JP7216877B2 - 新規なCRISPR/Cas12f酵素およびシステム - Google Patents
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Description
そのため、第一の側面では、本発明は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号1に対して少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を持つアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は基本的に配列番号1の生物学的機能を維持する、タンパク質を提供する。
本発明のタンパク質は、誘導化され、たとえば、別の分子(たとえば、別のポリペプチドやタンパク質)に連結されてもよい。通常、タンパク質の誘導化(たとえば、標識)は、当該タンパク質の所望の活性(たとえば、ガイドRNAと結合する活性、エンドヌクレアーゼ活性、ガイドRNAのガイドで標的配列の特定の部位と結合して切断する活性)に不利な影響を与えないものである。そのため、本発明のタンパク質は、このような誘導化の形態を含むことも望ましい。たとえば、本発明のタンパク質を1つまたは複数の別の分子団、たとえば、別のタンパク質またはポリペプチド、検出試薬、薬用試薬などに機能的に(化学的カップリング、遺伝子融合、非共役結合またはほかの手段を介して)連結してもよい。
そのため、第二の側面では、本発明は、上記のようなタンパク質および修飾部分を含む結合体を提供する。
第三の側面では、本発明は、本発明のタンパク質と、別のタンパク質またはポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
第四の側面では、本発明は、単離された核酸分子であって、以下から選ばれる配列を含むか、または以下から選ばれる配列からなるもので:
(i) 配列番号7または13で示される配列;
(ii) 配列番号7または13で示される配列に対して1個または複数個の塩基の置換、欠失または付加(たとえば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の塩基の置換、欠失または付加)を有する配列;
(iii) 配列番号7または13で示される配列に対して少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を持つ配列;
(iv) 厳格な条件において(i)-(iii)のいずれかに記載の配列とハイブリダイズする配列;あるいは
(v) (i)-(iii)のいずれかに記載の配列の相補配列;
かつ、(ii)-(v)のいずれかに記載の配列は基本的にその由来の配列の生物学的機能を維持し、前記配列の生物学的機能とは、CRISPR-Casシステムにおける直接反復配列としての活性である
核酸分子を提供する。
(a) 配列番号7または13で示されるヌクレオチド配列;
(b) 厳格な条件において(b)に記載の配列とハイブリダイズする配列;あるいは
(c) 配列番号7または13で示されるヌクレオチド配列の相補配列。
一部の実施形態において、前記単離された核酸分子はRNAである。
第五の側面では、本発明は、
(i) 本発明のタンパク質、結合体または融合タンパク質、およびこれらの任意の組み合わせから選ばれる、タンパク質成分、ならびに
(ii) 5'から3'への方向において第四の側面に記載の単離された核酸分子および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含む、核酸成分を含み、
ここで、前記タンパク質成分と核酸成分は相互に結合して複合体になっている
複合体を提供する。
a) 5'から3'への方向において直接反復配列および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含む、ガイドRNA、ならびに
b) Cas12fエフェクタータンパク質を含み、
前記ガイドRNAと前記Cas12fエフェクタータンパク質は複合体を形成しており、
ここで、前記Cas12fタンパク質の大きさは900-1200アミノ酸で、そのC末端の近くに1つのRuvC-I、RuvC-IIおよびRuvC-IIIモチーフで構成されるRuvCドメインが存在し、
ここで、前記Cas12fタンパク質は細菌ゲノムにおけるCRISPR座位の500bp以内に位置し、
好ましくは、前記直接反復配列の長さは21nt-36ntで、前記ガイド配列の長さは1-80ntで、かつ前記直接反復配列の最後の16または17個の塩基はループの大きさが8または9ntで、ステムが5対の相補塩基で構成される1つのステムループを形成してもよい
CRISPR-Casシステムを提供する。
第六の側面では、本発明は、単離された核酸分子であって、
(i) 本発明のタンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(ii) 第四の側面に記載の単離された核酸分子を含むか、あるいは
(iii) (i)および(ii)のヌクレオチド配列を含む
核酸分子を提供する。
また、第九の側面では、本発明は、
(i) 本発明のタンパク質、結合体、融合タンパク質、前記タンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびこれらの任意の組み合わせから選ばれる、第一成分、ならびに
(ii) ガイドRNAを含むヌクレオチド配列、または前記ガイドRNAを含むヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列である、第二成分を含み、
前記ガイドRNAは5'から3'への方向において直接反復配列および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含み、
前記ガイドRNAは(i)に記載のタンパク質、結合体または融合タンパク質と複合体を形成することができる
組成物を提供する。
(i) 本発明のタンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、任意に、操作可能に第一調節エレメントに連結している、第一核酸、ならびに
(ii) ガイドRNAを含むヌクレオチド配列をコードし、任意に、操作可能に第二調節エレメントに連結している、第二核酸を含み、
ここで、
前記第一核酸と第二核酸は同様か異なるベクターに存在し、
前記ガイドRNAは5'から3'への方向において直接反復配列および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含み、
前記ガイドRNAは(i)に記載のエフェクタータンパク質または融合タンパク質と複合体を形成することができる
組成物を提供する。
本発明のタンパク質、結合体、融合タンパク質、第四の側面に記載の単離された核酸分子、本発明の複合体、第六の側面に記載の単離された核酸分子、第七の側面に記載のベクター、第九の側面および第十の側面に記載の組成物は、本分野で既知の任意の方法によって送達することができる。このような方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、ソノポレーション効果、パーティクルガン、リン酸カルシウムによる形質移入、カチオントランスフェクション、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、熱ショック形質移入、ヌクレオフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インパレフェクション、光学的形質移入、試薬増強性核酸の取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ウイルス粒子、人工ウイルス体などよる送達を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記送達担体は粒子である。
もう一つの側面では、本発明は、上記のような成分のうちの1つまたは複数を含むキットを提供する。一部の実施形態において、前記キットは、本発明のタンパク質、結合体、融合タンパク質、第四の側面に記載の単離された核酸分子、本発明の複合体、第六の側面に記載の単離された核酸分子、第七の側面に記載のベクター、第九の側面および第十の側面に記載の組成物から選ばれる1つまたは複数の成分を含む。
もう一つの側面では、本発明は、標的遺伝子を修飾する方法であって、第五の側面に記載の複合体、第九の側面に記載の組成物または第十の側面に記載の組成物を前記標的遺伝子と接触させるか、前記標的遺伝子を含む細胞の中に送達することを含み、前記標的配列は前記標的遺伝子に存在する方法を提供する。
(i) インビトロにおける遺伝子またはゲノムの編集;
(ii) インビトロにおける1本鎖DNAの検出;
(iii) 標的遺伝子座における標的配列の編集による生物またはヒト以外の生物の修飾;
(iv) 標的遺伝子座における標的配列の欠陥による病症の治療。
一部の場合、本発明の方法によって細胞に導入された修飾により、細胞およびその子世代が改変されることで、その生物産物(たとえば抗体、デンプン、エタノールまたはほかの所望の細胞放出物)の生成が改良される。一部の場合、本発明の方法によって細胞に導入された修飾により、細胞およびその子世代が生産する生物産物が変化する改変を含むようになる。
本発明において、別途に説明しない限り、本明細書で使用される科学および技術名詞は当業者に理解される通常の意味を有する。そして、本明細書で使用される分子遺伝学、核酸化学、化学、分子生物学、生化学、細胞培養、微生物学、細胞生物学、ゲノム学および組み換えDNAなどの操作手順はいずれも関連分野で幅広く使用される通常の手順である。同時に、本発明がより良く理解されるように、以下に関連用語の定義および解釈を提供する。
(i) 配列番号1、2、3のいずれかで示される配列;
(ii) 配列番号1、2、3のいずれかで示される配列に対して1個または複数個のアミノ酸の置換、欠失または付加(たとえば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個のアミノ酸の置換、欠失または付加)を有する配列;あるいは
(iii) 配列番号1、2、3のいずれか3で示される配列に対して少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を持つ配列。
既存技術と比べ、本発明のCasタンパク質およびシステムは顕著な有利な面がある。たとえば、本発明のCasエフェクタータンパク質のPAMドメインは厳格な5'-TTN構造で、かつ標的配列の前から2番目および3番目の塩基の100%近くがTで、ほかの位置は任意の配列でもよく、現在すでに報告された最も厳格なPAMによって認識されるC2c1よりも厳格なPAM認識形態であるため、オフターゲット効果が顕著に低下する。たとえば、本発明のCasエフェクタータンパク質は真核生物の体内においてDNA切断が可能で、分子の大きさがCpf1およびCas9タンパク質よりも約200-300アミノ酸小さいため、形質移入効率が明らかにCpf1およびCas9よりも良い。
以下、以下の例を挙げて本発明を説明するための(本発明を限定するものではない)実施例を参照して本発明を説明する。
1.CRISPRおよび遺伝子のアノテーション:ProdigalによってNCBIおよびJGIデータベースの微生物ゲノムおよびメタゲノムのデータに対して遺伝子アノテーションを行ってすべてのタンパク質を得、同時にPiler-CRによってCRISPR座のアノテーションを行ったが、パラメーターはいずれもデフォルトであった。
2.タンパク質のろ過:配列一致性によってアノテーションタンパク質に対して冗長部分をなくし、配列が完全に一致するタンパク質を除去し、同時に長さが800アミノ酸超のタンパク質を大分子タンパク質とした。現在発見されたすべてのII型CRISPR/Casシステムのエフェクタータンパク質の多くは長さが900アミノ酸超であるため、計算の複雑度を降下させるために、CRISPRエフェクタータンパク質を探すとき、大分子タンパク質のみを考えた。
3.CRISPR関連大分子タンパク質の獲得:各CRISPR座の上下流から10 Kbまで伸ばし、CRISPRの隣接領域内における非冗長大分子タンパク質を同定した。
4.CRISPR関連大分子タンパク質のクラスタリング:BLASTPによって非冗長大分子CRISPR関連タンパク質に対して内部の2つずつのアラインメントを行い、Evalue<1E-10のアラインメント結果を出力した。MCLによってBLASTPの出力結果に対してCRISPR関連タンパク質ファミリーのクラスタリング分析を行った。
5.CRISPR密集大分子タンパク質ファミリーの同定:BLASTPによってCRISPR関連タンパク質ファミリーのタンパク質に対してアラインメントを行うことにより、CRISPR関連タンパク質を除いた非冗長大分子タンパク質データベースを得、Evalue<1E-10のアラインメント結果を出力した。もし一つの非CRISPR関連タンパク質データベースで発見された相同タンパク質が100%未満の場合、このファミリーのタンパク質がCRISPR領域に密集していることが示され、このような方法によってCRISPR密集大分子タンパク質ファミリーを同定した。
6.タンパク質の機能およびドメインのアノテーション:Pfamデータベース、NRデータベースおよびNCBIから集めされたCasタンパク質を利用してCRISPR密集大分子タンパク質ファミリーに対してアノテーションを行い、新たなCRISPR/Casタンパク質ファミリーを得た。Mafftによって各CRISPR/Casファミリーのタンパク質に対して多重配列アラインメントを行い、さらにJPredおよびHHpredによって保存ドメインの分析を行い、RuvCドメインを含むタンパク質ファミリーを同定した。
1.配列番号4で示される2本鎖DNA分子を人工合成し、同時に配列番号10で示される2本鎖DNA分子を人工合成した。
2.工程1で合成された2本鎖DNA分子を原核発現ベクターpACYC-Duet-1に連結し、組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fを得た。
組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fをシークエンシングした。シークエンシングの結果から、組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fに配列番号4および配列番号10で示される配列が含まれ、かつ配列番号1で示されるCas12f.4タンパク質および配列番号7で示されるCas12f.4原型直接反復配列を発現することが示された。組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fを大腸菌EC100に導入し、組み換え菌を得たが、当該組み換え菌をEC100-CRISPR/Cas12fと名付けた。
3、EC100-CRISPR/Cas12fの単一クローンを取り、100mLのLB液体培地(含50μg/mL アンピシリン)に接種し、37℃、200rpmで12h振とう培養し、培養菌液を得た。
4、細菌RNAの抽出:1.5 mLの細菌培養物を予め冷却された微量遠心管に移し、4℃、6000×gで5分間遠心した。遠心後、上清液を捨て、細胞沈殿を予め95℃に加熱された200μLのMax Bacterial Enhancement Reagentに再懸濁させ、均一に混合した。95℃で4分間インキュベートした。溶解産物に1 mLのTRIzol(登録商標)Reagentを入れて均一に混合し、室温で5分間インキュベートした。0.2mLの冷クロロホルムを入れ、手で管を振って15秒混合し、室温で2-3分間インキュベートした。4℃、12,000×gで15分間遠心した。600μLの上清を新たな管に取り、0.5mLの冷イソプロパノールを入れてRNAを沈殿させ、引っくり返して均一に混合し、室温で10分間インキュベートした。4℃、15,000×gで10分間遠心し、上清を捨て、1 mLの75%アルコールを入れ、ボルテックスで均一に混合した。4℃、7500×gで5分間遠心し、上清を捨て、空気中で乾燥した。RNA沈殿を50μLの無RNase水に溶解させ、60℃で10分間インキュベートした。
5、DNAの消化:20μgのRNAを39.5μLのdH2Oに65℃、5minで溶解させた。氷の上で5min置き、0.5μLのRNAI、5μLの緩衝液、5μLのDNaseIを入れ、37℃で45min反応させた(50μL反応系)。50μLのdH2Oを入れ、体積を100μLに調整した。2mLのPhase-Lock tube、16000gで30s遠心した後、100μLのフェノール:クロロホルム:イソペンタノール(25:24:1)、100μLの消化されたRNAを入れ、15s振とうし、15℃、16000gで12min遠心した。上清を新たな1.5mL遠心管に取り、上清と等体積のイソプロパノール1/10 NaoACを入れ、1hか-20℃で一晩反応させた。4℃、16000gで30min遠心し、上清を捨てた。350μLの75%アルコールを入れて沈殿を洗浄し、4℃、16000gで10min遠心し、上清を捨てた。乾燥し、20μLの無RNase水を入れ、65℃で沈殿を5min溶解させた。NanoDropによって濃度を測定し、ゲル電気泳動を行った。
6、3'脱リン酸化および5'リン酸化:20μgの消化されたRNAに、それぞれ水を42.5μLまで入れ、90℃で2min置いた。氷の上で5min冷却した。5μLの10×T4 PNK緩衝液、0.5 μLのRNaI、2 μLのT4 PNKを入れ(50μL)、37℃で6h反応させた。1μLのT4 PNK、1.25μL(100mM)のATPを入れ、37℃で1h反応させた。47.75μLのdH2Oを入れ、体積を100μLに調整した。2mLのPhase-Lock tube、16000gで30s遠心した後、100μLのフェノール:クロロホルム:イソペンタノール(25:24:1)、100μLの消化されたRNAを入れ、15s振とうし、15℃、16000gで12min遠心した。上清を新たな1.5mL遠心管に取り、上清と等体積のイソプロパノール、合計体積1/10 NaoACを入れ、1hか-20℃で一晩反応させた。4℃、16000gで30min遠心し、上清を捨てた。350μLの75%アルコールを入れて沈殿を洗浄し、4℃、16000gで10min遠心し、上清を捨てた。乾燥し、21μLの無RNase水を入れ、65℃で沈殿を5min溶解させ、NanoDropによって濃度を測定した。
7、RNAの単リン酸化:20μLのRNAを、90℃で1min置き、氷の上で5min冷却した。2μLのRNA 5'ポリホスファターゼの10×反応緩衝液、0.5μLの阻害剤、1μLのRNA 5'ポリホスファターゼ(20単位)を入れ、無RNase水を20μLまで入れ、37℃で60min反応させた。80μLのdH2Oを入れ、体積を100μLに調整した。2mLのPhase-Lock tube、16000gで30s遠心した後、100μLのフェノール:クロロホルム:イソペンタノール(25:24:1)、100μLの消化されたRNAを入れ、15s振とうし、15℃、16000gで12min遠心した。上清を新たな1.5mL遠心管に取り、上清と等体積のイソプロパノール、合計体積1/10 NaoACを入れ、1hか-20℃で一晩反応させた。4℃、16000gで30min遠心し、上清を捨て、350μLの75%アルコールを入れて沈殿を洗浄し、4℃、16000gで10min遠心し、上清を捨てた。乾燥し、21μLの無RNase水を入れ、65℃で沈殿を5min溶解させ、NanoDropによって濃度を測定した。
8、cDNAライブラリーの準備:16.5μL 無RNase水。5μL ポリ(A)ポリメラーゼの10×反応緩衝液。5μL 10mM ATP。1.5μL RiboGuard RNase阻害剤。20μL RNA基質。2μL ポリ(A)ポリメラーゼ(4単位)。50μL 合計体積。37℃ 20min。50μLのdH2Oを入れ、体積を100μLに調整した。2mLのPhase-Lock tube、16000gで30s遠心した後、100μLのフェノール:クロロホルム:イソペンタノール(25:24:1)、100μLの消化されたRNAを入れ、15s振とうし、15℃、16000gで12min遠心した。上清を新たな1.5mL遠心管に取り、上清と等体積のイソプロパノール、合計体積1/10 NaoACを入れ、1hか-20℃で一晩反応させた。4℃、16000gで30min遠心し、上清を捨て、乾燥し、11μLの無RNase水を入れ、65℃で沈殿を5min溶解させ、NanoDropによって濃度を測定した。
9、cDNAライブラリーにシークエンシングのリンカーを付加した後、北京貝瑞合康に送ってシークエンシングを行った。
10、元データに対して質量によって選別し、塩基の平均質量の値が30未満の配列を除去した。配列からリンカーを除去した後、25 nt~50 ntのRNA配列を残し、bowtieによってアライメントしてCRISPRアレイの参照配列にした。
11、アライメントにより、Cas12f.4のpre-crRNAは大腸菌体内において45ntの成熟crRNAに加工され、ここで、23ntの反復配列および19-22ntのガイド配列からなるものであることが見出された。
12、ViennaRNAおよびVARNAによって成熟のcrRNAに対して構造の予測および可視化分析を行ったところ、crRNAの反復配列の3'末端に一つの大きさ8塩基のステムループが形成できることがわかった(図1)。
13、Cas12f.5およびCas12f.6のcrRNAの3'末端の23ntの配列に対して予測したところ、似たような二次構造が見出された(図1)。
1.組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fを構築してシークエンシングした。シークエンシングの結果から、組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fに対して構造の説明をすると、ベクターpACYC-Duet-1の制限酵素Pml IおよびKpn I認識配列の間の小さい断片を配列番号4で示される配列における5'末端から1~3713番目で示される2本鎖DNA分子に置き換えた。組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fは配列番号1で示されるCas12f.4タンパク質および配列番号25で示されるCas12fガイドRNAを発現する。
2.組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fに発現カセットが含まれ、当該発現カセットのヌクレオチド配列は配列番号23で示される。配列番号23で示される配列において、5'末端から1~44番目はpLacZプロモーターのヌクレオチド配列で、45~3326番目はCas12f.4遺伝子のヌクレオチド配列で、3327~3412番目はターミネーターのヌクレオチド配列である(転写を終止するため)。5'末端から3413~3452番目はJ23119プロモーターのヌクレオチド配列で、3453~3628番目はCRISPRアレイのヌクレオチド配列で、3627~3713番目はrrnB-T1ターミネーターのヌクレオチド配列である(転写を終止するため)。
3.組み換え大腸菌の獲得:組み換えプラスミドpACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fを大腸菌EC100に導入し、組み換え大腸菌を得たが、EC100/pACYC-Duet-1+CRISPR/Cas12fと名付けた。組み換えプラスミドpACYC-Duet-1を大腸菌EC100に導入し、組み換え大腸菌を得たが、EC100/pACYC-Duet-1と名付けた。
4.PAMライブラリーの構築:配列番号24で示される配列を人工合成し、そしてpUC19ベクターに連結し、ここで、配列番号24で示される配列は5'末端の8個のランダムな塩基および標的配列を含む。PAMライブラリーの標的配列の5'末端の先端に8個のランダムな塩基を設計してプラスミドライブラリーを構築した。プラスミドをそれぞれCas12f.4遺伝子座を含む大腸菌およびCas.12f.4遺伝子座を含まない大腸菌に導入した。37℃で1時間処理した後、プラスミドを抽出し、そしてPAM領域の配列に対してPCR増幅およびシークエンシングを行った。
5.PAMライブラリーのドメインの獲得:それぞれ実験群および対照群における65,536種の組み合わせのPAM配列の出現回数を統計し、そして各群が有するPAM配列数で正規化した。任意の一つのPAM配列について、log2(対照群の正規化値/実験群の正規化値)が3.5超の場合、このPAMが顕著に消耗されたと見なし、計3,548本の顕著に消耗されたPAM配列が得られ、全部における比率が5.41%であった。Weblogoによって顕著に消耗されたPAM配列を予想したところ、Cas12f.4のPAMドメインは厳格な5'-TTN構造で(図2)、かつ標的配列の前から2番目および3番目の塩基のほぼ100%がTで、ほかの位置は任意の配列でもよいことがわかり、これは現在すでに報告された最も厳格なPAMによって認識されるC2c1よりも厳格なPAM認識形態である。
6.PAMライブラリーのドメインの検証:PAMライブラリー消耗実験により、Cas12f.4のPAMドメインを得たが、このドメインの厳密性を検証するため、10群のPAMを設けて体内実験を行い、Cas12fのこれらのPAMに対する編集活性を測定した。まず、30ntの標的およびPAM配列をプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子の非保存位置に組み込み、さらにCRSPR/Cas12fおよびガイドRNAで形成された複合体を使用してそれと混合して8時間培養した。プレートに塗布して集落数を統計すると、Cas12fの異なるPAM配列に対する消耗活性を判断することができる。実験結果から、CRISPR/Cas12f.4システムは5'-TTA、5'-TTT、5'-TTCおよび5'-TTGのPAMを持つ標的配列のみに対して有効に編集することができ、5'-TAT、5'-TCT、5'-TCG、5'-ATT、5'-CTTおよび5'-GTTのPAMを持つ標的配列に対して編集活性がないことが見られ、よってCas12f.4のPAMドメインに対する認識の厳密性が検証された。異なるPAMの集落を統計したところ、CRISPR/Cas12f.4システムの5'-TTA、5'-TTTおよび5'-TTCに対する編集活性が5'-TTGよりも高いことが見出された。
Cas12f.4遺伝子を含む真核発現ベクターおよびU6プロモーターとcrRNA(配列番号25)配列を含むPCR産物をリポソーム形質移入の方法によってヒトHEK293T細胞に導入し(図3a)、37℃、二酸化炭素濃度5%で72h培養した。全部の細胞のDNAを抽出し、そして標的部位700bpを含む配列を増幅し、PCR産物をTn5で第二世代シークエンシングライブラリーの構築を行い、シークエンシングは北京安諾優達基因科技有限公司によって完成され、シークエンシング結果をヒトゲノムのVEGFA遺伝子に対してアライメントし、Cas12f.4の目的の標的部位に対する切断様態を同定し(図3b)、CRISPR/Cas12f.4システムのVEGFAの編集効率が4.2%に達し、元のシークエンシングデータは図3cに示す(図3c)。
精製されたCas12f.4タンパク質(60μg)および配列番号28または29で示されるガイドRNA(120μg)を37℃で混合してリボ核タンパク質複合体(RNP)にし、さらにPEG4000によるプロトプラストで形質転換してCRISPR/Cas12f.4のRNPをトウモロコシプロトプラスト細胞に導入し、37℃で24時間暗培養した(図4a)。培養終了後、遠心して上清を除去してプロトプラストを収集し、プロトプラストDNAを抽出し、標的部位の上下流の約600bpのDNA断片を増幅した。標的部位を含むDNA断片に対してT7エンドヌクレアーゼによる酵素切断の検出を行い、結果は図4bに示すように、CRISPR/Cas12f.4システムはPDI1、SEB2.2に対して効率的な切断活性を有する。標的部位を含むDNA断片をBlunt Simpleベクターに連結し、プレートに塗布し、サーモフィッシャーサイエンティフィック(中国)有限公司によって単一クローンに対してSangerシークエンシングを行われ、シークエンシング結果をトウモロコシ群のPDI1、SEB2.2遺伝子に対してアライメントし、結果は図4b-4cに示すように、Cas12f.4の目的の標的部位に対する切断効率がそれぞれ33.5%と16.7%であったと同定された。
Claims (49)
- (i)配列番号1で示される配列;
(ii)配列番号1に対して、少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む配列;
(iii)配列番号1に対して、少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む配列;
(iv)配列番号1に対して、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む配列
から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、
(ii)、(iii)、及び(iv)のいずれか1つに記載の配列を含むタンパク質が、CRISPR/Casシステムにおけるエフェクタータンパク質であって、DNAを標的配列とする場合、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)ドメインを認識し、ここで、PAMドメインが、5’-TTN構造を有し、NはA、G、T、Cから選ばれる、タンパク質。 - 配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質および修飾部分を含む結合体。
- 前記修飾部分は、別のタンパク質またはポリペプチド、検出可能な標識、およびこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項3に記載の結合体。
- 前記修飾部分は、任意に、リンカーを介して請求項1に記載のタンパク質のN末端またはC末端に連結する、
請求項3または4に記載の結合体。 - 前記別のタンパク質またはポリペプチドは、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、核局在化シグナル(NLS)配列、ターゲティング部分、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレオチドデアミナーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写物放出因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、1本鎖RNA切断活性、2本鎖RNA切断活性、1本鎖DNA切断活性、2本鎖DNA切断活性および核酸結合活性から選ばれる活性を有するドメイン、ならびにこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項3-5のいずれか1項に記載の結合体。
- 前記結合体は、エピトープタグを含む、請求項3-6のいずれか1項に記載の結合体。
- 前記結合体は、NLS配列を含む、請求項3-7のいずれか1項に記載の結合体。
- 請求項1に記載のタンパク質と、別のタンパク質またはポリペプチドとを含む、融合タンパク質。
- 前記別のタンパク質またはポリペプチドは、任意に、リンカーを介して前記タンパク質のN末端またはC末端に連結している、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記別のタンパク質またはポリペプチドは、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、核局在化シグナル(NLS)配列、ターゲティング部分、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレオチドデアミナーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写物放出因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、1本鎖RNA切断活性、2本鎖RNA切断活性、1本鎖DNA切断活性、2本鎖DNA切断活性および核酸結合活性から選ばれる活性を有するドメイン、ならびにこれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項9または10に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、エピトープタグを含む、請求項9-11のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、NLS配列を含む、請求項9-12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、配列番号20で示されるアミノ酸配列を含む、請求項9-13のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 単離された核酸分子であって、
(i)配列番号7または13で示される配列;
(ii)配列番号7または13で示される配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列;または
(iii)(i)または(ii)に記載の配列の相補配列
から選択される配列を含み、または該配列からなり、
さらに、(ii)または(iii)に記載の配列は、CRISPR-Casシステムにおける直接反復配列としての活性を維持する、
核酸分子。 - 前記核酸分子は、1つまたは複数のステムループまたは最適化された二次構造を含む、請求項15に記載の単離された核酸分子。
- (a)配列番号7または13で示されるヌクレオチド配列;または
(b)配列番号7または13で示されるヌクレオチド配列の相補配列
から選択される配列を含む、または該配列からなる、
請求項15または16に記載の単離された核酸分子。 - (i)請求項1に記載のタンパク質、請求項3-8のいずれか1項に記載の結合体、請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質、およびこれらの任意の組み合わせから選ばれる、タンパク質成分;および
(ii)5’から3’への方向において請求項15-17のいずれか1項に記載の単離された核酸分子および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含む、核酸成分
を含む複合体であって、前記タンパク質成分および核酸成分は、相互に結合して複合体を形成する、複合体。 - 前記ガイド配列は、前記核酸分子の3’末端に連結している、請求項18に記載の複合体。
- 前記ガイド配列は、前記標的配列の相補配列を含む、請求項18または19に記載の複合体。
- (i)請求項1に記載のタンパク質または請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列;
(ii)請求項15-17のいずれか1項に記載の単離された核酸分子をコードするヌクレオチド配列;および、
(iii)(i)および(ii)を含むヌクレオチド配列
からなる群から選択される、単離された核酸分子。 - 請求項21に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
- 請求項21に記載の単離された核酸分子または請求項22に記載のベクターを含む宿主細胞。
- (i)請求項1に記載のタンパク質、請求項3-8のいずれか1項に記載の結合体、請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質、前記タンパク質または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびこれらの任意の組み合わせから選ばれる、第一成分;および
(ii)ガイドRNAを含むヌクレオチド配列、または前記ガイドRNAを含むヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列である、第二成分
を含む組成物であって、
前記ガイドRNAは、5’から3’への方向において直接反復配列および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含み、
前記ガイドRNAは、(i)に記載のタンパク質、結合体または融合タンパク質と複合体を形成することができ、
前記直接反復配列は、請求項15-17のいずれか1項で定義された単離された核酸分子である、
組成物。 - (i)請求項1に記載のタンパク質または請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、任意に、操作可能に第一調節エレメントに連結している、第一核酸;および
(ii)ガイドRNAを含むヌクレオチド配列をコードし、任意に、操作可能に第二調節エレメントに連結している、第二核酸
を含む1つまたは複数のベクターを含む組成物であって、
前記第一核酸と第二核酸は、同じまたは異なるベクターに存在し、
前記ガイドRNAは、5’から3’への方向において直接反復配列および標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含み、
前記ガイドRNAは、(i)に記載のタンパク質または融合タンパク質と複合体を形成することができ、
前記直接反復配列は、請求項15-17のいずれか1項で定義された単離された核酸分子である、
組成物。 - 前記第一調節エレメントおよび/または第二調節エレメントは、プロモーターである、請求項25に記載の組成物。
- 前記組成物における少なくとも一つの成分は、天然に存在しないものまたは修飾されたものである、請求項24-26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ガイド配列は、前記直接反復配列の3’末端に連結している、請求項24-27のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ガイド配列は、前記標的配列の相補配列を含む、請求項24-28のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的配列がDNAである場合、前記標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3’末端に位置し、かつ前記PAMは5’-TTNで示される配列を含み、ここで、NはA、G、T、Cから選択され、前記標的配列がRNAである場合、前記標的配列はPAMドメインの制限がない、請求項24-29のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的配列は、原核細胞または真核細胞由来のDNAまたはRNA配列である、または、前記標的配列は、天然に存在しないDNAまたはRNA配列である、請求項24-30のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的配列は、細胞内に存在する、請求項31に記載の組成物。
- 前記標的配列は、核内または細胞質内に存在する、請求項32に記載の組成物。
- 前記細胞は、真核細胞または原核細胞である、請求項32に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、1つまたは複数のNLS配列に連結しているか、または、前記結合体もしくは融合タンパク質は、1つもしくは複数のNLS配列を含む、請求項24-32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記NLS配列は、前記タンパク質のN末端またはC末端に結合される、請求項35に記載の組成物。
- 前記NLS配列は、前記タンパク質のN末端またはC末端に融合される、請求項35に記載の組成物。
- 請求項1に記載のタンパク質、請求項3-8のいずれか1項に記載の結合体、請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項15-17のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、請求項18-20のいずれか1項に記載の複合体、請求項21に記載の単離された核酸分子、請求項22に記載のベクター、請求項24-35のいずれか1項に記載の組成物から選択される1つまたは複数の成分を含むキット。
- 送達担体、ならびに請求項1に記載のタンパク質、請求項3-8のいずれか1項に記載の結合体、請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項15-17のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、請求項18-20のいずれか1項に記載の複合体、請求項21に記載の単離された核酸分子、請求項22に記載のベクター、請求項24-35のいずれか1項に記載の組成物からなる群から選択される1つまたは複数を含む、送達組成物。
- 標的遺伝子を修飾するための方法であって、請求項18-20のいずれか1項に記載の複合体または請求項24-35のいずれか1項に記載の組成物を前記標的遺伝子と接触させること、または前記標的遺伝子を含む細胞の中に送達すること、を含み、前記標的配列は、前記標的遺伝子中に存在し、前記細胞は、哺乳動物細胞または植物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞ではない、方法。
- 前記標的遺伝子は、in vitroの核酸分子中に存在する、請求項40に記載の方法。
- 前記修飾は、前記標的配列の断裂である、請求項40または41に記載の方法。
- 遺伝子産物の発現を改変する方法であって、請求項18-20のいずれか1項に記載の複合体または請求項24-35のいずれか1項に記載の組成物を前記遺伝子産物をコードする核酸分子と接触させること、または前記核酸分子を含む細胞の中に送達すること、を含み、前記標的配列は、前記核酸分子中に存在し、前記細胞は、哺乳動物細胞または植物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞ではない、方法。
- 前記核酸分子は、in vitroの核酸分子中に存在する、請求項43に記載の方法。
- 前記遺伝子産物の発現が改変される、請求項43または44に記載の方法。
- 前記タンパク質、結合体、融合タンパク質、単離された核酸分子、複合体、ベクター、または組成物は、送達担体に含まれる、請求項40-45のいずれか1項に記載の方法。
- 標的遺伝子または標的遺伝子産物をコードする核酸分子における1つまたは複数の標的配列を改変することによって細胞、細胞系または生物体を修飾することに使用される、請求項40-46のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項40-47のいずれか1項に記載の方法により得られた、in vitro、単離された、またはin vivoの細胞または細胞系またはこれらの子世代であって、
請求項1に記載のタンパク質、請求項3-8のいずれか1項に記載の結合体、請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項15-17のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、請求項18-20のいずれか1項に記載の複合体、請求項21に記載の単離された核酸分子、請求項22に記載のベクター、請求項24-35のいずれか1項に記載の組成物を含み、
前記細胞は、動物細胞または植物細胞であり、前記動物細胞は、ヒト細胞ではない、
細胞または細胞系またはこれらの子世代。 - (i)単離された遺伝子またはゲノムの編集;
(ii)単離された1本鎖DNAの検出;
(iii)標的遺伝子座における標的配列の編集による生物またはヒト以外の生物の修飾;または
(iv)標的遺伝子座における標的配列の欠陥による病症の治療
のための製剤の製造における、請求項1に記載のタンパク質、請求項3-8のいずれか1項に記載の結合体、請求項9-14のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項15-17のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、請求項18-20のいずれか1項に記載の複合体、請求項21に記載の単離された核酸分子、請求項22に記載のベクター、請求項24-35のいずれか1項に記載の組成物または請求項38に記載のキットの使用。
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