片又はその融合物を含む。

融合タンパク質は、典型的に、タンパク質に対して天然ではない追加のアミノ酸情報を含み、この追加のアミノ酸情報はそのタンパク質に共有結合している。このような追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質の精製又は同定を可能にするタグを含み得る。このような追加のアミノ酸情報は、融合タンパク質が細胞内に輸送されること及び／又は細胞内の特定の位置に輸送されることを可能にするペプチドを含み得る。これらの目的のためのタグの例には以下が含まれる：タンパク質がストレプトアビジンによって単離され得るように酵素ＢｉｒＡによるビオチン化を可能にするペプチドであるＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）；タンパク質カルモジュリンが結合しているペプチドであるカルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；Ｍｏｎｏ−Ｑのようなアニオン交換樹脂と効果的に結合しているペプチドであるポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；抗体によって認識されているペプチドであるＥタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；抗体によって認識されているペプチドであるＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）；抗体によって認識されているヘマグルチニン由来のペプチドであるＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；典型的に５〜１０個のヒスチジンであり、ニッケル又はコバルトキレートと直接結合することができるＨｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）；抗体によって認識されているｃ−ｍｙｃに由来するペプチドであるＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降及び組換えタンパク質の親和性精製を含む広範囲の用途に有用である、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識されている新規の１８個のアミノ酸合成ペプチドであるＮＥタグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；リボヌクレアーゼＡに由来するペプチドであるＳタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ストレプトアビジンと結合しているペプチドであるＳＢＰタグ；（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；哺乳動物発現を意図するＳｏｆｔａｇ１（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；原核生物発現を意図するＳｏｆｔａｇ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；ストレプトアビジン又はストレプトアクチン（ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）と呼ばれる修飾ストレプトアビジンと結合しているペプチドであるＳｔｒｅｐタグ（ＳｔｒｅｐタグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；抗体によって認識されているペプチドである、ＦｌＡｓＨ及びＲｅＡｓＨ二ヒ素（ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ）化合物（ＣＣＰＧＣＣ）Ｖ５タグによって認識されているテトラシステインタグであるＴＣタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；抗体によって認識されているペプチドであるＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）；ピリン−Ｃタンパク質と共有結合しているペプチドであるＩｓｏｐｅｐｔａｇ（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ）；ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と共有結合しているペプチドであるＳｐｙＴａｇ（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ）；ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質と共有結合しているペプチドであるＳｎｏｏｐＴａｇ（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ）；ストレプトアビジンによる認識を可能にするためにＢｉｒＡによってビオチン化されているタンパク質ドメインであるＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）；固定化グルタチオンと結合しているタンパク質であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ；自然蛍光性であり、抗体が結合することができるタンパク質である緑色蛍光タンパク質タグ；多種多様な基質との付着を可能にするために反応性ハロアルカン基質と共有結合により付着している変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼであるＨａｌｏＴａｇ；アミロースアガロースと結合しているタンパク質であるマルトース結合タンパク質タグ；Ｎｕｓタグ；チオレドキシンタグ；並びに二量化及び可溶化を可能にし、プロテインＡセファロース上での精製のために使用され得る免疫グロブリンＦｃドメインに由来するＦｃタグ。

ＳＶ４０から得られるもののような核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、タンパク質が細胞に入るとすぐに核に輸送されることを可能にする。天然のＡｓＣｐｆ１タンパク質が細菌起源であり、したがってＮＬＳモチーフを天然に含まないと仮定すると、組換えＡｓＣｐｆ１タンパク質への１つ以上のＮＬＳモチーフの付加は、標的ゲノムＤＮＡ基質が核に存在する真核細胞において使用される場合、改善されたゲノム編集活性を示すことが予想される。ＨＥＫ２９３細胞における機能試験により、二分ＮＬＳ（ヌクレオプラスミン）を使用すると、現在の商業的設計（３ ＳＶ４０ ＮＬＳ）及びＣｐｆ１タンパク質において有望であることを示した単一又は二重のＯｐＴ ＮＬＳの使用と比較して、編集が増加することが明らかになった。二分を含むＮＬＳエレメントのさらなる組合せが想定される。注目すべきことに、ヌクレオプラスミンは哺乳動物細胞において最もよく機能するが、ＳＶ４０ ＮＬＳはほとんど全ての有核細胞において機能するようである。二分ＳＶ４０ ＮＬＳはＣａｓ９及びＣｐｆ１の両方において機能的である。２つの異なるＮＬＳドメインを有することは、広範囲の種にわたって有効性を拡大することができる。

当業者は、これらの種々の融合タグ技術並びにこれらを含む融合タンパク質をどのように作製し、使用するかを理解している。

「単離された核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びこれらをコードするベクターを含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びベクターは、細胞成分のような、これらが由来し得る又は関連し得る他の生物学的物質を含まない。典型的に、単離された核酸は、細胞成分のような、これらが由来し得る又は関連し得る他の生物学的物質から精製される。

「単離された野生型ＡｓＣｐｆ１核酸」という用語は、野生型ＡｓＣｐｆ１タンパク質をコードする単離された核酸である。単離された野生型ＡｓＣｐｆ１核酸の例には、配列番号１が含まれる。

「単離された野生型ＬｂＣｐｆ１核酸」という用語は、野生型ＬｂＣｐｆ１タンパク質をコードする単離された核酸である。単離された野生型ＬｂＣｐｆ１核酸の例には、配列番号３が含まれる。

第１の態様では、単離された核酸が提供される。単離された核酸は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されたＡｓ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードする。第１の点では、単離された核酸は、核局在化シグナル並びにエピトープタグの使用を含む、配列番号８、配列番号１５及び配列番号２２を含む。単離された核酸はまた、配列番号５を含むＥ．コリにおける発現のためにコドン最適化されたＡｓ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードし、核局在化シグナル、複数の核局在化シグナル又は抗体若しくは他の方法による検出を可能にするエピトープタグをコードする配列並びに／又は配列番号１２及び配列番号１９に見られるＨｉｓ−Ｔａｇのような核酸から発現される組換えタンパク質の簡単な精製を可能にする親和性タグと融合することができる又は連結することができる。

第２の態様では、野生型Ａｓ Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離されたポリペプチドが提供される。第１の点では、単離されたポリペプチドは、配列番号２、配列番号１２、配列番号１６又は配列番号１９を含む。

第３の態様では、配列番号１５をコードする単離された発現ベクターが提供される。単離された発現ベクターは、配列番号１６によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするように配列番号１５に作動可能に連結しているプロモーター及びエンハンサーのような転写開始エレメントを含む。単離された発現ベクターは、転写終結エレメント、転写後プロセッシングエレメント（例えば、スプライシングドナー及びアクセプター配列並びに／又はポリアデニル化シグナル配列）、ｍＲＮＡ安定エレメント及びｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントをさらに含んでもよい。このような遺伝子エレメントは当業者によって理解され、使用される。

第４の態様では、配列番号１５をコードする単離された発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。配列番号１５をコードする単離された発現ベクターは、配列番号１６を含むポリペプチドの発現を可能にするように適切なプロモーター及び他の遺伝子エレメント（必要に応じて）に作動可能に連結している。第１の点では、宿主細胞はヒト細胞を含む。第２の点では、ヒト細胞は不死化細胞株を含む。第３の点では、不死化細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である。この第３の点についてのさらなる詳細として、不死化細胞株は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを形成するために配列番号２を含むポリペプチドとリボ核タンパク質複合体を形成することができる、単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含む。

長さ及び化学構造が最適化されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ
「長さが修飾された」という用語は、この用語がＲＮＡを修飾する場合、ヌクレオチド配列を欠いている参照ＲＮＡの短縮された若しくは切断された形態又はさらなるヌクレオチド配列を含む参照ＲＮＡの伸長された形態を指す。

「化学的に修飾された」という用語は、この用語がＲＮＡを修飾する場合、ＲＮＡと共有結合により連結している化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化学基を含有する参照ＲＮＡの形態を指す。化学的に修飾されたＲＮＡは、本明細書に記載されている場合、一般に、修飾されたヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成の間に組み込まれるオリゴヌクレオチド合成手順を使用して調製された合成ＲＮＡを指す。しかしながら、化学的に修飾されたＲＮＡはまた、合成後に適切な修飾剤により修飾された合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。

コンピテントなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムは、単離されたＡｓＣｐｆ１タンパク質及び単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡからなるガイドＲＮＡと形成された、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。一部の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの長さが修飾された単離形態及び／又は化学的に修飾された単離形態は、精製されたＡｓＣｐｆ１タンパク質、ＡｓＣｐｆ１タンパク質をコードする単離されたｍＲＮＡ又は発現ベクターにおいて、ＡｓＣｐｆ１タンパク質をコードする遺伝子と組み合わされる。ある特定のアッセイでは、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの長さが修飾された単離形態及び／又は化学的に修飾された単離形態は、ＡｓＣｐｆ１遺伝子をコードする内因性発現カセットからＡｓＣｐｆ１タンパク質を安定に発現する、細胞株に、導入され得る。

合成ＲＮＡの合成には、不必要な塩基の配列は短縮されるが、機能の喪失が生じるような短縮はされないことが望ましい。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼへのｃｒＲＮＡの結合を媒介する５’定常領域は、２０残基未満に切断されると活性の喪失を示す。ｃｒＲＮＡに標的配列特異性を付与するプロトスペーサーガイド領域を含む３’可変ドメインは、２５塩基ほどの長さで天然に存在する。このドメインは、機能的活性を喪失せずに約２０〜２１塩基に短縮され得る。したがって、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの最適化された長さは４０〜４１塩基であり、２０塩基の５’定常ドメイン及び２０〜２１塩基の３’可変ドメインを含む。

本発明は、ＡｓＣｐｆ１ヌクレアーゼのＤＮＡヌクレアーゼ活性を誘発するための適切なガイドＲＮＡを提供する。ｃｒＲＮＡの長さが修飾された及び／又は化学的に修飾された形態の両方に関して、これらの最適化された試薬は、ＡｓＣｐｆ１を用いた任意の適用において改善されたゲノム編集を提供する。ＣＲＩＳＰＲベースのツールの適用には、植物遺伝子編集、酵母遺伝子編集、ノックアウト／ノックイン動物システムの迅速な生成、疾患状態の動物モデルの生成、疾患状態の矯正、レポーター遺伝子の挿入及び全ゲノム機能的スクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。「ツールキット」は、転写活性化因子ＣＲＩＳＰＲａ）及びリプレッサー（ＣＲＩＳＰＲｉ）との融合タンパク質として、ＡｓＣｐｆ１のニッカーゼ型及びデッドミュータント（ｄｅａｄ ｍｕｔａｎｔ）を含むことによって、さらに拡大され得る。

ＡｓＣｐｆ１によるＲＮＡガイドＤＮＡ切断は主に、（ＳｐｙＣａｓ９によるＧＣリッチターゲティングと比較して）ＡＴリッチ遺伝子領域をターゲティングするその能力のために有用である。新たに発見されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ切断及び修飾バリアントは、ＡｓＣｐｆ１媒介性の互い違いの切断を促進し、遺伝子サイレンシング、相同性指向修復又はエキソン切除において利点をもたらすのに適している。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼによる遺伝子編集を指向するのに十分な効力を有する短縮されたＡｓＣｐｆ１ガイドＲＮＡを定義する。これは、完全に機能する短縮された化合物を合成するための製造に有用であり、機能性を最大にしながら、より高い品質、より低いコストをもたらす。

標的ＤＮＡ配列（ハイブリダイズされたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対を含む）又は長い合成単一ガイドｓｇＲＮＡを認識し、切断するために２つのＲＮＡの複合体を必要とするＳ．ｐｙ．Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、標的認識を指向するために短い単一のｃｒＲＮＡ種のみを必要とする。このＲＮＡは、普遍的でありかつＣｐｆ１タンパク質へのＲＮＡ種の結合を媒介する２０個のＲＮＡ残基の５’−ドメイン、及び標的特異的でありかつ正確なＤＮＡ配列へのＲＮＰ複合体の結合を媒介する２１〜２４個のＲＮＡ残基の３’−ドメインの、２つのドメインを含む。機能的ヌクレアーゼ複合体は、活性複合体を形成するために１：１のモル比で合わせられる、単一のｃｒＲＮＡ（４１〜４４塩基長）及び単離されたＣｐｆ１タンパク質を含む。ガイドｃｒＲＮＡ種は、発現プラスミド又はウイルスベクターから哺乳動物細胞において発現され得る。ｃｒＲＮＡはまた、インビトロ転写産物（ＩＶＴ）として作製され得、純粋な酵素ＲＮＡ種として単離され得る。より好ましくは、ｃｒＲＮＡは合成化学ＲＮＡオリゴヌクレオチドとして製造され得る。化学的製造は、以下に概説するような多くの利点を有する修飾残基の使用を可能にする。

合成核酸は、細胞ヌクレアーゼによって攻撃され、哺乳動物細胞又は血清中で急速に分解する。化学修飾は、合成核酸に相対的ヌクレアーゼ耐性を付与することができ、これらの半減期を延長し、それによって機能的性能及び効力を劇的に改善する。さらに厄介なことに、合成核酸は、哺乳動物細胞における抗ウイルス監視機構によってしばしば認識されるが、この機構は、先天性免疫系の一部であり、かつ、細胞死を導き得るインターフェロン応答経路活性化を導くものである。化学修飾は、合成ＲＮＡに対する望ましくない免疫応答を、低減させることができる又は排除することができる。したがって、生細胞での使用を意図した合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学的に修飾する方法を確立することは、有用である。しかしながら、タンパク質因子と特異的相互作用を有する核酸種は、化学修飾が核酸の三次構造を変化させ、核酸とアミノ酸残基との間の重要な接触点を遮断し得るので、盲目的に修飾することはできない。例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ修飾（２’ＯＭｅ）は、アミノ酸残基との相互作用からＲＮＡの２’−酸素を遮断し、次いで修飾ＲＮＡとタンパク質との間の機能的相互作用を破壊し得る。同様に、ホスホロチオエート修飾は、リン酸における非架橋酸素の置換を介して核酸のリン酸骨格に沿ったタンパク質結合を破壊し得る。

２’ＯＭｅ修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を増加させることが以前に示されており、また、同じ種類において、化学的に合成されたＲＮＡが哺乳動物細胞に導入された場合に先天性免疫応答を誘発するリスクも低減することができるので、この状況において特に有用である。ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡへのこの修飾残基の取り込みを可能にし、機能を保持する特定の修飾パターンが確立されている。同様に、本発明者らは、ＳｐｙＣａｓ９システムにおいてガイドＲＮＡとして役立つｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの安定性を改善した化学修飾パターンを最近開発した。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡにおける２’ＯＭｅ修飾残基の使用は、ヌクレアーゼに対するＲＮＡ安定性を改善し、ヌクレアーゼリッチ環境における編集の全体的な効率を高めると同時に、免疫原性誘因に関連する細胞死及び毒性（長い未修飾ＲＮＡで見られるような）を低減する。

本発明は、哺乳動物細胞におけるゲノム編集において使用することができる活性ＲＮＰ複合体を形成する際に機能を保持するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡについての化学修飾パターンを定義することに関する。修飾「ウォーク」は、単一の２’ＯＭｅ残基がＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する全ての位置に連続的に配置される場所に実施された。ゲノム編集においてＲＮＰ複合体の機能を低減させた又はなくした部位を同定した。高効率ゲノム編集に適合した化学修飾パターンが定義された。ｃｒＲＮＡの「修飾コンピテント」位置における２’−フルオロ（２’Ｆ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）修飾の有用性も実証した。ヌクレアーゼ感受性を低減させるために選択部位を修飾するためのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の使用並びに合成ＲＮＡに対するエキソヌクレアーゼ攻撃を低減させるための末端ブロックとしての非塩基修飾因子の成功した使用が示された。まとめると、これらの研究は、哺乳動物細胞における意図される適用において機能することが実証された一連の修飾化学と共に、化学修飾に適しているＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡにおける部位の「マップ」を提供する。

修飾パターンの具体例は以下の実施例に示される。２０塩基の５’定常ドメインは、大幅に修飾され、機能を保持することができる。特に、２０塩基の５’定常領域を使用し、５’末端から数えると、１、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８及び１９位におけるＲＮＡ残基は全て、活性を喪失せずに２’ＯＭｅ ＲＮＡ残基により置換され得る。このような置換は、単一、複数又は１４個全ての残基を修飾することができ、それによって１４／２０個の残基がこのドメインにおいてＲＮＡから２’ＯＭｅ ＲＮＡに変化している。２１塩基の３’可変ドメインにおいて寛容される最大修飾パターンはドメインの配列によって変化する。このドメイン内で、残基２１、２２、２３、２８、２９、３０、３２、３４、３５、３９、４０及び４１（５’定常領域の最初の塩基から数える）は、活性を喪失せずに２’ＯＭｅ残基により置換され得る。

２１〜２４塩基の３’標的特異的ドメイン内の選択位置のみが、活性を損なうことなく修飾され得る。Ｃｐｆ１の結晶構造に基づいて、定常領域及び標的領域内に多くのタンパク質接触点が存在する。定常領域修飾に関して、Ｃｐｆ１結晶構造接触点を、修飾され得る同定された機能的位置と比較した場合に現れる明らかな相関はなく、このことは、良好な修飾パターンが結晶構造から予測することができないことを意味する。同様に、標的領域修飾パターンを決定するために、経験的試験が必要であった。初期の２’ＯＭｅ修飾試験に基づいて、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ内の選択された領域は、修飾を寛容する領域を絞り込む試みとして２’ＯＭｅを使用して修飾された。２’ＯＭｅ修飾に感受性であるＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ内の単一残基の位置は図７に示される。Ｃｐｆ１媒介性ゲノム編集の強力な誘因である、より高いレベルの修飾パターンは図８に示される。２’Ｆ修飾は、２’ＯＭｅ修飾に寛容である任意の残基に位置付けられ得る。さらに、３’可変ドメインは、２’ＯＭｅ修飾の大きなブロックより２’Ｆ修飾の大きなブロックに対して寛容である。したがって、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの高度に修飾された型は、３’−ドメインに２’ＯＭｅ修飾を含み、５’−ドメインに２’Ｆ修飾を含む。中程度又は軽度の修飾パターンについて、２’ＯＭｅ又は２’Ｆのいずれか（又は両方）の修飾は、両方のドメインにおいて使用され得る。また、ＬＮＡ残基は、以下の実施例に定義されているように、機能を損なわずにｃｒＲＮＡに組み込まれ得る。

２’ＯＭｅ又は他の修飾糖アプローチの広範な使用の代替として、３’末端及び５’末端における非塩基修飾因子によるエキソヌクレアーゼ攻撃の遮断は、ｃｒＲＮＡ機能と適合性があり、細胞における機能を改善する。小さなＣ３スペーサー（プロパンジオール）又は大きなＺＥＮ基は、このアプローチのために同様に良好に機能する。さらに、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ｃｒＲＮＡの各末端における端部の２〜３塩基の間のような選択部位に配置され得るが、ｃｒＲＮＡの完全なＰＳ修飾又はループドメイン若しくはプロトスペーサードメインのいずれかの完全な修飾は、低減した活性を示す。

ガイドＲＮＡは、哺乳動物細胞におけるほとんどのＣＲＩＳＰＲ適用に関与する、後の修復事象を開始する、ＡｓＣｐｆ１によるＲＮＡ指向性ｄｓＤＮＡ切断において必要とされる。ＡｓＣｐｆ１ゲノム編集のためのガイドとしての修飾合成ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの使用が提供される。哺乳動物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１適用のための２’ＯＭｅ修飾ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、２’Ｆ修飾ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、ＬＮＡ修飾ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ及び末端が遮断されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの有用性は実証されている。当業者は、本開示に基づいてさらなる化学修飾が可能であることを認識し、理解する。これらの塩基修飾基の多くは、本発明において教示されるパターンに従って同様に機能することが予想される。これまで、ゲノム編集のためにＣｐｆ１と共に使用された全てのｃｒＲＮＡは未修飾ＲＮＡであった。本発明において、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの特性を改善し、毒性のリスクを低下させる機能的修飾パターンが提供される。

ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、インビトロ転写産物（ＩＶＴ）として又は化学合成によってＲＮＡ転写ベクターから細胞内で作製され得る。合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、これらが単独で分子内の特定の部位における修飾塩基の正確な挿入を可能にするので、明確な利点を提供する。本発明は、細胞におけるＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの性能を改善するために使用され得る化学修飾に適している位置のマップを提供する。一部の適用に関して、「最小修飾」アプローチで十分である。より高いヌクレアーゼ環境において又は特に高い先天性免疫反応性を有する細胞における使用に関して、「高修飾」アプローチが良好に機能し得る。本発明は、低い、中程度又は高い修飾の必要性のための方法を提供する。

ＡｓＣｐｆ１ベースのツールの適用は、多く、様々である。これらには、限定されないが、細菌遺伝子編集、植物遺伝子編集、酵母遺伝子編集、哺乳動物遺伝子編集、生きている動物の器官における細胞の編集、胚の編集、ノックアウト／ノックイン動物システムの迅速な生成、疾患状態の動物モデルの生成、疾患状態の矯正、レポーター遺伝子の挿入及び全ゲノム機能的スクリーニングが含まれる。

第５の態様では、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムが提供される。このシステムは、ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含む。第１の点では、ＡｓＣｐｆ１ポリペプチドは配列番号２を含む。第２の点では、適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は化学修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含有するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。

第６の態様では、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムが提供される。このシステムは、ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを発現するヒト細胞株を含む。第１の点では、ＡｓＣｐｆ１ポリペプチドは、配列番号２、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１９からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第２の点では、適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は化学修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含有するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。

第７の態様では、単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが提供される。単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼシステムにおいて活性である。第１の点では、単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学的に修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含有するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。

第８の態様では、遺伝子編集を実施する方法が提供される。この方法は、候補編集標的部位遺伝子座を、野生型ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む。第１の点では、野生型ＡｓＣｐｆ１ポリペプチドは、配列番号２、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１９からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第２の点では、適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含有するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。

別の態様では、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されたＬｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。第１の点では、単離された核酸は、配列番号１７又は配列番号３９６を含む。

別の態様では、野生型Ｌｐ Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離されたポリペプチドが提供される。第１の点では、単離されたポリペプチドは、配列番号１４又は配列番号２４を含む。

別の態様では、配列番号１７又は配列番号３９６をコードする単離された発現ベクターが提供される。

別の態様では、配列番号１７又は配列番号３９６をコードする単離された発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。配列番号１７又は配列番号３９６をコードする単離された発現ベクターは、それぞれ配列番号１４又は配列番号２４を含むポリペプチドの発現を可能にするように適切なプロモーターに作動可能に連結している。第１の点では、宿主細胞はヒト細胞を含む。第２の点では、ヒト細胞は不死化細胞株を含む。第３の点では、不死化細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である。この点のさらなる詳細では、宿主細胞は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを形成するために、配列番号４、配列番号１４、配列番号２０及び配列番号２４からなる群から選択されるポリペプチドとリボ核タンパク質複合体を形成することができる単離されたＬｂ Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含む。

別の態様では、Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチド及び適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムが提供される。第１の点では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムは、配列番号１４の形態のＬｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドを含む。第２の点では、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムは、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は化学修飾されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含む。

別の態様では、Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチド及び適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを発現するヒト細胞株を有する単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムが提供される。第１の点では、Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドは配列番号１４又は配列番号２４である。第２の点では、適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は化学修飾されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。

別の点では、遺伝子編集を実施する方法が提供される。この方法は、候補編集標的部位遺伝子座を、野生型Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチド及び適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む。第１の点では、この方法は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２０及び配列番号２４からなる群から選択される野生型Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドを含む。第２の点では、適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学修飾されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される。

別の点では、組換えＣｐｆ１融合タンパク質及び適切なｃｒＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステムが提供される。第１の点では、組換えＣｐｆ１融合タンパク質は、単離され、精製されたタンパク質である。第２の点では、組換えＣｐｆ１融合タンパク質は、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ及びＮ末端又はＣ末端の端部のいずれかに位置する複数の親和性タグを含む。１つの好ましい実施形態では、組換えＣｐｆ１融合タンパク質は、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ及び３つのＮ末端ＦＬＡＧタグ及びＣ末端６×Ｈｉｓタグを含む。第３の点では、組換えＣｐｆ１融合タンパク質及び適切なｃｒＲＮＡは１：１の化学量論比で（すなわち、等モル量で）提供される。

［実施例１］
単離された核酸ベクターにおいてコードされる野生型Ａｓ Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列
以下のリストは、本発明に記載されているポリペプチド融合タンパク質として発現される野生型（ＷＴ）Ａｓ Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを示す。多くの場合、１つより多いコドンが同じアミノ酸をコードし得るので、多くの異なるＤＮＡ配列が同じアミノ酸（ＡＡ）配列をコードし得る／発現し得ることが、当業者によって理解される。以下に示されているＤＮＡ配列は例としてのみ与えられ、同じタンパク質（例えば、同じアミノ酸配列）をコードする他のＤＮＡ配列が意図される。ＮＬＳドメインなどのようなさらなる特徴、エレメント又はタグが、前記配列に付加されてもよいことがさらに理解される。Ｃｐｆ１単独並びにＣ末端及びＮ末端の両方のＳＶ４０ＮＬＳドメイン及びＨＩＳタグと融合したＣｐｆ１としてこれらのタンパク質についてのアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す、ＷＴ ＡｓＣｐｆ１についての例を示す。ＮＬＳ配列、ドメインリンカー又は精製タグを表すアミノ酸配列は太字のフォントで示される。

［実施例２］
ヒトコドン最適化ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸を発現する単離されたベクター及びＡｓ Ｃｐｆ１ポリペプチド融合タンパク質を安定に発現するヒト細胞株の調製。

ＡｓＣｐｆ１についての参照アミノ酸は公開されている。Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．、Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．、Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ，Ｐ．、Ｖｏｌｚ，Ｓ．Ｅ．、Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ，Ｊ．、Ｒｅｇｅｖ，Ａ．、Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．及びＺｈａｎｇ，Ｆ．（２０１５年）Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １６３：１〜１３頁を参照のこと。ヒトコドン最適化ＡｓＣｐｆ１、隣接核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び５’−Ｖ５エピトープタグをコードするプラスミドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおける合成生物学（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門によって生成された。発現カセットに隣接するのは、５’ＸｈｏＩ及び３’ＥｃｏＲＩ制限酵素部位であった（図２）。Ｃｐｆ１プラスミドをＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）により消化し、カラムベースの精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の予め消化した哺乳動物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１−にライゲーションした（図３）。得られたライゲーションした構築物を、ＤＨ５α化学的コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。得られたコロニーをＬＢ培地中で３７℃にて一晩増殖させ、Ｐｒｏｍｅｇａ ｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡキットを使用してＤＮＡ単離を行った。隣接プライマー（Ｔ７フォワード及びＢＧＨリバース）並びに１０個の内部Ｃｐｆ１特異的プライマーを、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ試薬（ＡＢＩ）を用いた自動サンガーシークエンシングを使用した正確な挿入の配列検証のために使用した。本明細書に利用されるＣｐｆ１クローンの核酸配列は配列番号１５に示される。発現された組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１６に示される。

ＡｓＣｐｆ１−ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、アンピシリン耐性遺伝子内に位置するＰｖｕＩ（ＮＥＢ）により線状化し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、トランスフェクションの２４時間前に１００ｍｍ皿に播種した５００，０００個のＨＥＫ２９３細胞を利用した。トランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ−Ｘ２（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、ＡｓＣｐｆ１及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する線状化ベクターを複合化し、接着細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション培地を２４時間後に除去し、細胞を完全培地中で４８時間培養した。安定に組み込まれたｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターネオマイシン耐性を含有する安定なトランスジェニックＨＥＫ２９３細胞の生成のために以前に最適化された方法を使用して、本発明者らは、ＡｓＣｐｆ１−ｐｃＤＮＡ３．１（−）をトランスフェクトした細胞を選択するために完全培地中で、ネオマイシン類似体である、抗生物質ジェネティシン（Ｇ４１８；Ｇｉｂｃｏ）の存在下でトランスフェクト細胞を培養したので、この抗生物質に耐性がある。最初のＧ４１８投与は、生存細胞が回復し始め、１０日間にわたって増殖するまで、定期的に培地を交換しながら８００μｇ／ｍｌで行った。親ＨＥＫ２９３細胞株は、Ｇ４１８の最小用量に対して感受性であることが確認された。Ｇ４１８耐性を示した、得られたポリクローナルＡｓＣｐｆ１−ｐｃＤＮＡ３．１（−）細胞株を、限界希釈を使用して分割した。細胞をトリプシン処理し、完全培地に再懸濁し、計数して濃度を決定し、理論的に１つのウェル当たり１個未満の細胞の濃度まで９６ウェルプレートにおいて希釈した。

このときに、細胞のアリコートを取得し、タンパク質溶解緩衝液（ＲＩＰ Ａ）により溶解して、ＡｓＣｐｆ１が発現したかどうかをウェスタンブロットによって決定した。細胞タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量し、１５μｇの全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｉｎｆｒｅｅの４〜２０％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に負荷した。陽性対照として、以前の細胞株、ＳｐｙＣａｓ９−ｐｃＤＮＡ３．１（−）由来のタンパク質を、サイズ及び発現比較のために並行して流した。ゲルを１８０ボルトにて４５分間流し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＴｒａｎｓＢｌｏｔを用いてＰＶＤＦ膜に７分間移した。次いで、ブロットをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で遮断し、続いて１：１０００希釈のＶ５一次抗体（Ａｂｃａｍ）及び１：５０００のβ−アクチン一次抗体（Ａｂｃａｍ）を室温にて１時間遮断した。次にブロットを、Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中で、各々、１５分間３回洗浄した。ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体を、ラダー特異的ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ二次抗体と共に１：３０００希釈にて使用し、室温にて１時間、室温にてインキュベートした。次いでブロットをＴＢＳＴ中で１５分間３回洗浄した。発光検出を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｗｅｓｔ−Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ）基質を使用して行い、結果を図４に示し、これにより、予想されるサイズの組換えタンパク質の発現が確認される。

細胞をＧ４１８含有培地において選択下で連続的に増殖させ、個々の細胞（モノクローナルコロニー）を増加させた。生存コロニーを、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ウェスタンブロッティング及びｃｒＲＮＡガイドｄｓＤＮＡ切断の機能試験によって、ＡｓＣｐｆ１の存在について特徴付けた。４つのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを、大きなＡｓＣｐｆ１ ｍＲＮＡ内の異なる位置を検出するように設計した。配列は以下の表１に示される。

Ｇ４１８に耐性があるモノクローナル細胞株を６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。細胞をＧＩＴＣ含有緩衝液により溶解し、ＲＮＡを、Ｃｏｒｂｅｔｔ液体処理ロボット上のＷｉｚａｒｄ ９６ウェルＲＮＡ単離結合プレート（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。液体処理ロボット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために使用し、５００ｎｍｏｌのプライマー及び２５０ｎｍｏｌのプローブ（ＩＤＴ）と共にＩｍｍｏｌａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用してｑＰＣＲアッセイを設定した。ｑＰＣＲプレートをＡＢ７９００−ＨＴ上で実行し、関連ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。図５は、一連のクローン株についてＨＰＲＴ１発現に対して正規化したＡｓＣｐｆ１ ｍＲＮＡ発現の相対レベルを示す。驚くことではないが、異なるクローンは異なるレベルのＡｓＣｐｆ１ ｍＲＮＡ発現を示した。

全タンパク質を、並行して増殖させた培養物中の同じＡｓＣｐｆ１発現モノクローナル細胞株から単離した。細胞を、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。各溶解物中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。各試料からの全タンパク質１５マイクログラムをＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｉｎｆｒｅｅの４〜２０％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷し、広範囲の分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に１×Ｔｒｉｓ／グリシンランニング緩衝液中で１８０Ｖにて４５分間流した。タンパク質を、７分間、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＴｒａｎｓＢｌｏｔ移送ユニットを使用してＰＤＶＦ膜に移した。ブロットを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で遮断し、続いて１：１０００希釈のＶ５一次抗体（Ａｂｃａｍ）及び１：５０００のβ−アクチン一次抗体（Ａｂｃａｍ）と室温にて１時間インキュベートした。ブロットを、Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中で、各々１５分間３回洗浄した。ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体を、ラダー特異的ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ二次抗体と共に１：３０００希釈にて使用し、室温にて１時間、室温にてインキュベートした。次いでブロットをＴＢＳＴ中で１５分間３回洗浄した。発光検出を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｗｅｓｔ−Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ）基質を使用して行った。図６は、１０個のモノクローナル細胞株におけるＶ５タグ化ＡｓＣｐｆ１組換えタンパク質発現レベルの検出を示す。図６に見られる観察されたタンパク質レベルと、図５に示される同じ細胞株由来の対応するｍＲＮＡレベルとの間には、良好な一致が存在する。

３個のモノクローナルＡｓＣｐｆ１安定細胞株（１Ａ１、２Ａ２及び２Ｂ１）を増加させ、ＡｓＣｐｆ１指向ゲノム編集を支持する能力について試験した。以前に決定されたＡｓＣｐｆ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルに基づいて、１Ａ１は「高」発現株であり、２Ａ２は「中」発現株であり、２Ｂ１は「低」発現株である。以下の表２に示すように、細胞株に、ヒトＨＲＰＴ１遺伝子のエキソン内の異なる部位をターゲティングする６つの異なるｃｒＲＮＡをトランスフェクトした。ｃｒＲＮＡは、５’末端にユニバーサル２０塩基Ｃｐｆ１結合ドメインを含み、３’末端に２４塩基標的特異的プロトスペーサードメインを含む。

リバーストランスフェクション形式では、抗ＨＰＲＴ１ ｃｒＲＮＡを個々にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、３個のＨＥＫ−Ｃｐｆ１細胞株の各々にトランスフェクトした。トランスフェクションを、９６ウェルプレート形式において１つのウェル当たり４０，０００個の細胞を用いて行った。ＲＮＡを、０．７５μｌの脂質試薬中に３０ｎＭの最終濃度にて導入した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。３個の細胞株に見られる切断効率を以下の表３に示す。

予想されるように、ＨＰＲＴ１における異なる部位をターゲティングする異なるｃｒＲＮＡは、異なるレベルの遺伝子編集活性を示した。細胞株１Ａ１では、これは１８％〜７３％の範囲であった。「高」及び「中」Ｃｐｆ１発現クローン１Ａ１及び２Ａ２は、ほぼ同一の遺伝子編集活性を示し、両方のクローンが、各部位において最大の遺伝子編集活性に到達するのに十分なレベルでＣｐｆ１を発現したことを示した。「低」発現クローンであるクローン２Ｂ１は、低減した編集活性を示した。したがって、クローン１Ａ１及び２Ａ２の両方はＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの最適化及び部位スクリーニングに適している。

［実施例３］
ｃｒＲＮＡの長さ最適化：５’−２０塩基ユニバーサルループドメインの切断の試験。

ヒトＨＰＲＴ１遺伝子における６つの部位のセットを、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの長さ最適化を研究するために選択した。３’−２４塩基標的特異的プロトスペーサードメインを有し、５’末端から一連の１塩基欠失のセットを表す、２０、１９、１８及び１７塩基の５’−ループドメインを有する全ての一連のｃｒＲＮＡを合成した。３’−２１塩基標的特異的プロトスペーサードメインを有し、同様に２０、１９、１８及び１７塩基の５’−ループドメインを有する全ての第２のセットのｃｒＲＮＡを同じ部位において合成した。

ＡｓＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを安定に発現するＨＥＫ細胞株をこれらの研究において利用した（実施例２）。リバーストランスフェクション形式では、抗ＨＰＲＴ１ ｃｒＲＮＡを個々にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、ＨＥＫ−Ｃｐｆ１細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションを、９６ウェルプレート形式において１つのウェル当たり４０，０００個の細胞を用いて行った。ＲＮＡを、０．７５μｌの脂質試薬中に３０ｎＭの最終濃度にて導入した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。結果を以下の表４に示し、２０及び１９塩基長の５’−ユニバーサルループドメインは十分に機能するが、１８又は１７塩基ループドメインが利用される場合、活性の顕著な喪失が見られることが実証される。観察は、２４塩基又は２１塩基プロトスペーサードメインが利用されるかどうかに関わらず、ほぼ同一である。

［実施例４］
ｃｒＲＮＡの長さ最適化：３’−２４塩基標的特異的プロトスペーサードメインの切断の試験。

ヒトＨＰＲＴ１遺伝子における６つの部位の同じセットを、３’−プロトスペーサー（標的特異的）ドメインにおける切断の効果を研究するために使用した。同じ５’−２０塩基ユニバーサルループドメインを有する全ての一連のＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを合成した。これらは、３’末端から一連の欠失を有する、２１、１９、１８又は１７塩基の３’標的特異的プロトスペーサードメインと対合した。

ＡｓＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを安定に発現するＨＥＫ細胞株をこれらの研究において利用した（実施例２）。リバーストランスフェクション形式では、抗ＨＰＲＴ１ ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを個々にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、ＨＥＫ−Ｃｐｆ１細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションを、９６ウェルプレート形式において１つのウェル当たり４０，０００個の細胞を用いて行った。ＲＮＡを、０．７５μｌの脂質試薬中に３０ｎＭの最終濃度にて導入した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。結果を以下の表５に示し、２１塩基長の３’−プロトスペーサー（標的特異的）ドメインは十分に機能するが、このドメインが短縮されると、活性の喪失が配列／部位依存様式で観察されることが実証される。いくつかの高度に活性な部位（３８３５１のような）は、１７塩基に切断された場合でさえ、認識される活性を維持するが、全ての部位での機能性の最も高い可能性を維持するために、２１塩基のプロトスペーサーが推奨される。したがって、堅実な最小の長さのＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは４１塩基であり、２０塩基の５’−ユニバーサルループドメイン及び２１塩基の３’−プロトスペーサー標的特異的ドメインを含む。

［実施例５］
単一塩基の２’ＯＭｅ修飾による、２つのＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡのウォークスルー（ｗａｌｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）。

ヒトＨＰＲＴ１遺伝子における２つの部位を、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ内の全ての可能な位置における単一ＲＮＡ残基の２’ＯＭｅ−ＲＮＡ残基による置き換えの効果を研究するために選択した（３８３５１及び３８５９５）。修飾に対する配列特異的寛容の可能性を考慮すると、２つの部位においてこのスクリーニングを実施することが必要であった。単一塩基ステップにおいて、全ての可能な位置に単一の２’ＯＭｅ残基を有する一連のｃｒＲＮＡを合成した。ｃｒＲＮＡは４４塩基長であり又は４１塩基長のいずれかであった。全て５’末端２０塩基ユニバーサルループドメイン、続いて３’末端２１又は２４塩基プロトスペーサー標的特異的ドメインを有した。

ＡｓＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを安定に発現するＨＥＫ細胞株をこれらの研究において利用した（ＨＥＫ−Ｃｐｆ１）（実施例２）。リバーストランスフェクション形式では、抗ＨＰＲＴ１ ｃｒＲＮＡを個々にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、ＨＥＫ−Ｃｐｆ１細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションを、９６ウェルプレート形式において１つのウェル当たり４０，０００個の細胞を用いて行った。ＲＮＡを、０．７５μｌの脂質試薬中に３０ｎＭの最終濃度にて導入した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。ＨＰＲＴ１部位３８３５１についての結果を以下の表６に示し、ＨＲＰＴ１部位３８５９５についての結果を以下の表７に示す。この結果により、２’ＯＭｅ修飾によりＲＮＡ残基を置き換えた場合、ｄｓＤＮＡを切断するためにＣｐｆ１の活性を低減させる又は活性を完全になくす部位の位置が実証される。この結果は、２４塩基又は２１塩基プロトスペーサードメインが利用されるかどうかに関わらず、ほぼ同一である。

２’ＯＭｅ ＲＮＡ残基のＲＮＡ残基に対する置換がゲノム編集アッセイにおいて活性の喪失を示した部位を、５’−ユニバーサルループドメイン又は３’標的特異的プロトスペーサードメイン内の位置にマッピングした。結果を図７にまとめる。ユニバーサルループドメイン内の残基Ａ２、Ａ３、Ｕ４、Ｕ１１、Ｇ１５及びＵ２０の修飾は活性の喪失をもたらし；研究した４つ全てのｃｒＲＮＡクラス（部位３８３５１ ４４ｍｅｒ、部位３８３５１ ４１ｍｅｒ、部位３８５９５ ４４ｍｅｒ及び部位３８５９５ ４１ｍｅｒ）ついて同じ部位が同定された。対照的に、修飾効果の正確なパターンはプロトスペーサードメイン内の部位について変化し、このことは、修飾寛容が配列状況によって変化し、プロトスペーサードメインが全ての標的部位について異なる配列を有することが一般的であるために予想される。研究した配列について、位置５、６、１３、１６及び１８は、４つ全てのｃｒＲＮＡクラスについての修飾により活性の喪失を示し、したがって、２’ＯＭｅ ＲＮＡ化学修飾を回避するための位置が同定される。

［実施例６］
ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡにおける配列のブロックの修飾。

ヒトＨＰＲＴ１遺伝子における３つの部位を、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ内のＲＮＡ残基のブロックの、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ、２’Ｆ ＲＮＡ又はＬＮＡ残基による置き換えの効果を研究するために選択した（３８３５１、３８５９５及び３８１０４）。ホスホロチオエート結合（ＰＳ）及び非ヌクレオチド末端修飾因子によるヌクレオチド間結合の修飾も試験した。ｃｒＲＮＡは４４塩基長であり又は４１塩基長のいずれかであった。全て５’末端２０塩基ユニバーサルループドメイン、続いて３’末端２１又は２４塩基プロトスペーサー標的特異的ドメインを有した。

ＡｓＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを安定に発現するＨＥＫ細胞株をこれらの研究において利用した（ＨＥＫ−Ｃｐｆ１）（実施例２）。リバーストランスフェクション形式では、抗ＨＰＲＴ１ ｃｒＲＮＡを個々にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、ＨＥＫ−Ｃｐｆ１細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションを、９６ウェルプレート形式において１つのウェル当たり４０，０００個の細胞を用いて行った。ＲＮＡを、０．７５μｌの脂質試薬中に３０ｎＭの最終濃度にて導入した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。結果を以下の表８に示す。

ユニバーサル５−ループドメインの大きなブロックを修飾し、活性を保持することができる（１４／２０塩基）。しかしながら、標的特異的３’−プロトスペーサードメインは、２〜３個の連続する２’ＯＭｅ残基がＲＮＡ残基と置き換わる場合、たとえこれらの位置が単一塩基ウォークにおいて活性の喪失を全く示さなかった場合であっても（実施例５）、活性の顕著な喪失を示す。プロトスペーサードメインにおける修飾パターンは、多くの場合、１つの修飾パターンが１つの配列については十分に機能するが、別の配列については十分に機能しないように、配列状況によって影響を受けると予想される。図７に示されている修飾マップは、いくつかの部位において高い性能を示し、配列状況にかかわらずおそらく使用することができる、最小から高いレベルの修飾までの範囲である修飾パターンを示す。

２’Ｆ残基は、２’ＯＭｅ修飾に寛容である任意の位置に配置することができた。ＬＮＡ残基もまた、ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ内に配置することができ、末端修飾因子の使用を以下の表８に示す。ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合はヌクレアーゼ耐性を付与し、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するためにｃｒＲＮＡの末端に配置することができる又はエンドヌクレアーゼ攻撃を遮断するために中央領域に配置することができる。ＰＳ結合によるｃｒＲＮＡの大きなブロックの修飾（ループドメイン又はプロトスペーサードメインの全修飾のような）はｃｒＲＮＡ機能と適合せず、この修飾パターンを利用すると、活性の顕著な喪失が見られる。各末端における２〜３個のヌクレオチド間結合のような限定された使用を効果的に利用することができ、このようなパターンはエキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するのに有用である。非塩基修飾因子（Ｃ３スペーサープロパンジオール基又はＺＥＮ修飾因子ナフチル−アゾ基のような）は、活性を喪失せずにｃｒＲＮＡの一方又は両方の末端に配置することができ、エキソヌクレアーゼ攻撃も遮断する。

［実施例７］
ＲＮＰ複合体として送達されるＡｓＣｐｆ１タンパク質を伴う修飾ｃｒＲＮＡの使用。

リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を細胞に送達するためにエレクトロポレーションを使用してＨＥＫ−２９３細胞においてゲノム編集を実施するために、ＡｓＣｐｆ１タンパク質を伴う化学修飾ｃｒＲＮＡを使用する能力を研究するために、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子（３８１０４）における部位を選択した。

標準的な技術を使用してＥ．コリから単離した、精製した組換えＡｓＣｐｆ１タンパク質をこの実施例において利用した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。

ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを９５℃に５分間加熱し、次いで室温に冷却した。ｃｒＲＮＡを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（単一のトランスフェクションについて、６μＬの体積中に１６８ピコモルのタンパク質と共に２０２ピコモルのＲＮＡ）中で１．２：１のＲＮＡ：タンパク質のモル比にてＡｓＣｐｆ１タンパク質と混合した。ＲＮＰ複合体を室温にて１５分間形成させた。ＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理後に再懸濁し、培地中で洗浄し、使用前にＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、２０μＬのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液中で３．５×１０^５個の細胞の最終濃度において再懸濁した。２０μＬの細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートに入れ、５μＬのＣｐｆ１ ＲＮＰ複合体を各ウェル（５μＭの最終濃度）に加え、３μＬのＣｐｆ１エレクトロポレーションエンハンサー溶液を各ウェルに加えた（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。２５μＬの最終混合物を、９６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅエレクトロポレーションモジュールの各ウェルに移した。細胞を、Ａｍａｘａ ９６ウェルシャトルプロトコール、プログラム９６−ＤＳ−１５０を使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、７５μＬの培地を各ウェルに加え、２５μＬの最終細胞混合物を、９６ウェルインキュベーションプレート（最終体積２００μＬ）中の１７５μＬの予め温めた培地に移した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。結果を以下の表９に示す。以下に示すように、低又は高レベルの修飾を有するＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、哺乳動物細胞においてゲノム編集を媒介するＲＮＰ複合体としてエレクトロポレーションによる送達に適合する。

［実施例８］
Ｅ．コリにおけるＡｓＣｐｆ１発現プラスミドによる修飾ｃｒＲＮＡの使用
ヒトＨＰＲＴ１遺伝子（３８３４６）における部位をＥ．コリプラスミドにクローニングし、Ｅ．コリ細胞における部位特異的切断を実施するために化学的に修飾されたｃｒＲＮＡを使用する能力を研究するために使用した。ＡｓＣｐｆ１をプラスミドから発現させた。エレクトロポレーションを使用して、ＡｓＣｐｆ１発現プラスミド及び化学合成したｃｒＲＮＡの両方を送達した。

ＡｓＣｐｆ１タンパク質を、ファージＴ７プロモーター及び標準的なＥ．コリ翻訳エレメントを使用して、この実施例においてプラスミドから発現させた。発現構築物のアミノ酸配列を配列番号１６）に示す。

ＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを９５℃に５分間加熱し、次いで室温に冷却した。ｃｒＲＮＡ及びＡｓＣｐｆ１プラスミドを、ＴＥ（単一の形質転換について、５μＬの体積中に４００ピコモルのＲＮＡと共に６０フェムトモルのＡｓＣｐｆ１プラスミド）中で混合し、２０μＬのコンピテントＥ．コリ細胞に直接加えた。生存がＣｐｆ１による切断の成功と結びついている細菌株を、対数中期まで細胞増殖させ、氷冷１０％グリセロール中で３回洗浄することによってコンピテントにし、１：１００体積の１０％グリセロール中の最終懸濁液にした。エレクトロポレーションを、予め冷却した０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに２５μＬの形質転換混合物を加え、１．８ｋＶの指数関数的減衰をパルスすることによって実施した。エレクトロポレーション後、９８０μＬのＳＯＢ培地を、混合しながらエレクトロポレーションキュベットに加え、得られた細胞懸濁液を滅菌した１５ｍｌの培養管に移した。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃にて１．５時間インキュベートし、そのときにＩＰＴＧ（１ｍＭ）を加え、続いてさらに３７℃にて１時間振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、細胞を選択培地に播種して生存を評価した。

この例は、化学的に修飾された合成ｃｒＲＮＡが細菌における遺伝子編集のためにＣｐｆ１と共に使用され得ることを実証している。しかしながら、高効率は、エキソヌクレアーゼ遮断ＰＳヌクレオチド間結合を伴う、より広範に修飾されているＲＮＡを使用したときのみに見られる。細菌細胞において最も良く機能する修飾パターンは、哺乳動物細胞において不十分に機能する（表１０）。

［実施例９］
単離された核酸ベクターにおいてコードされる野生型Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列
以下のリストは、本発明に記載されているポリペプチド融合タンパク質として発現される野生型（ＷＴ）Ｌｂ Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを示す。多くの場合、１つより多いコドンが同じアミノ酸をコードし得るので、多くの異なるＤＮＡ配列は、同じアミノ酸（ＡＡ）配列をコードし得る／発現し得ることが、当業者によって理解される。以下に示されるＤＮＡ配列は例としてのみ役立ち、同じタンパク質（例えば、同じアミノ酸配列）をコードする他のＤＮＡ配列が意図される。ＮＬＳドメインなどのような、さらなる特徴、エレメント又はタグが、前記配列に付加されてもよいことは、さらに理解される。

ＬｂＣｐｆ１単独並びにＮ末端Ｖ５タグ、Ｎ末端ＳＶ４０ ＮＬＳドメイン、Ｃ末端ＳＶ４０ ＮＬＳドメイン及びＣ末端６×Ｈｉｓタグと融合したＬｂＣｐｆ１としてのこれらのタンパク質についてのアミノ酸及びＤＮＡ配列を示すＷＴ ＬｂＣｐｆ１についての例を示す。

［実施例１０］
ＲＮＰ複合体として送達されるＬｂＣｐｆ１タンパク質を伴う修飾ｃｒＲＮＡの使用。

ヒトＨＰＲＴ１遺伝子における１２の部位、３８０９４−Ｓ（配列番号３５８）、３８１０４−Ｓ（配列番号３６１）、３８１１５−ＡＳ（配列番号３６４）、３８１４６−ＡＳ（配列番号３６７）、３８１６４−ＡＳ（配列番号３７０）、３８１６４−Ｓ（配列番号３７２）、３８１８６−Ｓ（配列番号３７６）、３８２２８−Ｓ（配列番号３７９）、３８３３０−ＡＳ（配列番号３８２）、３８３４３−Ｓ（配列番号３８５）、３８４５５−Ｓ（配列番号３８８）及び３８４８６−Ｓ（配列番号３９１）（ここでＡ及びＡＳはそれぞれセンス及びアンチセンス鎖を表す）を、ＡｓＣｐｆ１及びＳｐｙＣａｓ９の標的編集活性と比較して、ＬｂＣｐｆ１の標的編集活性を研究するために選択した。リボ核タンパク質タンパク質（ＲＮＰ）複合体を細胞に送達するためにエレクトロポレーションを使用してＨＥＫ−２９３細胞においてゲノム編集を実施するためにＬｂＣｐｆ１タンパク質を伴う化学的に修飾されたｃｒＲＮＡを使用する能力を比較する研究を行った。

標準的な技術を使用してＥ．コリから単離した、精製した組換えＬｂＣｐｆ１タンパク質をこの実施例において利用した。組換えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。

ＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ及びＡｓＣｐｆ１対照ｃｒＲＮＡを９５℃に５分間加熱し、次いで室温に冷却した。ｃｒＲＮＡを、ＰＢＳ（単一のトランスフェクションについて、１０μＬの体積中に５μＭのＲＮＰ複合体）中で１：１のＲＮＡ：タンパク質のモル比にてＬｂＣｐｆ１又はＡｓＣｐｆ１と混合した。ＲＮＰ複合体を室温にて１５分間形成させた。ＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理後に再懸濁し、培地中で洗浄し、使用前にＰＢＳ中で２度目の洗浄をした。細胞を、２０μＬのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液中で３．５×１０^５個の細胞の最終濃度において再懸濁した。２０μＬの細胞懸濁液をＶ底９６ウェルプレートに入れ、５μＬのＣｐｆ１ ＲＮＰ複合体を各ウェル（５μＭの最終濃度）に加え、３μＭのＣｐｆ１エレクトロポレーションエンハンサー溶液を各ウェルに加えた（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。２５μＬの最終混合物を、９６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅエレクトロポレーションモジュールの各ウェルに移した。細胞を、Ａｍａｘａ ９６ウェルシャトルプロトコール、プログラム９６−ＤＳ−１５０を使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、７５μＬの培地を各ウェルに加え、２５μＬの最終細胞混合物を、９６ウェルインキュベーションプレート（最終体積２００μＬ）中の１７５μＬの予め温めた培地に移した。細胞を３７℃にて４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び目的のＨＰＲＴ領域をターゲティングするプライマー（ＨＰＲＴ−ｌｏｗフォワードプライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３９４）；ＨＰＲＴ−ｌｏｗリバースプライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号３９５））を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を融解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて３７℃にて１時間、２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。消化した産物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において可視化した。標的化ＤＮＡの切断パーセントを、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。配列を表１０に示し、結果を図９にグラフで表す。

生物材料寄託情報
本明細書に記載されている細胞株（例えば、１Ａ１、２Ａ２及び２Ｂ１）は、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０に位置し、＿＿＿＿＿に以下の受託番号：＿＿＿＿＿を割り当てられたアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

本明細書において引用されている刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、個々にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「一つの（ａ）」及び「一つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」という用語並びに同様の指示語の使用は、本明細書において別途指示しない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途記載されない限り、オープンエンドの用語として解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途指示されない限り、その範囲内に含まれる各別個の値を個々に言及することの簡易方法として役立つことが意図されるにすぎず、各別個の値は、これが本明細書において個々に列挙されるように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において別途指示されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、いずれかの適切な順序で実施され得る。本明細書において提供されるいずれかの及び全ての実施例又は例示的な言語（例えば、「のような」）の使用は、本発明をより良く例示することが意図されているにすぎず、別途要求されない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる言語も、請求されていないいずれかの要素が本発明の実施に必須であるとして示すものと解釈されるべきではない。

本発明を実施するために本発明者らに公知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことで当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形形態を適切に用いることを期待し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている方法とは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法により許可される通り、本明細書に添付されている特許請求の範囲内に列挙される主題の全ての修飾及び同等物を含む。さらに、上記要素の、これらの全ての可能な変形形態におけるいずれかの組合せは、本明細書において別途指示されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。

Claims (46)

1. ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）における発現のためにコドン最適化されたＡｓ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードする単離された核酸。
2. 配列番号１５を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
3. 野生型Ａｓ Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離されたポリペプチド。
4. 配列番号１２を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
5. 配列番号１５をコードする単離された発現ベクター。
6. 配列番号１５をコードする単離された発現ベクターを含む宿主細胞であって、配列番号１５をコードする単離された発現ベクターは、配列番号１２を含むポリペプチドの発現を可能にするように適切なプロモーターに作動可能に連結している、宿主細胞。
7. ヒト細胞を含む、請求項６に記載の宿主細胞。
8. ヒト細胞が不死化細胞株を含む、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 不死化細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、請求項８に記載の宿主細胞。
10. 野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを形成するために、配列番号２、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１９からなる群から選択されるポリペプチドと、リボ核タンパク質複合体を形成することができる単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡをさらに含む、請求項６に記載の宿主細胞株。
11. ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド、及び
    適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ
    を含む、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
12. ＡｓＣｐｆ１ポリペプチドが配列番号１２を含む、請求項１１に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
13. 適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は化学的に修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項１１に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
14. ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを発現するヒト細胞株を含む、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
15. ＡｓＣｐｆ１ポリペプチドが配列番号１２を含む、請求項１４に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
16. 適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は化学的に修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項１４に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
17. 規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼシステムにおいて活性である、単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ。
18. 長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学的に修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項１７に記載の単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ。
19. １９〜２０ヌクレオチド長の５’−ユニバーサルループドメイン及び１９〜２１ヌクレオチド長の３’標的特異的プロトスペーサードメインを含む長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡである、請求項１７に記載の単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ。
20. 長さ短縮及び化学修飾の両方を含む、請求項１７に記載の単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ。
21. 化学修飾が、末端基修飾（例えば、Ｃ３スペーサー）、２’ＯＭｅ修飾、２’−フルオロ修飾、及びＬＮＡ修飾からなる群から選択される、請求項２０に記載の単離されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ。
22. 候補編集標的部位遺伝子座を、野生型ＡｓＣｐｆ１ポリペプチド及び適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む、遺伝子編集を実施する方法。
23. 野生型ＡｓＣｐｆ１ポリペプチドが、配列番号２、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１９からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 適切なＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さが短縮されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学的に修飾されたＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＡｓＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項２２に記載の方法。
25. ヒトにおける発現のためにコドン最適化されたＬｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
26. 配列番号１７又は配列番号３９６を含む、請求項２５に記載の単離された核酸。
27. 野生型Ｌｐ Ｃｐｆ１タンパク質をコードする、単離されたポリペプチド。
28. 配列番号１４又は配列番号２４を含む、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
29. 配列番号１７又は配列番号３９６をコードする、単離された発現ベクター。
30. 配列番号１７又は配列番号３９６をコードする単離された発現ベクターを含む宿主細胞であって、配列番号１７又は配列番号３９６をコードする単離された発現ベクターが、それぞれ配列番号１４又は配列番号２４を含むポリペプチドの発現を可能にするように適切なプロモーターに作動可能に連結している、宿主細胞。
31. ヒト細胞を含む、請求項３０に記載の宿主細胞。
32. ヒト細胞が不死化細胞株を含む、請求項３１に記載の宿主細胞。
33. 不死化細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、請求項３２に記載の宿主細胞。
34. 野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを形成するために、配列番号４、配列番号１４、配列番号２０及び配列番号２４からなる群から選択されるポリペプチドと、リボ核タンパク質複合体を形成することができる単離されたＬｂ Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡをさらに含む、請求項３０に記載の宿主細胞株。
35. Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチド及び
    適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ
    を含む、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
36. Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドが配列番号１４を含む、請求項３５に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
37. 適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は化学的に修飾されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項３５に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
38. Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチド及び適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを発現するヒト細胞株を含む、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
39. Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドが、配列番号１４又は配列番号２４を含む、請求項３８に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
40. 適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は化学的に修飾されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項３８に記載の単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステム。
41. 候補編集標的部位遺伝子座を、野生型Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチド及び適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡを有する活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼシステムと接触させるステップを含む、遺伝子編集を実施する方法。
42. 野生型Ｌｂ Ｃｐｆ１ポリペプチドが、配列番号４、配列番号１４、配列番号２０及び配列番号２４からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
43. 適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、化学的に修飾されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ、又は長さ短縮及び化学修飾の両方を含むＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡから選択される、請求項４１に記載の方法。
44. 適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、１９〜２０ヌクレオチド長の５’−ユニバーサルループドメイン、及び１９〜２１ヌクレオチド長の３’標的特異的プロトスペーサードメインを含む、長さが短縮されたＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。
45. 適切なＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡが、長さ短縮及び化学修飾の両方を含む、請求項４１に記載の方法。
46. 化学修飾が、末端基修飾（例えば、Ｃ３スペーサー）、２’ＯＭｅ修飾、２’−フルオロ修飾、及びＬＮＡ修飾からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。

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